Engineering formatotrophic growth in Escherichia coli
- To meet the demands of a growing world population while reducing carbon dioxide (CO2) emissions, it is necessary to capture CO2 and convert it into value-added compounds. In recent years, metabolic engineering of microbes has gained strong momentum as a strategy for the production of valuable chemicals. As common microbial feedstocks like glucose directly compete with human consumption, the one carbon (C1) compound formate was suggested as an alternative feedstock. Formate can be easily produced by various means including electrochemical reduction of CO2 and could serve as a feedstock for microbial production, hence presenting a novel entry point for CO2 to the biosphere and a storage option for excess electricity. Compared to the gaseous molecule CO2, formate is a highly soluble compound that can be easily handled and stored. It can serve as a carbon and energy source for natural formatotrophs, but these microbes are difficult to cultivate and engineer. In this work, I present the results of several projects that aim to establishTo meet the demands of a growing world population while reducing carbon dioxide (CO2) emissions, it is necessary to capture CO2 and convert it into value-added compounds. In recent years, metabolic engineering of microbes has gained strong momentum as a strategy for the production of valuable chemicals. As common microbial feedstocks like glucose directly compete with human consumption, the one carbon (C1) compound formate was suggested as an alternative feedstock. Formate can be easily produced by various means including electrochemical reduction of CO2 and could serve as a feedstock for microbial production, hence presenting a novel entry point for CO2 to the biosphere and a storage option for excess electricity. Compared to the gaseous molecule CO2, formate is a highly soluble compound that can be easily handled and stored. It can serve as a carbon and energy source for natural formatotrophs, but these microbes are difficult to cultivate and engineer. In this work, I present the results of several projects that aim to establish efficient formatotrophic growth of E. coli – which cannot naturally grow on formate – via synthetic formate assimilation pathways. In the first study, I establish a workflow for growth-coupled metabolic engineering of E. coli. I demonstrate this approach by presenting an engineering scheme for the PFL-threonine cycle, a synthetic pathway for anaerobic formate assimilation in E. coli. The described methods are intended to create a standardized toolbox for engineers that aim to establish novel metabolic routes in E. coli and related organisms. The second chapter presents a study on the catalytic efficiency of C1-oxidizing enzymes in vivo. As formatotrophic growth requires generation of both energy and biomass from formate, the engineered E. coli strains need to be equipped with a highly efficient formate dehydrogenase, which provides reduction equivalents and ATP for formate assimilation. I engineered a strain that cannot generate reducing power and energy for cellular growth, when fed on acetate. Under this condition, the strain depends on the introduction of an enzymatic system for NADH regeneration, which could further produce ATP via oxidative phosphorylation. I show that the strain presents a valuable testing platform for C1-oxidizing enzymes by testing different NAD-dependent formate and methanol dehydrogenases in the energy auxotroph strain. Using this platform, several candidate enzymes with high in vivo activity, were identified and characterized as potential energy-generating systems for synthetic formatotrophic or methylotrophic growth in E. coli. In the third chapter, I present the establishment of the serine threonine cycle (STC) – a synthetic formate assimilation pathway – in E. coli. In this pathway, formate is assimilated via formate tetrahydrofolate ligase (FtfL) from Methylobacterium extorquens (M. extorquens). The carbon from formate is attached to glycine to produce serine, which is converted into pyruvate entering central metabolism. Via the natural threonine synthesis and cleavage route, glycine is regenerated and acetyl-CoA is produced as the pathway product. I engineered several selection strains that depend on different STC modules for growth and determined key enzymes that enable high flux through threonine synthesis and cleavage. I could show that expression of an auxiliary formate dehydrogenase was required to achieve growth via threonine synthesis and cleavage on pyruvate. By overexpressing most of the pathway enzymes from the genome, and applying adaptive laboratory evolution, growth on glycine and formate was achieved, indicating the activity of the complete cycle. The fourth chapter shows the establishment of the reductive glycine pathway (rGP) – a short, linear formate assimilation route – in E. coli. As in the STC, formate is assimilated via M. extorquens FtfL. The C1 from formate is condensed with CO2 via the reverse reaction of the glycine cleavage system to produce glycine. Another carbon from formate is attached to glycine to form serine, which is assimilated into central metabolism via pyruvate. The engineered E. coli strain, expressing most of the pathway genes from the genome, can grow via the rGP with formate or methanol as a sole carbon and energy source.…
- Um den steigenden Bedarf einer wachsenden Weltbevölkerung zu decken und gleichzeitig die CO2-Emissionen zu reduzieren, ist es notwendig, CO2 aufzufangen und zu recyceln. Durch gentechnische Veränderungen von Mikroorganismen ist es möglich diese zur Produktion wertvoller organischer Verbindungen zu nutzen. Da mikrobielle Kulturen primär mit Glucose gefüttert werden und somit mit menschlicher Nahrungsversorgung konkurrieren, wurde die C1-Verbindung Formiat als alternativer bakterieller Nährstoff vorgeschlagen.. Formiat kann durch unterschiedliche Verfahren hergestellt werden, unter anderem durch elektrochemische Reduktion von CO2. Dieses Verfahren ermöglicht das Recycling von CO2 und weiterhin eine Speichermöglichkeit für überschüssige Elektrizität. Formiat ist im Vergleich zum gasförmigen CO2 gut wasserlöslich, was den Transport und die Verwendung als mikrobiellen Nährstoff erleichtert. Natürlich vorkommende formatotrophe Mikroorganismen nutzen Formiat als Kohlenstoff- und Energiequelle. Diese lassen sich allerdings meist schwierigUm den steigenden Bedarf einer wachsenden Weltbevölkerung zu decken und gleichzeitig die CO2-Emissionen zu reduzieren, ist es notwendig, CO2 aufzufangen und zu recyceln. Durch gentechnische Veränderungen von Mikroorganismen ist es möglich diese zur Produktion wertvoller organischer Verbindungen zu nutzen. Da mikrobielle Kulturen primär mit Glucose gefüttert werden und somit mit menschlicher Nahrungsversorgung konkurrieren, wurde die C1-Verbindung Formiat als alternativer bakterieller Nährstoff vorgeschlagen.. Formiat kann durch unterschiedliche Verfahren hergestellt werden, unter anderem durch elektrochemische Reduktion von CO2. Dieses Verfahren ermöglicht das Recycling von CO2 und weiterhin eine Speichermöglichkeit für überschüssige Elektrizität. Formiat ist im Vergleich zum gasförmigen CO2 gut wasserlöslich, was den Transport und die Verwendung als mikrobiellen Nährstoff erleichtert. Natürlich vorkommende formatotrophe Mikroorganismen nutzen Formiat als Kohlenstoff- und Energiequelle. Diese lassen sich allerdings meist schwierig kultivieren und genetisch verändern. In dieser Arbeit stelle ich die Ergebnisse verschiedener Projekte vor, die gemeinsam darauf abzielen, effizientes formatotrophes Wachstum von E. coli – welches natürlicherweise nicht auf Formiat wachsen kann – mittels synthetischer Formiat-Assimilierungswege zu ermöglichen. In der ersten Studie stelle ich eine Strategie für wachstumsgekoppeltes Stoffwechsel-Engineering in E. coli vor. Ich erläutere diese Strategie anhand eines Beispiels, der schrittweisen Etablierung eines synthetischen Formiat- Assimilierungswegs, des PFL-Threonin-Zyklus. Die in diesem Kapitel beschriebenen Methoden sollen einen Leitfaden für Ingenieure bereitstellen, die neue Stoffwechselwege in E. coli und verwandten Organismen etablieren wollen. Im zweiten Kapitel stelle ich eine Studie über die katalytische Effizienz von C1-oxidierenden Enzymen vor. Da formatotrophes Wachstum sowohl die Erzeugung von Energie als auch von Biomasse aus Formiat erfordert, müssen synthetisch formatotrophe E. coli Stämme mit einer hocheffizienten Formiat-Dehydrogenase ausgestattet werden, welche Reduktionsäquivalente und ATP für die Assimilierung von Formiat liefert. Um die Effizienz verschiedener Enzyme testen und vergleichen zu können, entwickelte ich einen E. coli Stamm, der aus Acetat weder Reduktionsäquivalente noch Energie für das Zellwachstum erzeugen kann. Dieser „energie-auxotrophe“ Stamm benötigt eines zusätzlichen enzymatischen Systems zur NADH-Regenerierung, um auf Acetat wachsen zu können. Ich testete verschiedene NAD-abhängige Formiat- und Methanol-Dehydrogenasen in diesem Stamm und konnte zeigen, dass Wachstum auf Acetat durch Zugabe von Formiat oder Methanol ermöglicht wurde. Dies zeigt, dass der Stamm eine zuverlässige Testplattform für C1-oxidierende Enzyme darstellt. Unter Verwendung dieser Plattform wurden mehrere Kandidatenenzyme mit hoher in vivo-Aktivität identifiziert und als Kandidatenenzyme für synthetisches formatotrophes oder methylotrophes Wachstum in E. coli charakterisiert. Im dritten Kapitel stelle ich die Etablierung des Serin-Threonin-Zyklus (STZ) – eines synthetischen Formiat-Assimilationswegs – in E. coli vor. In diesem Stoffwechselweg wird Formiat über die Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase (FtfL) aus Methylobacterium extorquens (M. extorquens) assimiliert. Der Kohlenstoff aus Formiat wird an Glycin gebunden, um Serin zu produzieren, welches im nächsten Schritt in Pyruvat umgewandelt wird und so in den zentralen Kohlenstoffmetabolismus gelangt. Über den natürlichen Threonin-Synthese- und Spaltweg wird Glycin regeneriert und Acetyl-CoA als Produkt des Stoffwechselwegs generiert. Ich entwickelte mehrere E. coli Selektionsstämme, deren Wachstum von verschiedenen STZ-Modulen abhängt, und konnte Schlüsselenzyme bestimmen, die einen hohen Reaktionsfluss durch die Threonin-Synthese und -Spaltung ermöglichen. Ich konnte zeigen, dass die Expression einer Formiat-Dehydrogenase erforderlich ist, um Wachstum auf Pyruvat über Threonin zu erreichen. Durch Integration und Überexpression der meisten Enzyme des STZ auf Genomebene und Anwendung adaptiver Laborevolution wurde Wachstum auf Glycin und Formiat erreicht, was bedeutet, dass der gesamte Serin-Threonin-Zyklus in E. coli aktiv ist. Das vierte Kapitel zeigt die Etablierung des reduktiven Glycinwegs (rGW) – eines kurzen, linearen Formiat-Assimilierungswegs – in E. coli. Wie im STZ wird Formiat über M. extorquens FtfL assimiliert. Dabei wird das Kohlenstoffatom aus Formiat mit CO2 über die umgekehrte Reaktion des Glycin-Spaltungssystems zu Glycin kondensiert. Ein weiteres Kohlenstoffatom aus Formiat wird an Glycin gebunden, um Serin zu bilden, welches über Pyruvat in den Zentralstoffwechsel gelangt. Durch Expression der rGW Enzyme auf Genomebene und adaptive Laborevolution wurde ein E. coli Stamm erzeugt welcher über den rGW auf Formiat oder Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen kann.…
