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Im Rahmen der EU-weiten REACH-Verordnung haben Alternativmethoden zum Tierversuch in der Toxikologie an Bedeutung gewonnen. Die Alternativmethoden gliedern sich auf in In-vitro- und In-silico-Methoden. In dieser Dissertation wurden verschiedene Konzepte der In-silico-Toxikologie behandelt.
Die bearbeiteten Themen reichen von quantitativen Strukturaktivitätsbeziehungen (QSAR) über eine neue Herangehensweise an das gängige Konzept zur Festlegung von Grenzwerten bis hin zu computerbasierten Modellierungen zum Alkohol- und Bisphenol-A-Stoffwechsel.
Das Kapitel über QSAR befasst sich im Wesentlichen mit der Erstellung und Analyse einer Datenbank mit 878 Substanzen, die sich aus Tierversuchsstudien aus dem Archiv des Bundesinstituts für Risikobewertung zusammensetzt. Das Design wurde dabei an eine bereits bestehende Datenbank angepasst, um so einen möglichst großen Datenpool zu generieren. In der Analyse konnte u.a. gezeigt werden, dass Stoffe mit niedrigerem Molekulargewicht ein erhöhtes Potential für toxikologische Schäden aufwiesen als größere Moleküle.
Mit Hilfe des sogenannten TTC-Konzepts können Grenzwerte für Stoffe geringer Exposition festgelegt werden, zu denen keine toxikologischen Daten zur Verfügung stehen. In dieser Arbeit wurden für die Stoffe dreier Datenbanken entsprechende Grenzwerte festgelegt. Es erfolgte zunächst eine gängige strukturbasierte Aufteilung der Substanzen in die Kategorien "nicht toxisch", "möglicherweise toxisch" und "eindeutig toxisch". Substanzen, die aufgrund ihrer Struktur in eine der drei Klassen eingeordnet werden, erhalten den entsprechenden Grenzwert. Da in die dritte Klasse auch Stoffe eingeordnet werden, deren Toxizität nicht bestimmbar ist, ist sie sehr groß. Daher wurden in dieser Arbeit die ersten beiden Klassen zusammengelgt, um einen größeren Datenpool zu ermöglichen. Eine weitere Neuerung umfasst die Erstellung eines internen Grenzwerts. Diese Vorgehensweise hat den Vorteil, dass der Expositionsweg herausgerechnet wird und somit beispielsweise Studien mit oraler Verabreichung mit Studien dermaler Verabreichung verglichen werden können.
Mittels physiologisch basiertem kinetischem Modelling ist es möglich, Vorgänge im menschlichen Körper mit Hilfe spezieller Software nachzuvollziehen. Durch diese Vorgehensweise können Expositionen von Chemikalien simuliert werden. In einem Teil der Arbeit wurden Alkoholexpositionen von gestillten Neugeborenen simuliert, deren Mütter unmittelbar zuvor alkoholische Getränke konsumiert hatten. Mit dem Modell konnte gezeigt werden, dass die Expositionen des Kindes durchweg gering waren. Nach einem Glas Wein wurden Spitzenkonzentrationen im Blut von Neugeborenen von 0,0034 Promille ermittelt. Zum Vergleich wurde die Exposition durch ein für Säuglinge zugelassenes alkoholhaltiges pflanzliches Arzneimittel simuliert. Hier wurden Spitzenkonzentrationen von 0,0141 Promille erreicht. Daher scheinen Empfehlungen wie gelegentlicher Konsum ohne schädigende Wirkung auf das Kind wissenschaftlich fundiert zu sein.
Ein weiteres Kinetik-Modell befasste sich mit dem Stoffwechsel von Bisphenol A. Teils widersprüchliche Daten zur Belastung mit BPA in der wissenschaftlichen Literatur führen wiederholt zu Anregungen, den Grenzwert der Chemikalie anzupassen. Die Funktionalität der am Metabolismus beteiligten Enzyme kann je nach Individuum unterschiedlich ausgeprägt sein. Mittels Modellings konnte hier gezeigt werden, dass dies maßgeblich dazu führt, dass sich berechnete Plasmaspiegel von Individuen bis zu 4,7-fach unterscheiden.
Die Arbeit konnte somit einen Beitrag zur Nutzung und Weiterentwicklung von In-silico-Modellen für diverse toxikologische Fragestellungen leisten.
Die Häufung von Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und einigen Krebsarten, deren Entstehung auf Übergewicht und Bewegungsmangel zurückzuführen sind, ist ein aktuelles Problem unserer Gesellschaft. Insbesondere mit fortschreitendem Alter nehmen die damit einhergehenden Komplikationen zu. Umso bedeutender ist das Verständnis der pathologischen Mechanismen in Folge von Adipositas, Bewegungsmangel, des Alterungsprozesses und den Einfluss-nehmenden Faktoren.
Ziel dieser Arbeit war die Entstehung metabolischer Erkrankungen beim Menschen zu untersuchen. Die Auswertung von Verlaufsdaten anthropometrischer und metabolischer Parameter der 584 Teilnehmern der prospektiven ‚Metabolisches Syndrom Berlin Potsdam Follow-up Studie‘ wies für die gesamte Kohorte einen Anstieg an Übergewicht, ebenso eine Verschlechterung des Blutdrucks und des Glukosestoffwechsels auf. Wir untersuchten, ob das Hormon FGF21 Einfluss an dem Auftreten eines Diabetes mellitus Typ 2 (T2DM) oder des Metabolischen Syndroms (MetS) hat. Wir konnten zeigen, dass Personen, die später ein MetS entwickeln, bereits zu Studienbeginn einen erhöhten FGF21-Spiegel, einen höheren BMI, WHR, Hb1Ac und diastolischen Blutdruck aufwiesen. Neben FGF21 wurde auch Vaspin in diesem Zusammenhang untersucht. Es zeigte sich, dass Personen, die später einen T2DM entwickeln, neben einer Erhöhung klinischer Parameter tendenziell erhöhte Spiegel des Hormons aufwiesen. Mit FGF21 und Vaspin wurden hier zwei neue Faktoren für die Vorhersage des Metabolischen Syndroms bzw. Diabetes mellitus Typ 2 identifiziert.
Der langfristige Effekt einer Gewichtsreduktion wurde in einer Subkohorte von 60 Personen untersucht. Der überwiegende Teil der Probanden mit Gewichtsabnahme-Intervention nahm in der ersten sechsmonatigen Phase erfolgreich ab. Jedoch zeigte sich ein deutlicher Trend zur Wiederzunahme des verlorenen Gewichts über den Beobachtungszeitraum von fünf Jahren. Von besonderem Interesse war die Abschätzung des kardiovaskulären Risikos über den Framingham Score. Es wurde deutlich, dass für Personen mit konstanter Gewichtsabnahme ein deutlich geringeres kardiovaskuläres Risiko bestand. Hingegen zeigten Personen mit konstanter Wiederzunahme oder starken Gewichtsschwankungen ein hohes kardiovaskuläres Risiko. Unsere Daten legten nahe, dass eine erfolgreiche dauerhafte Gewichtsreduktion statistisch mit einem erniedrigten kardiovaskulären Risiko assoziiert ist, während Probanden mit starken Gewichtsschwankungen oder einer Gewichtszunahme ein gesteigertes Risiko haben könnten.
Um die Interaktion der molekularen Vorgänge hinsichtlich der Gewichtsreduktion und Lebensspanne untersuchen zu können, nutzen wir den Modellorganismus C.elegans. Eine kontinuierliche Restriktion wirkte sich verlängernd, eine Überversorgung verkürzend auf die Lebensspanne des Rundwurms aus. Der Einfluss eines zeitlich eingeschränkten, intermittierenden Nahrungsregimes, analog zum Weight-Cycling im Menschen, auf die Lebensspanne war von großem Interesse. Dieser regelmäßige Wechsel zwischen ad libitum Fütterung und Restriktion hatte in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Restriktion einen unterschiedlich starken lebensverlängernden Effekt. Phänomene, wie Gewichtswiederzunahmen, sind in C.elegans nicht zu beobachten und beruhen vermutlich auf einem Mechanismus ist, der evolutionär jünger und in C.elegans noch nicht angelegt ist.
Um neue Stoffwechselwege zu identifizieren, die die Lebensspanne beeinflussen, wurden Metabolitenprofile genetischer als auch diätetischer Langlebigkeitsmodelle analysiert. Diese Analysen wiesen den Tryptophan-Stoffwechsel als einen neuen, bisher noch nicht im Fokus stehenden Stoffwechselweg aus, der mit Langlebigkeit in Verbindung steht.
The relationship between nutrition and the development of chronic diseases including metabolic syndrome, diabetes mellitus, cancer and cardiovascular disease has been well studied. On the other hand, changes in the GH-IGF-1 axis in association with nutrition-related diseases have been reported. The interplay between GH, total IGF-1 and different inhibitory and stimulatory kinds of IGF-1 binding proteins (IGFBPs) results in IGF-1 bioactivity, the ability of IGF-1 to induce phosphorylation of its receptor and consequently its signaling. Moreover, IGF-1 bioactivity is sufficient to reflect any change in the GH-IGF-1 system. Accumulating evidence suggests that both of high protein diet, characterized by increased glucagon secretion, and insulin-induced hypoglycemia increase mortality rate and the mechanisms are unclear. However both of glucagon and insulin-induced hypoglycemia are potent stimuli of GH secretion. The aim of the current study was to identify the impact of glucagon and insulin-induced hypoglycemia on IGF-1 bioactivity as possible mechanisms. In a double-blind placebo-controlled study, glucagon was intramuscularly administrated in 13 type 1 diabetic patients (6 males /7 females; [BMI]: 24.8 ± 0.95 kg/m2), 11 obese subjects (OP; 5/ 6; 34.4 ± 1.7 kg/m2), and 13 healthy lean participants (LP; 6/ 7; 21.7 ± 0.6 kg/m2), whereas 12 obese subjects (OP; 6/ 6; 34.4 ± 1.7 kg/m2), and 13 healthy lean participants (LP; 6/ 7; 21.7 ± 0.6 kg/m2) performed insulin tolerance test in another double-blind placebo-controlled study and changes in GH, total IGF-1, IGF binding proteins (IGFBPs) and IGF-1 bioactivity, measured by the cell-based KIRA method, were investigated. In addition, the interaction between the metabolic hormones (glucagon and insulin) and the GH-IGF-1 system on the transcriptional level was studied using mouse primary hepatocytes. In this thesis, glucagon decreased IGF-1 bioactivity in humans independently of endogenous insulin levels, most likely through modulation of IGFBP-1 and-2 levels. The glucagon-induced reduction in IGF-1 bioactivity may represent a novel mechanism underlying the impact of glucagon on GH secretion and may explain the negative effect of high protein diet related to increased cardiovascular risk and mortality rate. In addition, insulin-induced hypoglycemia was correlated with a decrease in IGF-1 bioactivity through up-regulation of IGFBP-2. These results may refer to a possible and poorly explored mechanism explaining the strong association between hypoglycemia and increased cardiovascular mortality among diabetic patients.
Aufgrund ihrer potenziell gesundheitsfördernden Wirkung sind die polyphenolischen Isoflavone für die menschliche Ernährung von großem Interesse. Eine Vielzahl an experimentellen und epidemiologischen Studien zeigen für die in Soja enthaltenen Isoflavone Daidzein und Genistein eine präventive Wirkung bezüglich hormon-abhängiger und altersbedingter Erkrankungen, wie Brust- und Prostatakrebs, Osteoporose, Herz-Kreislauf-Erkrankungen sowie des menopausalen Syndroms. Die Metabolisierung und Bioaktivierung dieser sekundären Pflanzenstoffe durch die humane intestinale Darmmikrobiota ist individuell unterschiedlich. Nur in einem geringen Teil der westlichen Bevölkerung wird der Daidzein-Metabolit Equol durch spezifische Darmbakterien gebildet. Ein isoliertes Equol-produzierendes Bakterium des menschlichen Darmtrakts ist Slackia isoflavoniconvertens. Anhand dieser Spezies sollten die bislang unbekannten, an der Umsetzung von Daidzein und Genistein beteiligten Enzyme identifiziert und charakterisiert werden.
Fermentationsexperimente mit S. isoflavoniconvertens zeigten, dass die Gene der Daidzein und Genistein-umsetzenden Enzyme nicht konstitutiv exprimiert werden, sondern induziert werden müssen. Mit Hilfe der zweidimensionalen differentiellen Gelelektrophorese wurden sechs Proteine detektiert, welche in einer S. isoflavoniconvertens-Kultur in Anwesenheit von Daidzein induziert wurden. Auf Grundlage einzelner Peptidsequenzen erfolgte die Sequenzierung eines Genkomplexes mit den in gleicher Orientierung angeordneten Genen der durch Daidzein induzierten Proteine. Sequenzvergleiche identifizierten zudem äquivalente Genprodukte zu den Proteinen von S. isoflavoniconvertens in anderen Equolproduzierenden Bakterien. Nach der heterologen Expression in Escherichia coli wurden drei dieser Gene durch enzymatische Aktivitätstests als Daidzein-Reduktase (DZNR), Dihydrodaidzein-Reduktase (DHDR) und Tetrahydrodaidzein-Reduktase (THDR) identifiziert. Die Kombination der E. coli-Zellextrakte führte zur vollständigen Umsetzung von Daidzein über Dihydrodaidzein zu Equol. Neben Daidzein setzte die DZNR auch Genistein zu Dihydrogenistein um. Dies erfolgte mit einer größeren Umsatzgeschwindigkeit im Vergleich zur Reduktion von Daidzein zu Dihydrodaidzein. Enzymatische Aktivitätstests mit dem Zellextrakt von S. isoflavoniconvertens zeigten ebenfalls eine schnellere Umsetzung von Genistein. Die Kombination der rekombinanten DHDR und THDR führte zur Umsetzung von Dihydrodaidzein zu Equol. Der korrespondierende Metabolit 5-Hydroxyequol konnte als Endprodukt des Genistein-Metabolismus nicht detektiert werden. Zur Reinigung der drei identifizierten Reduktasen wurden diese genetisch an ein Strep-tag fusioniert und mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Die übrigen durch Daidzein induzierten Proteine IfcA, IfcBC und IfcE wurden ebenfalls in E. coli exprimiert und als Strep-Fusionsproteine gereinigt. Vergleichende Aktivitätstests identifizierten das induzierte Protein IfcA als Dihydrodaidzein-Racemase. Diese katalysierte die Umsetzung des (R)- und (S)-Enantiomers von Dihydrodaidzein und Dihydrogenistein zum korrespondierenden Racemat. Neben dem Elektronentransfer-Flavoprotein IfcBC wurden auch die THDR, DZNR und IfcE als FAD-haltige Flavoproteine identifiziert. Zudem handelte es sich bei IfcE um ein Eisen-Schwefel-Protein. Nach Induktion der für die Daidzein-Umsetzung kodierenden Gene wurden mehrere verschieden lange mRNA-Transkripte gebildet. Dies zeigte, dass die Transkription des durch Daidzein induzierten Genkomplexes in S. isoflavoniconvertens nicht in Form eines einzelnen Operonsystems erfolgte.
Auf Grundlage der identifizierten Daidzein-umsetzenden Enzyme kann der Mechanismus der bakteriellen Umsetzung von Isoflavonen durch S. isoflavoniconvertens eingehend erforscht werden. Die ermittelten Gensequenzen der durch Daidzein induzierten Proteine sowie die korrespondierenden Gene weiterer Equol-produzierender Bakterien bieten zudem die Möglichkeit der mikrobiellen Metagenomanalyse im humanen Darmtrakt.
Aminosäuren sind lebensnotwendige Moleküle für alle Organismen. Ihre Erkennung im Körper ermöglicht eine bedarfsgerechte Regulation ihrer Aufnahme und ihrer Verwertung. Welcher Chemosensor für diese Erkennung jedoch hauptverantwortlich ist, ist bisher unklar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Umamigeschmacksrezeptoruntereinheit Tas1r1 jenseits ihrer gustatorischen Bedeutung für die Aminosäuredetektion in der Mundhöhle untersucht.
In der histologischen Tas1r1-Expressionsanalyse nichtgustatorischer Gewebe der Mauslinie Tas1r1-Cre/ROSA26-tdRFP wurde über die Detektion des Reporterproteins tdRFP die Expression des Tas1r1 in allen untersuchten Geweben (Speiseröhre, Magen, Darm, Bauchspeicheldrüse, Leber, Niere, Muskel- und Fettgewebe, Milz, Thymus, Lymphknoten, Lunge sowie Hoden) nachgewiesen. Mit Ausnahme von Dünndarm und Hoden gelang hierbei der Nachweis erstmals spezifisch auf zellulärer Ebene. Caecum und Lymphknoten wurden zudem neu als Expressionsorte des Tas1r1 identifiziert.
Trotz der beobachteten weiten Verbreitung des Tas1r1 im Organismus – unter anderem auch in Geweben, die für den Proteinstoffwechsel besonders relevant sind – waren im Zuge der durchgeführten Untersuchung potentieller extraoraler Funktionen des Rezeptors durch phänotypische Charakterisierung der Mauslinie Tas1r1-BLiR nur schwache Auswirkungen auf Aminosäurestoffwechsel bzw. Stickstoffhaushalt im Falle eines Tas1r1-Knockouts detektierbar. Während sich Ernährungsverhalten, Gesamtphysiologie, Gewebemorphologie sowie Futterverdaulichkeit unverändert zeigten, war die renale Stickstoffausscheidung bei Tas1r1-Knockout-Mäusen auf eiweißarmer sowie auf eiweißreicher Diät signifikant verringert. Eine Überdeckung der Auswirkungen des Tas1r1-Knockouts aufgrund kompensatorischer Effekte durch den Aminosäuresensor CaSR oder den Peptidsensor Gpr93 war nicht nachweisbar. Es bleibt offen, ob andere Mechanismen oder andere Chemosensoren an einer Kompensation beteiligt sind oder aber Tas1r1 in extraoralem Gewebe andere Funktionen als die der Aminosäuredetektion übernimmt. Unterschiede im extraoralen Expressionsmuster der beiden Umamirezeptor-untereinheiten Tas1r1 und Tasr3 lassen Spekulationen über andere Partner, Liganden und Funktionen zu.
The toxicologically most relevant mercury (Hg) species for human exposure is methylmercury (MeHg). Thiomersal is a common preservative used in some vaccine formulations. The aim of this study is to get further mechanistic insight into the yet not fully understood neurotoxic modes of action of organic Hg species. Mercury species investigated include MeHgCl and thiomersal. Additionally HgCl2 was studied, since in the brain mercuric Hg can be formed by dealkylation of the organic species. As a cellular system astrocytes were used. In vivo astrocytes provide the environment necessary for neuronal function. In the present study, cytotoxic effects of the respective mercuricals increased with rising alkylation level and correlated with their cellular bioavailability. Further experiments revealed for all species at subcytotoxic concentrations no induction of DNA strand breaks, whereas all species massively increased H2O2-induced DNA strand breaks. This co-genotoxic effect is likely due to a disturbance of the cellular DNA damage response. Thus, at nanomolar, sub-cytotoxic concentrations, all three mercury species strongly disturbed poly(ADP-ribosyl)ation, a signalling reaction induced by DNA strand breaks. Interestingly, the molecular mechanism behind this inhibition seems to be different for the species. Since chronic PARP-1 inhibition is also discussed to sacrifice neurogenesis and learning abilities, further experiments on neurons and in vivo studies could be helpful to clarify whether the inhibition of poly(ADP-ribosyl)ation contributes to organic Hg induced neurotoxicity.
Effect of benzylglucosinolate on signaling pathways associated with type 2 diabetes prevention
(2014)
Type 2 diabetes (T2D) is a health problem throughout the world. In 2010, there were nearly 230 million individuals with diabetes worldwide and it is estimated that in the economically advanced countries the cases will increase about 50% in the next twenty years. Insulin resistance is one of major features in T2D, which is also a risk factor for metabolic and cardiovascular complications. Epidemiological and animal studies have shown that the consumption of vegetables and fruits can delay or prevent the development of the disease, although the underlying mechanisms of these effects are still unclear. Brassica species such as broccoli (Brassica oleracea var. italica) and nasturtium (Tropaeolum majus) possess high content of bioactive phytochemicals, e.g. nitrogen sulfur compounds (glucosinolates and isothiocyanates) and polyphenols largely associated with the prevention of cancer. Isothiocyanates (ITCs) display their anti-carcinogenic potential by inducing detoxicating phase II enzymes and increasing glutathione (GSH) levels in tissues. In T2D diabetes an increase in gluconeogenesis and triglyceride synthesis, and a reduction in fatty acid oxidation accompanied by the presence of reactive oxygen species (ROS) are observed; altogether is the result of an inappropriate response to insulin. Forkhead box O (FOXO) transcription factors play a crucial role in the regulation of insulin effects on gene expression and metabolism, and alterations in FOXO function could contribute to metabolic disorders in diabetes. In this study using stably transfected human osteosarcoma cells (U-2 OS) with constitutive expression of FOXO1 protein labeled with GFP (green fluorescent protein) and human hepatoma cells HepG2 cell cultures, the ability of benzylisothiocyanate (BITC) deriving from benzylglucosinolate, extracted from nasturtium to modulate, i) the insulin-signaling pathway, ii) the intracellular localization of FOXO1 and iii) the expression of proteins involved in glucose metabolism, ROS detoxification, cell cycle arrest and DNA repair was evaluated. BITC promoted oxidative stress and in response to that induced FOXO1 translocation from cytoplasm into the nucleus antagonizing the insulin effect. BITC stimulus was able to down-regulate gluconeogenic enzymes, which can be considered as an anti-diabetic effect; to promote antioxidant resistance expressed by the up-regulation in manganese superoxide dismutase (MnSOD) and detoxification enzymes; to modulate autophagy by induction of BECLIN1 and down-regulation of the mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) pathway; and to promote cell cycle arrest and DNA damage repair by up-regulation of the cyclin-dependent kinase inhibitor (p21CIP) and Growth Arrest / DNA Damage Repair (GADD45). Except for the nuclear factor (erythroid derived)-like2 (NRF2) and its influence in the detoxification enzymes gene expression, all the observed effects were independent from FOXO1, protein kinase B (AKT/PKB) and NAD-dependent deacetylase sirtuin-1 (SIRT1). The current study provides evidence that besides of the anticarcinogenic potential, isothiocyanates might have a role in T2D prevention. BITC stimulus mimics the fasting state, in which insulin signaling is not triggered and FOXO proteins remain in the nucleus modulating gene expression of their target genes, with the advantage of a down-regulation of gluconeogenesis instead of its increase. These effects suggest that BITC might be considered as a promising substance in the prevention or treatment of T2D, therefore the factors behind of its modulatory effects need further investigation.
Intensive Forschung hat in den vergangenen Jahrzehnten zu einer sehr detaillierten Charakterisierung des Geschmackssystems der Säugetiere geführt. Dennoch sind mit den bislang eingesetzten Methoden wichtige Fragestellungen unbeantwortet geblieben. Eine dieser Fragen gilt der Unterscheidung von Bitterstoffen. Die Zahl der Substanzen, die für den Menschen bitter schmecken und in Tieren angeborenes Aversionsverhalten auslösen, geht in die Tausende. Diese Substanzen sind sowohl von der chemischen Struktur als auch von ihrer Wirkung auf den Organismus sehr verschieden. Während viele Bitterstoffe potente Gifte darstellen, sind andere in den Mengen, die mit der Nahrung aufgenommen werden, harmlos oder haben sogar positive Effekte auf den Körper. Zwischen diesen Gruppen unterscheiden zu können, wäre für ein Tier von Vorteil. Ein solcher Mechanismus ist jedoch bei Säugetieren nicht bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Verarbeitung von Geschmacksinformation in der ersten Station der Geschmacksbahn im Mausgehirn, dem Nucleus tractus solitarii (NTS), mit besonderem Augenmerk auf der Frage nach der Diskriminierung verschiedener Bitterstoffe. Zu diesem Zweck wurde eine neue Untersuchungsmethode für das Geschmackssystem etabliert, die die Nachteile bereits verfügbarer Methoden umgeht und ihre Vorteile kombiniert. Die Arc-catFISH-Methode (cellular compartment analysis of temporal activity by fluorescent in situ hybridization), die die Charakterisierung der Antwort großer Neuronengruppen auf zwei Stimuli erlaubt, wurde zur Untersuchung geschmacksverarbeitender Zellen im NTS angewandt. Im Zuge dieses Projekts wurde erstmals eine stimulusinduzierte Arc-Expression im NTS gezeigt. Die ersten Ergebnisse offenbarten, dass die Arc-Expression im NTS spezifisch nach Stimulation mit Bitterstoffen auftritt und sich die Arc exprimierenden Neurone vornehmlich im gustatorischen Teil des NTS befinden. Dies weist darauf hin, dass Arc-Expression ein Marker für bitterverarbeitende gustatorische Neurone im NTS ist. Nach zweimaliger Stimulation mit Bittersubstanzen konnten überlappende, aber verschiedene Populationen von Neuronen beobachtet werden, die unterschiedlich auf die drei verwendeten Bittersubstanzen Cycloheximid, Chininhydrochlorid und Cucurbitacin I reagierten. Diese Neurone sind vermutlich an der Steuerung von Abwehrreflexen beteiligt und könnten so die Grundlage für divergentes Verhalten gegenüber verschiedenen Bitterstoffen bilden.
Initiation and perpetuation of inflammatory bowel diseases (IBD) may result from an exaggerated mucosal immune response to the luminal microbiota in a susceptible host. We proposed that this may be caused either 1) by an abnormal microbial composition or 2) by weakening of the protective mucus layer due to excessive mucus degradation, which may lead to an easy access of luminal antigens to the host mucosa triggering inflammation. We tested whether the probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 (NCIMB) is capable of reducing chronic gut inflammation by changing the existing gut microbiota composition and aimed to identify mechanisms that are involved in possible beneficial effects of the probiotic. To identify health-promoting mechanisms of the strain, we used interleukin (IL)-10 deficient mice that spontaneously develop gut inflammation and fed these mice a diet containing NCIMB (106 cells g-1) for 3, 8 and 24 weeks, respectively. Control mice were fed an identically composed diet but without the probiotic strain. No clear-cut differences between the animals were observed in pro-inflammatory cytokine gene expression and in intestinal microbiota composition after probiotic supplementation. However, we observed a low abundance of the mucin-degrading bacterium Akkermansia muciniphila in the mice that were fed NCIMB for 8 weeks. These low cell numbers were associated with significantly lower interferon gamma (IFN-γ) and IFN-γ-inducible protein (IP-10) mRNA levels as compared to the NCIMB-treated mice that were killed after 3 and 24 weeks of intervention. In conclusion, NCIMB was not capable of reducing gut inflammation in the IL-10-/- mouse model. To further identify the exact role of A. muciniphila and uncover a possible interaction between this bacterium, NCIMB and the host in relation to inflammation, we performed in vitro studies using HT-29 colon cancer cells. The HT-29 cells were treated with bacterial conditioned media obtained by growing either A. muciniphila (AM-CM) or NCIMB (NCIMB-CM) or both together (COMB-CM) in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) for 2 h at 37 °C followed by bacterial cell removal. HT-29 cells treated with COMB-CM displayed reduced cell viability after 18 h (p<0.01) and no viable cells were detected after 24 h of treatment, in contrast to the other groups or heated COMB-CM. Detection of activated caspase-3 in COMB-CM treated groups indicated that death of the HT-29 cells was brought about by apoptosis. It was concluded that either NCIMB or A. muciniphila produce a soluble and heat-sensitive factor during their concomitant presence that influences cell viability in an in vitro system. We currently hypothesize that this factor is a protein, which has not yet been identified. Based on the potential effect of A. muciniphila on inflammation (in vivo) and cell-viability (in vitro) in the presence of NCIMB, we investigated how the presence of A. muciniphila affects the severity of an intestinal Salmonella enterica Typhimurium (STm)-induced gut inflammation using gnotobiotic C3H mice with a background microbiota of eight bacterial species (SIHUMI, referred to as simplified human intestinal microbiota). Presence of A. muciniphila in STm-infected SIHUMI (SIHUMI-AS) mice caused significantly increased histopathology scores and elevated mRNA levels of IFN-γ, IP-10, tumor necrosis factor alpha (TNF-α), IL-12, IL-17 and IL-6 in cecal and colonic tissue. The number of mucin filled goblet cells was 2- to 3- fold lower in cecal tissue of SIHUMI-AS mice compared to SIHUMI mice associated with STm (SIHUMI-S) or A. muciniphila (SIHUMI-A) or SIHUMI mice. Reduced goblet cell numbers significantly correlated with increased IFN-γ (r2 = -0.86, ***P<0.001) in all infected mice. In addition, loss of cecal mucin sulphation was observed in SIHUMI-AS mice. Concomitant presence of A. muciniphila and STm resulted in a drastic change in microbiota composition of the SIHUMI consortium. The proportion of Bacteroides thetaiotaomicron in SIHUMI, SIHUMI-A and SIHUMI-S mice made up to 80-90% but was completely taken over by STm in SIHUMI-AS mice contributing 94% to total bacteria. These results suggest that A. muciniphila exacerbates STm-induced intestinal inflammation by its ability to disturb host mucus homeostasis. In conclusion, abnormal microbiota composition together with excessive mucus degradation contributes to severe intestinal inflammation in a susceptible host.
Hintergrund: Gestillte Kinder haben im Vergleich zu nicht gestillten Kindern eine geringere Inzidenz von gastrointestinalen Infektionen und atopischen Erkrankungen. Man geht davon aus, dass der gesundheitsfördernde Effekt der Muttermilch teilweise über die intestinale Mikrobiota vermittelt wird. Diese ist in Stillkindern durch eine geringe Diversität und einen hohen Anteil an Bifidobakterien charakterisiert. Neueste Ansätze in der Weiterentwicklung industriell hergestellter Säuglingsnahrung zielen darauf ab, eine intestinale Mikrobiota zu fördern, die der von gestillten Kindern ähnelt. Die Supplementation von Säuglingsnahrung mit Probiotika (lebende Mikroorganismen) oder Präbiotika (unverdauliche Kohlenhydrate, die als Energiesubstrat für probiotische Bakterien dienen) könnte die bifidogene und antipathogene, aber auch immunmodulierende Wirkung der Muttermilch nachahmen. Aufgrund unterschiedlicher Interaktionen mit der Darmmikrobiota und dem Immunsystem fokussiert man mit der gleichzeitigen Gabe von Pro- und Präbiotika (Synbiotika) eine synergistische Wirkung an. Zielstellung und Studiendesign: In einer randomisiert-kontrollierten, klinischen Studie wurde untersucht, ob sich in den ersten drei Lebensmonaten von gesunden und termingerecht geborenen Kindern mit einer Synbiotikum-haltigen Säuglingsnahrung eine intestinale Mikrobiota etabliert, die der von gestillten Kindern gleicht. Das Synbiotikum setzte sich aus Bifidobacterium animalis ssp. lactis CNCM I 3446 (ältere Bezeichnung B. lactis BB-12) und Kuhmilcholigosacchariden zusammen. Die Studie umfasste zwei Gruppen von Kindern, die eine Säuglingsnahrung mit (SYN-Gruppe, n=21) oder ohne Supplement (KON-Gruppe, n=18) erhielten. Gestillte Kinder dienten als Referenz (REF-Gruppe, n=23). Um die Diversität der Bifidobakterien auf Speziesebene umfassend zu charakterisieren, wurden quantitative Real-Time PCR (qPCR)-Verfahren, basierend auf dem single-copy groEL als phylogenetisches Zielgen, zur spezifischen Quantifizierung von zwölf Bifidobakterienspezies in humanen Fäzes entwickelt und validiert. Ergebnisse: Die supplementierte Säuglingsnahrung war gut verträglich und unterstützte eine gesunde Entwicklung; vergleichbare anthropometrische Daten von SYN- und REF-Gruppe. Das Synbiotikum stimulierte selektiv das Wachstum von Laktobazillen und Bifidobakterien. Die Zellzahl für Laktobazillen der SYN-Gruppe war zur REF-Gruppe äquivalent (9,07±0,32 versus 9,90±0,27 log10 Zellen/g Fäzes TM [MW±SEM]; p<0,0019; Äquivalenzdifferenz von 1 log10 Zellen/g Fäzes TM) und höher als in der KON-Gruppe (8,27±0,31 log10 Zellen/g Fäzes TM [MW±SEM]). Die Zellzahl für Bifidobakterien war in der SYN-Gruppe am höchsten (11,54±0,05 versus 11,00±0,17 [REF-Gruppe] und 10,54±0,24 [KON-Gruppe] log10 Zellen/g Fäzes TM [MW±SEM]). In der SYN-Gruppe wurde die höchste Anzahl an Bifidobakterienspezies erfasst (167 mit [128 ohne] B. animalis in 56 Fäzesproben versus 98 und 93 in jeweils 51 Fäzesproben der REF- und KON-Gruppe). Neben Kinder-typischen Spezies wie B. bifidum und B. breve wurden auch Spezies, die für Erwachsene charakteristisch sind (B. adolescentis), häufiger in der SYN-Gruppe als in den Vergleichsgruppen nachgewiesen. Der pH-Wert in Fäzes von Kindern aus der SYN-Gruppe war niedriger als der aus der KON-Gruppe (6,07±0,20 versus 6,45±0,17 [MW±SEM]) und näher an dem von gestillten Kindern mit 5,29±0,12 (MW±SEM). Schlussfolgerung: Die Supplementation einer Säuglingsnahrung mit dem Synbiotikum aus CNCM I-3446 und Kuhmilcholigosacchariden führte zu einer Angleichung in der Zusammensetzung der intestinalen Mikrobiota und des fäkalen pH-Wertes an gestillte Kinder. Die in dieser Arbeit entwickelten groEL-basierten qPCR-Verfahren erlaubten eine spezifische und genaue Analyse der Bifidobakterienpopulation unter dem Einfluss eines Synbiotikums.
Introduction: Intestinal bacteria influence gut morphology by affecting epithelial cell proliferation, development of the lamina propria, villus length and crypt depth [1]. Gut microbiota-derived factors have been proposed to also play a role in the development of a 30 % longer intestine, that is characteristic of PRM/Alf mice compared to other mouse strains [2, 3]. Polyamines and SCFAs produced by gut bacteria are important growth factors, which possibly influence mucosal morphology, in particular villus length and crypt depth and play a role in gut lengthening in the PRM/Alf mouse. However, experimental evidence is lacking. Aim: The objective of this work was to clarify the role of bacterially-produced polyamines on crypt depth, mucosa thickness and epithelial cell proliferation. For this purpose, C3H mice associated with a simplified human microbiota (SIHUMI) were compared with mice colonized with SIHUMI complemented by the polyamine-producing Fusobacterium varium (SIHUMI + Fv). In addition, the microbial impact on gut lengthening in PRM/Alf mice was characterized and the contribution of SCFAs and polyamines to this phenotype was examined. Results: SIHUMI + Fv mice exhibited an up to 1.7 fold higher intestinal polyamine concentration compared to SIHUMI mice, which was mainly due to increased putrescine concentrations. However, no differences were observed in crypt depth, mucosa thickness and epithelial proliferation. In PRM/Alf mice, the intestine of conventional mice was 8.5 % longer compared to germfree mice. In contrast, intestinal lengths of C3H mice were similar, independent of the colonization status. The comparison of PRM/Alf and C3H mice, both associated with SIHUMI + Fv, demonstrated that PRM/Alf mice had a 35.9 % longer intestine than C3H mice. However, intestinal SCFA and polyamine concentrations of PRM/Alf mice were similar or even lower, except N acetylcadaverine, which was 3.1-fold higher in PRM/Alf mice. When germfree PRM/Alf mice were associated with a complex PRM/Alf microbiota, the intestine was one quarter longer compared to PRM/Alf mice colonized with a C3H microbiota. This gut elongation correlated with levels of the polyamine N acetylspermine. Conclusion: The intestinal microbiota is able to influence intestinal length dependent on microbial composition and on the mouse genotype. Although SCFAs do not contribute to gut elongation, an influence of the polyamines N acetylcadaverine and N acetylspermine is conceivable. In addition, the study clearly demonstrated that bacterial putrescine does not influence gut morphology in C3H mice.
The phenolic compounds as food components represent the largest group of secondary metabolites in plant foods. The phenolic compounds, e.g. chlorogenic acid (CQA), are susceptible to oxidation by enzymes specially, polyphenol oxidase (PPO) and at alkaline conditions. Both enzymatic and non-enzymatic oxidations occur in the presence of oxygen and produce quinone, which normally further react with other quinone to produce colored compounds (dimers), as well as is capable of undergoing a nucleophilic addition to proteins. The interactions of proteins with the phenolic compounds have received considerable attention in the recent years where, plant phenolic compounds have drawn increasing attention due to their antioxidant properties and their noticeable effects in the prevention of various oxidative stress associated diseases. Green coffee beans are one of the richest sources of chlorogenic acids. Therefore, a green coffee extract would provide an eligible food relevant source for phenolic compounds for modification of proteins. The interaction between 5-CQA and amino acid lysine showed decrease in both free CQA and amino acid groups and only a slight effect on the antioxidative capacity depending on the reaction time was found. Furthermore, this interaction showed a large number of intermediary substances of low intensities. The reaction of lysine with 5-CQA in a model system initially leads to formation of 3-CQA and 4-CQA (both are isomers of 5-CQA), oxidation giving rise to the formation of a dimer which subsequently forms an adduct with lysine to finally result in a benzacridine derivative as reported and confirmed with the aid of HPLC coupled with ESI-MSn. The benzacridine derivative containing a trihydroxy structural element, was found to be yellow, being very reactive with oxygen yielding semiquinone and quinone type of products with characteristic green colors. Finally, the optimal conditions for this interaction as assessed by both the loss of CQA and free amino groups of lysine can be given at pH 7 and 25°C, the interaction increasing with incubation time and depending also on the amount of tyrosinase present. Green coffee bean has a higher diversity and content of phenolics, where besides the CQA isomers and their esters, other conjugates like feruloylquinic acids were also identified, thus documenting differences in phenolic profiles for the two coffee types (Coffea arabica and Coffea robusta). Coffee proteins are modified by interactions with phenolic compounds during the extraction, where those from C. arabica are more susceptible to these interactions compared to C. robusta, and the polyphenol oxidase activity seems to be a crucial factor for the formation of these addition products. Moreover, In-gel digestion combined with MALDI-TOF-MS revealed that the most reactive and susceptible protein fractions to covalent reactions are the α-chains of the 11S storage protein. Thus, based on these results and those supplied by other research groups, a tentative list of possible adduct structures was derived. The diversity of the different CQA derivatives present in green coffee beans complicates the series of reactions occurring, providing a broad palette of reaction products. These interactions influence the properties of protein, where they exposed changes in the solubility and hydrophobicity of proteins compared to faba bean proteins (as control). Modification of milk whey protein products (primarily b-lactoglobulin) with coffee specific phenolics and commercial CQA under enzymatic and alkaline conditions seems to be affecting their chemical, structural and functional properties, where both modifications led to reduced free amino-,thiol groups and tryptophan content. We propose that the disulfide-thiol exchange in the C-terminus of b-lactoglobulin may be initiated by the redox conditions provided in the presence of CQA. The protein structure b-lactoglobulin thereupon becomes more disordered as simulated by molecular dynamic calculation. This unfolding process may additionally be supported by the reaction of the CQA at the proposed sites of modification of -amino groups of lysine (K77, K91, K138, K47) and the thiol group of cysteine (C121). These covalent modifications also decreased the solubility and hydrophobicity of b-lactoglobulin, moreover they provide modified protein samples with a high antioxidative power, thermally more stable as reflected by a higher Td, require less amount of energy to unfold and when emulsified with lutein esters, exhibit their higher stability against UV light. The MALDI-TOF and SDS-PAGE results revealed that proteins treated at alkaline conditions were more strongly modified than those treated under enzymatic conditions. Finally, the results showed a slight change in emulsifying properties of modified proteins.
Das Selenoprotein Glutathionperoxidase 2 (GPx2) ist ein epithelzellspezifisches, Hydroperoxide-reduzierendes Enzym, welches im Darmepithel, vor allem in den proliferierenden Zellen des Kryptengrundes, exprimiert wird. Die Aufrechterhaltung der GPx2-Expression im Kryptengrund auch bei subadäquatem Selenstatus könnte darauf hinweisen, dass sie hier besonders wichtige Funktionen wahrnimmt. Tatsächlich weisen GPx2 knockout (KO)-Mäuse eine erhöhte Apoptoserate im Kryptengrund auf. Ein Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die physiologische Funktion der GPx2 näher zu untersuchen. In Kryptengrundepithelzellen aus dem Colon selenarmer GPx2 KO-Mäuse wurde eine erhöhte Caspase 3/7-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp (WT) festgestellt. Zudem wiesen diese Zellen eine erhöhte Suszeptibilität für oxidativen Stress auf. Die GPx2 gewährleistet also den Schutz der proliferierenden Zellen des Kryptengrundes auch bei subadäquater Selenversorgung. Des Weiteren wurde im Colon selenarmer (-Se) und -adäquater (+Se) GPx2 KO-Mäuse im Vergleich zum WT eine erhöhte Tumornekrosefaktor α-Expression und eine erhöhte Infiltration von Makrophagen festgestellt. Durch Fütterung einer selensupplementierten Diät (++Se) konnte dies verhindert werden. In GPx2 KO-Mäusen liegt demnach bereits basal eine niedriggradige Entzündung vor. Dies unterstreicht, dass GPx2 vor allem eine wichtige antiinflammatorische Funktion im Darmepithel besitzt. Dem Mikronährstoff Selen werden protektive Funktionen in der Colonkanzerogenese zugeschrieben. In einem Mausmodell der Colitis-assoziierten Colonkanzerogenese wirkte GPx2 antiinflammatorisch und hemmte so die Tumorentstehung. Auf der anderen Seite wurden jedoch auch prokanzerogene Eigenschaften der GPx2 aufgedeckt. Deshalb sollte in dieser Arbeit untersucht werden, welchen Effekt ein GPx2 knockout in einem Modell der sporadischen, durch Azoxymethan (AOM) induzierten, Colonkanzerogenese hat. Im WT kam es in präneoplastischen Läsionen häufig zu einer erhöhten GPx2-Expression im Vergleich zur normalen Darmmucosa. Eine derartige Steigerung der GPx2-Expression wurde auch in der humanen Colonkanzerogenese beschrieben. Das Fehlen der GPx2 resultierte in einer verminderten Entstehung von Tumoren (-Se und ++Se) und präneoplastischen Läsionen (-Se und +Se). Somit förderte GPx2 die Tumorentstehung im AOM-Modell. Acht Stunden nach AOM-Gabe war im GPx2 KO-Colon im Vergleich zum WT eine erhöhte Apoptoserate in der Kryptenmitte (-Se, +Se), nicht jedoch im Kryptengrund oder in der ++Se-Gruppe zu beobachten. Möglicherweise wirkte GPx2 prokanzerogen, indem sie die effiziente Elimination geschädigter Zellen in der Tumorinitiationsphase verhinderte. Eine ähnliche Wirkung wäre auch durch die erhöhte GPx2-Expression in der Promotionsphase denkbar. So könnte GPx2 proliferierende präneoplastische Zellen vor oxidativem Stress, Apoptosen, oder auch der Antitumorimmunität schützen. Dies könnte durch ein Zusammenwirken mit anderen Selenoproteinen wie GPx1 und Thioredoxinreduktasen, für die ebenfalls auch prokanzerogene Funktionen beschrieben wurden, verstärkt werden. Eine wichtige Rolle könnte hier die Modulation des Redoxstatus in Tumorzellen spielen. Die Variation des Selengehalts der Diät hatte im WT einen eher U-förmigen Effekt. So traten in der –Se und ++Se-Gruppe tendenziell mehr und größere Tumore auf, als in der +Se Gruppe. Zusammenfassend schützt GPx2 also die proliferierenden Zellen des Kryptengrundes. Sie könnte jedoch auch proliferierende transformierte Zellen schützen und so die sporadische, AOM-induzierte Colonkanzerogenese fördern. In einem Modell der Colitis-assoziierten Colonkanzerogenese hatte GPx2 auf Grund ihrer antiinflammatorischen Wirkung einen gegenteiligen Effekt und hemmte die Tumorentstehung. Die Rolle der GPx2 in der Colonkanzerogenese ist also abhängig vom zugrunde liegenden Mechanismus und wird maßgeblich von der Beteiligung einer Entzündung bestimmt.
Korrelation zwischen der genetischen und der funktionellen Diversität humaner Bitterrezeptoren
(2013)
Der Mensch besitzt ~25 funktionelle Bitterrezeptoren (TAS2R), die für die Wahrnehmung potenziell toxischer Substanzen in der Nahrung verantwortlich sind. Aufgrund der großen genetischen Variabilität der TAS2R-Gene könnte es eine Vielzahl funktionell unterschiedlicher TAS2R-Haplotypen geben, die zu Unterschieden der Bitterwahrnehmung führen. Dies konnte bereits in funktionellen Analysen und sensorischen Studien für einzelne Bitterrezeptoren gezeigt werden. In dieser Arbeit wurden die häufigsten Haplotypen aller 25 Bitterrezeptoren verschiedener Ethnien funktionell charakterisiert. Das Ziel war eine umfassende Aussage über die funktionelle Diversität der TAS2Rs, die die molekulare Grundlage für individuelle Bitterwahrnehmung bildet, treffen zu können. Fehlende Varianten wurden aus genomischer DNA kloniert oder durch gezielte Mutagenese bereits vorhandener TAS2R-Konstrukte generiert. Die funktionelle Analyse erfolgte mittels Expression der TAS2R-Haplotypen in HEK293TG16gust44 Zellen und anschließenden Calcium-Imaging-Experimenten mit zwei bekannten Agonisten. Die Haplotypen der fünf orphanen TAS2Rs wurden mit über hundert Bitterstoffen stimuliert. Durch die gelungene Deorphanisierung des TAS2R41 in dieser Arbeit, wurden für die 21 aktivierbaren TAS2Rs 36 funktionell-unterschiedliche Haplotypen identifiziert. Die tatsächliche funktionelle Vielfalt blieb jedoch deutlich hinter der genetischen Variabilität der TAS2Rs zurück. Neun Bitterrezeptoren wiesen funktionell homogene Haplotypen auf oder besaßen nur eine weltweit vorherrschende Variante. Funktionell heterogene Haplotypen wurden für zwölf TAS2Rs identifiziert. Inaktive Varianten der Rezeptoren TAS2R9, TAS2R38 und TAS2R46 sollten die Wahrnehmung von Bitterstoffen wie Ofloxacin, Cnicin, Hydrocortison, Limonin, Parthenolid oder Strychnin beeinflussen. Unterschiedlich sensitive Varianten, besonders der Rezeptoren TAS2R47 und TAS2R49, sollten für Agonisten wie Absinthin, Amarogentin oder Cromolyn ebenfalls zu phänotypischen Unterschieden führen. Wie für den TAS2R16 bereits gezeigt, traten Haplotypen des funktionell heterogenen TAS2R7 und TAS2R41 ethnien-spezifisch auf, was auf lokale Anpassung und verschiedene Phänotypen hinweisen könnte. Weiterführend muss nun eine Analyse der funktionell-variablen TAS2Rs in sensorischen Tests erfolgen, um ihre phänotypische Relevanz zu prüfen. Die Analyse der funktionsmodulierenden Aminosäurepositionen, z.Bsp. des TAS2R44, TAS2R47 oder TAS2R49, könnte weiterführend zum besseren Verständnis der Rezeptor-Ligand- und Rezeptor-G-Protein-Interaktion beitragen.
Diet is a major force influencing the intestinal microbiota. This is obvious from drastic changes in microbiota composition after a dietary alteration. Due to the complexity of the commensal microbiota and the high inter-individual variability, little is known about the bacterial response at the cellular level. The objective of this work was to identify mechanisms that enable gut bacteria to adapt to dietary factors. For this purpose, germ-free mice monoassociated with the commensal Escherichia coli K-12 strain MG1655 were fed three different diets over three weeks: a diet rich in starch, a diet rich in non-digestible lactose and a diet rich in casein. Two dimensional gel electrophoresis and electrospray tandem mass spectrometry were applied to identify differentially expressed proteins of E. coli recovered from small intestine and caecum of mice fed the lactose or casein diets in comparison with those of mice fed the starch diet. Selected differentially expressed bacterial proteins were characterised in vitro for their possible roles in bacterial adaptation to the various diets. Proteins belonging to the oxidative stress regulon oxyR such as alkyl hydroperoxide reductase subunit F (AhpF), DNA protection during starvation protein (Dps) and ferric uptake regulatory protein (Fur), which are required for E. coli’s oxidative stress response, were upregulated in E. coli of mice fed the lactose-rich diet. Reporter gene analysis revealed that not only oxidative stress but also carbohydrate-induced osmotic stress led to the OxyR-dependent expression of ahpCF and dps. Moreover, the growth of E. coli mutants lacking the ahpCF or oxyR genes was impaired in the presence of non-digestible sucrose. This indicates that some OxyR-dependent proteins are crucial for the adaptation of E. coli to osmotic stress conditions. In addition, the function of two so far poorly characterised E. coli proteins was analysed: 2 deoxy-D gluconate 3 dehydrogenase (KduD) was upregulated in intestinal E. coli of mice fed the lactose-rich diet and this enzyme and 5 keto 4 deoxyuronate isomerase (KduI) were downregulated on the casein-rich diet. Reporter gene analysis identified galacturonate and glucuronate as inducers of the kduD and kduI gene expression. Moreover, KduI was shown to facilitate the breakdown of these hexuronates, which are normally degraded by uronate isomerase (UxaC), altronate oxidoreductase (UxaB), altronate dehydratase (UxaA), mannonate oxidoreductase (UxuB) and mannonate dehydratase (UxuA), whose expression was repressed by osmotic stress. The growth of kduID-deficient E. coli on galacturonate or glucuronate was impaired in the presence of osmotic stress, suggesting KduI and KduD to compensate for the function of the regular hexuronate degrading enzymes under such conditions. This indicates a novel function of KduI and KduD in E. coli’s hexuronate metabolism. Promotion of the intracellular formation of hexuronates by lactose connects these in vitro observations with the induction of KduD on the lactose-rich diet. Taken together, this study demonstrates the crucial influence of osmotic stress on the gene expression of E. coli enzymes involved in stress response and metabolic processes. Therefore, the adaptation to diet-induced osmotic stress is a possible key factor for bacterial colonisation of the intestinal environment.
Enterolignans (enterodiol and enterolactone) exhibit structural similarity to estradiol and have therefore been hypothesized to modulate hormone related cancers such as breast cancer. The bioactivation of the plant lignan secoisolariciresinol diglucoside (SDG) requires the transformation by intestinal bacteria including the deglycosylation of SDG to secoisolariciresinol (SECO) followed by demethylation and dehydroxylation of SECO to enterodiol (ED). Finally, ED is dehydrogenated to enterolactone (EL). It is unclear whether the bacterial activation of SDG to ED and EL is crucial for the cancer preventing effects of dietary lignans. The possible protective effect of bacterial lignan transformation on a 7,12 dimethylbenz(a)anthracene (DMBA)-induced breast cancer in gnotobiotic rats was investigated. Germ-free rats were associated with a defined lignan-converting consortium (Clostridium saccharogumia, Blautia producta, Eggerthella lenta, and Lactonifactor longoviformis). The rats colonized with lignan-converting bacteria consortium (LCC) were fed a lignan-rich flaxseed diet and breast cancer was chemical induced. Identically treated germ-free rats served as control. All bacteria of the consortium successfully colonized the intestine of the LCC rats. The plant lignan SDG was converted into the enterolignans ED and EL in the LCC rats but not in the germ-free rats. This transformation did not influence cancer incidence but significantly decreased tumor numbers per tumor-bearing rat, and tumor size. Cell proliferation was significantly inhibited and apoptosis was significantly induced in LCC rats. No differences between LCC and control rats were observed in the expression of the genes encoding the estrogen receptors (ERα and ERβ) and G-coupled protein receptor 30 (GPR30). Similar findings were observed for both insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and epidermal growth factor receptor (EGFR) genes involved in tumor growth. Proteome analysis revealed that 24 proteins were differentially expressed in tumor tissue from LCC and germ-free. RanBP-type and C3HC4-type zinc finger-containing protein 1 (RBCK1) and poly(rC)-binding protein 1 (PBCP1) were down-regulated by 3.2- and 2.0-fold, respectively. These proteins are associated with cell proliferation. The activity of selected enzymes involved in the degradation of oxidants in plasma and liver was significantly increased in the LCC rats. However, plasma and liver concentrations of reduced glutathione (non-enzymatic antioxidant) and malondialdehyde (oxidative stress marker) did not differ between the groups. In conclusion, the bacterial conversion of plant lignan to enterolignans beneficially influences their anti-cancer effect. However, the mechanisms involved in these effects remain elusive.
Die Restenose stellt ein zentrales Problem der interventionellen Kardiologie dar und ist häufigste Komplikation nach perkutanen Angioplastieverfahren. Hauptursache dieser Wiederverengung des Gefäßes ist die Bildung einer Neointima durch die Proliferation transdifferenzierter vaskulärer glatter Muskelzellen und die Sekretion extrazellulärer Matrix. Die Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und die Entzündungsreaktion nach der Gefäßverletzung werden als frühe, die Neointimabildung induzierende Prozesse diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mehrere Projekte bearbeitet, die Aufschluss über die während der Neointimabildung statt findenden Prozesse geben sollen. Mit Hilfe eines Verletzungsmodells der murinen Femoralarterie wurde der Einfluss der Entzündung und der ROS-Bildung auf die Neointimabildung in der Maus untersucht. Die Behandlung mit dem mitochondrialen Superoxiddismutase-Mimetikum MitoTEMPO verminderte die Bildung der Neointima besser, als die Behandlung mit dem globalen ROS-Fänger N-Acetylcystein. Die stärkste Hemmung der Neointimabildung wurde jedoch durch die Immunsuppression mit Rapamycin erreicht. Interferon-γ (INFγ) ist ein wichtiges Zytokin der Th1-Immunantwort, das in Folge der Gefäßverletzung freigesetzt wird und die proinflammatorischen Chemokine CXCL9 (MIG, Monokine Induced by INF), CXCL10 (IP-10, INF inducible Protein of 10 kDa) und CXCL11 (I-TAC, Interferon inducible T cell-Chemoattractant) induziert. CXCL9, CXCL10 und CXCL11 sind Liganden des CXC-Chemokinrezeptors 3 (CXCR3) und locken chemotaktisch CXCR3 positive Entzündungszellen zum Ort der Gefäßverletzung. Daher wurde die spezielle Bedeutung des Chemokins CXCL10 in der Restenose untersucht. Dazu wurden CXCL10-defiziente Mäuse dem Femoralisverletzungsmodell unterzogen und die Gefäße nach 14 Tagen morphometrisch und immunhistologisch untersucht. CXCL10-Defizienz führte in Mäusen zu einer verminderten Neointimabildung, die mit einer verringerten Inflammation, Apoptose und Proliferation im verletzten Gefäß korrelierte. Neben der Inflammation beeinflusst aber auch die Reendothelialisierung der verletzten Gefäßwand die Restenose. Interessanterweise war im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen in den CXCL10-Knockout-Mäusen auch die Reendothelialisierung erheblich verbessert. Offensichtlich ist das CXCR3-Chemokinsystem also in völlig unterschiedliche biologische Prozesse involviert und beeinflusst nicht nur die Bildung der Neoimtima durch die Förderung der Entzündung, sondern auch die Unterdrückung der Reendothelialisierung der verletzten Gefäßwand. Tatsächlich wird der CXCR3 nicht nur auf Entzündungszellen, sondern auch auf Endothelzellen exprimiert. Zur separaten Untersuchung der Rolle des CXCR3 in der Inflammation und der Reendothelialisierung wurde im Rahmen dieser Arbeit damit begonnen konditionelle CXCR3-Knockout-Mäuse zu generieren, in denen der CXCR3 entweder in Entzündungszellen oder in Endothelzellen ausgeschaltet ist. Zum besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, mit denen der CXCR3 seine Funktionen vermittelt, wurde zudem untersucht ob dieser mit anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) interagiert. Die Analyse von Coimmunpräzipitaten deutet auf eine Homodimerisierung der beiden CXCR3 Splicevarianten CXCR3A und CXCR3B, sowie auf die Heterodimerbildung von CXCR3A und CXCR3B mit sich, sowie jeweils mit CCR2, CCR3, CCR5 und den Opioidrezeptoren MOR und KOR hin. Die getestete Methode des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) erwies sich jedoch als ungeeignet zur Untersuchung von CXCR3, da dieser in HEK293T-Zellen nicht korrekt transient exprimiert wurde. Insgesamt deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass das CXCR3-Chemokinsystem eine zentrale Rolle in unterschiedlichen, die Neointimabildung beeinflussenden Prozessen spielt. Damit könnten der CXCR3 und insbesondere das Chemokin CXCL10 interessante Zielmoleküle in der Entwicklung neuer verbesserter Therapien zur Verhinderung der Restenose darstellen.
Die Bittergeschmacksrezeptoren stellen in der Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine besondere Gruppe dar. Im Menschen können die 25 Rezeptoren eine große Anzahl unterschiedlichster Bittergeschmacksstoffe detektieren. Diese Substanzen können sowohl schädlich, wie etwa Strychnin, als auch der Gesundheit förderliche Arzneistoffe, wie etwa Chloramphenicol sein. Unter den Bittergeschmacksrezeptoren des Menschen gibt es eine Gruppe von drei Rezeptoren, die besonders viele Bitterstoffe detektieren können. Einer von ihnen ist der Rezeptor hTAS2R10. In dieser Arbeit konnte sowohl experimentell als auch durch computergestützte Modellierung gezeigt werden, dass der hTAS2R10 nur eine Bindungstasche besitzt. Das stimmt mit den bisher ausführlich experimentell und in silico untersuchten Rezeptoren hTAS2R1, -R16, -R38 und -R46 überein. Die für die Agonisteninteraktionen nachweislich wichtigen Transmembrandomänen sind in den bisher untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren, wie auch im hTAS2R10, die Transmembrandomänen 3, 5, 6 und 7. Die Untersuchungen zeigten, dass die Bindungstasche des hTAS2R10 in der oberen Hälfte des zum extrazellulären Raum gerichteten Bereichs lokalisiert ist. Insbesondere konnte für die untersuchten Agonisten Strychnin, Parthenolid und Denatoniumbenzoat gezeigt werden, dass die Seitenketten der Aminosäuren in Position 3.29 und 5.40 ausgeprägte agonistenselektive Wechselwirkungen eingehen. Weitere Untersuchungen haben ergeben, dass das weitgefächerte Agonistenspektrum des hTAS2R10 zu Lasten der Sensitivität für einzelne Bitterstoffe geht. Der Vergleich wichtiger Positionen im hTAS2R10, hTAS2R46 und mTas2r105 hat deutlich gemacht, dass sich die Bindungsmodi zwischen diesen Rezeptoren unterscheiden. Dies deutet auf eine getrennte evolutionäre Entwicklung der Bindungseigenschaften dieser Rezeptoren hin. Gleichfalls zeigten die Untersuchungen, dass einige Positionen wie z.B. 7.39 die Funktion aller untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren prägen, sich jedoch die genaue Bedeutung im jeweiligen Rezeptor unterscheiden kann. Einzelne dieser Positionen konnten auch bei der Agonisteninteraktion des Rhodopsins und des β2-adrenergen Rezeptors beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit helfen dabei die Wechselwirkungen zwischen Bitterstoffen und den Bittergeschmacksrezeptoren zu verstehen und geben erste Einblicke in die Entwicklung der Rezeptoren in Hinblick auf ihren Funktionsmechanismus. Diese Erkenntnisse können genutzt werden, um Inhibitoren zu entwickeln, die sowohl ein wichtiges Werkzeug in der Rezeptoranalytik wären, als auch dazu genutzt werden könnten, den unerwünschten bitteren Geschmack von Medikamenten oder gesundheitsfördernden sekundären Pflanzenstoffen zu mindern. Damit könnte ein Beitrag zur Gesundheit der Menschen geleistet werden.
Salty taste has evolved to maintain electrolyte homeostasis, serving as a detector for salt containing food. In rodents, salty taste involves at least two transduction mechanisms. One is sensitive to the drug amiloride and specific for Na+, involving epithelial sodium channel (ENaC). A second rodent transduction pathway, which is triggered by various cations, is amiloride insensitive and not almost understood to date. Studies in primates showed amiloride-sensitive as well as amiloride-insensitive gustatory responses to NaCl, implying a role of both salt taste transduction pathways in humans. However, sensory studies in humans point to largely amiloride-insensitive sodium taste perception. An involvement of ENaC in human sodium taste perception was not shown, so far. In this study, ENaC subunit protein and mRNA could be localized to human taste bud cells (TBC). Thus, basolateral αβγ-ENaC ion channels are likely in TBC of circumvallate papillae, possibly mediating basolateral sodium entry. Similarly, basolateral βγ-ENaC might play a role in fungiform TBC. Strikingly, δ-ENaC subunit was confined to taste bud pores of both papillae, likely mediating gustatory sodium entry in TBC, either apical or paracellular via tight junctions. However, regional separation of δ-ENaC and βγ-ENaC in fungiform and circumvallate TBC indicate the presence of unknown interaction partner necessary to assemble into functional ion channels. However, screening of a macaque taste tissue cDNA library did neither reveal polypeptides assembling into a functional cation channel by interaction with δ-ENaC or βγ-ENaC nor ENaC independent salt taste receptor candidates. Thus, ENaC subunits are likely involved in human taste transduction, while exact composition and identity of an amiloride (in)sensitive salt taste receptors remain unclear. Localization of δ-ENaC in human taste pores strongly suggests a role in human taste transduction. In contrast, δ-ENaC is classified as pseudogene Scnn1d in mouse. However, no experimental detected sequences are annotated, while evidences for parts of Scnn1d derived mRNAs exist. In order to elucidate if Scnn1d is possibly involved in rodent salt taste perception, Scnn1d was evaluated in this study to clarify if Scnn1d is a gene or a transcribed pseudogene in mice. Comparative mapping of human SCNN1D to mouse chromosome 4 revealed complete Scnn1d sequence as well as its pseudogenization by Mus specific endogenous retroviruses. Moreover, tissue specific transcription of unitary Scnn1d pseudogene was found in mouse vallate papillae, kidney and testis and led to identification of nine Scnn1d transcripts. In vitro translation experiments showed that Scnn1d transcripts are coding competent for short polypeptides, possibly present in vivo. However, no sodium channel like function or sodium channel modulating activity was evident for Scnn1d transcripts and/or derived polypeptides. Thus, an involvement of mouse δ-ENaC in sodium taste transduction is unlikely and points to species specific differences in salt taste transduction mechanisms.
Die Wahrnehmung von Geschmacksempfindungen beruht auf dem Zusammenspiel verschiedener Sinneseindrücke wie Schmecken, Riechen und Tasten. Diese Komplexität der gustatorischen Wahrnehmung erschwert die Beantwortung der Frage wie Geschmacksinformationen vom Mund ins Gehirn weitergeleitet, prozessiert und kodiert werden. Die Analysen zur neuronalen Prozessierung von Geschmacksinformationen erfolgten zumeist mit Bitterstimuli am Mausmodell. Zwar ist bekannt, dass das Genom der Maus für 35 funktionelle Bitterrezeptoren kodiert, jedoch war nur für zwei unter ihnen ein Ligand ermittelt worden. Um eine bessere Grundlage für tierexperimentelle Arbeiten zu schaffen, wurden 16 der 35 Bitterrezeptoren der Maus heterolog in HEK293T-Zellen exprimiert und in Calcium-Imaging-Experimenten funktionell charakterisiert. Die Daten belegen, dass das Funktionsspektrum der Bitterrezeptoren der Maus im Vergleich zum Menschen enger ist und widerlegen damit die Aussage, dass humane und murine orthologe Rezeptoren durch das gleiche Ligandenspektrum angesprochen werden. Die Interpretation von tierexperimentellen Daten und die Übertragbarkeit auf den Menschen werden folglich nicht nur durch die Komplexität des Geschmacks, sondern auch durch Speziesunterschiede verkompliziert. Die Komplexität des Geschmacks beruht u. a. auf der Tatsache, dass Geschmacksstoffe selten isoliert auftreten und daher eine Vielzahl an Informationen kodiert werden muss. Um solche geschmacksstoffassoziierten Stimuli in der Analyse der gustatorischen Kommunikationsbahnen auszuschließen, sollten Opsine, die durch Licht spezifischer Wellenlänge angeregt werden können, für die selektive Ersetzung von Geschmacksrezeptoren genutzt werden. Um die Funktionalität dieser angestrebten Knockout-Knockin-Modelle zu evaluieren, die eine Kopplung von Opsinen mit dem geschmacksspezifischen G-Protein Gustducin voraussetzte, wurden Oozyten vom Krallenfrosch Xenopus laevis mit dem Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Verfahren hinsichtlich dieser Interaktion analysiert. Der positiven Bewertung dieser Kopplung folgte die Erzeugung von drei Mauslinien, die in der kodierenden Region eines spezifischen Geschmacksrezeptors (Tas1r1, Tas1r2, Tas2r114) Photorezeptoren exprimierten. Durch RT-PCR-, In-situ-Hybridisierungs- und immunhistochemische Experimente konnte der erfolgreiche Knockout der Rezeptorgene und der Knockin der Opsine belegt werden. Der Nachweis der Funktionalität der Opsine im gustatorischen System wird Gegenstand zukünftiger Analysen sein. Bei erfolgreichem Beleg der Lichtempfindlichkeit von Geschmacksrezeptorzellen dieser Mausmodelle wäre ein System geschaffen, dass es ermöglichen würde, gustatorische neuronale Netzwerke und Hirnareale zu identifizieren, die auf einen reinen geschmacks- und qualitätsspezifischen Stimulus zurückzuführen wären.
Ghrelin is a unique hunger-inducing stomach-borne hormone. It activates orexigenic circuits in the central nervous system (CNS) when acylated with a fatty acid residue by the Ghrelin O-acyltransferase (GOAT). Soon after the discovery of ghrelin a theoretical model emerged which suggests that the gastric peptide ghrelin is the first “meal initiation molecule
Darmkrebs ist die zweithäufigste malignombedingte Todesursache in den westlichen Industrieländern. Durch eine frühzeitige Diagnose besteht jedoch eine hohe Chance auf Heilung. Der Goldstandard zur Darmkrebsfrüherkennung ist gegenwärtig die Koloskopie. Eine Darmspiegelung ist jedoch invasiv und mit Unannehmlichkeiten für den Patienten verbunden. Die Akzeptanz in der Bevölkerung ist daher gering. Ziel des BMBF- Projektes „Entwicklung eines nichtinvasiven Nachweissystems zur Früherkennung von humanem Darmkrebs“, in dessen Rahmen diese Arbeit entstand, ist die Bereitstellung eines nichtinvasiven Nachweisverfahrens zur Darmkrebsfrüherkennung. Der Nachweis soll über die Detektion von aus neoplastischen Zellen stammender DNA in Stuhl erfolgen. Die Entartung dieser Zellen beruht auf Veränderungen im Erbgut, welches unter anderem Mutationen sind. Im ersten Teil des BMBF-Projektes wurde ein Set von Mutationen zusammengestellt, welches eine hohe Sensitivität für Vorstufen von Darmkrebs aufweist. Ziel dieser Arbeit war es, eine Nachweismethode für die zuvor identifizierten Punktmutationen zu entwickeln. Das Nachweisverfahren musste dabei unempfindlich gegen einen hohen Hintergrund nichtmutierter DNA sein, da im Stuhl geringe Mengen DNA aus neoplastischen Zellen bei einem hohen Hintergrund von DNA aus gesunden Zellen vorliegen. Hierzu wurden Plasmidmodellsysteme für die aus dem Marker-Set stammenden Genfragmente BRAF und dessen Mutante V600E, CTNNB1 und T41I, T41A, S45P und K-ras G12C hergestellt. Mit Hilfe dieser Plasmidmodellsysteme wurde dann das Nachweissystem entwickelt. Der entscheidende Schritt für die Detektion von Punktmutationen bei hohem Wildtypüberschuss ist eine vorhergehende Anreicherung. In der vorliegenden Arbeit wurde dazu die Methode der LNA-clamp-PCR (locked nucleic acid) etabliert. Die Bewertung der erzielten Anreicherung erfolgte über das relative Detektionslimit. Zur Bestimmung des Detektionslimits wurde die Schmelzkurvenanalyse von Hybridisierungssonden eingesetzt; diese wurde im Rahmen dieser Arbeit für die drei oben genannten Genfragmente und ihre Mutanten entwickelt. Die LNA-clamp-PCR wird in Anwesenheit eines LNA-Blockers durchgeführt. Das Nukleotidanalogon LNA weist im Vergleich zu DNA eine erhöhte Affinität zu komplementären DNA-Strängen auf. Gleichzeitig kommt es bei Anwesenheit einer Basenfehlpaarung zu einer größeren Destabilisierung der Bindung. Als Blocker werden kurze LNA-DNA-Hybridoligonukleotide eingesetzt, die den mutierten Sequenzbereich überspannen und selbst der Wildtypsequenz entsprechen. Durch Bindung an die Wildtypsequenz wird deren Amplifikation während der PCR verhindert (clamp = arretieren, festklemmen). Der Blocker selbst wird dabei nicht verlängert. Der Blocker bindet unter optimalen Bedingungen jedoch nicht an die mutierte Sequenz. Die Mutante wird daher ungehindert amplifiziert und somit gegenüber dem Wildtyp-Fragment angereichert. Die Position des Blockers kann im Bindungsbereich eines der Primer sein und hier dessen Hybridisierung an dem Wildtyp-Fragment verhindern oder zwischen den beiden Primern liegen und so die Synthese durch die Polymerase inhibieren. Die Anwendbarkeit beider Systeme wurde in dieser Arbeit gezeigt. Die LNA-clamp-PCR mit Primerblocker wurde für BRAF etabliert. Es wurde ein Detektionslimit von mindestens 1:100 erzielt. Die LNA-clamp-PCR mit Amplifikationsblocker wurde erfolgreich für BRAF, K-ras und CTNNB1: T41I, T41A mit einem Detektionslimit von 1:1000 bis 1:10 000 entwickelt. In Stuhlproben liegt DNA aus neoplastischen Zellen nach Literaturangaben zu einem Anteil von 1% bis 0,1% vor. Die LNA-clamp-PCR weist also mit Amplifikationsblockern ein ausreichend hohes Detektionslimit für die Analyse von Stuhlproben auf. Durch die erfolgreiche Etablierung der Methode auf drei verschiedenen Genfragmenten und vier unterschiedlichen Punktmutationen konnte deren universelle Einsetzbarkeit gezeigt werden. Für die Ausweitung der LNA-clamp-PCR auf die übrigen Mutationen des Marker-Sets wurden Richtlinien ausgearbeitet und die Blockereffizienz als Kennzahl eingeführt. Die LNA-clamp-PCR ist ein schnelles, kostengünstiges Verfahren, welches einen geringen Arbeitsaufwand erfordert und wenig fehleranfällig ist. Sie ist somit ein geeignetes Anreicherungsverfahren für Punktmutationen in einem diagnostischen System zur Darmkrebsfrüherkennung. Darüber hinaus kann die LNA-clamp-PCR auch in anderen Bereichen, in denen die Detektion von Punktmutationen in einem hohen Wildtyphintergrund erforderlich ist, eingesetzt werden.
Das ITC SFN und der Mikronährstoff Se sind bekannt als chemopräventive Inhaltsstoffe von Gemüse der Brassica-Familie, welcher auch Brokkoli angehört. Die Wirkungen von sowohl SFN als auch Se beruhen auf zahlreichen verschiedenen Mechanismen. Es existieren jedoch Schnittstellen, an welchen Interaktionen beider Substanzen möglich sind. Basierend auf diesem Wissen wurden in dieser Arbeit Wechselwirkungen zwischen SFN und Se auf die Aktivität sowie Expression von Phase II Enzymen und Selenoproteinen untersucht. Der Einfluss der Kombination von SFN und Se auf die unter physiologischen Bedingungen stattfindende Proliferation und Apoptose war ebenso Gegenstand der Arbeit wie die Modulation von Entzündungsprozessen sowie der Tumorentstehung während der entzündungsverstärkten Colonkanzerogenese im Mausmodell. Das hinsichtlich seiner Wirksamkeit mit aus GRA hydrolysiertem SFN zunächst als vergleichbar befundene synthetische SFN wurde für die Untersuchung im AOM/DSS-induzierten Colontumormodell gewählt und in Kombination mit 3 verschiedenen Selendiäten verabreicht. Der Einfluss von SFN und Se auf Phase II Enzyme und Selenoproteine entlang des GIT war organabhängig und nach 4 Wochen geringer als nach 7 Tagen. Die schwächere Induktion deutet auf eine Anpassung des Organismus hin. Ein SFN-vermittelter Effekt auf NQO1 war im Selenmangel am deutlichsten. Die Aktivität des Selenoproteins TrxR wurde hingegen erst bei ausreichender Selenversorgung durch SFN beeinflusst. Die als Nrf2-Zielgen bekannte und in der Hierarchie der Selenoproteine einen hohen Rang einnehmende GPx2 konnte in bestimmten Organen bereits unter selenarmen Bedingungen durch SFN induziert werden. Eine Überexpression des Enzyms war jedoch nicht möglich. SFN steigerte, unabhängig vom Selenstatus, im oberen Abschnitt des GIT und im Colon die Aktivität der GST. Eine Induktion des eigenen Metabolismus wäre somit denkbar. Im Falle eines Mangels an GPx2 wurde GPx1 bei hinreichender Selenversorgung stärker exprimiert, allerdings konnte sie die Funktion von GPx2 nicht völlig erset-zen. Im Selenmangel kann die Aktivitätssteigerung der TrxR im Dünndarm, dem Ab-schnitt der Selenabsorption, als ein Versuch der GPx2-Kompensation angesehen werden. SFN war nicht in der Lage, über eine Aktivierung des Nrf2/ARE-Signalweges kompensatorische Effekte zu induzieren. Apoptotische Prozesse wurden unter physiologischen Bedingungen nur marginal durch SFN und Se moduliert. Das elektrophile ITC konnte lediglich im Selenmangel Apoptose im luminalen Bereich der Colonkrypten induzieren. Die durch supranutritive Selenkonzentration induzierte Apoptose im Kryptengrund wurde nicht durch SFN beeinflusst. Einer bei Abwesenheit der GPx2 erhöhten Apoptoserate im Kryptengrund wirkte SFN bei adäquater Selenversorgung entgegen, war indessen proapoptotisch unter selendefizienten Konditionen. Der Einfluss von SFN auf die Entzündung war deutlich abhängig vom Selenstatus. Während SFN im Selenmangel anscheinend prooxidative Prozesse induzierte und die Entzündungssymptome verschlimmerte, wirkte es unter adäquatem Selenstatus an-tiinflammatorisch. Den vergleichsweise milden Grad der Entzündung im selensupplementierten Status konnte SFN nicht zusätzlich beeinflussen. SFN veränderte die Inzi-denz colorektaler Tumore nicht. Ein, die Tumorinitiation blockierender SFN-Effekt durch direkte Hemmung der metabolischen Aktivierung des Prokanzerogens im selenadäquaten Zustand scheint offensichtlich. Eine Überversorgung mit Se kann protektiv im Hinblick auf Entzündung oder Colonkanzerogenese sein, jedoch bewirkt SFN keinen zusätzlichen Schutz. Kombinationseffekte von SFN und Se in Bezug auf Phase II Enzyme, Selenoproteine und Apoptose sowie die entzündungsverstärkte Colonkanzerogenese sind nicht eindeutiger Natur und können, abhängig vom Endpunkt, synergistische oder antagonistische Züge aufweisen. Eine bei Selendefizienz deutlichere Wirkung von SFN kann mit Hilfe der gesteigerten Aktivierung von Nrf2 erklärt werden, dies muss jedoch nicht von Vorteil sein. Bei adäquater Selenversorgung kann SFN kurzfristig antiinflammatorische und antikanzerogene Prozesse induzieren. Von einer längerfristigen ständigen SFN-Aufnahme in Form von GRA-reichen Brassicacea ist jedoch abzuraten, da von einer Adaptation auszugehen ist. Die Wirkung von SFN innerhalb der komplexen Pflanzenmatrix bleibt Gegenstand zukünftiger Untersuchungen.
Die adipositasbedingte Insulinresistenz geht mit einer unterschwelligen Entzündungsreaktion einher. Als Antwort auf dieses Entzündungsgeschehen wird PGE2 unter anderem von Kupffer Zellen der Leber freigesetzt und kann seine Wirkung über vier PGE2-Rezeptorsubtypen (EP1-EP4) vermitteln. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass PGE2 in Rattenhepatozyten über den EP3 R ERK1/2-abhängig die intrazelluläre Weiterleitung des Insulinsignals hemmt. Über die Modulation der Insulinrezeptorsignalkette durch andere EP-Rezeptoren war bisher nichts bekannt. Daher sollte in stabil transfizierten Zelllinien, die jeweils nur einen der vier EP-Rezeptorsubtypen exprimierten, der Einfluss von PGE2 auf die Insulinrezeptorsignalkette untersucht werden. Es wurden HepG2-Zellen, die keinen funktionalen EP-Rezeptor aufwiesen, sowie HepG2-Zellen, die stabil den EP1-R (HepG2-EP1), den EP3β-R (HepG2 EP3β) oder den EP4-R (HepG2 EP4) exprimierten, sowie die humane fötale Hepatozytenzelllinie, Fh hTert, die den EP2- und den EP4-R exprimierte, für die Untersuchungen verwendet. Die Zellen wurden für 330 min mit PGE2 (10 µM) vorinkubiert, um die pathophysiologische Situation nachzustellen und anschließend mit Insulin (10 nM) für 15 min stimuliert. Die insulinabhängige Akt- und ERK1/2-Phosphorylierung wurde im Western-Blot bestimmt. In allen Hepatomzelllinien die EP-R exprimierten, nicht aber in der Zelllinie, die keinen EP R exprimierte, hemmte PGE2 die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung. In allen drei stabil transfizierten Zelllinien, nicht jedoch in den Fh-hTert-Zellen, steigerte PGE2 die basale und insulinstimulierte Phosphorylierung der Serin/Threoninkinase ERK1/2. In den HepG2 EP1- und den HepG2-EP3β-Zellen steigerte PGE2 mutmaßlich über die ERK1/2-Aktivierung die Serinphosphorylierung des IRS, welche die Weiterleitung des Insulinsignals blockiert. Die Hemmung der Aktivierung von ERK1/2 hob in EP3 R-exprimierenden Zellen die Abschwächung der Insulinsignalübertragung teilweise auf. In diesen Zellen scheint die ERK1/2-Aktivierung die größte Bedeutung für die Hemmung der insulinstimulierten Akt-Phosphorylierung zu haben. Da durch die Hemmstoffe die PGE2-abhängige Modulation nicht vollständig aufgehoben wurde, scheinen darüber hinaus aber noch andere Mechanismen zur Modulation beizutragen. In den Fh hTert-Zellen wurde die Insulinrezeptorsignalkette offensichtlich über einen ERK1/2-unabhängigen, bisher nicht identifizierten Weg unterbrochen. Eine gesteigerte PGE2-Bildung im Rahmen der Adipositas ist nicht auf die peripheren Gewebe beschränkt. Auch im Hypothalamus können bei Adipositas Zeichen einer Entzündung nachgewiesen werden, die mit einer gesteigerten PGE2-Bildung einhergehen. Daher wurde das EP R-Profil von primären hypothalamischen Neuronen und neuronalen Modellzelllinien charakterisiert, um zu prüfen, ob PGE2 in hypothalamischen Neuronen die Insulinsignalkette in ähnlicher Weise unterbricht wie in Hepatozyten. In allen neuronalen Zellen hemmte die Vorinkubation mit PGE2 die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung nicht. In der neuronalen hypothalamischen Zelllinie N 41 wirkte PGE2 eher synergistisch mit Insulin. In durch Retinsäure ausdifferenzierten SH SY5Y-Zellen waren die Ergebnisse allerdings widersprüchlich. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Expression der EP Rezeptoren im Verlauf der Kultur stark schwankte und somit die EP R-Ausstattung der Zellen zwischen den Zellversuchen variierte. Auch in den primären hypothalamischen Neuronen variierte die EP R-Expression abhängig vom Differenzierungszustand und PGE2 beeinflusste die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung nicht. Obwohl in allen neuronalen Zellen die Akt-Phosphorylierung durch Insulin gesteigert wurde, konnte in keiner der Zellen eine insulinabhängige Regulation der Expression von Insulinzielgenen (POMC und AgRP) nachgewiesen werden. Das liegt wahrscheinlich an dem niedrigen Differenzierungsgrad der untersuchten Zellen. Im Rahmen der Adipositas kommt es zu einer Überaktivierung des Endocannabinoidsystems. Endocannabinoidrezeptoren sind mit den EP Rezeptoren verwandt. Daher wurde geprüft, ob Endocannabinoide die Insulinsignalweiterleitung in ähnlicher Weise beeinflussen können wie PGE2. Die Vorinkubation der N 41-Zellen für 330 min mit einem Endocannabinoidrezeptoragonisten steigerte die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung, was auf einen insulinsensitiven Effekt von Endocannabinoiden hindeutet. Dies steht im Widerspruch zu der in der Literatur beschriebenen endocannabinoidabhängigen Insulinresistenz, die aber auf indirekte, durch Endocannabinoide ausgelöste Veränderungen zurückzuführen sein könnte.
The widespread usage of products containing volatile organic compounds (VOC) has lead to a general human exposure to these chemicals in work places or homes being suspected to contribute to the growing incidence of environmental diseases. Since the causal molecular mechanisms for the development of these disorders are not completely understood, the overall objective of this thesis was to investigate VOC-mediated molecular effects on human lung cells in vitro at VOC concentrations comparable to exposure scenarios below current occupational limits. Although differential expression of single proteins in response to VOCs has been reported, effects on complex protein networks (proteome) have not been investigated. However, this information is indispensable when trying to ascertain a mechanism for VOC action on the cellular level and establishing preventive strategies. For this study, the alveolar epithelial cell line A549 has been used. This cell line, cultured in a two-phase (air/liquid) model allows the most direct exposure and had been successfully applied for the analysis of inflammatory effects in response to VOCs. Mass spectrometric identification of 266 protein spots provided the first proteomic map of A549 cell line to this extent that may foster future work with this frequently used cellular model. The distribution of three typical air contaminants, monochlorobenzene (CB), styrene and 1,2 dichlorobenzene (1,2-DCB), between gas and liquid phase of the exposure model has been analyzed by gas chromatography. The obtained VOC partitioning was in agreement with available literature data. Subsequently the adapted in vitro system has been successfully employed to characterize the effects of the aromatic compound styrene on the proteome of A549 cells (Chapter 4). Initially, the cell toxicity has been assessed in order to ensure that most of the concentrations used in the following proteomic approach were not cytotoxic. Significant changes in abundance and phosphorylation in the total soluble protein fraction of A549 cells have been detected following styrene exposure. All proteins have been identified using mass spectrometry and the main cellular functions have been assigned. Validation experiments on protein and transcript level confirmed the results of the 2-DE experiments. From the results, two main cellular pathways have been identified that were induced by styrene: the cellular oxidative stress response combined with moderate pro-apoptotic signaling. Measurement of cellular reactive oxygen species (ROS) as well as the styrene-mediated induction of oxidative stress marker proteins confirmed the hypothesis of oxidative stress as the main molecular response mechanism. Finally, adducts of cellular proteins with the reactive styrene metabolite styrene 7,8 oxide (SO) have been identified. Especially the SO-adducts observed at both the reactive centers of thioredoxin reductase 1, which is a key element in the control of the cellular redox state, may be involved in styrene-induced ROS formation and apoptosis. A similar proteomic approach has been carried out with the halobenzenes CB and 1,2-DCB (Chapter 5). In accordance with previous findings, cell toxicity assessment showed enhanced toxicity compared to the one caused by styrene. Significant changes in abundance and phosphorylation of total soluble proteins of A549 cells have been detected following exposure to subtoxic concentrations of CB and 1,2-DCB. All proteins have been identified using mass spectrometry and the main cellular functions have been assigned. As for the styrene experiment, the results indicated two main pathways to be affected in the presence of chlorinated benzenes, cell death signaling and oxidative stress response. The strong induction of pro-apoptotic signaling has been confirmed for both treatments by detection of the cleavage of caspase 3. Likewise, the induction of redox-sensitive protein species could be correlated to an increased cellular level of ROS observed following CB treatment. Finally, common mechanisms in the cellular response to aromatic VOCs have been investigated (Chapter 6). A similar number (4.6-6.9%) of all quantified protein spots showed differential expression (p<0.05) following cell exposure to styrene, CB or 1,2-DCB. However, not more than three protein spots showed significant regulation in the same direction for all three volatile compounds: voltage-dependent anion-selective channel protein 2, peroxiredoxin 1 and elongation factor 2. However, all of these proteins are important molecular targets in stress- and cell death-related signaling pathways.
Die gesundheitsfördernden Eigenschaften von grünem Tee sind weitgehend akzeptiert. Den Teecatechinen, insbesondere dem Epigallocatechin-3-gallat (EGCG), werden zahlreiche positive Effekte zugesprochen (z. B. antioxidativ, antikanzerogen, antiinflammatorisch, Blutdruck und Cholesterinspiegel senkend). Die Mechanismen, die zu einer Reduktion der in Tierversuchen beschriebenen Körper- und Fettmasse führen, sind nicht ausreichend geklärt. Ziel dieser Arbeit bestand darin, die kurz- und mittelfristigen Wirkungen einer TEAVIGO®-Applikation (mind. 94 % EGCG) am Mausmodell im Hinblick auf den Energie- und Fettstoffwechsel sowie die Expression daran beteiligter Gene in wichtigen Organen und Geweben zu untersuchen. In verschiedenen Tierversuchen wurde männlichen C57BL/6-Mäusen eine Hochfettdiät (HFD) mit und ohne Supplementation (oral, diätetisch) des entkoffeinierten Grüntee-Extraktes TEAVIGO® in unterschiedlichen Dosierungen gefüttert. Es wurden sowohl kurz- als auch mittelfristige Wirkungen des EGCG auf die Energiebilanz (u. a. indirekte Tierkalorimetrie) und Körperzusammensetzung (NMR) sowie die exogene Substratoxidation (Stabilisotopentechnik: Atemtests, Inkorporation natürlicher 13C-angereicherter Triglyceride aus Maiskeimöl in diverse Organe/Gewebe) und Gen-expression (quantitative real-time PCR) untersucht. Die Applikationsform und ihre Dauer riefen unterschiedliche Wirkungen hervor. Mäuse mit diätetischer Supplementation zeigten bereits nach kurzer Zeit eine verminderte Körperfettmasse, die bei weiterer Verabreichung auch zu einer Reduktion der Körpermasse führte. Beide Applikationsformen resultieren, unabhängig von der Dauer der Intervention, in einer erhöhten Energieausscheidung, während die Futter- und Energieaufnahme durch EGCG nicht beeinflusst wurden. Der Energieverlust war von einer erhöhten Fett- und Stickstoffausscheidung begleitet, deren Ursache die in der Literatur beschriebene Interaktion und Hemmung digestiver Enzyme sein könnte. Besonders unter postprandialen Bedingungen wiesen EGCG-Mäuse erniedrigte Triglycerid- und Glycogengehalte in der Leber auf, was auf eine eingeschränkte intestinale Absorption der Nährstoffe hindeutet. Transkriptanalysen ergaben im Darm eine verminderte Expression von Fettsäuretransportern, während die Expression von Glucosetransportern durch EGCG erhöht wurde. Weiterhin reduzierte EGCG, nach Umstellung von Standard- auf eine maiskeimölhaltige Hochfettdiät, die Inkorporation natürlicher 13C-angereicherter Triglyceride in diverse Organe und Gewebe – insbesondere Leber, viszerales und braunes Fettgewebe sowie Skelettmuskel. Die Analyse der 13C-Anreicherung im Atem der Mäuse und die Energieumsatzmessungen ergaben nach kurzer Applikation eine erhöhte Fettoxidation, die im weiteren Verlauf der Intervention auf eine erhöhte Kohlenhydratoxidation umgeschaltet wurde. Weiterhin war die orale Applikation von EGCG bei gleichzeitiger Fütterung einer Hochfettdiät von makroskopischen und mikroskopischen degenerativen Veränderungen der Leber begleitet. Diese Effekte wurden nach diätetischer Supplementation der Hochfettdiät mit EGCG nicht beobachtet. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Körpergewichts- und Fettgewebs-abnahme durch diätetisches EGCG sich durch eine herabgesetzte Verdaulichkeit der Nahrung erklären lässt. Dies führte zu verschiedenen kurz- und mittelfristigen Veränderungen in der Fettverteilung und im Fettmetabolismus.
Background: Very recently a gene marker panel that allows the mutational analysis of APC, CTNNB1, B-RAF and K-RAS was conceived. The aim of the present study was to use the 4-gene marker panel covering the Wnt and Ras-Raf-MEK-MAPK signalling pathways to determine the percentage of sporadic colorectal carcinomas (CRC) carrying at least one of the four above-mentioned genes in a mutated form alone and/or in combination with microsatellite instability (MSI) and to compare the sensitivity of the gene marker panel used in this study with that of gene marker panels previously reported in the scientific literature. Methods: CTNNB1 and B-RAF were screened by PCR-single-strand conformation polymorphism analysis and K-RAS gene mutations by restriction fragment length polymorphism analysis. For the mutational analysis of the APC gene mutation cluster region (codons 1243–1567) direct DNA sequencing was performed. The U.S. National Cancer Institute microsatellite panel (BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 and D17S250) was used for MSI analysis. Results: It could be shown that about 80% of early stage CRC (UICC stages I and II) and over 90% of CRC in the UICC stage IV carried at least one mutated gene and/or showed MSI. No significant increase in the gene mutation frequencies could be determined when comparing tumours in the UICC stage I with those in UICC stage IV. Conclusions: When compared with previously published gene marker panels the 4-gene marker panel used in the present study shows an excellent performance, allowing to detect genetic alterations in 80–90% of human sporadic CRC samples analyzed.
Heterocyclic aromatic amines (HCAs) are formed in meat cooked at high temperatures for a long time or over an open flame. In this context 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP), the most abundant HCA in cooked meat, has been suggested to be involved in colon and prostate carcinogenesis. In the latter case it has been reported that: (1) roughly 50% of Fischer F344 male rats treated with PhIP develop carcinomas in the ventral prostate lobe at 1 year of age; (2) inflammation precedes prostatic intraepithelial neoplasia in PhIP-fed rats; (3) inflammation specifically occurs in the ventral prostate lobe of PhIP-fed rats. To test whether PhIP by itself leads to inflammation in the colon and whether a human-relevant concentration of PhIP is able to induce preneoplastic lesions in the colon, male F344 rats were fed 0.1 or 100 ppm PhIP for up to 10 months and thereafter the colon tissue was analyzed histochemically. In none of the experimental groups signs of acute or chronic colonic inflammation were observed. 0.1 ppm PhIP leads to the development of hyperplastic and dysplastic lesions in the colon of single animals, but the incidence of these lesions does not reach a statistical significance. In contrast, in rats fed 100 ppm PhIP for 10 months hyperplastic and dysplastic colonic lesions were induced in a statistically significant number of animals. It is concluded that: (1) the induction of preneoplastic lesions in rat colon by PhIP is not preceded or accompanied by an inflammatory process; (2) a human-relevant concentration of PhIP alone is not sufficient to initiate colon carcinogenesis in rats.
Eine besondere Rolle im Fremdstoffmetabolismus hat die SULT1A1 beim Menschen aufgrund der hohen Expression und breiten Gewebeverteilung. Während die humane SULT1A1 in sehr vielen Geweben exprimiert wird, wurde die murine SULT1A1 vor allem in der Leber, Lunge und Colon gefunden. Neben der Gewebeverteilung spielt auch der Polymorphismus im humanen SULT1A1-Gen eine bedeutende Rolle. Der häufigste Polymorphismus in diesem Gen führt zu einer Aminosäuresubstitution von Arginin zu Histidin an Position 213. Die Genvariante mit Histidin (auch als SULT1A1*2 bezeichnet) codiert für ein Protein mit einer geringen Enzymaktivität und einer reduzierten Enzymmenge in Thrombocyten. Über den Einfluss dieser allelischen Varianten in anderen Geweben ist bislang wenig bekannt. In vorausgegangenen epidemiologischen Studien wurden mögliche Korrelationen zwischen den Genvarianten und der Krebsentstehung in verschiedenen Geweben untersucht. Diese Daten liefern jedoch widersprüchliche Ergebnisse zum Krebsrisiko. Aufgrund der strittigen epidemiologischen Daten sollten Tiermodelle generiert werden, um die häufigsten SULT1A1-Allele hinsichtlich der Empfindlichkeit gegenüber Nahrungs- und Umweltkanzerogenen zu untersuchen. Zur Erzeugung transgener (tg) Mauslinien wurde mittels Mikroinjektion der codierenden Genbereich und große flankierende Humansequenzen stromaufwärts und stromabwärts in das Mausgenom integriert. Es wurden mehrere Mauslinien hergestellt. Zwei davon, die Mauslinie 31 mit dem SULT1A1*1-Allel und die Mauslinie 28 mit dem SULT1A1*2-Allel, wurden eingehend analysiert. In beiden Linien wurde eine identische Kopienzahl des Transgens ermittelt. Proteinbiochemische Charakterisierungen zeigten eine weitgehend dem Menschen entsprechende Gewebeverteilung und zelluläre und subzelluläre Lokalisation der humanen SULT1A1 in der Linie (Li) 28. In Li 31 wurden Unterschiede zu Li 28 sowohl in der Gewebeverteilung als auch in der zellulären Lokalisation des exprimierten humanen Proteins ermittelt. Dabei war die Expression auf Proteinebene in der SULT1A1*2-tg Linie generell stärker als in der SULT1A1*1-Linie. Dieses Ergebnis war überraschend, denn in humanen Thrombocyten führt das SULT1A1*1-Allel zu einem höheren Gehalt an SULT1A1-Protein als das SULT1A1*2-Allel. Zur Analyse der unterschiedlichen Proteinexpressionen in den tg Mauslinien wurde die cDNA und der 5´-flankierende Bereich des SULT1A1-Gens sequenziert. In beiden tg Linien entsprach die Sequenz der cDNA der Referenzsequenz aus der Gendatenbank (Pubmed). In der 5´-flankierenden Region wurden bekannte Polymorphismen analysiert und unterschiedliche Haplotypen in den tg Linien an den Positionen -624 und -396 ermittelt. Dabei wurde in der Li 31 der Haplotyp detektiert, der in der Literatur mit einer höheren SULT1A1-Enzymaktivität beschrieben wird. Der mögliche Zusammenhang zwischen Transkriptionsrate und Proteinexpression wurde in RNA-Expressionsanalysen im codierenden und 5´-nicht codierenden Bereich (mit den alternativen Exons 1B und 1A) untersucht. Im codierenden Bereich und im Exon 1B konnte in den untersuchten Organen eine höhere RNA-Expression in der Li 28 im Vergleich zur Li 31 ermittelt werden. Außer in der Lunge wurde für Exon 1B eine identische RNA-Expression detektiert. RNA, die Exon 1A enthielt, wurde in allen untersuchten Organen der Li 28, aber nur in der Lunge bei der Li 31 gefunden. In beiden tg Linien konnten mit den Exon 1A-Primern jedoch auch größere PCR-Produkte ermittelt werden. Dieser Unterschied im Exon 1A und mögliche Spleißvarianten könnten damit für die unterschiedliche Proteinexpression des humanen SULT1A1-Proteins in den beiden tg Mauslinien sein. Die in dieser Arbeit generierten und charakterisierten tg Mausmodelle wurden in einer toxikologischen Studie eingesetzt. Es wurde das heterozyklische aromatische Amin 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo-[4,5-b]pyridin (PhIP) verwendet. PhIP wird beim Erhitzen und Braten von Fleisch und Fisch gebildet und könnte mit der erhöhten Krebsentstehung im Colon in der westlichen Welt im Zusammenhang stehen. Mittels 32P-Postlabelling sollte der Einfluss der zusätzlichen Expression der humanen SULT-Proteine auf die PhIP-DNA-Adduktbildung analysiert werden. Dabei wurden mehr DNA-Addukte in den tg Tieren als in den Wildtyp-Mäusen ermittelt. Die Konzentration der gebildeten DNA-Addukte korrelierte mit der Expressionsstärke des humanen SULT1A1-Proteins in den tg Mäusen. An den in dieser Arbeit generierten tg Mauslinien mit den häufigsten allelischen Varianten des SULT1A1-Gens konnten Unterschiede auf RNA- und Protein-Ebene ermittelt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Expression der humanen SULT1A1 eine Auswirkung sowohl auf die Stärke als auch das Zielgewebe der DNA-Adduktbildung in vivo hat.
Der ubiquitär exprimierte, multifunktionale Glucosetransporter GLUT8 gehört zur Klasse III der Familie der passiven Glucosetransporter, die aus insgesamt 14 Proteinen besteht. Die fünf Mitglieder der Klasse IIII unterscheiden sich strukturell leicht von den Mitgliedern der Klasse I und II (Joost und Thorens, 2001). GLUT8 besitzt ein N-terminales Dileucin-Motiv, das Teil eines [DE]XXXL[LI] Motivs ist, welches für die Sortierung des Transporters in späte Endosomen und Lysosomen verantwortlich ist (Augustin et al., 2005). Da bis heute kein Signal identifiziert wurde, das eine Translokation des Transporters zur Plasmamembran auslöst, wird eine intrazelluläre Funktion von GLUT8 vermutet (Widmer et al., 2005). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die intrazelluläre Funktion des Transporters in der Regulation der Glucosehomöostase des Körpers durch Analyse einer Slc2a8-knockout-Maus untersucht. Die homozygote Deletion des Transporters erbrachte lebensfähige Nachkommen, die sich augenscheinlich nicht von ihren Wildtyp-Geschwistern unterschieden. Allerdings wurde bei Verpaarungen heterozygoter Mäuse eine verminderte Anzahl an Slc2a8-/--Nachkommen beobachtet, die signifikant von der erwarteten Mendel’schen Verteilung abwich. Da Slc2a8 die höchste mRNA-Expression in den Testes aufwies und die Überprüfung der Fertilität mittels verschiedener homozygoter Verpaarungen eine Störung der weiblichen Fortpflanzungsfähigkeit ausschloss, wurden die Spermatozoen der Slc2a8-/--Mäuse eingehender untersucht. Als Ursache für die verringerte Anzahl von Slc2a8-/--Geburten wurde eine verminderte Prozentzahl motiler Slc2a8-/--Spermien ermittelt, die durch eine unzureichende mitochondriale Kondensation in den Spermien bedingt war. Diese Veränderung war mit einem reduzierten mitochondrialen Membranpotential assoziiert, was eine verminderte ATP-Produktion nach sich zog. Somit scheint GLUT8 in den Spermien an einem intrazellulären Transportprozess beteiligt zu sein, der einen Einfluss auf die oxidative Phosphorylierung der Mitochondrien ausübt. Im Gehirn wurde Slc2a8 besonders stark im Hippocampus exprimiert, der in der Regulation von körperlicher Aktivität, Explorationsverhalten, Erinnerungs- und Lernprozessen sowie Angst- und Stressreaktionen eine Rolle spielt. Außerdem wurde GLUT8 im Hypothalamus nachgewiesen, der unter anderem an der Regulation der Nahrungsaufnahme beteiligt ist. Die Slc2a8-/--Mäuse zeigten im Vergleich zu ihren Slc2a8+/+-Geschwistern eine signifikant gesteigerte körperliche Aktivität, die zusammen mit der von Membrez et al. (2006) publizierten erhöhten Zellproliferation im Hippocampus auf eine Nährstoffunterversorgung dieses Areals hindeutet. Die Nahrungsaufnahme war in Abwesenheit von GLUT8 nicht verändert, was zusammen mit dem nur geringfügig niedrigeren Körpergewicht der Slc2a8-/--Mäuse eine Funktion von GLUT8 im Glucose-sensing der Glucose-sensitiven Neurone des Gehirns ausschließt. Das leicht reduzierte Körpergewicht der Slc2a8-/--Mäuse ließ sich keinem bestimmten Organ- oder Gewebetyp zuordnen, sondern schien durch eine marginale Gewichtsreduktion aller untersuchten Gewebe bedingt zu sein. Zusammen mit den erniedrigten Blutglucosespiegeln und der anscheinend gesteigerten Lebenserwartung zeigten die Slc2a8-/--Mäuse Symptome einer leichten Nährstoffunterversorgung. GLUT8 scheint daher am Transport von Zuckerderivaten, die während des lysosomalen/endosomalen Abbaus von Glykoproteinen anfallen, beteiligt zu sein. Die so wiederaufbereiteten Zucker dienen dem Körper offenbar als zusätzliche Energiequelle.
Vitamin E wird immer noch als das wichtigste lipophile Antioxidanz in biologischen Membranen betrachtet. In den letzten Jahren hat sich jedoch der Schwerpunkt der Vitamin E-Forschung hin zu den nicht-antioxidativen Funktionen verlagert. Besonderes Interesse gilt dabei dem α-Tocopherol, der häufigsten Vitamin E-Form im Gewebe von Säugetieren, und seiner Rolle bei der Regulation der Genexpression. Das Ziel dieser Dissertation war die Untersuchung der genregulatorischen Funktionen von α-Tocoperol und die Identifizierung α-Tocopherol-sensitiver Gene in vivo. Zu diesem Zweck wurden Mäuse mit verschiedenen Mengen α-Tocopherol gefüttert. Die Analyse der hepatischen Genexpression mit Hilfe von DNA-Microarrays identifizierte 387 α-Tocopherol-sensitive Gene. Funktionelle Clusteranalysen der differentiell exprimierten Gene zeigten einen Einfluss von α-Tocooherol auf zelluläre Transportprozesse. Besonders solche Gene, die an vesikulären Transportvorgängen beteiligt sind, wurden größtenteils durch α-Tocopherol hochreguliert. Für Syntaxin 1C, Vesicle-associated membrane protein 1, N-ethylmaleimide-sensitive factor and Syntaxin binding protein 1 konnte eine erhöhte Expression mittels real time PCR bestätigt werden. Ein funktioneller Einfluss von α-Tocopherol auf vesikuläre Transportprozesse konnte mit Hilfe des in vitro β-Hexosaminidase Assays in der sekretorischen Mastzelllinie RBL-2H3 gezeigt werden. Die Inkubation der Zellen mit α-Tocopherol resultierte in einer konzentrationsabhängigen Erhöhung der PMA/Ionomycin-stimulierten Sekretion der β-Hexosaminidase. Eine erhöhte Expression ausgewählter Gene, die an der Degranulation beteiligt sind, konnte nicht beobachtet werden. Damit schien ein direkter genregulatorischer Effekt von α-Tocopherol eher unwahrscheinlich. Da eine erhöhte Sekretion auch mit β-Tocopherol aber nicht mit Trolox, einem hydrophilen Vitamin E-Analogon, gefunden wurde, wurde vermutet, dass α-Tocopherol die Degranulation möglicherweise durch seine membranständige Lokalisation beeinflussen könnte. Die Inkubation der Zellen mit α-Tocopherol resultierte in einer veränderten Verteilung des Gangliosids GM1, einem Lipid raft Marker. Es wird angenommen, dass diese Membranmikrodomänen als Plattformen für Signaltransduktionsvorgänge fungieren. Ein möglicher Einfluss von Vitamin E auf die Rekrutierung/Translokation von Signalproteinen in Membranmikrodomänen könnte die beobachteten Effekte erklären. Eine Rolle von α-Tocopherol im vesikulären Transport könnte nicht nur seine eigene Absorption und seinen Transport beeinflussen, sondern auch eine Erklärung für die bei schwerer Vitamin E-Defizienz auftretenden neuronalen Dysfunktionen bieten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die α-Tocopheroltransferprotein (Ttpa) Knockout-Maus als genetisches Modell für Vitamin E-Defizienz verwendet, um den Effekt von Ttpa auf die Genexpression und die Gewebeverteilung von α-Tocopherol zu analysieren. Ttpa ist ein cytosolisches Protein, das für die selektive Retention von α-Tocopherol in der Leber verantwortlich ist. Die Ttpa-Defizienz resultierte in sehr geringen α-Tocopherol-Konzentrationen im Plasma und den extrahepatischen Geweben. Die Analyse der α-Tocopherol-Gehalte im Gehirn wies auf eine Rolle von Ttpa bei der α-Tocopherol-Aufnahme ins Gehirn hin.
Untersuchung des Recyclings Kaede-fusionierter Corticotropin-Releasing-Factor Rezeptoren Typ 1
(2009)
Aktivierte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) werden schnell desensitisiert, internalisiert und anschließend entweder lysosomal degradiert oder zur Plasmamembran (PM) recycelt. Zur Resensitisierung der Zellen tragen neben recycelten auch neusynthetisierte Rezeptoren bei. Die Überlagerung beider Prozesse erschwert die Untersuchung des Rezeptorrecyclings. In dieser Arbeit sollte mit Hilfe des photokonvertierbaren Fluoreszenzproteins Kaede eine Technik entwickelt werden, mit der es möglich ist Recycling- von Neusyntheseprozessen zu trennen und das Recycling von GPCR mikroskopisch in Echtzeit zu beobachten. Als Modellproteine wurden der Vasopressin-1a-Rezeptor V1aR (recycelnder Rezeptor), der Vasopressin-2-Rezeptor V2R (degradierter Rezeptor) und der Corticotropin-Releasing Factor-Rezeptor Typ 1 (CRF1R) verwendet, wobei bei Letzterem untersucht werden sollte, ob er nach Stimulation zur PM zurücktransportiert wird. Da Kaede als fluoreszierendes Protein mit den GPCR fusioniert wird, wurde zunächst überprüft, ob es die Eigenschaften der Rezeptoren verändert und generell für Transportstudien geeignet ist. Eventuell könnte die bereits publizierte Tetramerisierung von Kaede seine Anwendung verhindern oder erschweren. Mittels Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie konnte gezeigt werden, dass Kaede nicht tetramerisiert, wenn es an ein Membranprotein fusioniert ist. Außerdem konnte in in vitro- und Zellkulturexperimenten belegt werden, dass die native und die photokonvertierte Form von Kaede gleichermaßen stabil sind. Darüber hinaus zeigten Kaede-fusionierte GPCR sowohl in Kolokalisationsstudien als auch in Agonistbindungs- und Rezeptoraktivierungsexperimenten die gleichen Eigenschaften wie CFP- bzw. die unfusionierte Rezeptoren. Lediglich die Expression der Kaede-fusionierten Rezeptoren war geringer. Parallel wurde anhand der bereits publizierten Kaede-Struktur versucht, die Tetramerisierung des Proteins durch den Austausch interagierender Aminosäuren zu unterbinden. Die eingeführten Mutationen bewirkten aber eine Fehlfaltung des Proteins und damit den Verlust der Fluoreszenz. Da zuvor gezeigt werden konnte, dass Kaede-fusionierte Membranproteine nicht tetramerisieren und nicht die Eigenschaften der fusionierten Proteine verändern, war monomerisiertes Kaede zur Untersuchung des Rezeptorrecyclings nicht notwendig. Im zweiten Teil der Arbeit wurde mit Hilfe von Kaede-Fusionsproteinen und mikroskopischer Testsysteme das noch unbekannte Recyclingverhalten des CRF1R untersucht. Hierfür wurden die Kaede-fusionierten Rezeptoren in eukaryotischen Zellen exprimiert und mit Agonisten internalisiert. Die internalisierten Rezeptoren wurden in Endosomen selektiv mit UV-Strahlung photokonvertiert. Anschließend wurde der Transport der photokonvertierten Form verfolgt. Sowohl beim CRF1R als auch beim V1aR wurden Signale in der PM detektiert, beim V2R hingegen nicht. Dies zeigt, dass es sich beim CRF1R um einen recycelnden Rezeptor handelt. Die als Kontrolle eingesetzten Rezeptoren verhielten sich in diesem Experiment wie erwartet: Der V1aR wurde zur PM zurücktransportiert, der V2R nicht. Diese Ergebnisse konnten mit Hilfe biochemischer und durchflusscytometrischer Experimente bestätigt werden. Die Internalisierung des CRF1R verläuft Clathrin-vermittelt in Anwesenheit von β-Arrestin. Je nach Stabilität der β Arrestin-Interaktion unterscheidet man zwei Klassen von Rezeptoren: Klasse A-Rezeptoren interagieren transient mit β Arrestin und können recyceln. Im Gegensatz dazu gehen Klasse B-Rezeptoren eine stabile Interaktion mit β Arrestin ein und werden nach Internalisierung degradiert. In mikroskopischen Untersuchungen konnte für die aktivierten CRF1R und V1aR eine Rekrutierung von β Arrestin zur PM und eine transiente Interaktion mit β Arrestin gezeigt werden (Klasse A-Rezeptoren). Für den V2R wurde dagegen eine stabile Interaktion mit β Arrestin beobachtet (Klasse B-Rezeptor). Diese Daten stützen die Ergebnisse des Kaede-basierten Recyclingversuchs und zeigen, dass der CRF1R ein recycelnder Rezeptor ist. Ferner wurde untersucht, ob der CRF1R zu den schnell oder langsam recycelnden Rezeptoren zählt. Schnell recycelnde Rezeptoren werden direkt aus frühen Endosomen, langsam recycelnde hingegen über das Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) bzw. über Recycling-Endosomen zur PM transportiert. Als Marker für das TGN oder die Recycling-Endosomen wurde Rab11 verwendet. In Kolokalisationsstudien konnte gezeigt werden, dass der CRF1R den langsam recycelnden Rezeptoren zugeordnet werden kann. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit belegt werden, dass Kaede als Fusionspartner für Membranproteine genutzt werden kann um deren Transport in Echtzeit zu studieren. Damit wurde erstmals eine mikroskopische Methode etabliert, die es erlaubt recycelnde von neusynthetisierten Rezeptoren zu unterscheiden. Mit Hilfe dieser Methode war es möglich zu zeigen, dass der CRF1R ein recycelnder Rezeptor ist.
Die Induktion antioxidativer Enzyme gilt als eine Möglichkeit, die antioxidative Kapazität von Zellen zu steigern und dadurch mit oxidativem Stress assoziierten Erkrankungen (z. B. Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Neurodegeneration, Atherosklerose) vorzubeugen. Ausgehend davon wurde in der vorliegenden Arbeit der Dual-Luciferase-Reportergen-(DLR)-Assay zum Nachweis der Induktion der antioxidativen Enzyme Katalase (CAT), zytosolische Glutathion-Peroxidase (GPX1) und Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase (SOD1) entwickelt. Im Zuge dessen wurden drei Säugetierzelllinien (CaCo2, IEC-18, V79) auf ihre Eignung zur Modellzelllinie untersucht. Aufgrund der Transfektionseffizienz wurde die Fibroblastenzelllinie V79 ausgewählt. Zur Gewährleistung eines hohen Substanzdurchsatzes des DLR-Assays wurden bei der Etablierung Parameter wie Kulturplattenformat, DNA-Menge, Luciferasen-Kinetik berücksichtigt. Nach erfolgreicher Etablierung des Versuchs im 96-Well-Format wurden L-Carnitin, Catechin, Epigallocatechingallat, Genistein, Wasserstoffperoxid (H2O2), Natrium-Ascorbat, Paraquat, Quercetin, 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA) und Trolox in nicht-zytotoxischen Konzentrationen hinsichtlich der Aktivierung des Ratten-CAT-, des humanen GPX1- und des humanen SOD1-Promotors untersucht. Die Bestimmung der maximal tolerierbaren Behandlungskonzentration erfolgte im Vorfeld mittels Resazurintest. Von den zehn Verbindungen zeichneten sich drei Substanzen als potente Induktoren für die SOD1 und die GPX1 aus. Die 24-stündige Behandlung von mit Reportergenkonstrukten transient transfizierten V79-Zellen mit 100 µM Paraquat resultierte in einer Verdopplung der relativen SOD1-Promotor-Aktivität und einer Erhöhung der relativen GPX1-Promotor-Aktivität auf 1,6 bzw. 1,7. Die Stimulation mit 20 µM Genistein oder 10 µM Quercetin führte wiederum zu einer Verdopplung bis Verdreifachung der relativen SOD1- und GPX1-Promotor-Aktivität. Der Promotor der Rattenkatalase konnte demgegenüber nur durch 50 µM H2O2 aktiviert werden (1,5fach). Für diesen DLR-Assays bieten sich folglich Genistein, Quercetin wie auch H2O2 als Referenzsubstanzen an. Um aber eine qualitative Charakterisierung der einzelnen Verbindungen hinsichtlich ihres Induktionspotentials zu gewährleisten, sollten von allen getesteten Substanzen Dosis-Wirkungskurven aufgenommen werden. Zudem wird für den routinemäßigen Einsatz die Verwendung stabil transfizierter Zellen zur Vermeidung von mit der Transfektion verbundenen experimentellen Schwankungen empfohlen.
Dietary antioxidants are believed to play an important role in the prevention and treatment of a variety of diseases associated with oxidative stress. Although there is a wide range of dietary antioxidants, the bulk of the research to date has been focused on the nutrient antioxidants vitamin C, E, and carotenoids. Certain relatively uncommon antioxidants such as lipoic acid (LA), and phenolic compounds such as (-)-epicatechin (EC), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epicatechin gallate (ECG), and (-)-epigallocatechin gallate (EGCG), have not been extensively investigated although they may exert greater antioxidant potency than that of carotenoids and vitamins. Extracts from selected plants and plant byproducts may represent rich sources for one or more of such antioxidants and therefore exhibit higher effects than a single antioxidant due to the synergistic effects produced between such antioxidants. However, in the last decade a number of epidemiological, animal and in vitro studies have suggested a protective and therapeutic potency of these antioxidants in a broad range of diseases such as cancer, diabetes, atherosclerosis, cataract and acute and chronic neurological disorders. Inflammation, the response of the host toward any infection or injury, plays a central role in the development of many chronic diseases. Several evidences demonstrated the rise of different types of cancer from sites of inflammation. This suggests that active oxygen species and some cytokines generated in the inflamed tissues can cause injury to DNA and ultimately lead to carcinogenesis. Diethylnitrosamine (DEN) is one of the most important environmental carcinogens, present in a variety of foods, alcoholic beverages, tobacco smoke and it can be synthesized endogenously. In addition to the liver it can induce carcinogenesis in other organs like kidney, trachea, lung, esophagus, fore stomach, and nasal cavity. Several epidemiological and laboratory studies indicate that nitroso compounds including DEN may induce hyperplasia and chronic inflammation which is closely associated with the development of hepatocellular carcinoma. Despite increasing evidence on the potential of antioxidants in modulating the etiology of chronic diseases, little is known about their role in inflammation and acute phase response (APR). Therefore the aim of the present work was to study the protective effect of water and solvent extracts of eight plant and plant byproducts including green tea, artichoke, spinach, broccoli, onion and eggplant, orange and potato peels as well as eight antioxidants agents including EC, EGC, ECG, EGCG, ascorbic acid (AA), acetylcysteine (NAC), α-LA, and alpha-tocopherol (α-TOC) toward acute inflammation induced by interleukin-6 (IL-6) and hepatotoxicity induced by DEN in vitro. The negative acute phase proteins (APP), transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) were used as inflammatory biomarkers analyzed by ELISA, whereas neutral red assay was used for evaluating the cytotoxicity. All experiments were performed in vitro using human hepatocarcinoma cell line (HepG2). Additionally the antioxidant activity was measured by TEAC and FRAP assays, phenolic content was measured by Folin–Ciocalteu and characterized by HPLC. Moreover, the microheterogeneity of TTR was detected using immunoprecipitation assay combined with SELDI-TOF MS. Results of present study showed that HepG2 cells provide a simple, sensitive in vitro system for studying the regulation of the negative APP, TTR and RBP under free and inflammatory condition. IL-6, a potent proinflammatory cytokine, in a concentration of 25 ng/ml was able to reduce TTR and RBP secretion by approximately 50-60% after 24h of incubation. With exception of broccoli and water extract of onion which showed pro-inflammatory effects in this study, all other plant extracts, at specific concentrations, were able to elevate TTR secretion in normal condition and even under treatment of IL-6 where the effect was quite lower. Green tea followed by artichoke and potato peel exhibited the highest elevation in TTR concentration which reached 1.1 and 2.5 folds of control in presence and absences of IL-6 respectively. In general Plant extracts were ordered according their anti-inflammatory potency as following: in water extracts; green tea > artichoke > potato peel > orange peel > spinach > eggplant peel, where in solvent extracts; green tea > artichoke > potato peel > spinach > eggplant peel > onion > orange peel. The antiinflammatory effect of water extracts of green tea, artichoke and orange peel were significantly higher than their corresponding solvent extracts whereas water extracts of eggplant-, potato peels and spinach showed lower effect than their solvent extracts. On the other hand α-LA followed by EGCG and ECG exhibited the highest elevation in TTR concentration compared to other antioxidants. The relation between the anti-inflammatory potential and antioxidants activity and phenolic content for the investigated substances was generally weak. This may suggest the involvement of other mechanisms than antioxidants properties for the observed effect. TTR secreted by HepG2 cells has a molecular structure quite similar to the purified standard and serum TTR in which all the three main variants are contained including native, S-cystinylated and Sglutathionylated TTR. Interestingly, a variant with molecular mass of 13453.8 + 8.3 Da has been detected only in TTR secreted by HepG2. Among all investigated antioxidants and plant extracts, six substances were able to elevate the native preferable TTR variant. The potency of these substances can be ordered as following α-LA > NAC > onion > AA > EGCG > green tea. A weak correlation between elevation on TTR and shifting to the native form was observed. Similar weak correlation has also been observed between antioxidants activity and elevation in native TTR. Although DEN was able to induce cell death in a concentration dependent manner, it requires considerably higher concentrations for its effects especially after 24h. This may be attributed to a lack in cytochrome P450 enzymes produced by HepG2. At selected concentrations some antioxidants and plant extracts significantly attenuate DEN cytotoxicity as following: spinach > α-LA > artichoke > orange peel > eggplant peel > α-TOC > onion > AA. Contrary all other substances especially green tea, broccoli, potato peel, and ECG stimulate DEN toxicity. In conclusion, this study demonstrated that selected antioxidants and plant extracts may attenuate the inflammatory process, not only by their antioxidants potency but also by other mechanisms which remain unclear. They may also play a vital role on stabilizing the tetramic structure of TTR and thereby prevent amyloidosis diseases. Lipoic acid represents in this study unique function against inflammation and hepatotoxicity. Despite the protective effect demonstrated by investigated substances, attention should also be given to the pro-oxidant and potential cytotoxic effects produced at higher concentrations.
Die funktionelle Bedeutung des Coxsackie- und Adenovirus Rezeptors (CAR) im kolorektalen Karzinom
(2009)
Der Coxsackie- und Adenovirus Rezeptor (CAR) ist als Bestandteil von Tight Junctions (TJ) an interzellulären Adhäsionsprozessen beteiligt und scheint eine wichtige Rolle in der Karzinogenese zu spielen. Diese ist jedoch insbesondere bei Entstehung von Darmkrebs weitgehend unklar. Ziel der Arbeit war es daher, die funktionelle Bedeutung, mögliche Interaktionspartner sowie die Expressionsregulation von CAR im kolorektalen Karzinom zu analysieren. In den Zelllinien CaCo2, Colo205, DLD1, HCT116, HT29, SW480 und T84 konnte die Expression von CAR (mRNA und Protein) nachgewiesen werden. Nach stabiler CAR-Überexpression durch Transfektion von CARcDNA in DLD1, HCT116 und SW480 wurde das Zellwachstum gehemmt und eine Abnahme von Migration und Invasion induziert. Eine stabile CAR-Inhibition nach Transfektion von CARsiRNA führte in diesen Zelllinien zum Anstieg der Proliferation sowie zu verstärkter Migrations- und Invasionsaktivität, die in DLD1 mit morphologischen Änderungen einhergingen. Eine Genexpressionsanalyse der Zelllinie DLD1 mit CAR-Inhibition identifizierte α-Catenin als das am stärksten regulierte Gen. Obwohl keine direkte Interaktion beider Proteine detektiert werden konnte, führte eine stabile Re-Expression von α-Catenin in DLD1 mit stabiler CAR-Inhibition zu einer deutlichen Reduktion von Proliferation, Migration und Invasion sowie zu einem Rückgang der zellmorphologischen Änderungen. Um den Einfluss von Differenzierung auf die Regulation der CAR-Expression zu untersuchen, erfolgte eine Behandlung aller Zelllinien mit Natriumbutyrat. Dies führte in fünf der sieben Zelllinien zu einer Aktivierung des CAR-Promotors sowie zu einer gesteigerten Expression und Immunoreaktivität von CAR an der Zelloberfläche. Die Zelllinie CaCo2 zeigte nach spontaner Differenzierung durch 21-tägiges Wachstum post Konfluenz ebenfalls eine verstärkte CAR-mRNA-Expression sowie eine erhöhte CAR-Präsenz an der Zelloberfläche. Die gewonnenen Daten konnten die funktionelle Bedeutung von CAR für die Kolonkarzinogenese sowie den Einfluss von α-Catenin auf diese Funktion deutlich machen. Es wurde gezeigt, dass die Expressionsregulation sowie die subzelluläre Verteilung von CAR durch den zellulären Differenzierungsstatus beeinflusst werden kann.
The fat-soluble vitamin A, which is chemically referred to retinol (ROH), is known to be essential for the process of vision, the immune system but also for cell differentiation and proliferation. Recently, ROH itself has been reported to be involved in adipogenesis and a ROH transport protein, the retinol-binding protein 4 (RBP4), in insulin resistance and type 2 diabetes. However, there is still considerable scientific debate about this relation. With the increasing amount of studies investigating the relation of ROH in obesity and type 2 diabetes, basic research is an essential prerequisite for interpreting these results. This thesis enhances the knowledge on this relation by reviewing ROH metabolism on extra- and intracellular level. Aim 1: In the blood stream ROH is transported in a complex with RBP4 and a second protein, transthyretin (TTR), to the target cells. The levels of RBP4 and TTR are influenced by several factors but mainly by liver and kidney function. The reason for that is that liver and the kidneys are the sites of RBP4 synthesis and catabolism, respectively. Interestingly, obesity and type 2 diabetes involve disorders of the liver and the kidneys. Therefore the aim was to investigate factors that influence RBP4 and TTR levels in relation to obesity and type 2 diabetes (Part 1). Aim 2: Once arrived in the target cell ROH is bound to cellular retinol-binding protein type I (CRBP-I) and metabolised: ROH can either be stored as retinylesters or it can be oxidised to retinoic acid (RA). By acting as a transcription factor in the nucleus RA may influence processes such as adipogenesis. Therefore vitamin A has been postulated to be involved in obesity and type 2 diabetes. CRBP-I is known to mediate the storage of ROH in the liver, but the extra-hepatic metabolism and the functions of CRBP-I are not well known. This has been investigated in Part 2 of this work. Material & Methods: RBP4 and TTR levels were investigated by ELISA in serum samples of human subjects with overweight, type 2 diabetes, kidney or liver dysfunction. Molecular alterations of the RBP4 and TTR protein structure were analysed by MALDI-TOF mass spectrometry. The functions of intracellular CRBP-I were investigated in CRBP-I knock-out mice in liver and extra-hepatic tissues by measuring ROH levels as well as the levels of its storage form, the retinylesters, using reverse phase HPLC. The postprandial uptake of ROH into tissues was analysed using labelled ROH. The mRNA levels of enzymes that metabolize ROH were examined by real-time polymerase chain reaction (RCR). Results: The previous published results showing increased RBP4 levels in type 2 diabetic patients could not be confirmed in this work. However, it could be shown that during kidney dysfunction RBP4 levels are increased and that RBP4 and TTR levels are decreased during liver dysfunction. The important new finding of this work is that increased RBP4 levels in type 2 diabetic mice were increased when kidney function was decreased. Thus an increase in RBP4 levels in type 2 diabetes may be the effect of a reduced kidney function which is common in type 2 diabetes. Interestingly, during severe kidney dysfunction the molecular structure of RBP4 and TTR was altered in a specific manner which was not the case during liver diseases and type 2 diabetes. This underlines the important function of the kidneys in RBP4 metabolism. CRBP-I has been confirmed to be responsible for the ROH storage in the liver since CRBP-I knock-out mice had decreased ROH and retinylesters (the storage form of ROH) levels in the liver. Interestingly, in the adipose tissue (the second largest ROH storage tissue in the body) ROH and retinylesters levels were higher in the CRBP-I knock-out compared to the wild-type mice. It could be shown in this work that a different ROH binding protein, cellular retinol-binding protein type III, is upregulated in CRBP-I knock-out mice. Moreover enzymes were identified which mediate very efficiently ROH esterification in the adipose tissue of the knock-out mice. In the pancreas there was a higher postprandial ROH uptake in the CRBP-I knock-out compard to wild-type mice. Even under a vitamin A deficient diet the knock-out animals had ROH and retinylesters levels which were comparable to wild-type animals. These results underline the important role of ROH for insulin secretion in the pancreas. Summing up, there is evidence that RBP4 levels are more determined by kidney function than by type 2 diabetes and that specific molecular modifications occur during kidney dysfunction. The results in adipose tissue and pancreas of CRBP-I knock-out mice support the hypothesis that ROH plays an important role in glucose and lipid metabolism.
Alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe werden in vielen Matrizes wie Fahrzeugabgasen und Tabakrauch und auch als Kontaminanten in Nahrungsmitteln neben rein aromatischen Kongeneren gefunden. Alkylierte PAK können über die Alkylseitenkette über benzylische Hydroxylierung und nachfolgende Sulfonierung katalysiert über Sulfotransferasen (SULT) zu reaktiven Schwefelsäureestern umgesetzt werden. Die SULT-vermittelte Bioaktivierung zu einem genotoxischen Schwefelsäureester wurde für den benzylischen Alkohol 1-Hydroxymethylpyren des Hepatokanzerogens 1-Methylpyren in früheren Arbeiten gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob die benzylischen Alkohole weiterer alkylierter PAK über Sulfonierung zu genotoxischen Schwefelsäureestern umgesetzt werden. Hierzu wurde eine Gruppe von 17 Modellsubstanzen ausgewählt, um die Ableitung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen zu ermöglichen. Das genotoxische Potenzial authentischer benzylischer Schwefelsäureester der Modellsubstanzen wurde zunächst in vitro über DNA-Adduktbildung im zellfreien System und Mutagenität im Salmonella-Rückmutationstest untersucht. Die Sulfate zeigten große Reaktivitätsunterschiede in Abhängigkeit von der Struktur des aromatischen Systems und der Position der Alkylseitenkette, wobei die Endpunkte DNA-Adduktbildung und Mutagenität gut korrelierten. Des Weiteren wurde der Salmonella-Mutagenitätstest mit den benzylischen Alkoholen der untersuchten alkylierten PAK und gentechnisch veränderten S. typhimurium-Stämmen, die SULT-Formen des Menschen heterolog exprimieren, durchgeführt. Bis auf die Alkohole 2- und 4-HMP zeigten alle untersuchten benzylischen Alkohole deutliche mutagene Effekte in einem oder mehreren humane SULT exprimierenden Stämmen. Die durchgeführten in vitro-Versuche zeigten das Potenzial der benzylischen Metabolite alkylierter PAK für genotoxische Wirkungen. Nachfolgend musste geklärt werden, welche Relevanz die beobachteten Effekte für die komplexere in vivo-Situation haben. Nach Verabreichung verschiedener benzylischer Schwefelsäureester und Alkohole an männliche Ratten konnten DNA-Addukte in den untersuchten Organen detektiert werden, was im Fall der Schwefelsäureester deren systemische Bioverfügbarkeit und im Fall der benzylischen Alkohole deren Umsatz durch SULT der männlichen Ratte zeigte. Da im Gegensatz zum Menschen die SULT-Expression in der Ratte auf die Leber fokussiert ist, musste ein Großteil des Umsatzes zu genotoxischen Sulfaten in der Leber stattgefunden haben. DNA-Addukte wurden jedoch auch in extrahepatischen Organen gefunden, was über einen hepatischen Export der gebildeten reaktiven Sulfate und deren Transport über den Blutkreislauf zu diesen Geweben erklärt werden kann. Für die weiterführenden in vivo-Studien wurden die benzylischen Alkohole 1-HMP und 1-HM-8-MP ausgewählt, die trotz großer struktureller Ähnlichkeit toxikodynamische Unterschiede zeigten. Zur Untersuchung der Bedeutung des SULT-vermittelten Toxifizierungsweges als auch konkurrierender detoxifizierender oxidativer Stoffwechselprozesse, wurden für 1-HMP und 1-HM-8-MP in vivo-Inhibitionsstudien mit SULT-Inhibitoren und für 1-HM-8-MP auch mit ADH/ALDH-Inhibitoren durchgeführt. Eine Vorbehandlung mit dem SULT-Hemmstoff Pentachlorphenol führte zu einer Reduktion der DNA-Adduktniveaus in Organen 1-HMP- und 1-HM-8-MP-behandelter Tiere. Die Verabreichung von Quercetin hatte keine Auswirkung auf die DNA-Adduktniveaus. Die Hemmung der DNA-Adduktbildung bei Verabreichung von Pentachlorphenol verdeutlichte jedoch, dass benzylische Alkohole alkylierter PAK in vivo über Sulfonierung bioaktiviert werden. Eine Vorbehandlung mit dem ADH-Inhibitor 4-Methylpyrazol und dem ADH-Substrat Ethanol führte zu erhöhten DNA-Adduktniveaus in Organen 1-HM-8-MP-behandelter Tiere. Den gleichen Effekt, jedoch in geringerem Ausmaß, hatte auch die Vorbehandlung mit dem ALDH-Inhibitor Disulfiram. Dies deutet darauf hin, dass oxidative Modifikationen an der Seitenkette des 1-HM-8-MP einen Detoxifizierungsmechanismus darstellen. Nach Verabreichung benzylischer Metabolite alkylierter PAK wurden oftmals hohe Adduktniveaus in der Niere detektiert. Als mögliche Ursache hierfür wurde eine Transporter-vermittelte renale Sekretion reaktiver Sulfate postuliert, die über Vorbehandlung mit Probenecid vor Verabreichung von 1-HMP und 1-HM-8-MP überprüft wurde. Der Haupteffekt der Probenecid-Behandlung wurde jedoch nicht in der Niere, sondern in der Leber beobachtet, die stark erhöhte Adduktniveaus zeigte. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die Hemmung des Exportes in der Leber gebildeter reaktiver Sulfate über Inhibition hepatischer organischer Anionentransporter.
Das seit 1957 als essentiell klassifizierte Spurenelement Selen vermittelt seine Funktion hauptsächlich durch seinen Einbau in Selenoproteine in Form der 21. proteinogenen Aminosäure Selenocystein. Insgesamt wurden 25 humane Gene für Selenoproteine identifiziert, deren genaue Funktion häufig noch nicht bekannt ist. Selen ist das einzige Mitglied aus der Gruppe der Mikronährstoffe, für das nach wie vor eine antikanzerogene Funktion vor allem in Bezug auf Darmkrebs postuliert wird. Die Grundlage dafür liefert eine Interventionsstudie, bei der 1.312 Probanden für 4,5 Jahre mit 200 μg Selen/Tag supplementiert wurden. Dies resultierte in einer Senkung der Gesamtkrebsmortalität um 50 %. Die Fragen einer optimalen Selenzufuhr, die nicht nur den Bedarf deckt, sondern auch die Entfaltung der antikanzerogenen Wirkung von Selen gewährleistet und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch ungeklärt. Zudem liegt die Selenzufuhr bei einem Großteil der europäischen Bevölkerung unter den Empfehlungen. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit vier Wochen alte Mäuse für sechs Wochen marginal defizient (0,086 mg/kg Futter) bzw. selenadäquat (0,15 mg/kg Futter) gefüttert. Dieser geringe Unterschied im Selengehalt resultierte in einer Senkung des Plasmaselenspiegels der selenarmen Tiere auf 13 % und der GPx-Aktivität in der Leber auf 35 %. Zunächst wurde der Einfluss von Selen auf die globale Genexpression im murinen Colon mittels Microarray untersucht. Von den im Colon exprimierten Selenoproteinen reagierte die mRNA von SelW, SelH, GPx1 und SelM im Selenmangel besonders deutlich mit Expressionsverlust. Da diese Selenoproteine nicht nur im Colon, sondern auch in Leukozyten reguliert waren, sind sie auch als humane Biomarker für die in dieser Studie gewählte Schwankung des Selengehalts geeignet. Des Weiteren wurde auf Basis der Microarraydaten eine Signalweganalyse durchgeführt, die der Identifizierung krebsrelevanter Signalwege diente, um mögliche molekularbiologische Erklärungsansätze für die Rolle von Selen im Krebsgeschehen zu finden. Es zeigte sich, dass die mRNA von Schlüsselgenen des Wnt-Signalwegs wie β-Catenin, Gsk3β, Dvl2, Tle2, Lef1 und c-Myc auf Schwankungen des Selengehalts reagiert. Vor allem die Induktion von c-Myc, einem Zielgen des Wnt-Signalwegs, deutet darauf hin, dass dieser im Selenmangel tatsächlich aktiver ist als bei selenadäquater Versorgung. Ein weiterer möglicher Erklärungsansatz für die postulierte präventive Funktion von Selen gegenüber Darmkrebs ist die gastrointestinale Glutathionperoxidase (GPx2), die physiologisch in den proliferierenden Zellen des Kryptengrunds exprimiert wird. Die Regulation dieses Enzyms durch den Wnt-Signalweg, der ebenfalls in proliferierenden Zellen aktiv ist, konnte mittels Reportergenanalyse und endogen auf mRNA- und Proteinebene in Zellkultur gezeigt werden. Die Aktivierung verkürzter Promotorkonstrukte und die Mutation eines potentiellen Bindeelements identifizierten den für die Bindung von TCF und β-Catenin verantwortlichen Bereich. Als Zielgen des Wnt-Signalwegs scheint GPx2 zu den an Proliferationsprozessen beteiligten Genen zu gehören, was unter physiologischen Bedingungen die Aufrechterhaltung des intestinalen Epithels gewährleistet. Bei der Entstehung intestinaler Tumore, die in der Initiationsphase zu über 90 % mit einer konstitutiven Aktivierung des Wnt-Signalwegs einhergeht, wirkt GPx2 möglicherweise prokanzerogen. Die genaue Funktion von GPx2 während der Kanzerogenese bleibt weiter zu untersuchen.
Die Toxizität und Kanzerogenität von rein aromatischen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) ist seit Jahrzehnten bekannt und umfassend erforscht. Die alkylierten PAK (alkPAK) besitzen jedoch aufgrund ihrer Alkylgruppe eine weitere Möglichkeit zur Bioaktivierung und müssen daher gesondert betrachtet werden. Die Alkylgruppe wird zunächst hydroxyliert, anschließend zur Säure oxidiert oder direkt konjugiert. Entstehen hierbei instabile benzylische Sulfokonjugate, so können diese DNA-Addukte bilden und zu Mutationen führen. In Hinblick auf die Bioaktivierung von alkPAK galt es daher zu klären welchen Einfluss die Struktur auf die benzylische Hydroxylierung hat und welche humanen Formen der löslichen Sulfotransferasen besonders an der Umsetzung der alkPAK-Derivate beteiligt sind. Die Untersuchung der Albuminbindung von Schwefelsäureestern sowie ihre Aufnahme in Nierenzellen sollten Aufschluss hinsichtlich möglicher Transportvorgänge geben. Für die in-vivo-Situation wurde weiterhin die Modulation des Metabolismus ausgewählter benzylischer Alkohole durch verschiedene Nahrungsmittelbestandteile, Arzneimittel und Fremdstoffe an Ratten untersucht. Als Biomarker wurden benzylische Carbonsäuren im Urin und die entsprechenden Mercaptursäuren in Urin und Fäzes betrachtet. Zunächst wurde anhand von Inkubationen mit Rattenlebermikrosomen festgestellt, dass insbesondere größere Ringsystemen wie etwa alkylierte Benzo[a]pyrene im Gegensatz zu Methylpyrenen in wesentlich geringerem Umfang zum benzylischen Alkohol umgesetzt werden. Dies wurde auch in Untersuchungen mit humanen Lebermikrosomen bestätigt. Untersuchungen an einzelnen humanen Cytochromen P450 zeigten, dass insbesondere die durch PAK induzierbaren Formen hCYP1A1 und 1B1 hohe Umsatzraten aufwiesen. Die hepatisch exprimierten Formen hCYP1A2 und 3A4 waren jedoch auch zur Bildung der benzylischen Alkohole in der Lage. Für die anschließende Sulfonierung der benzylischen Alkohole wurden besonders hohe Aktivitäten mit den humanen Sulfotransferasen hSULT1A1, 1A2, 1C2 und 1E1 festgestellt. Aufgrund der Enzymexpression und der guten Durchblutung, die eine gute Substratversorgung ermöglicht, ist die Leber als Hauptort der benzylischen Hydroxylierung und Sulfonierung anzusehen. Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zeigen jedoch, dass nach 1-Hydroxymethylpyren-Applikation bei Ratten die Niere die höchste Zahl an DNA-Addukten aufweist. Wegen der Fokussierung der Sulfonierung auf die Leber ist die systemische Verteilung der Schwefelsäureester die einzig plausible Erklärung. So wurde im Rahmen dieser Arbeit eine hochaffine Bindungsstelle für 2-Sulfoxymethylpyren an Albumin beschrieben und die Aufnahme von benzylischen Sulfaten durch die humanen organischen Anionentransporter hOAT1, 3 und 4 in Nierenzellen in vitro gezeigt. Für die in-vivo-Situation wurde der Einfluss von Ethanol, 4-Methylpyrazol, Pentachlorphenol, Quercetin und Disulfiram untersucht. Neben der durch die Detoxifizierung mittels Alkoholdehydrogenase und Aldehyddehydrogenase entstandenen benzylischen Carbonsäure kann als Biomarker die entsprechende Mercaptursäure herangezogen werden. Sie ist ein indirekter Nachweis für die reaktiven und toxischen benzylischen Sulfate der alkPAK. Für die beiden im Tierversuch eingesetzten benzylischen Alkohole (1-Hydroxymethylpyren und 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren) konnte sie in Urin und Fäzes nachgewiesen werden. Es wurde jedoch ein deutlicher Unterschied in der gebildeten Menge sowie der Verteilung zwischen Urin und Fäzes für die beiden Mercaptursäuren festgestellt. Hierfür sind wahrscheinlich Unterschiede im Transport der benzylischen Schwefelsäureester sowie der Spezifität der an der Mercaptursäurebildung beteiligten Enzyme verantwortlich. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass der humane organische Anionentransporter hOAT1 1,8-Dimethylpyrenmercaptursäure nicht und der hOAT3 nur mit niedrigen Umsatzraten transportiert. Bei den Modulatoren zeigte die Gabe der kompetitiven Alkoholdehydrogenase-Hemmstoffe Ethanol und 4-Methylpyrazol die Bedeutung der Alkoholdehydrogenasen für die Entgiftung der benzylischen Alkohole: Die Oxidation zur entsprechenden Carbonsäure war reduziert und die Bildung der Mercaptursäure erhöht. Eine Hemmung der Toxifizierung vermittelt durch Sulfotransferase-Inhibitoren konnte nur für Pentachlorphenol beim Metabolismus des 1-Hydroxymethylpyrens beobachtet werden. Gleichzeitig erwies sich Pentachlorphenol als kompetitiver Alkoholdehydrogenase-Inhibitor, da eine signifikant geminderte Carbonsäureausscheidung zu beobachten war. Bei 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren traten diese Effekte nicht auf. Die unterschiedlichen bzw. unterschiedlich starken Effekte der Modulatoren beim Metabolismus der verschiedenen benzylischen Alkohole bestätigen die Beobachtungen aus den in-vitro-Untersuchungen, dass unterschiedliche Enzym- und Transporteraffinitäten und –aktivitäten vorliegen.
Der Fettsäurestoffwechsel unterliegt vielfältigen Kontrollmechanismen. So wird der Fettsäureabbau über die Induktion und Aktivität spezifischer Enzyme reguliert. Ein zentraler Regulator ist dabei der nukleäre Rezeptor Peroxisomenproliferator-aktivierter-Rezeptor-α (PPARα). PPARα wird durch freie Fettsäuren in der Zelle aktiviert und fördert über die Induktion von Zielgenen den Fettsäuretransport und -abbau sowie die Gluconeogenese und Ketogenese. Der Anstieg an freien Fettsäuren beim Fasten, aber auch im Diabetes aktiviert PPARα. Unabhängig davon wurde in beiden Stoffwechsellagen auch eine erhöhte Expression des nukleären Rezeptors Constitutiver-Androstan-Rezeptor (CAR) und einiger CAR-Zielgene, vorrangig Enzyme des Fremdstoffmetabolismus wie Cytochrom P450 2B (CYP2B), festgestellt. Bei der Adaption an eine Fastensituation scheinen PPARα- und CAR-Signalwege über einen bisher unbekannten Mechanismus miteinander verschaltet zu sein. In der vorliegenden Arbeit sollte der der Verschaltung zugrunde liegende Mechanismus anhand eines Modelsystems, der PPARα-Agonisten-vermittelten Verstärkung der Phenobarbital (PB)-abhängigen Induktion des CAR-Zielgens CYP2B, in vitro untersucht werden. Zudem sollte die physiologische Relevanz einer durch PPARα-Agonisten vermittelten Modulierung der CYP2B-Aktivität in einer Ganztierstudie in vivo belegt werden. Die verwendeten synthetischen PPARα-Agonisten steigerten in primären Hepatozyten der Ratte signifikant die Phenobarbital (PB)-abhängige mRNA- und Protein-Expression sowie die Aktivität von CYP2B. Ohne vorherige PB-Behandlung induzierten PPARα-Agonisten CYP2B nicht. In Gegenwart von PB war die Steigerung der CYP2B-Aktivität durch PPARα-Agonisten dosisabhängig. In einem Luciferase-Reportergenassay wurde gezeigt, dass die Induktion durch PB unter der Kontrolle des CYP2B1-Promotors von einem distalen PBREM (PB-responsive-enhancer-module), an welches CAR binden kann, abhängig war. PPARα-Agonisten steigerten diese PB- und PBREM-abhängige Reportergentranskription und induzierten die CAR-mRNA und CAR-Proteinexpression. Sie aktivierten die Transkription eines Reportergens unter der Kontrolle eines Promotorfragments von bis zu 4,4 kb oberhalb des mutmaßlichen CAR-Transkriptionsstarts. Mit Hilfe von Deletionskonstrukten konnte ein potentielles Peroxisomenproliferator-aktivierter-Rezeptor-responsives Element (PPRE) im CAR-Promotorbereich von -942 bp bis -930 bp identifiziert werden, welches essentiell für die Initiation der Transkription durch PPARα-Agonisten ist. In band shift Experimenten akkumulierte verstärkt Kernprotein mit diesem PPRE. Ein Überschuss an unmarkiertem Wildtyp-CAR-Reportergenvektor, nicht aber an CAR-Reportergenvektor mit PPRE-Deletion, konnte mit dem markierten PPRE um die Bindung von Kernprotein konkurrieren. Nach Chromatin-Immunpräzipitation mit einem PPARα-Antikörper wiederum wurde das betreffende PPRE amplifiziert. Bei in vivo Experimenten an männlichen Ratten resultierte die Behandlung mit PPARα-Agonisten in einer signifikanten Induktion der CAR-mRNA-Expression und signifikant erhöhter PB-abhängiger CYP2B-Aktivität. Die physiologisch Relevanz wurde durch weiterführenden Experimente unterstrichen, in denen gezeigt wurde, dass die Fasten-abhängige Induktion von CAR in PPARα-defizienten Mäusen unterdrückt war. Diese Experimente legen nahe, dass durch PPARα-Agonisten aktiviertes PPARα an das PPRE im CAR-Promotorbereich von -942 bp bis -930 bp bindet und dadurch die CAR-Transkription induziert. Somit kann CAR als PPARα-Zielgen betrachtet werden, was die Schlussfolgerung zulässt, dass die PPARα- und CAR-Signalwege über die direkte Bindung von PPARα an den CAR-Promotor unmittelbar miteinander verknüpft sind. Allerdings ist davon unabhängig eine Aktivierung von CAR, etwa durch PB, für die vermehrte Induktion von CAR-Zielgenen notwendig . Die physiologische Relevanz der PPARα-abhängige CAR-Expression zeigt sich in den Ganztierexperimenten, bei denen die Wirksamkeit der PPARα-Agonisten bestätigt werden konnte. CAR-abhängig induzierte Enzyme sind nicht nur in großem Umfang am Fremdstoffmetabolismus beteiligt, sondern auch am Abbau von Schilddrüsenhormonen und Glucocorticoiden. Sie können damit direkt Einfluss auf den Kohlenhydrat- und Energiestoffwechsel sowie die Regulation der Nahrungsaufnahme nehmen. Über eine PPARα-abhängige Induktion von CAR im Rahmen der Fastenadaption könnten die CAR-Zielgene UDP-Glucuronyltransferase 1A1 und Sulfotransferase N beispielsweise verstärkt Schilddrüsenhormone abbauen und in der Folge den Grundumsatz senken. Der in dieser Arbeit erstmals beschriebene Mechanismus ist dafür von zentraler Bedeutung.
Übergewicht, Diabetes oder Fettstoffwechselstörungen sind mit erniedrigten Adiponectinspiegeln assoziiert. Eine Modulation des Adiponectins kann durch genetische und metabolische Gegebenheiten erfolgen. Das Ziel dieser Arbeit war die Analyse von Faktoren, welche die Adiponectinspiegel beeinflussen können, sowie eine Charakterisierung der Oligomerverteilung unter verschiedenen metabolischen Bedingungen. In der MeSyBePo-Kohorte waren die zirkulierenden Adiponectinspiegel mit den Promotorpolymorphismen ADIPOQ -11377 C/G und ADIPOQ -11391 G/A im Adiponectingen assoziiert. Im Hinblick auf die metabolischen Faktoren korrelierte Adiponectin eng mit Parametern des Glukose- und Fettstoffwechsels sowie dem Übergewicht. Innerhalb von hyperinsulinämischen euglykämischen Clamps führte eine akute Hyperinsulinämie zu einer Abnahme der Adiponectinspiegel. Adiponectin zirkuliert im Serum als hochmolekulare (HMW), mittelmolekulare (MMW) und niedrigmolekulare (LMW) Spezies. Mit zunehmendem Körpergewicht konnte eine Verlagerung von HMW-Spezies hin zu den LMW-Spezies beobachtet werden. Durch eine moderate Gewichtsabnahme erhöhten sich die Anteile an HMW- und MMW-Adiponectin wieder. Während sich in Abhängigkeit vom Glukosemetabolismus keine Unterschiede in den Gesamtspiegeln ergaben, wurden bei Personen mit normaler Glukosetoleranz signifikant höhere Anteile an MMW-Adiponectin detektiert als bei Personen mit einem gestörten Glukosestoffwechsel. Insgesamt scheinen die HMW- und MMW-Spezies gegensätzlich zur LMW-Spezies reguliert zu werden. Die Arbeit unterstreicht die wichtige Rolle des Adiponectins im Glukose- und Fettstoffwechsel sowie bei einer Adipositas in vivo. Dabei waren Änderungen der Adiponectinspiegel bei Vorliegen von Insulinresistenz und Adipositas stets mit einer Umverteilung der Oligomerfraktionen verbunden. Vor allem die HMW- und MMW-Spezies des Adiponectins scheinen von entscheidender Bedeutung zu sein.
Vitamin E ist der Überbegriff für 4 Tocopherole (α, β, γ und δ) sowie 4 Tocotrienole (α, β, γ und δ), die als gemeinsames Merkmal ein Chromanolringsystem sowie eine gesättigte (Tocopherole) bzw. ungesättigte (Tocotrienole) Seitenkette aufweisen. Neben ihrer antioxidativen Wirkung (Schutz von Membranen vor Lipidperoxidaton) konnten für einige Vitamin E - Formen auch eine Reihe von hochspezifischen, nicht-antioxidativen Wirkungen in vitro nachgewiesen werden. Meist bleibt jedoch unklar, ob ein solcher Effekt auch in vivo, also im Tiermodel oder direkt im Menschen, gefunden werden kann. In erster Linie müsste hierbei geklärt werden, ob die jeweilige Vitamin E - Form auch bioverfügbar, also in für eine Wirkung ausreichender Konzentration im Organismus vorhanden ist, oder aber vorher eliminiert und ausgeschieden wird. In dieser Doktorarbeit wurden deshalb wichtige Grundlagen zum Abbau der Tocopherole und Tocotrienole erarbeitet. • In HepG2-Zellen konnte der Abbau der Tocotrienole mit Hilfe flüssig- sowie gaschromatographischer Analysemethoden vollständig aufgeklärt werden. Wie sich hierbei ergab, verläuft der Abbau weitgehend in Analogie zum Abbau der Tocopherole über eine durch Cytochrom P450 katalysierte initiale ω-Hydroxylierung mit 5 nachfolgenden β-Oxidationsschritten. • In vitro konnten in HepG2 – Zellen die Abbauraten der verschiedenen Vitamin E - Formen bestimmt werden. Dies nahmen in folgender Reihenfolge zu: α-Tocopherol < γ-Tocopherol < α-Tocotrienol < γ-Tocotrienol. • Wie sich mit Hilfe eines mit Cytochrom P450 hochangereicherten Homogenats aus Rattenlebern ergab, stellt die initiale ω-Hydroxylierung einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Abbaus dar: α-Tocopherol wurde weit langsamer hydroxyliert als alle anderen Vitamin E – Formen. • Der unterschiedliche Abbau von α-Tocopherol und γ-Tocotrienol konnte auch im Mäuseversuch in vivo bestätigt werden. Nach Fütterung von Mäusen mit α-Tocopherol wurden nur geringe Mengen von α-Tocopherolmetaboliten im Urin der Mäuse gefunden, während nach Applikation von γ-Tocotrienol hohe Konzentrationen der γ-Tocotrienolmetabolite nachgewiesen wurden. In Plasma und Leber wiederum wurden (dem Futtergehalt entsprechende) hohe α-Tocopherolkonzentrationen entdeckt, während γ-Tocotrienol selbst nach hoher Gabe nicht oder nur in Spuren nachweisbar war. In HepG2 – Zellen konnte gezeigt werden, dass γ-Tocotrienol eine cytotoxische Wirkung auf die Hepatocarcinoma-Zelllinie HepG2 entfalten kann, indem durch die Aktivierung der proteolytischen Caspase 3 die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) ausgelöst wird. Abschliessend lässt sich festhalten, dass der Körper lediglich das natürliche α-Tocopherol vor dem Abbau bewahrt, die anderen Vitamin E – Formen jedoch als Fremdstoffe behandelt und rapide ausscheidet. Als doppelter Schutz vor Verlust des “wertvollen” α-Tocopherol dienen hierbei das α-Tocopherol Transfer Protein sowie die in dieser Arbeit gefundenen Unterschiede im ersten Schritt des Abbaus, der Cytochrom P450 - katalysierten ω-Hydroxylierung. Beides erklärt die bevorzugte Retention von α-Tocopherol im Organsimus und seine hohe Bioaktivität. Will man deshalb in vitro Ergebnisse anderer Vitamin E – Formen auf die in vivo Situation übertragen, muss man die geringe Bioverfügbarkeit dieser Substanzen berücksichtigen.
Alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (alk-PAK) kommen zusammen mit rein aromatischen polyzyklischen Kohlenwasserstoffen u.a. im Zigarettenrauch, Dieselabgasen sowie einigen Lebensmitteln (z.B. Freilandgemüse, planzliche Öle und Fette) vor. Benzylische Hydroxylierung und nachfolgende Sulfokonjugation ist ein wichtiger Bioaktivierungsweg für einige alk-PAK. Oxidation der benzylischen Alkohole durch Alkoholdehydrogenasen (ADH) und Aldehyddehydrogenasen (ALDH) zur Carbonsäure könnte einen wichtigen Detoxifizierungsweg in Konkurrenz zur Aktivierung durch Sulfotransferasen (SULT) darstellen, was für 1-Hydroxymethylpyren in der Ratte bereits gezeigt wurde (Ma, L., Kuhlow, A. & Glatt, H. (2002). Polycyclic Aromat Compnds 22, 933-946). Durch Hemmung der ADH und/oder ALDH ist eine verstärkte Aktivierung zu erwarten, wie in der besagten Studie ebenfalls nachgewiesen wurde. Insbesondere Ethanol kommt in diesem Zusammenhang eine Rolle als möglicher Risikofaktor für alk-PAK induzierte Kanzerogenese zu. Menschen konsumieren häufig große Mengen Ethanol und oft besteht eine Koexposition mit alk-PAK (z.B. durch Rauchen). Ähnliches gilt für 5-(Hydroxymethyl)-2-furfural (HMF), einem Pyrolyseprodukt reduzierender Zucker, dem gegenüber Menschen in recht hohen Mengen exponiert sind. Auch bei HMF steht der ADH- und ALDH-vermittelte oxidative Metabolismus in Konkurrenz zu einer Aktivierung durch Sulfokonjugation. Um die Bedeutung humaner ADH und ALDH im Metabolismus von alk-PAK und von HMF aufzuklären, wurden alle bekannten humanen ADH sowie die humanen ALDH2 und 3A1 (aus theoretischen Überlegungen heraus die vielversprechendsten Formen) für kinetische Analysen in Bakterien exprimiert. Als Enzymquelle dienten zytosolische Präparationen und durch Anionenaustauschchromatographie partiell gereinigte Enzyme. In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass primäre benzylische Alkohole von Methyl- und Dimethylpyrenen gute Substrate humaner ADH sind. Sekundäre benzylische Alkohole und benzylische Alkohole von alk-PAK mit größerem Kohlenwasserstoffgrundgerüst erwiesen sich dagegen als schlechte Substrate. Vier Formen (ADH1C, 2, 3 und 4) wurden näher analysiert. Dazu wurden sie partiell gereinigt, primär um die störende endogene Bakterien-ADH zu eliminieren. Alle untersuchten ADH waren in der Lage Pyrenylmethanole zu oxidieren. Insbesondere ADH2 katalysierte die Oxidation der Pyrenylmethanole effizient, aber auch für ADH1C und 4 waren die Pyrenylmethanole gute Substrate. ADH3 oxidierte die Pyrenylmethanole mit geringer katalytischer Effizienz. Die Reduktion der entsprechenden Pyrenaldehyde durch ADH1C, 2 und 4 wurde mit noch höherer Effizienz katalysiert als die Oxidation der Pyrenylmethanole, was die Bedeutung von ALDH für die effiziente Detoxifizierung dieser Verbindungen unterstreicht. In einer an diese Arbeit angelehnten Diplomarbeit (Rost, K. (2007). Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät) wurde auch tatsächlich gezeigt, dass humane ALDH2 aber auch ALDH3A1 in der Lage sind, die Pyrenaldehyde zu Pyrenylcarbonsäuren zu oxidieren. Die bestimmten kinetischen Parameter legen nahe, dass insbesondere ALDH2 von Bedeutung für die Detoxifizierung von Methyl- und Dimethylpyrenen ist. Schon allein auf Grund der an der Detoxifizierung beteiligten Enzyme ist Ethanolaufnahme bei Koexposition mit Pyrenderivaten als Risiokofaktor anzusehen. Es ist wahrscheinlich, dass Ethanol und, nach dessen Oxidation, Acetaldehyd als konkurrierende Substrate die ADH- und ALDH-katalysierte Oxidation von Pyrenylmethanolen bzw. Pyrenaldehyden inhibieren und somit zu einer verstärkten SULT-vermittelten Aktivierung der Pyrenylmethanole führen. In der Tat wurde eine effiziente Inhibition der ADH2-katalysierten Oxidation von 1-Hydroxymethylpyren und von 1-(Hydroxymethyl)-8-methylpyren durch physiologisch relevante Ethanolkonzentrationen nachgewiesen. Drei humane ADH (4, 2 und 3), die HMF effizient zum 2,5-Diformylfuran oxidieren können, wurden identifiziert. Durch ALDH-katalysierte Weiteroxidation dieser Substanz entsteht schließlich 2,5-Furandicarbonsäure, die nach HMF-Exposition auch tatsächlich im menschlichen Urin gefunden wurde (Jellum, E., Børresen, H. C. & Eldjarn, L. (1973). Clin Chim Acta 47, 191-201). Weiter wurde gezeigt, dass ALDH3A1, aber auch ALDH2 HMF effizient zur 5-(Hydroxymethyl)-2-furancarbonsäure (HMFA) oxidieren können, ein weiterer nachgewiesener HMF Metabolit in vivo. Dass die ADH-katalysierte Oxidation von HMFA und nachfolgende ALDH-katalysierte Oxidation zur Bildung von 2,5-Furandicarbonsäure einen nennenswerten Anteil beträgt, kann aufgrund der kinetischen Daten für HMFA als Substrat humaner ADH ausgeschlossen werden. Die beobachteten Enzymaktivitäten lassen den Schluss zu, dass Ethanolaufnahme zu einer Reduktion des oxidativen HMF Metabolismus führt und somit eine Aktivierung von HMF durch Sulfokonjugation begünstigt.