570 Biowissenschaften; Biologie
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Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des multidisziplinären Deutsch-Russischen Verbundprojektes "Laptev See 2000" erstellt. Die dargestellten bodenkundlichen und mikro-biologischen Untersuchungen verfolgten das Ziel die mikrobielle Lebensgemeinschaft eines Permafrostbodens im sibirischen Lena Delta zu charakterisieren, wobei den methanogenen Archaea besondere Beachtung zukam. Die Probennahme wurde im August 2001 im zentralen Lenadelta, auf der Insel Samoylov durchgeführt. Das Delta liegt im Bereich des kontinuierlichen Permafrostes, was bedeutet, dass nur eine flache saisonale Auftauschicht während der Sommermonate auftaut. Das untersuchte Bodenprofil lag im Zentrum eines für die Landschaft repräsentativen Low Center Polygons. Zum Zeitpunkt der Beprobung betrug die Auftautiefe des untersuchten Bodens 45 cm.. Der Wasserstand lag zum Untersuchungszeitpunkt 18 cm unter der Geländeoberfläche, so dass alle tiefer liegenden Horizonte durch anaerobe Verhältnisse charakterisiert waren. Die Untersuchung der bodenkundlichen Parameter ergab unter anderem eine mit zunehmender Tiefe abnehmende Konzentration von Kohlenstoff und Stickstoff, sowie eine Abnahme von Temperatur und Wurzeldichte. Um die Auswirkungen der sich mit der Tiefe verändernden Bodeneigenschaften auf die Mikroorganismen zu ermitteln, wurden die Mikroorganismenpopulationen der verschiedenen Bodentiefen mit Hilfe der Fluoreszenz in situ Hybridisierung hinsichtlich ihrer Anzahl, Aktivität und Zusammensetzung beschrieben. Für die Charakterisierung des physiologischen Profils dieser Gemeinschaften, bezüglich der von ihr umsetzbaren Kohlenstoffverbindungen, wurden BIOLOG Mikrotiterplatten unter den in situ Bedingungen angepassten Bedingungen eingesetzt. Die sich im Profil verändernden Bodenparameter, vor allem die abnehmende Substratversorgung, die geringe Temperatur und die anaeroben Verhältnisse in den unteren Bodenschichten führten zu einer Veränderung der Mikroorganismenpopulation im Bodenprofil. So nahm von oben nach unten die Gesamtanzahl der ermittelten Mikroorganismen von 23,0 × 108 auf 1,2 × 108 Zellen g-1 ab. Gleichzeitig sank der Anteil der aktiven Zellen von 59% auf 33%. Das bedeutet, dass im Bereich von 0-5 cm 35mal mehr aktive Zellen g-1 als im Bereich von 40-45 cm gefunden wurden. Durch den Einsatz spezieller rRNS-Sonden konn-te zusätzlich eine Abnahme der Diversität mit zunehmender Bodentiefe nachgewiesen werden. Die geringere Aktivität der Population in den unteren Horizonten sowie die Unterschiede in der Zusammensetzung wirkten sich auf den Abbau der organischen Substanz aus. So wur-den die mit Hilfe der BIOLOG Mikrotiterplatten angebotenen Substanzen in größerer Tiefe langsamer und unvollständiger abgebaut. Insbesondere in den oberen 5 cm konnten einige der angebotenen Polymere und Kohlehydrate deutlich besser als im restlichen Profil umge-setzt werden. Das außerdem unter anaeroben Versuchsbedingungen diese Substrate deutlich schlechter umgesetzt wurden, kann so interpretiert werden, dass die konstant anaeroben Bedingungen in den unteren Horizonten ein Auftreten der Arten, die diese Substrate umset-zen, erschweren. Die in den oberen, aeroben Bodenabschnitten wesentlich höheren Zellzahlen und Aktivitäten und die dadurch schnellere C-Umsetzung führen auch zu einer besseren Substratversorgung der methanogenen Archaea in den makroskopisch aeroben Horizonten. Die erhöhte Substratverfügbarkeit erklärt die Tatsache, dass im Bereich von 0-5 cm die meisten methanogenen Archaea gefunden wurden, obwohl sich dieser Bereich zum Zeitpunkt der Probennahme oberhalb des wassergesättigten Bodenbereichs befand. Trotz der aeroben Bedingungen in, liegt im Bereich von 5 10 cm die für die methanogenen Archaea am besten geeignete Kombination aus Substratangebot und anaeroben Nischen vor. Hinzu kommt, dass in diesen Tiefen die Sommertemperaturen etwas höher liegen als in den tieferen Horizonten, was wiederum die Aktivität positiv beeinflusst. Bei zusammenfassender Betrachtung der Untersuchungsergebnisse von Anzahl, Aktivität, Zusammensetzung und Leistung der gesamten, aber im besonderen auch der methanogenen Mikroorganismenpopulation wird deutlich, dass in dem untersuchten Bodenprofil unter ökologischen Gesichtspunkten die oberen 15-20 cm den für den C-Umsatz relevantesten Bereich darstellen. Das Zusammenspiel wichtiger Bodenparameter wie Bodentemperatur, Wasserstand, Nährstoffversorgung und Durchwurzelung führt dazu, dass in dem untersuchten Tundraboden in den oberen 15-20 cm eine wesentlich größere und diversere Anzahl an Mikroorganismen existiert, die für einen schnelleren und umfassenderen Kohlenstoffumsatz in diesem Bereich des active layers sorgt.
Bei konventionellen Mikroarray-Experimenten zur Genexpressionsanalyse wird fluoreszenz- oder radioaktiv-markierte cDNA oder RNA mit immobilisierten Proben hybridisiert. Für ein gut detektierbares und auswertbares Ergebnis werden jedoch pro Array mindestens 15 - 20 µg Hybridisierungstarget benötigt. Dazu müssen entweder 15 - 20 µg RNA direkt durch Reverse Transkription in markierte cDNA umgeschrieben werden oder bei Vorhandensein von weniger Startmaterial die RNA amplifiziert werden (Standard- Affymetrix-Protokolle, Klur et al. 2004). Oft sind damit zeit- und kostenintensive Probenpräparationen verbunden und das Ergebnis ist nicht immer reproduzierbar. Obwohl es inzwischen einige Protokolle gibt, die dieses Problem zu lösen versuchen (Zhang et al. 2001, Iscove et al. 2002, McClintick et al. 2003, Stirewalt et al. 2004), eine optimale, leicht handbare und reproduzierbare Methode gibt es weiterhin nicht, weshalb in dieser Arbeit ein weiterer Lösungsansatz gesucht wurde. In der vorgestellten Arbeit werden zwei einfache Methoden beschrieben, mit denen Gene aus geringen RNA-Mengen nachgewiesen werden können: erstens die On Chip- RT-PCR mit cDNA als Matrize und zweitens diese Methode als One-Step-Reaktion mit RNA als Matrize. Beide Methoden beruhen auf dem Prinzip der PCR an immobilisierten Primern auf einer Chipoberfläche. Diese Möglichkeit der exponentiellen Amplifikation ist reproduzierbar und sensitiv. In Experimenten zur Etablierung des On-Chip-PCR-Systems wurden für die Immobilisierung der Primer verschiedene Kopplungsmethoden verwendet. Die affine Kopplung über Biotin- Streptavidin erwies sich als geeignet. Die On-Chip-Reaktion an kovalent gebundenen Primern wurde für amino-modifizierte Primer auf Epoxy-Oberflächen sowie für EDC-Kopplung auf silanisierten Oberflächen gezeigt. Für die letztgenannte Methode wurde die On-Chip-PCR optimiert, dass Spottingkonzentrationen der Primer von 5 - 10µM schon ausreichend sind. Der Einsatz von fluoreszenz-markierten Primern während der PCR ermöglicht eine unmittelbare Auswertung nach der Synthese ohne zusätzliche Detektionsschritte. In dieser Arbeit konnte außerdem mit der vorgestellten Methode der simultane Nachweis zweier Gene gezeigt werden. Die Methode kann noch als Multiplex-Analyse ausgebaut werden, um so mehrere Gene in gleichzeitig einem Ansatz nachweisen zu können. Die Ergebnisse der Versuche mit Matrizen aus unterschiedlichen Zelltypen deuten darauf hin, dass die On-Chip-RT-PCR eine weitere optimale Methode für den Nachweis von gering exprimierten Genen bietet.
The multidrug and toxic compounds extrusion (MATE) family includes hundreds of functionally uncharacterised proteins from bacteria and all eukaryotic kingdoms except the animal kingdom, that function as drug/toxin::Na<sup>+ or H<sup>+ antiporters. In Arabidopsis thaliana the MATE family comprises 56 members, one of which is NIC2 (Novel Ion Carrier 2). Using heterologous expression systems including Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, and the homologous expression system of Arabidopsis thaliana, the functional characterisation of NIC2 was performed. It has been demonstrated that NIC2 confers resistance of E. coli towards the chemically diverse compounds such as tetraethylammonium chloride (TEACl), tetramethylammonium chloride (TMACl) and a toxic analogue of indole-3-acetic acid, 5-fluoro-indole-acetic acid (F-IAA). Therefore, NIC2 may be able to transport a broad range of drug and toxic compounds. In wild-type yeast the expression of NIC2 increased the tolerance towards lithium and sodium, but not towards potassium and calcium. In A. thaliana, the overexpression of NIC2 led to strong phenotypic changes. Under normal growth condtions overexpression caused an extremely bushy phenotype with no apical dominance but an enhanced number of lateral flowering shoots. The amount of rossette leaves and flowers with accompanying siliques were also much higher than in wild-type plants and the senescence occurred earlier in the transgenic plants. In contrast, RNA interference (RNAi) used to silence NIC2 expression, induced early flower stalk development and flowering compared with wild-type plants. In additon, the main flower stalks were not able to grow vertically, but instead had a strong tendency to bend towards the ground. While NIC2 RNAi seedlings produced many lateral roots outgrowing from the primary root and the root-shoot junction, NIC2 overexpression seedlings displayed longer primary roots that were characterised by a 2 to 4 h delay in the gravitropic response. In addition, these lines exhibited an enhanced resistance to exogenously applied auxins, i.e. indole-3-acetic acid (IAA) and indole-3-butyric acid (IBA) when compared with the wild-type roots. Based on these results, it is suggested that the NIC2 overexpression and NIC2 RNAi phenotypes were due to decreased or increased levels of auxin, respectively. The ProNIC2:GUS fusion gene revealed that NIC2 is expressed in the stele of the elongation zone, in the lateral root cap, in new lateral root primordia, and in pericycle cells of the root system. In the vascular tissue of rosette leaves and inflorescence stems, the expression was observed in the xylem parenchyma cells, while in siliques it was also in vascular tissue, but as well in the dehiscence and abscission zones. The organ- and tissue-specific expression sites of NIC2 correlate with the sites of auxin action in mature Arabidopsis plants. Further experiments using ProNIC2:GUS indicated that NIC2 is an auxin-inducible gene. Additionally, during the gravitropic response when an endogenous auxin gradient across the root tip forms, the GUS activity pattern of the ProNIC2:GUS fusion gene markedly changed at the upper side of the root tip, while at the lower side stayed unchanged. Finally, at the subcellular level NIC2-GFP fusion protein localised in the peroxisomes of Nicotana tabacum BY2 protoplasts. Considering the experimental results, it is proposed that the hypothetical function of NIC2 is the efflux transport which takes part in the auxin homeostasis in plant tissues probably by removing auxin conjugates from the cytoplasm into peroxisomes.
The protection of species is one major focus in conservation biology. The basis for any management concept is the knowledge of the species autecology. In my thesis, I studied the life-history traits and population dynamics of the endangered Lesser Spotted Woodpecker (Picoides minor) in Central Europe. Here, I combine a range of approaches, from empirical investigations of a Lesser Spotted Woodpecker population in the Taunus low mountain range in Germany, the analysis of empirical data and the development of an individual-based stochastic model simulating the population dynamics. In the field studies I collected basic demographic data of reproductive success and mortality. Moreover, breeding biology and behaviour were investigated in detail. My results showed a significant decrease of the reproductive success with later timing of breeding, caused by deterioration in food supply. Moreover, mate fidelity was of benefit, since pairs composed of individuals that bred together the previous year started earlier with egg laying and obtained a higher reproductive success. Both sexes were involved in parental care, but the care was only shared equally during incubation and the early nestling stage. In the late nestling stage, parental care strategies differed between sexes: Females considerably decreased feeding rate with number of nestlings and even completely deserted small broods. Males fed their nestlings irrespective of brood size and compensated for the females absence. The organisation of parental care in the Lesser Spotted Woodpecker is discussed to provide the possibility for females to mate with two males with separate nests and indeed, polyandry was confirmed. To investigate the influence of the observed flexibility in the social mating system on the population persistence, a stochastic individual-based model simulating the population dynamics of the Lesser Spotted Woodpecker was developed, based on empirical results. However, pre-breeding survival rates could not be obtained empirically and I present in this thesis a pattern-oriented modelling approach to estimate pre-breeding survival rates by comparing simulation results with empirical pattern of population structure and reproductive success on population level. Here, I estimated the pre-breeding survival for two Lesser Spotted Woodpecker populations on different latitudes to test the reliability of the results. Finally, I used the same simulation model to investigate the effect of flexibility in the mating system on the persistence of the population. With increasing rate of polyandry in the population, the persistence increased and even low rates of polyandry had a strong influence. Even when presuming only a low polyandry rate and costs of polyandry in terms of higher mortality and lower reproductive success for the secondary male, the positive effect of polyandry on the persistence of the population was still strong. This thesis greatly helped to increase the knowledge of the autecology of an endangered woodpecker species. Beyond the relevance for the species, I could demonstrate here that in general flexibility in mating systems are buffer mechanisms and reduce the impact of environmental and demographic noise.
During this PhD project three technical platforms were either improved or newly established in order to identify interesting genes involved in SNF, validate their expression and functionally characterise them. An existing 5.6K cDNA array (Colebatch et al., 2004) was extended to produce the 9.6K LjNEST array, while a second array, the 11.6K LjKDRI array, was also produced. Furthermore, the protocol for array hybridisation was substantially improved (Ott et al., in press). After functional classification of all clones according to the MIPS database and annotation of their corresponding tentative consensus sequence (TIGR) these cDNA arrays were used by several international collaborators and by our group (Krusell et al., 2005; in press). To confirm results obtained from the cDNA array analysis different sets of cDNA pools were generated that facilitate rapid qRT-PCR analysis of candidate gene expression. As stable transformation of Lotus japonicus takes several months, an Agrobacterium rhizogenes transformation system was established in the lab and growth conditions for screening transformants for symbiotic phenotypes were improved. These platforms enable us to identify genes, validate their expression and functionally characterise them in the minimum of time. The resources that I helped to establish, were used in collaboration with other people to characterise several genes like the potassium transporter LjKup and the sulphate transporter LjSst1, that were transcriptionally induced in nodules compared to uninfected roots, in more detail (Desbrosses et al., 2004; Krusell et al., 2005). Another gene that was studied in detail was LjAox1. This gene was identified during cDNA array experiments and detailed expression analysis revealed a strong and early induction of the gene during nodulation with high expression in young nodules which declines with the age of the nodule. Therefore, LjAox1 is an early nodulin. Promoter:gus fusions revealed an LjAox1 expression around the nodule endodermis. The physiological role of LjAox1 is currently being persued via RNAi. Using RNA interference, the synthesis of all symbiotic leghemoglobins was silenced simultaneously in Lotus japonicus. As a result, growth of LbRNAi lines was severely inhibited compared to wild-type plants when plants were grown under symbiotic conditions in the absence of mineral nitrogen. The nodules of these plants were arrested in growth 14 post inoculation and lacked the characteristic pinkish colour. Growing these transgenic plants in conditions where reduced nitrogen is available for the plant led to normal plant growth and development. This demonstrates that leghemoglobins are not required for plant development per se, and proves for the first time that leghemoglobins are indispensable for symbiotic nitrogen fixation. Absence of leghemoglobins in LbRNAi nodules led to significant increases in free-oxygen concentrations throughout the nodules, a decrease in energy status as reflected by the ATP/ADP ratio, and an absence of the bacterial nitrogenase protein. The bacterial population within nodules of LbRNAi plants was slightly reduced. Alterations of plant nitrogen and carbon metabolism in LbRNAi nodules was reflected in changes in amino acid composition and starch deposition (Ott et al., 2005). These data provide strong evidence that nodule leghemoglobins function as oxygen transporters that facilitate high flux rates of oxygen to the sites of respiration at low free oxygen concentrations within the infected cells.
Vitamin E : elucidation of the mechanism of side chain degradation and gene regulatory functions
(2005)
For more than 80 years vitamin E has been in the focus of scientific research. Most of the progress concerning non-antioxidant functions, nevertheless, has only arisen from publications during the last decade. Most recently, the metabolic pathway of vitamin E has been almost completely elucidated. Vitamin E is metabolized by truncation of its side chain. The initial step of an omega-hydroxylation is carried out by cytochromes P450 (CYPs). This was evidenced by the inhibition of the metabolism of alpha-tocopherol by ketoconozole, an inhibitor of CYP3A expression, whereas rifampicin, an inducer of CYP3A expression increased the metabolism of alpha-tocopherol. Although the degradation pathway is identical for all tocopherols and tocotrienols, there is a marked difference in the amount of the release of metabolites from the individual vitamin E forms in cell culture as well as in experimental animals and in humans. Recent findings not only proposed an CYP3A4-mediated degradation of vitamin E but also suggested an induction of the metabolizing enzymes by vitamin E itself. In order to investigate how vitamin E is able to influence the expression of metabolizing enzymes like CYP3A4, a pregnane X receptor (PXR)-based reporter gene assay was chosen. PXR is a nuclear receptor which regulates the transcription of genes, e.g., CYP3A4, by binding to specific DNA response elements. And indeed, as shown here, vitamin E is able to influence the expression of CYP3A via PXR in an in vitro reporter gene assay. Tocotrienols showed the highest activity followed by delta- and alpha-tocopherol. An up-regulation of Cyp3a11 mRNA, the murine homolog of the human CYP3A4, could also be confirmed in an animal experiment. The PXR-mediated change in gene expression displayed the first evidence of a direct transcriptional activity of vitamin E. PXR regulates the expression of genes involved in xenobiotic detoxification, including oxidation, conjugation, and transport. CYP3A, e.g., is involved in the oxidative metabolism of numerous currently used drugs. This opens a discussion of possible side effects of vitamin E, but the extent to which supranutritional doses of vitamin E modulate these pathways in humans has yet to be determined. Additionally, as there is arising evidence that vitamin E's essentiality is more likely to be based on gene regulation than on antioxidant functions, it appeared necessary to further investigate the ability of vitamin E to influence gene expression. Mice were divided in three groups with diets (i) deficient in alpha-tocopherol, (ii) adequate in alpha-tocopherol supply and (iii) with a supranutritional dosage of alpha-tocopherol. After three months, half of each group was supplemented via a gastric tube with a supranutritional dosage of gamma-tocotrienol per day for 7 days. Livers were analyzed for vitamin E content and liver RNA was prepared for hybridization using cDNA array and oligonucleotide array technology. A significant change in gene expression was observed by alpha-tocopherol but not by gamma-tocotrienol and only using the oligonucleotide array but not using the cDNA array. The latter effect is most probably due to the limited number of genes represented on a cDNA array, the lacking gamma-tocotrienol effect is obviously caused by a rapid degradation, which might prevent bioefficacy of gamma-tocotrienol. Alpha-tocopherol changed the expression of various genes. The most striking observation was an up-regulation of genes, which code for proteins involved in synaptic transmitter release and calcium signal transduction. Synapsin, synaptotagmin, synaptophysin, synaptobrevin, RAB3A, complexin 1, Snap25, ionotropic glutamate receptors (alpha 2 and zeta 1) were shown to be up-regulated in the supranutritional group compared to the deficient group. The up-regulation of synaptic genes shown in this work are not only supported by the strong concentration of genes which all are involved in the process of vesicular transport of neurotransmitters, but were also confirmed by a recent publication. However, a confirmation by real time PCR in neuronal tissue like brain is now required to explain the effect of vitamin E on neurological functionality. The change in expression of genes coding for synaptic proteins by vitamin E is of principal interest thus far, since the only human disease directly originating from an inadequate vitamin E status is ataxia with isolated vitamin E deficiency. Therefore, with the results of this work, an explanation for the observed neurological symptoms associated with vitamin E deficiency can be presented for the first time.
Für ein tiefergehendes Verständnis von Entwicklung und Funktion der quergestreiften Muskulatur ist eine Betrachtung der am Aufbau der Myofibrillen, den kontraktilen Organellen, beteiligten Proteine essentiell. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Myomesin, einem Protein der sarkomeren M-Bande. Zunächst wurde die cDNA des humanen Myomesins vollständig kloniert, sequenziert und nachfolgend die komplette Größe der aminoterminalen Kopfdomäne bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß Myomesin in vitro mit den Domänen 1 und 12 an Myosin bindet. Die muskelspezifische Isoform der Kreatinkinase bindet an die Domänen 7 und 8. Stimulations- und Inhibitionsexperimente belegen, daß Myomesin an Serin 618 in vivo durch die Proteinkinase A phosphoryliert wird und daß diese Phosphorylierung durch Aktivierung beta2-adrenerger Rezeptoren stimulierbar ist. In Muskelgewebeproben von Patienten, die an der Hypertrophen Kardiomyopathie, einer genetisch bedingten Herzmuskelkrankheit, erkrankt sind, konnte mit einem neu hergestellten phosphorylierungsabhängigen Antikörper eine Verminderung der Menge phosphorylierten Myomesins nachgewiesen werden. Mögliche Ursachen werden diskutiert. Myomesin bildet Dimere, wie durch hefegenetische und biochemische Experimente gezeigt werden konnte. Die Dimerisierung von Myomesin könnte eine zentrale Rolle für den Einbau der Myosinfilamente in die naszierende Myofibrille haben. Anhand der gewonnenen Daten wurde ein verbessertes Modell der zentralen M-Bande erstellt.
Even though the structure of the plant cell wall is by and large quite well characterized, its synthesis and regulation remains largely obscure. However, it is accepted that the building blocks of the polysaccharidic part of the plant cell wall are nucleotide sugars. Thus to gain more insight into the cell wall biosynthesis, in the first part of this thesis, plant genes possibly involved in the nucleotide sugar interconversion pathway were identified using a bioinformatics approach and characterized in plants, mainly in Arabidopsis. For the computational identification profile hidden markov models were extracted from the Pfam and TIGR databases. Mainly with these, plant genes were identified facilitating the “hmmer” program. Several gene families were identified and three were further characterized, the UDP-rhamnose synthase (RHM), UDP-glucuronic acid epimerase (GAE) and the myo-inositol oxygenase (MIOX) families. For the three-membered RHM family relative ubiquitous expression was shown using variuos methods. For one of these genes, RHM2, T-DNA lines could be obtained. Moreover, the transcription of the whole family was downregulated facilitating an RNAi approach. In both cases a alteration of cell wall typic polysaccharides and developmental changes could be shown. In the case of the rhm2 mutant these were restricted to the seed or the seed mucilage, whereas the RNAi plants showed profound changes in the whole plant. In the case of the six-membered GAE family, the gene expressed to the highest level (GAE6) was cloned, expressed heterologously and its function was characterized. Thus, it could be shown that GAE6 encodes for an enzyme responsible for the conversion of UDP-glucuronic acid to UDP-galacturonic acid. However, a change in transcript level of variuos GAE family members achieved by T-DNA insertions (gae2, gae5, gae6), overexpression (GAE6) or an RNAi approach, targeting the whole family, did not reveal any robust changes in the cell wall. Contrary to the other two families the MIOX gene family had to be identified using a BLAST based approach due to the lack of enough suitable candidate genes for building a hidden markov model. An initial bioinformatic characterization was performed which will lead to further insights into this pathway. In total it was possible to identify the two gene families which are involved in the synthesis of the two pectin backbone sugars galacturonic acid and rhamnose. Moreover with the identification of the MIOX genes a genefamily, important for the supply of nucleotide sugar precursors was identified. In a second part of this thesis publicly available microarray datasets were analyzed with respect to co-responsive behavior of transcripts on a global basis using nearly 10,000 genes. The data has been made available to the community in form of a database providing additional statistical and visualization tools (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de). Using the framework of the database to identify nucleotide sugar converting genes indicated that co-response might be used for identification of novel genes involved in cell wall synthesis based on already known genes.
Durch die anthropogene Nutzung sind viele Auen in Mitteleuropa verändert worden, wobei insbesondere die Retentionsflächen stark verringert wurden. Während Auen seit längerem im Fokus der wissenschaftlichen Bearbeitung stehen, gibt es bisher große Wissensdefizite in der Frage der Auenreaktivierungen. Zum einen sind derartige Projekte bisher kaum verwirklicht und zum anderen ist ein langfristiges Monitoring notwendig, um die Anpassung von Biozönosen an die veränderten Standortbedingungen beobachten zu können. Um die Folgen derartiger Eingriffe zu analysieren, bieten sich computergestützte Modellierungen der Landschaftsentwicklung an, wie sie in der vorliegenden Arbeit verwirklicht wurden. Ziel der Arbeit war, mit Hilfe eines Geografischen Informationssystems (GIS) das Entwicklungspotenzial der Landschaft bei verschiedenen Rückdeichungsvarianten auf der Ebene der Biotoptypen darzustellen. Dabei ging es nicht um die Erstellung eines allgemein gültigen Auenmodells sondern um die Erarbeitung eines Modells für einen konkreten Anwendungsfall. Der erarbeitete Ansatz sollte zudem für die landschaftsplanerische Praxis geeignet sein. Als Beispielgebiete wurden Flächen an der Mittleren Elbe bei Rogätz und Sandau, beide im nördlichen Teil von Sachsen-Anhalt, ausgewählt. Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Im ersten Teil werden Erhebungen und Auswertungen als Grundlage der Modellentwicklung dargestellt. Dazu wurden die Biotoptypen der Beispielgebiete flächendeckend erhoben und mit punktuellen Vegetationserhebungen ergänzt. Aus dem Forschungsprojekt "Rückgewinnung von Retentionsflächen und Altauenreaktivierung an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt" des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) standen standortökologische Daten der Hydrologie und Bodenkunde zur Verfügung. Ziel der Auswertung war, Schlüsselfaktoren für Hydrologie und Bodenbedingungen innerhalb der rezenten Aue zu identifizieren, die zur Ausprägung bestimmter Biotoptypen führen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Modell für Biotoptypenpotenziale auf den geplanten Rück–deichungsflächen entwickelt. Das Modell bearbeitet die Datenbank der verwendeten GIS-Dateien, die auf Daten zum Bestand beruht und um solche der Prognose der Standortökologie (Hydrologie und Boden) im Rückdeichungsfalle aus dem BMBF-Projekt erweitert wurde. Weitere Voraussetzung für die Modellierung war die Erarbeitung von Leitbildern, in denen unterschiedliche Nutzungsszenarios für die Landschaft nach Deichrückverlegung hypothetisch festgelegt wurden. Insbesondere die Nutzungsintensität wurde variiert, von einer Variante intensiver land- und forstwirtschaftlicher Nutzung über sogenannte integrierte Entwicklungsziele aus dem BMBF-Projekt bis hin zu einer Variante der Naturschutznutzung. Zusätzlich wurde eine zukünftige Potentielle Natürliche Vegetation modelliert. Eine Überprüfung des Modell fand für den Raum der rezenten Aue in der intensiven Nutzungsvariante statt, die der gegenwärtigen Nutzung am nächsten kommt. Werden Informationen des Bestandsbiotoptyps als Korrekturgröße in das Modell einbezogen, konnte für viele Biotoptypen eine Trefferquote von über 90 % erreicht werden. Bei flächenmäßig weniger bedeutenden Bio–toptypen lag dieser Wert aufgrund der schmaleren Datenbasis zwischen 20 und 40 %. Als Ergebnis liegt für unterschiedliche Deichvarianten und Leitbilder in den Beispielgebieten die Landschaftsentwicklung als Biotoppotenzial vor. Als eine vereinfachte Regionalisierung der punktuellen Vegetationsdaten wurde im Modell geprüft, inwieweit die modellierten Biotopflächen der Charakteristik der pflanzensoziologischen Aufnahmen aus der rezenten Aue entsprechen. In dem Falle wurde die Pflanzengesellschaft der jeweiligen ökologisch im Rahmen der Untersuchung einheitlichen Flächeneinheit zugeordnet. Anteilig lässt sich damit die Biotopprognosefläche pflanzensoziologisch konkretisieren. Die vorliegende Arbeit gehört zu den bisher wenigen Arbeiten, die sich mit den Folgen von Auenreaktivierung auf die Entwicklung der Landschaft auseinandersetzen. Sie zeigt eine Möglichkeit auf, Prognosemodelle für Biotoptypen und Vegetation anhand begrenzter Felduntersuchungen zu entwerfen. Derartige Modelle können zum Verständnis von Eingriffen in den Naturhaushalt, wie sie die Deichrückverlegungen darstellen, beitragen und eine Folgenabschätzung unterstützen.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen Signaltransduktionsprozesse in den Strukturen der Kraftübertragung quergestreifter Muskelzellen, d. h. in den Costameren (Zell-Matrix-Kontakten) und den Glanzstreifen (Zell-Zell-Kontakten der Kardiomyozyten).Es ließ sich zeigen, dass sich die Morphologie der Zell-Matrix-Kontakte während der Differenzierung von Skelettmuskelzellen dramatisch ändert, was mit einer veränderten Proteinzusammensetzung einhergeht. Immunfluoreszenz-Analysen von Skelettmuskelzellen verschiedener Differenzierungsstadien implizieren, dass die Signalwege, welche die Dynamik der Fokalkontakte in Nichtmuskelzellen bestimmen, nur für frühe Stadien der Muskeldifferenzierung Relevanz haben können. Ausgehend von diesem Befund wurde begonnen, noch unbekannte Signalwege zu identifizieren, welche die Ausbildung von Costameren kontrollieren: In den Vorläuferstrukturen der Costamere gelang es, eine transiente Interaktion der Proteine Paxillin und Ponsin zu identifizieren. Biochemische Untersuchungen legen nahe, dass Ponsin über eine Skelettmuskel-spezifische Insertion im Carboxyterminus das Adapterprotein Nck2 in diesen Komplex rekrutiert. Es wird vorgeschlagen, dass die drei Proteine einen ternären Signalkomplex bilden, der die Umbauvorgänge der Zell-Matrix-Kontakte kontrolliert und dessen Aktivität von mitogen activated protein kinases (MAPK) reguliert wird.Die Anpassungsvorgänge der Strukturen der Kraftübertragung an pathologische Situtation (Kardiomyopathien) in der adulten quergestreiften Muskulatur wurden ausgehend von einem zweiten Protein, dem muscle LIM protein (MLP), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein mutiertes MLP-Protein, das im Menschen eine hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) auslöst, strukturelle Defekte aufweist und weniger stabil ist. Weiterhin zeigte dieses mutierte Protein eine verringerte Bindungsfähigkeit an die beiden Liganden N-RAP und alpha-Actinin. Die molekulare Grundlage der HCM-verursachenden Mutationen im MLP-Gen könnte folglich eine Veränderung der Homöostase im ternären Komplex MLP – N-RAP – alpha-Actinin sein. Die Expressionsdaten eines neu generierten monoklonalen MLP-Antikörpers deuten darauf hin, dass die Funktionen des MLP nicht nur für die Integrität des Myokards, sondern auch für die der Skelettmuskulatur notwendig sind.
Für das Verständnis der Strukturbildung bei Proteinen ist es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilität und Faltung zu verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Erörterung von Gesetzmäßigkeiten zu den Faltungseigenschaften von globulären Proteinen investiert. Die große Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat- (LRR-) oder Ankyrin-Proteine gehören, wurde dahingegen noch wenig untersucht. Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelförmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Tertiärstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Stabilität und Faltung eines LRR-Proteins mittels verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als Untersuchungsobjekt diente die für die Infektion ausreichende zentrale LRR-Domäne des Invasionsproteins Internalin B (InlB241) des Bakteriums Listeria monocytogenes. Des weiteren sollten die Integrität und die Stabilitäts- und Faltungseigenschaften der sogenannten Internalin-Domäne (InlB321) untersucht werden. Hierbei handelt es sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Domäne, welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Domäne mit einer Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domäne besteht. Von beiden Konstrukten konnte eine vollständige thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw. thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungsübergängen durchgeführt werden. Sowohl InlB241 als auch InlB321 zeigen einen reversiblen und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichtsübergänge, was die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte. Die zusätzliche Ig-ähnliche Domäne im InlB321 resultierte im Vergleich zum InlB241 in einer Erhöhung der freien Enthalpie der Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese Stabilitätszunahme äußerte sich sowohl in einer Verschiebung des Übergangsmittelpunktes zu höheren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch in einer Erhöhung der Kooperativität des Gleichgewichtsübergangs (9.7 kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Domäne nicht unabhängig voneinander falten und dass die Ig-ähnliche Domäne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor während der Invasion interagiert, eine kritische Rolle für die <i style='mso-bidi-font-style:normal'>in vivo Stabilität des Internalin B spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativität des Übergangs die Integrität der Internalin-Domäne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen keine Intermediate vorliegen. Kinetische Messungen über Tryptophanfluoreszenz und Fern-UV<span style='color:red'> </span>Circulardichroismus deuteten auf die Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der LRR-Domäne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH 2 denaturierten Zustand zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen über ein Intermediat. Eine Erhöhung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins führte zu einer Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im Übergang zu einem alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Domäne deuteten kinetische Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals während der Entfaltung möglicherweise auf die Präsenz von zwei Prozessen hin. Der erste langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem Übergangsmittelpunkt zeigte eine starke Abhängigkeit von der Temperatur, während der zweite schnellere Prozess der Entfaltung stärker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing. Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten für die Erklärung der langsamen Faltungsphase zunächst keinen Hinweis auf dass Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollständige Amplitude während der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann. Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die InlB-Konstrukte als Modelle für die Untersuchung der Faltung von Solenoidproteinen verwendet werden können.<span lang=EN-GB style='mso-ansi-language: EN-GB'><o:p></o:p></span>
Charakterisierung von ausgewählten Protein-Phosphatasen und MATE-Proteinen aus Arabidopsis thaliana
(2004)
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression der Protein Phosphatase-gene TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 und STH2 analysiert. Alle fünf ausgewählten Gene kodieren für PP des PP1/PP2A-Typs. Es wurde untersucht, ob homologen PP-Isoformen individuelle Expressionsmuster zugewiesen werden konnten. Besonderes Augenmerk richtete sich dabei auf die Expression von PP-Genen in den Schließzellen von A. thaliana. In mehreren Inhibitorstudien wurde beschrieben, dass PP1/PP2A-Proteine eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion pflanzlicher Schließzellen spielen. Bisher konnte allerdings noch keine der entsprechenden katalytischen Untereinheiten auf molekularer Ebene identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass mit TOPP1 ein Protein des PP1-Typs präferenziell in den Schließzellen von A. thaliana exprimiert wird. Ein Vergleich der Genexpression von TOPP1, TOPP2 und TOPP5 zeigte für die drei homologen Gene sehr Isoform-spezifische Expressionsmuster. Dies war ein deutlicher Hinweis, dass diese eng verwandten PP trotz großer Übereinstimmung auf Aminosäureebene vermutlich unterschiedliche Funktionen in planta haben. Die Untersuchung der Genexpression von STH1 und STH2 zeigte, dass die fast identischen Proteine zum Teil in unterschiedlichen Geweben vorkommen. Die Transkripte der beiden Gene, welche eine eigene Untergruppe von PP2A-verwandten Sequenzen bilden, konnten aus EF isoliert werden. Der in dieser Arbeit entwickelte Screeningansatz ermöglichte es, die sehr ähnlichen cDNA-Fragmente eindeutig voneinander zu unterscheiden. Die gefundenen Isoform-spezifischen Expressionsmuster waren ein deutlicher Hinweis auf unterschiedliche Funktionen in planta. Zur weiteren Untersuchung der PP-Funktionen in planta wurden Pflanzen mit veränderter Genaktivität von TOPP2 oder STH1 untersucht. In Pflanzen mit RNAi-vermittelter Reduktion des TOPP2-Transkriptgehalts ließ sich ein deutlich verändertes Blattwachstum beobachten. Die eingerollten oder asymmetrisch entwickelten Blätter waren vermutlich ein Hinweis, dass diese PP1-Isoform auch in A. thaliana eine Rolle bei der Zellteilung spielt. Für TOPP2-Expression in Hefen wurde diese Funktion schon nachgewiesen. Die Analyse von Insertions-mutanten mit T-DNA Insertionen in beiden STH1-Allelen waren neben den Expressions-studien ein weiterer Hinweis, dass sich STH1 nicht funktionell durch STH2 ersetzen lässt. Die Experimente in dieser Arbeit zeigten, dass das Fehlen der STH1-Genaktivität zu einem deutlichen Blattphänotyp mit gezahnten Blatträndern führte. Für STH2-Insertionsmutanten wurde dieses veränderte Wachstum nicht beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Gen NIC1, welches für ein MATE-Membranprotein kodiert, identifiziert und charakterisiert. Die Sequenzierung des Genoms von A. thaliana hatte gezeigt, dass mindestens 56 MATE-Gene in dieser Pflanze vorhanden sind. Zum Zeitpunkt der Identifikation von NIC1 war keines dieser Gene charakterisiert. Außer für das MATE-Protein ERC1 aus S. cerevisiae gab es keine Studien zu eukaryotischen Mitgliedern dieser großen Familie von Membranproteinen. Anhand NIC1 wurden heterologe Expressionssysteme zur funktionellen Charakterisierung von MATE-Proteinen aus Pflanzen etabliert. Die cDNA von NIC1 wurde nach ihrer Klonierung in X. laevis Oozyten und S. cerevisiae exprimiert. In S. cerevisiae erhöhte die NIC1-Expression die Lithumtoleranz der Hefen und führte zu einer Verminderung der Natriumtoleranz. Parallele Versuche mit NIC2 und NIC4 (in den Diplomarbeiten von Blazej Dolniak und Mandy Kursawe) zeigten, dass auch diese beiden Proteine die Salztoleranz von S. cerevisiae beeinflussten. Während NIC2 die Lithium- und Natriumtoleranz erhöhte, führte NIC4-Expresion zu einer höheren Sensibilität gegenüber diesen beiden Kationen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der drei homologen Proteine zeigten sich auch bei ihrer Expression in X. laevis Oozyten. NIC1 induzierte in den Oozyten auswärts gerichtete Chloridströme, die spannungsabhängig waren und durch mikromolare Konzentrationen der trivalenten Kationen Lanthan oder Gadolinium inhibiert werden konnten. NIC4 induzierte Barium-inhibierbare Kaliumströme, die spannungsunabhängig waren. Für NIC2 ließ sich in diesem Expressionssystem keine Aktivität detektieren. Zur Untersuchung der NIC1-Funktion in planta wurde die Genaktivität in transgenen Pflanzen lokalisiert und reduziert. Die NIC1-Genexpression war hauptsächlich in den vaskulären Geweben der Pflanze detektierbar und einer Verminderung des NIC1-Transkriptgehalts beeinflusste die Entwicklungsgeschwindigkeit der Pflanzen. Sie entwickelten sich deutlich langsamer als der parallel kultivierte Wildtyp. Der deutliche Phänotyp bei Veränderung der Genaktivität von nur einem der mindestens 56 vorhandenen MATE-Gene in A. thaliana zeigte, dass vermutlich keine weitere MATE-Isoform in der Lage ist, die Funktion von NIC1 zu übernehmen.
The past decades are characterized by various efforts to provide complete sequence information of genomes regarding various organisms. The availability of full genome data triggered the development of multiplex high-throughput assays allowing simultaneous measurement of transcripts, proteins and metabolites. With genome information and profiling technologies now in hand a highly parallel experimental biology is offering opportunities to explore and discover novel principles governing biological systems. Understanding biological complexity through modelling cellular systems represents the driving force which today allows shifting from a component-centric focus to integrative and systems level investigations. The emerging field of systems biology integrates discovery and hypothesis-driven science to provide comprehensive knowledge via computational models of biological systems. Within the context of evolving systems biology, investigations were made in large-scale computational analyses on transcript co-response data through selected prokaryotic and plant model organisms. CSB.DB - a comprehensive systems-biology database - (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/) was initiated to provide public and open access to the results of biostatistical analyses in conjunction with additional biological knowledge. The database tool CSB.DB enables potential users to infer hypothesis about functional interrelation of genes of interest and may serve as future basis for more sophisticated means of elucidating gene function. The co-response concept and the CSB.DB database tool were successfully applied to predict operons in Escherichia coli by using the chromosomal distance and transcriptional co-responses. Moreover, examples were shown which indicate that transcriptional co-response analysis allows identification of differential promoter activities under different experimental conditions. The co-response concept was successfully transferred to complex organisms with the focus on the eukaryotic plant model organism Arabidopsis thaliana. The investigations made enabled the discovery of novel genes regarding particular physiological processes and beyond, allowed annotation of gene functions which cannot be accessed by sequence homology. GMD - the Golm Metabolome Database - was initiated and implemented in CSB.DB to integrated metabolite information and metabolite profiles. This novel module will allow addressing complex biological questions towards transcriptional interrelation and extent the recent systems level quest towards phenotyping.
Environmental stresses such as drought, high salt and low temperature affect plant growth and decrease crop productivity extremely. It is important to improve stress tolerance of the crop plant to increase crop yield under stress conditions. The Arabidopsis thaliana salt tolerance 1 gene (AtSTO1) was originally identified by Lippuner et al., (1996). In this study around 27 members of STO-like proteins were identified in Arabidopsis thaliana, rice and other plant species. The STO proteins have two consensus motifs (CCADEAAL and FCV(L)EDRA). The STO family members can be regarded as a distinct class of C2C2 proteins considering their low sequence similarity to other GATA like proteins and poor conservation in the C-terminus. AtSTO1 was found to be induced by salt, cold and drought in leaves and roots of 4-week-old Arabidopsis thaliana wild-type plants. The expression of AtSTO1 under salt and cold stress was more pronounced in roots than in leaves. The data provided here revealed that the AtSTO1 protein is localized in the nucleus. The observation that AtSTO1 localizes in the nucleus is consistent with its proposed function as a transcription factor. AtSTO1-dependent phenotypes were observed when plant were grown at 50 mM NaCl on agar plates. Leaves of AtSTO1 overexpression lines were bigger with dark green coloration, whereas stunted growth and yellowish leaves were observed in wild-type and RNAi plants. Also, the AtSTO1 overexpression plants when exposed to long-term cold stress had a red leaf coloration which was much stronger than in wild-type and RNAi lines. Growth of AtSTO1 overexpression lines in long term under salt and cold stress was always associated with long roots which was more pronounced than in wild-type and RNAi lines. Proline accumulation increased more strongly in leaves and roots of AtSTO1 overexpression lines than in tissues of wild-type and RNAi lines when treated with 200 mM NaCl, exposed to cold stress or when watering was prevented for one day or two weeks. Also, soluble sugar content increased to higher levels under salt, cold and drought stress in AtSTO1 overexpression lines when compared to wild-type and RNAi lines. The increase in soluble sugar content was detected in AtSTO1 overexpression lines after long-term (2 weeks) growth of plants under these stresses. Anthocyanins accumulated in leaves of AtSTO1 overexpression lines when exposed to long term salt stress (200 mM NaCl for 2 weeks) or to 4°C for 6 and 8 weeks. Also, anthocyanin content was increased in flowers of AtSTO1 overexpression plants kept at 4°C for 8 weeks. Taken together these data indicate that overexpression of AtSTO1 enhances abiotic stress toleranc via a more pronounced accumulation of compatible solutes under stress.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. Für die Analyse wurde ein faseroptischer Affinitätssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensität. Die Versuche am faseroptischen Affinitätssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied lässt sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten kD quantitativ erfassen. Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfläche sowie die Hybridisierungs- und Dissoziationsparameter essentiell für die Methodenentwicklung war, wurden die Parameter für ein optimales Spotting und die Immobilisierung von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberflächen sowie die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode. Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenität als auch im Signal/Rausch-Verhältnis wurden an NeutrAvidin-Oberflächen erreicht. Für die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenlänge, Puffersystem, Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glasträger zu spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden erreicht werden. In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch mit der Analyse der Fluoreszenzintensität wurde der Genotyp der Proben identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse (PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die Genauigkeit lag bei 96%. In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen bestätigt werden. Ursache für die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte Signal/Rausch-Verhältnis. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte Analysesystem für die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet ist, homocygote Patientenproben zuverlässig zu analysieren. Prinzipiell ist das auch bei heterocygoter DNA möglich. Da nach aktuellem Kenntnisstand eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht veröffentlicht wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist sich der reverse Ansatz der Methode. Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kostengünstigere und weniger hoch dimensionierte Lösung für Fragestellungen beispielsweise in der Ernährungswissenschaft, bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann diese Methode zukünftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden.
Die immunologische Kontrazeption mittels Zona pellucida (ZP) Proteinen gilt als vielversprechender Ansatz für die Reproduktionskontrolle verwilderter Haus- und Wildtierbestände. Da die Applikation von nativer ZP mit Nebenwirkungen verbunden ist, wird die Verwendung einzelner ZP Peptide als Bestandteil kontrazeptiver Vakzine als besonders aussichtsreich erachtet. Das Prinzip dieser nebenwirkungsfreien ZP Immunisierung ist die gezielte Trennung der Entzündungsreaktionen auslösenden T-Zell-Epitope der ZP von den kontrazeptiv wirkenden B-Zell-Epitopen. Niedermolekulare synthetische oder rekombinante Peptide allein sind gering immunogen und können somit keine ausreichende Immunantwort induzieren. Die Verwendung von Peptiden für die immunologische Kontrazeption erfordert daher ein „Vakzin-Design“, d. h. die gezielte Kombination der Peptide mit immunstimulierenden Substanzen (Liposomen, Carrierproteinen, Adjuvantien). Zielstellung der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Potentials synthetischer Peptide für die Immunokontrazeption von verwilderten Hauskatzen (Felis catus). Dazu wurden zunächst relevante B-Zell-Epitope des felinen Zona pellucida Proteins, ZPB2, identifiziert und synthetisiert. Zwei der synthetischen Peptide (P3, P6) wurden zur Herstellung von Antikörpern an BSA konjugiert und zusammen mit Freundschem Adjuvans in Ratten verimpft. Die kontrazeptive Relevanz beider Peptide sowie der Ratten Anti-Peptid Antiseren wurde im in vitro Befruchtungssystem der Hauskatze geprüft. Zur Untersuchung der Immunogenität der Peptide in der Zielspezies Hauskatze erfolgte die Entwicklung von Vakzin-Prototypen für die einmalige Applikation. Neben der Eruierung der Stärke und Dauer der Immunantwort wurde durch Verpaarung der Tiere auch das kontrazeptive Potential in vivo abgeschätzt.
The overall objective of the study is an elaboration of quantitative methods for national conservation planning, coincident with the international approach ('hotspots' approach). This objective requires a solution of following problems: 1) How to estimate large scale vegetation diversity from abiotic factors only? 2) How to adopt 'global hotspots' approach for bordering of national biodiversity hotspots? 3) How to set conservation targets, accounting for difference in environmental conditions and human threats between national biodiversity hotspots? 4) How to design large scale national conservation plan reflecting hierarchical nature of biodiversity? The case study for national conservation planning is Russia. Conclusions: · Large scale vegetation diversity can be predicted to a major extent by climatically determined latent heat for evaporation and geometrical structure of landscape, described as an altitudinal difference. The climate based model reproduces observed species number of vascular plant for different areas of the world with an average error 15% · National biodiversity hotspots can be mapped from biotic or abiotic data using corrected for a country the quantitative criteria for plant endemism and land use from the 'global hotspots' approach · Quantitative conservation targets, accounting for difference in environmental conditions and human threats between national biodiversity hotspots can be set using national data for Red Data book species · Large scale national conservation plan reflecting hierarchical nature of biodiversity can be designed by combination of abiotic method at national scale (identification of large scale hotspots) and biotic method at regional scale (analysis of species data from Red Data book)
Substanzen der pharmazeutischen und chemischen Industrie müssen nach internationalen Richtlinien auf deren Toxizität gegenüber Mensch und Umwelt geprüft werden. Dazu gehören u. a. Prüfungen zur Vorhersage des embryotoxischen Potentials, die am lebenden Organismus durchgeführt werden. Mit dem Ziel die Anzahl der Tierversuche zu verringern, die notwendig sind um das toxikologische Profil einer Prüfsubstanz zu bestimmen, wurde der Embryonale Stammzelltest (EST) entwickelt. Als Grundlage des EST dienen embryonale Stammzellen (ES-Zellen) einer Zelllinie. ES-Zellen sind Zellen, die sich in der frühen embryonalen Entwicklung in die Zellen der Keimblätter entwickeln können. Daraus wiederum differenzieren die vielen verschiedenen, unterschiedlich spezialisierten Zelltypen des komplexen Organismus. Im EST wird die Konzentration einer Prüfsubstanz bestimmt, bei der die Differenzierung von ES-Zellen zu Herzmuskelzellen zu 50 % inhibiert wird. Zusätzlich wird die Konzentration der Prüfsubstanz bestimm°t, bei der 50 % der ES-Zellen (IC50D3) bzw. Fibroblastenzellen (IC503T3) absterben. Die allgemeine Toxizität ist damit von der spezifischen Toxizität der Prüfsubstanz auf die ES-Zellen und deren Differenzierung unterscheidbar. Die Parameter fliessen in ein biostatistisches Modell zur Prädiktion des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanzen ein. Es wurde ein Versuchsprotokoll entwickelt, wonach die ES-Zellen sich verstärkt zu Endothelzellen differenzieren. Die Endothelzellen, die im lebenden Organismus die Wand der späteren Blutgefässe, wie Venen und Arterien bilden, wurden mittels molekularbiologischer Methoden auf der RNA- und der Protein-Ebene nachgewiesen und quantifiziert. Verschiedene Zellkulturmethoden, Wachstumsfaktoren, als auch Wachstumsfaktorkonzentrationen wurden auf deren Vermögen die Differenzierung der ES-Zellen zu Endothelzellen zu induzieren, untersucht. Nach der Etablierung des Differenzierungsprotokolls wurden sieben Substanzen auf deren Vermögen geprüft, die Differenzierung von ES-Zellen zu Endothelzellen zu inhibieren. Die Endothelzellen wurden dabei über die Expression der RNA von zwei endothelzellspezifischen Genen quantifiziert. Im Vergleich dazu wurden die IC50D3 und die IC503T3 der Prüfsubstanz bestimmt, um eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanz zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der sieben Prüfsubstanzen in nicht-, schwach- oder stark embryotoxisch vorgenommen werden konnte. Es ist zu schlussfolgern, dass der weiterentwickelte in vitro Embryotoxizitätsassay sensitiv und reproduzierbar ist. Mit der Verwendung von verschiedenen Differenzierungsendpunkten kann die Prädiktionskraft des Assays deutlich verbessert, und die Anzahl von Tierversuchen verringert werden. Durch die Verwendung von molekularbiologischen Markern kann der Assay einem Hochdurchsatzscreening zugängig gemacht werden und damit die Anzahl von Prüfsubstanzen deutlich erhöht werden.
In this work different approaches are undertaken to improve the understanding of the sucrose-to-starch pathway in developing potato tubers. At first an inducible gene expression system from fungal origin is optimised for the use of studying metabolism in the potato tuber. It is found that the alc system from Aspergillus nidulans responds more rapidly to acetaldehyde than ethanol, and that acetaldehyde has less side-effects on metabolism. The optimal induction conditions then are used to study the effects of temporally controlled cytosolic expression of a yeast invertase on metabolism of potato tubers. The observed differences between induced and constitutive expression of the invertase lead to the conclusion that glycolysis is induced after an ATP demand has been created by an increase in sucrose cycling. Furthermore, the data suggest that in the potato tuber maltose is a product of glucose condensation rather than starch degradation. In the second part of the work it is shown that the expression of a yeast invertase in the vacuole of potato tubers has similar effects on metabolism than the expression of the same enzyme in the apoplast. These observations give further evidence to the presence of a mechanism by which sucrose is taken up via endocytosis to the vacuole rather than via transporters directly to the cytosol. Finally, a kinetic in silico model of sucrose breakdown is presented that is able to simulate this part of potato tuber metabolism on a quantitative level. Furthermore, it can predict the metabolic effects of the introduction of a yeast invertase in the cytosol of potato tubers with an astonishing precision. In summary, these data prove that inducible gene expression and kinetic computer models of metabolic pathways are useful tools to greatly improve the understanding of plant metabolism.
For recombinant production of proteins for structural and functional analyses, the E. coli expression system is the most widely used due to high yields and straightforward processing. However, particularly the expression of eukaryotic proteins in E. coli is often problematic, e.g. when the protein is not folded correctly and is deposited in insoluble inclusion bodies. In some cases it is favourable to analyse deletion constructs of a protein or an individual protein domain instead of the full-length protein. This implies the generation of a set of expression constructs that need to be characterised. In this work methods to optimise and evaluate in vitro folding of inclusion body proteins as well as high-throughput characterisation of expression constructs were developed. Transferring inclusion body proteins to their native state involves two steps: (a) solubilisation with a chaotropic reagent or a strong ionic detergent and (b) folding of the protein by removal of the chaotrop accompanied by the transfer into an appropriate buffer. The yield of natively folded protein is often substantially reduced due to aggregation or misfolding; it may, however, be improved by certain additives to the folding buffer. These additives need to be identified empirically. In this thesis a screening procedure for folding conditions was developed. To reduce the number of possible combinations of screening additives, empirical observations documented in the literature as well as well known properties of certain screening additives were considered. To decrease the amount of protein and work invested, the screen was miniaturised and automated using a pipetting robot. Twenty rapid dilution conditions for the denatured protein are tested and two conditions for folding of proteins using the detergent/cyclodextrin protein folding system of Rozema et al. (1996). 100 µg protein is used per condition. In addition, eight conditions can be tested for folding of His-tagged proteins (approx. 200 µg) immobilised on metal chelate resins. The screen was successfully applied to fold a human protein, the p22 subunit of dynactin that is expressed in inclusion bodies in E. coli. For p22 dynactin – as is the case for many proteins – there was no biological assay available to assess the success of the folding screen. Protein solubility can not be used as a stringent criterion because beside natively folded protein, soluble misfolded species and microaggregates may occur. This work evaluates methods to detect small amounts of natively folded protein after automated folding screening. Before folding screening with p22 dynactin, two model enzymes, bovine carbonic anhydrase II (CAB) and pig heart mitochondrial malate dehydrogenase, were used for evaluation. Recovered activity after refolding was correlated to different biophysical methods. 8-anilino-1-naphtalenesulfonic acid binding-experiments gave no useful information when refolding CAB, due to low sensitivity and because misfolded protein could not be readily distinguished from native protein. Tryptophan fluorescence spectra of refolded CAB were used to assess the success of refolding. The shift of the intensity maximum to a shorter wavelength, compared to the denaturant unfolded protein, as well as the fluorescence intensity correlated to recovered enzymatic activity. For both model enzymes, analytical hydrophobic interaction chromatography (HIC) was useful to identify refolded samples that contain active enzyme. Compactly folded, active enzyme eluted in a distinct peak in a decreasing ammonium sulfate gradient. The detection limit of analytical HIC was approx. 5 µg. In case of CAB, tryptophan fluorescence spectroscopy and analytical HIC showed that both methods in combination can be useful to rule out false positives or false negatives obtained with one method. These two methods were also useful to identify conditions for folding of p22 dynactin. However, tryptophan fluorescence spectroscopy can lead to false positives because in some cases spectra of soluble microaggregates are not well distinguishable from spectra of natively folded protein. In summary, a fast and reliable screening procedure was developed to make inclusion body proteins accessible to structural or functional analyses. In a separate project, 88 different E. coli expression constructs for 17 human protein domains that had been identified by sequence analysis were analysed using high-throughput purification and folding analysis in order to obtain candidates suitable for structural analysis. After 96 deep-well microplate expression and automated protein purification, solubly expressed protein domains were directly analysed using 1D ¹H-NMR spectroscopy. It was found that isolated methyl group signals below 0.5 ppm are particularly sensitive and reliable probes for folded protein. In addition – similar to the evaluation of a folding screen – analytical HIC proved to be an efficient tool for identifying constructs that yield compactly folded protein. Both methods, 1D ¹H-NMR spectroscopy and analytical HIC, provided complementary results. Six constructs, representing two domains, could be quickly identified as targets that are well suitable for structural analysis. The structure of one of these domains was solved recently by co-workers, the other structure was published by another group during this project.
Die Pektat-Lyasen gehören zu einer Proteinfamilie, die meistens von pflanzenpathogenen Mikroorganismen sekretiert werden. Die Enzyme katalysieren den Abbau von Polygalakturonsäure, einem Hauptbestandteil in pflanzlichen Mittellamellen und Primärzellwänden. Der Abbau der alpha-1,4-verbrückten Galakturonsäurereste erfogt durch eine beta-Eliminierungsreaktion, dabei entsteht ein Produkt mit einer ungesättigten C4-C5 Bindung am nicht reduzierenden Ende, das durch spektroskopische Messungen beobachtet werden kann. Für die enzymatische Reaktion der Pektat-Lyasen ist Calcium nötig und das pH-Optimum der Reaktion liegt bei pH 8.5. Alle bis jetzt bekannten Strukturen der Pektat- und Pektin-Lyasen haben das gleiche Strukturmotiv - eine rechtsgängige parallele beta-Helix. Die Struktur der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis (BsPel) ist im Komplex mit Calcium gelöst worden. BsPel ist ein monomeres Protein mit einer ungefähren Molekularmasse von 43 kDa, das keine Disulfidbrücken enthält. Dies erlaubte sowohl eine effiziente rekombinante Expression des Wildtypproteins, als auch von destabilisierten Mutanten im Cytoplasma von E. coli. Parallele beta-Helices sind relativ große, jedoch verhältnismäßig einfach aufgebaute Proteine. Um detailliertere Informationen über die kritischen Schritte bei der in vitro-Faltung von parallelen beta-Helices zu erhalten, sollte in der vorliegenden Arbeit versucht werden, den Faltungsmechanismus dieses Proteins näher zu charakterisieren. Dabei sollte vor allem die Frage geklärt werden, welche Wechselwirkungen für die Stabilität dieses Proteins einerseits und für die Stabilität von essentiellen Faltungsintermediaten andererseits besonders wichtig sind.<BR>Rückfaltung von BsPel, ausgehend vom guanidiniumchlorid-denaturierten Zustand, war bei kleinen Proteinkonzentrationen und niedrigen Temperaturen vollständig möglich. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge waren aber nicht reversibel und zeigten eine apparente Hysterese. Kinetische Messungen des Fluoreszenz- und CD-Signals im fernen UV ergaben eine extreme Denaturierungsmittelabhängigkeit der Rückfaltungsrate im Bereich des Übergangmittelpunktes. Der extreme Abfall der Rückfaltungsraten mit steigender Denaturierungsmittelkonzentration kann als kooperative Entfaltung eines essentiellen Faltungsintermediats verstanden werden. Dieses Faltungsintermediat ist temperaturlabil und kann durch den Zusatz Glycerin im Renaturierungspuffer stabilisiert werden, wobei sich die Hysterese verringert, jedoch nicht vollständig aufgehoben wird. Durch reverse Doppelsprungexperimente konnten zwei transiente Faltungsintermediate nachgewiesen werden, die auf zwei parallelen Faltungswegen liegen und beide zum nativen Zustand weiterreagieren können. Fluoreszenzemissionsspektren der beiden Intermediate zeigten, daß beide schon nativähnliche Struktur aufweisen. Kinetische Daten von Prolin-Doppelsprungexperimenten zeigten, daß Prolinisomerisierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Reaktivierung des denaturierten Enzyms darstellt. Desweiteren konnte durch Prolin-Doppelsprungexperimenten an Mutanten mit Substitutionen im Prolinrest 281 gezeigt werden, daß die langsame Renaturierung von BsPel nicht durch die Isomerisierung der einzigen cis-Peptidbindung an Prolin 281 verursacht wird, sondern durch die Isomerisierung mehrerer trans-Proline. Die beiden beobachteten transienten Faltungsintermediate sind somit wahrscheinlich zwei Populationen von Faltungsintermediaten mit nicht-nativen X-Pro-Peptidbindungen, wobei sich die Populationen durch mindestens eine nicht-native X-Pro-Peptidbindung unterscheiden.<BR>Der Austausch des Prolinrestes 281 gegen verschiedene Aminosäuren (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) führte zu einer starken Destabilisierung des nativen Proteins und daneben auch zu einer Reduktion in der Aktivität, da die Mutationsstelle in der Nähe der putativen Substratbindetasche liegt. Die Rückfaltungskinetiken der Prolinmutanten war bei 10°C annähernd gleich zum Wildtyp und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Faltung waren durch die Mutation nicht verändert. Die durch die Mutation verursachte drastische Destabilisierung des nativen Zustands führte zu einem reversiblen Entfaltungsgleichgewicht bei pH 7 und 10°C. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge der Mutante P281A zeigten bei Messungen der Tryptophanfluoreszenzemission und der Aktivität einen kooperativen Phasenübergang mit einem Übergangsmittelpunkt bei 1.1 M GdmCl. Durch die Übereinstimmung der Faltungsübergänge bei beiden Messparametern konnten die Faltungsübergänge nach dem Zwei-Zustandsmodell ausgewertet werden. Dabei wurde eine freie Sabilisierungsenthalpie der Faltung für die Mutante von <nobr>- 64.2 ± 0.4 kJ/mol</nobr> und eine Kooperativität des Übergangs von <nobr>- 58.2 ± 0.3 kJ/(mol·M)</nobr> bestimmt.<BR> BsPel enthält, wie die meisten monomeren rechtsgängigen parallelen beta-Helix-Proteine, einen internen Stapel wasserstoffverbrückter Asparagin-Seitenketten. Die Mehrheit der erzeugten Mutanten mit Substitutionen im Zentrum der Asn-Leiter (N271X) waren als enzymatisch aktives Protein zugänglich. Die Auswirkung der Mutation auf die Stabilität und Rückfaltung wurde an den Proteinen BsPel-N271T und BsPel-N271A näher analysiert. Dabei führte die Unterbrechung des Asparaginstapels im Inneren der beta-Helix zu keiner drastischen Destabilisierung des nativen Proteins. Allerdings führten diese Mutationen zu einem temperatur-sensitiven Faltungsphänotyp und die Hysterese im Denaturierungsübergang wurde verstärkt. Offenbar wird durch die Unterbrechung des Asparaginstapel ein essentielles, thermolabiles Faltungsintermediat destabilisiert. Der Asparaginstapel wird somit bei der Faltung sehr früh ausgebildet und ist wahrscheinlich schon im Übergangszustand vorhanden.
Die vorliegende Arbeit ist eine aktuelle Dokumentation von Körperbau, Körperzusammensetzung und Ernährungsgewohnheiten an 708 jüngeren und älteren Männern und Frauen aus dem Bundesland Brandenburg. Der Körperbau wurde über ein 42 Längen-, Breiten-, Tiefen- und Umfangsmaße umfassendes anthropometrisches Untersuchungsprogramm bestimmt. Die Einschätzung von Gesamtkörperfettanteil und Magermasse erfolgte mit zwei Feldmethoden, der Hautfaltendickenmessung und der bioelektrischen Impedanzanalyse. Mit Hilfe eines semiquantitativen Fragebogens zu den Ernährungsgewohnheiten wurde der Lebensmittelverzehr erfasst und daraus die Energie- und Nährstoffaufnahme berechnet. Die Ergebnisse zum Körperbau zeigen im Mittel eine Abnahme der Längenmaße, jedoch eine Zunahme der Breiten-, Tiefen- und Umfangsmaße mit steigendem Erwachsenenalter. Einfache Parameter zur Beurteilung des Ernährungszustandes, wie Körpermasse und Body-Mass-Index (BMI) nehmen im Alter geschlechtsspezifisch zu. Nach den Richtlinien der WHO für den BMI gelten 55,3% der untersuchten Männern als übergewichtig, davon 10% als adipös. Von allen untersuchten Frauen sind 41,6% übergewichtig, davon sind 14,3% adipös. Der Anteil der Übergewichtigen ist zwar beim weiblichen Geschlecht geringer, aber dafür haben mehr Frauen die Grenze zur Adipositas überschritten. Für eine wissenschaftlich exakte Beurteilung des Ernährungszustandes reichen Körpermasse und BMI nicht aus, da sie die Körperzusammensetzung nicht bzw. nicht genügend berücksichtigen. Die subkutane Fettschichtdicke nimmt insbesondere am Rumpf zu, was als zusätzliches Gesundheitsrisiko gilt. Der Gesamtkörperfettanteil steigt im Erwachsenenalter abhängig von der Berechnungsmethode an. Die untersuchten Frauen sind gegenüber den Männern in allen Altersgruppen durch einen etwa ein Drittel höheren Körperfettanteil gekennzeichnet. Die tägliche Nahrungsenergieaufnahme der untersuchten Personen lässt eine abnehmende Tendenz bis zum 65. Lebensjahr erkennen. Trotz einer sinkenden Nahrungsenergieaufnahme im Alter, nimmt der BMI zu. Mögliche Ursachen hierfür werden in der Arbeit diskutiert. Der Anteil der Grundnährstoffe an der Energiebereitstellung entspricht in keiner der untersuchten Gruppen den Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Ernährung. Allgemein ist der Fettkonsum zu hoch und der Kohlenhydratanteil zu gering. Das zeigt sich besonders in den beiden mittleren untersuchten Altersgruppen und bei den Männern stärker als bei den Frauen.
Recent high-throughput technologies enable the acquisition of a variety of complementary data and imply regulatory networks on the systems biology level. A common approach to the reconstruction of such networks is the cluster analysis which is based on a similarity measure. We use the information theoretic concept of the mutual information, that has been originally defined for discrete data, as a measure of similarity and propose an extension to a commonly applied algorithm for its calculation from continuous biological data. We compare our approach to previously existing algorithms. We develop a performance optimised software package for the application of the mutual information to large-scale datasets. Furthermore, we design and implement a web-based service for the analysis of integrated data measured with different technologies. Application to biological data reveals biologically relevant groupings and reconstructed signalling networks show agreements with physiological findings.
Mit der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe elektronenmikroskopischer Methoden verschiedene Liposomen-DNA-Komplexe zum Gentransfer charakterisiert sowie die Aufnahme und Verteilung in der Zellkultur untersucht werden. Dabei waren vor allem solche Präparationen von besonderem Interesse, die in unserer Arbeitsgruppe 'Drug Targeting' getestet oder entwickelt und verwendet wurden, wie Sendai-Virus Liposomen (HVJ-Liposomen), Virosomen sowie DAC-Chol und DOCSPER-Liposomen als Vertreter der kationischen Lipide. Im ersten Teil der Arbeit wurden fusogene Liposomen und Virosomen charakterisiert. Bei diesen Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erzielt: ·Sendai-Viren fusionieren mit Liposomen unterschiedlicher Lipidzusammensetzung. ·Die daraus resultierenden HVJ-Liposomen sind mit elektronenmikroskopischen Methoden identifizierbar. ·Die Spikes auf den HVJ-Liposomen besitzen fusogene Eigenschaften. ·HVJ-Liposomen eignen sich auf Grund der geringen Ausbeute sowie der geringen Transfektionseffizienz nicht zum in vitro Gentransfer. ·Virosomen stellen einen weiteren Typ fusogener Gentransfervesikel dar. ·Ihre Größe und fusogenen Eigenschaften sind abhängig von der externen Zugabe einer optimierten Lipidmischung. ·Im Innenraum der Virosomen kann mit Poly-L-Lysin vorkomplexierte DNA verkapselt werden. ·Die fusogenen Eigenschaften der Virosomen wurden mit Hilfe immunelektronenmikroskopischer Techniken und monoklonaler Antikörper gegen Hämagglutinin/Neuraminidase und das Fusionsprotein sowie mit polyklonalen Antiseren gezeigt. ·An Hand goldmarkierter DNA sind Virosomen nach der Transfektion in der Zelle nachweisbar. Da in unserer Arbeitsgruppe bevorzugt kationische Liposomen zum Gentransfer verwendet werden, wurde auch die Struktur der Liposomen untersucht und folgende Ergebnisse dokumentiert: ·Die Struktur und die Größe kationischer Liposomen werden hauptsächlich durch die Lipidzusammensetzung bestimmt. ·Die Bildung von Liposomen-DNA-Komplexen ist mit einer Größenzunahme der Komplexe gekoppelt. ·Die Anzahl gebundener Plasmide steigt mit der Größe der Lipoplexe. ·Gentransferaktive Lipopolyplexe (mit Protaminsulfat komplexierte DNA und DAC-Chol- Liposomen) sind kleiner als Lipoplexe. Ihre Struktur wird von der Zusammensetzung bestimmt. Eine weitere wichtige Frage betrifft den Weg der Gencarrier in der Zelle. Kenntnisse über diese Vorgänge sind vorteilhaft, um die einzelnen Schritte zu verstehen und möglichst gezielt zu verbessern. Bei der Untersuchung der Partikel im Hinblick auf zelluläre Barrieren beim Gentransfer konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: ·Die Bindung der Partikel an die Zellmembran und Aufnahme sind abhängig von den eingesetzten Zellen und Komplexen sowie derInkubationszeit. ·Die Aufnahme erfolgt über endozytotische Mechanismen, wobei Lipopolyplexe schneller als Lipoplexe in die Zellen gelangen. Nicht alle gebundenen Komplexe werden aufgenommen. ·Die aufgenommenen Partikel befinden sich in Endosomen und werden ins Innere der Zelle transportiert. ·Freisetzung der DNA und Eintritt in den Zellkern über Kernporen konnte nicht beobachtet werden. ·DNA-haltige Vesikel in Kernnähe deuten auf einen weiteren Mechanismus hin (Vesikeltransfer zum Zellkern).
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei humane Varianten des von Wang et al., 1999, erstmals beschriebenen muskelspezifischen Proteins Xin (Huhn und Maus) über Sequenzanalyse, Immunofluoreszenzmikroskopie, Transfektionsstudien und biochemischer Analyse näher charakterisiert. Die Proteine wurden mit human Xin related proteins 1 und 2 – hXirp1 und 2 –bezeichnet. Die Xin-Proteine enthielten bisher unbekannte, sowie spezifische, repetitive Motive, die aus jeweils mindestens 16 Aminosäuren bestanden. Ihre Aminosäuresequenz, mit einer Vielzahl weiterer putativer Motivsequenzen, verwies auf eine potentielle Funktion von hXirp als Adapterprotein in Muskelzellen. Das hier näher untersuchte hXirp1 lokalisierte an den Zell-Matrix-Verbindungen der Muskel-Sehnen-Übergangszone im Skelettmuskel, sowie an den Zell-Zell-Verbindungen der Glanzstreifen im Herzmuskel. Während der Muskelentwicklung zeigte hXirp1 eine sehr frühe Expression, zusammen mit einer prägnanten Lokalisation an den Prämyofibrillen und deren Verankerungsstrukturen, die auf eine Funktion des Proteins in der Myofibrillogenese deuten. Ektopische Expressionen von hXirp1 in einer Vielzahl von Nichtmuskel-Kulturzellen zeigten wiederum eine Lokalisation des Proteins an den Zell-Matrix-Kontakten dieser Zellen. Am Beispiel von hXirp1 und 2 wurde stellvertretend für die Familie der Xin-Proteine gezeigt, daß es sich bei den repetitiven Motiven um neuartige, F-Aktin bindende Sequenzmotive handelte. Die Xin-Proteine können somit als muskelspezifische, aktinbindende, potentielle Adapterproteine bezeichnet werden, denen eine strukturelle und funktionelle Beteiligung an der Verankerung der Myofibrillen im adulten Muskel, wie auch während der Myofibrillogenese zukommt.
Menschen nehmen Tausende von Stoffen als bitter wahr. Die chemische Struktur der verschiedenen Bitterstoffe ist sehr vielfältig: Sie reicht von kleinen Molekülen wie Kaliumchlorid oder Harnstoff, bis zu sehr komplexen organischen Verbindungen. Die Größe der einzigen bekannten menschlichen Familie von Bitterrezeptoren (TAS2Rs) wurde auf nur ca. 80-120 Mitglieder geschätzt. In Anbetracht der hohen Zahl und Komplexität der Bitterstoffe erscheint die Zahl von Rezeptoren als sehr gering. Dies führt natürlich zu einer Reihe von Fragen: Wie viele Mitglieder hat die menschliche TAS2R-Genfamilie? Wie viele verschiedene Substanzen können denselben Rezeptor aktivieren? Scheint die Zahl der TAS2R-Rezeptoren ausreichend, alle Bitterstoffe wahrnehmen zu können oder muss es noch andere Bitterrezeptorfamilien geben? Diese Fragen zu beantworten, ist das Ziel der vorliegenden Arbeit. Hier durchgeführte Analysen des menschlichen Genomprojektes zeigen, dass Menschen ca. 25 TAS2R-Rezeptoren besitzt, die eine sehr divergente Aminosäurestruktur aufweisen. Diese Rezeptoren wurden in eine neu entwickelte Expressionskassette kloniert, die den Transport des Rezeptors an die Zelloberfläche ermöglicht. Um Liganden für die menschliche TAS2R-Rezeptoren zu identifizieren, wurden die Rezeptoren in HEK293 Zellen exprimiert und mit verschiedenen Bitterstoffen stimuliert. Der Nachweis der Rezeptoraktivierung erfolgte durch Calcium-Imaging. Es konnte gezeigt werden, dass hTAS2R16 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Salicin und verwandten bitteren Pyranosiden ist. So wird hTAS2R16 in HEK293 Zellen durch Salicin und chemisch verwandte Substanzen aktiviert. Ein Vergleich der in diesem Messsystem erhaltenen Daten mit psychophysikalisch ermittelten Geschmackswahrnehmungen beim Menschen, ergab eine hohe Übereinstimmung. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Desensitiverung einzelner Rezeptoren die Ursache für die Adaption des Bittergeschmacks ist. Der Nachweis der Expression des Rezeptors in menschlichen Geschmackspapillen, sowie die festgestellte Assoziation des G/A Polymorpphismus an Position 665 des hTAS2R16 Gens mit einer reduzierten Salicinwahrnehmung, sind weitere unabhängige Beweise für diese These. Ein anderer menschlicher Rezeptor, hTAS2R10, wird durch die Bitterstoffe Strychnin, Brucin und Denatonium aktiviert. Dies sowie die Tatsache, dass die zur Aktivierung benutzten Konzentrationen eine sinnvolle Korrelation zu dem menschlichen Geschmacksschwellwert von Strychnin zeigen, sind starke Hinweise, dass hTAS2R10 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Strychnin und verwandten Substanzen ist. Die vorliegenden Daten zeigen eindeutig, dass die TAS2R-Rezeptoren auch beim Menschen Bitterrezeptoren darstellen. Sowohl hTAS2R16, als auch hTAS2R10 werden durch ein Spektrum strukturell sehr unterschiedlicher Bitterstoffe aktiviert. Falls die anderen Mitglieder der TAS2R-Familie ebenfalls dieses Verhalten zeigen, wäre es möglich, dass die nur ca. 25 Mitglieder umfassende TAS2R-Rezeptorfamilie des Menschen tatsächlich zur Wahrnehmung aller Bitterstoffe ausreicht.
Die Präeklampsie ist eine schwangerschaftsspezifische Bluthochdruck-Erkrankung, die im Allgemeinen nach der 20. Schwangerschaftswoche auftritt. Neben der Hypertonie sind die Proteinurie und die Ödembildung charakteristische Symptome der Präeklampsie. Obwohl heute die Pathophysiologie der Präeklampsie zum großen Teil verstanden ist, ist die Ätiologie dieser Erkrankung noch unklar. 1999 konnten wir in den Seren von Präeklampsie-Patientinnen agonistische Autoantikörper, die gegen den Angiotensin II AT1-Rezeptor gerichtet sind (AT1-AAK), nachweisen. Diese AT1-AAK gehören zur Antikörpersubklasse IgG3. Die AT1-AAK führen in Kulturen neonataler Rattenkardiomyozyten AT1-Rezeptor spezifisch zu einem positiv chronotropen Effekt. Mittels Immunpräzipitation wurde gezeigt, dass AT1-AAK spezifisch den AT1-Rezeptor präzipitieren. Kontrollproben, aus denen die AT1-AAK entfernt wurden, führen zu keiner Präzipitation des AT1-Rezeptors. Die Präzipitation des AT1-Rezeptors bleibt ebenfalls aus, wenn die AT1-AAK mit einem Peptid, welches der Aminosäuresequenz des zweiten extrazellulären Loops des humanen AT1-Rezeptors entspricht, behandelt wurden. Eine Langzeitbehandlung der Kulturen neonataler Rattenherzzellen mit AT1-AAK vermindert die funktionelle Ansprechbarkeit der Zellen auf einen erneuten AT1-Rezeptor-Stimulus. Eine veränderte AT1-Rezeptorexpression wurde nicht nachgewiesen. In guter Übereinstimmung mit den in vitro-Expressionsdaten wurde gezeigt, dass die plazentare AT1-Rezeptorexpression bei Präeklampsie-Patientinnen nicht verschieden von der plazentaren AT1-Rezeptorexpression gesunder Schwangerer mit nicht pathogen verändertem Blutdruck ist. Im Zellsystem der neonatalen Rattenherzzellen führen die AT1-AAK zur Aktivierung von Gi-Proteinen und zu verringerten intrazellulären cAMP-Spiegeln. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die AT1-AAK in Kulturen neonataler Rattenherzzellen die Transkriptionsfaktoren AP-1 und NFkB aktivieren. Die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB wurde vornehmlich in den Nicht-Myozyten der Rattenherzzellkultur nachgewiesen. Generell wurde festgestellt, dass sich die AT1-AAK pharmakologisch wie der natürliche Agonist des AT1-Rezeptors, Angiotensin II, verhalten. Erste Daten dieser Arbeit deuten auf einen eventuellen Einfluss der AT1-AAK auf die Expression von Komponenten der extrazellulären Matrix bzw. assoziierter Faktoren (Kollagen III, MMP-2, TIMP-2, Colligin) hin. In allen in dieser Arbeit untersuchten Seren von klinisch diagnostizierten Präeklampsie-Patientinnen wurden agonistische AT1-AAK nachgewiesen. Wir vermuten daher, dass die AT1-AAK möglicherweise bedeutend in der Pathogenese der Präeklampsie sind.
Zur Ermittlung der Akzeptanz und ihres prädiktiven Wertes für den Verzehr von Lebensmitteln bzw. Getränken, sind Beliebtheitsprüfungen mit Konsumenten unter standardisierten Bedingungen im Sensoriklabor üblich. Die prädiktive Aussagekraft dieser Laboruntersuchungen wird jedoch durch folgende Aspekte eingeschränkt: (1) Der situative Kontext wird ausgeschaltet, d.h. die Verzehrssituation, in der ein Produkt üblicherweise konsumiert wird, ist im Labor bewusst eliminiert und das zu bewertende Produkt wird nicht in einer kompletten Mahlzeit dargeboten (2) Der Produktkontakt im Labor ist im Gegensatz zu der anhaltenden Konfrontation unter alltäglichen Bedingungen nur kurzfristig, was Langzeitaussagen bzw. Dauerpräferenzen nicht zuläßt; (3) Im Labortest ist die freie Auswahl auf eine geringe Anzahl angebotener Produkte beschränkt. In dieser Arbeit soll daher die Frage beantwortet werden, welchen prädiktiven Wert sensorische Beliebtheitsuntersuchungen im Labor für Lebensmittelakzeptanz und -verzehr unter Alltagssituationen haben. Dies wird für verschiedene Altersgruppen gezeigt, die frei in ihrer Entscheidungsfindung sind. Dazu gaben 56 Studenten (23,1±3,7 Jahre) und zwei Seniorengruppen, zum einen aus einer Begegnungsstätte (20 Probanden; 75,6±8,1 Jahre) und zum anderen aus dem betreuten Wohnen (14 Probanden; 76,1±12,5 Jahre), in einer ersten Laboruntersuchung Beliebtheitsbewertungen (Akzeptanz und Rangordnungsprüfung) zu 6 Erfrischungsgetränken ab. Anschließend folgte ein mindestens vierwöchiger Zeitraum, in denen die Probanden aus einem speziell für die Studie konzipierten Automaten Getränke in Einrichtungen der Gemeinschaftsverpflegung entnehmen konnten. Die Entnahme war via Chipkarte ad libitum möglich. Computergestützt wurden dabei individuelle Getränkewahl, Menge und Entnahmezeit aufgezeichnet. Unmittelbar nach der Automatenphase wurde eine erneute Laboruntersuchung durchgeführt. In allen Untersuchungsphasen wurden dieselben Erfrischungsgetränke aus Konzentrat, variiert in Apfel- oder Orangensaftgeschmack, ohne oder mit Zusatz von Zucker (20g/l) und Kohlensäure (4 g/l CO2), angeboten. Eine Quntitativ Deskriptive Analyse bestätigte unterschiedliche Profile bei den Produkten, so dass von sensorisch wahrnehmbaren Unterschieden zwischen den Produkten ausgegangen werden konnte. Die Probanden bekamen zu keiner Zeit Informationen über die exakte Zusammensetzung der Getränke. Sowohl in der Laborbewertung als auch nach Getränkekonsum via Automat, fanden sich unterschiede zwischen den Altersgruppen. In der Akzeptanzprüfung bewerteten Studenten die Apfelvarianten besser als die Orangenvarianten. Senioren, die insgesamt höhere Akzeptanzwerte vergaben, bewerteten alle Getränke in fast allen Attributen gleichermaßen gut. Nach der 4-wöchigen Automatenphase hatte sich die Akzeptanz der sechs Getränke nicht wesentlich geändert. Auch in beiden Rangordnungsprüfungen waren bei den Studenten „Apfel“ und „Apfel mit Kohlensäure“ auf den ersten Plätzen, „Orange mit Zuckerzusatz“ auf dem letzten Platz. Nach Adjustierung auf die individuelle Trinkmenge (in Wenig-, Mittel- Vieltrinker) und wurde „Apfel mit Kohlensäure“ in der Automatenphase von den Studenten am meisten getrunken. In der Vieltrinkergruppe wurde „Orange mit Zuckerzusatz“ deutlich vernachlässigt. Der Automatenkonsum der Studenten bestätigte damit im Wesentlichen die Ergebnisse der Beliebtheitsprüfung im Labor. Bei den Senioren waren in der Rangordnungsprüfung, die eine Lieblingsreihenfolge erzwang, alle süßeren Getränke (mit Zuckerzusatz) auf den ersten Plätzen. In der Automatenphase wurden jedoch viele Getränke ohne Zuckerzusatz bevorzugt. Dies zeigte sich sowohl in der individuellen Präferenz, als auch im Gesamtkonsum. Aufgrund der Ergebnisse kann der prädiktive Wert von Laboruntersuchungen mit Senioren in Bezug auf die Auswahl und den Konsum unter alltäglichen Bedingungen als gering beurteilt werden. Die Getränke mit der individuell höchsten Laborpräferenz wurden unter Alltagsumgebung in der Gemeinschaftsverpflegung in deutlich geringeren Umfang als erwartet verzehrt. In der Vergleichsgruppe der Studenten ist die Übereinstimmung größer(p<0,05). In Häufigkeitsfragebögen vor und nach der Automatenphase wurde das Trinkverhalten speziell von kohlensäurehaltigen Getränken erfragt. Der Anteil von kohlensäurehaltigen Getränken ist sehr variabel, und kann tagesabhängig von einem geringen bis zum Hauptanteil ausmachen. Senioren tranken von den Automatengetränken weniger kohlensäurehaltige Getränke als Studenten(p<0,001). Trotzdem zeigte nur eine Minderheit einen völligen Verzicht, wie sich durch Fragebogen und auch Automatenkonsum ermitteln ließ. Die Verwendung eines computergestützten Getränkeautomaten bietet eine neue Möglichkeit, die Langzeitpräferenz und den tatsächlichen Konsum unter gewohnten Alltagsbedingungen und bei freier Produktauswahl zu ermitteln. Selbst bei Altersgruppen, die mit Laboruntersuchungen überfordert sind, können Vorlieben untersucht werden.
The development of fast and reliable biochemical tools for on-site screening in environmental analysis was the main target of the present work. Due to various hazardous effects such as endocrine disruption and toxicity phenolic compounds are key analytes in environmental analysis and thus were chosen as model analytes. Three different methods were developed: For the enzymatic detection of phenols in environmental samples an enzyme-based biosensor was developed. In contrast to reported work using tyrosinase or peroxidases, we developed a biosensor based on glucose dehydrogenase as biorecognition element. This biosensor was devoted for an application in a laboratory flow system as well as in a portable device for on-site measurements. This enzymatic detection is applicable only for a limited number of phenols due to substrate specificity of the enzyme. For other relevant compounds based on a phenolic structure (i.e. nitrophenol, alkylphenols and alkylphenol ethoxylates) immunological methods had to be developed. The electrochemical GDH-biosensor was used as the label detector in these immunoassays. Two heterogeneous immunoassays were developed where ßGal was used as the label. An electrochemical method for the determination of the marker enzyme activity was processed. The separation step was realized with protein A/G columns (laboratory flow system) or by direct immobilization of the antibodies in small disposable capillaries (on-site analysis). All methods were targeted on the contemporary analysis of small numbers of samples.
Der "Leukocyte Receptor Complex" (LRC) ist ein DNA-Sequenzabschnitt auf dem Chromosom 19 des Menschen, der eine Länge von über 900.000 Basenpaaren umfaßt. In diesem Chromosomenabschnitt ist eine Vielzahl von Genen lokalisiert, die für die Funktion verschiedener weißer Blutzellen (Leukozyten) von entscheidender Bedeutung sind. Bei den aus diesen Genen synthetisierten Proteinen (Eiweißen) handelt es sich um Strukturen, die auf der Oberfläche dieser Zellen lokalisiert sind und zur Interaktion der Leukozyten mit ihrer Umgebung dienen. Diese auch als Rezeptoren bezeichneten Proteine können mit Oberflächenproteinen auf anderen Körperzellen wechselwirken und daraus resultierende Signale in das Innere der Blutzelle weiterleiten. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde der LRC im Detail untersucht. Hierzu wurde zunächst der gesamte Chromosomenabschnitt aus kleineren, einander überlappenden DNA-Fragmenten rekonstruiert. Aufgrund der in diesen DNA-Fragmenten enthaltenen DNA-Sequenzen war es möglich, den gesamten Chromosomenabschnitt ähnlich einem Puzzle zusammenzusetzen. Die anschließende Analyse des LRC zeigte, daß sich dieser in drei Bereiche, sogenannte Cluster, unterteilen läßt. Diese Cluster sind dadurch gekennzeichnet, daß in ihnen jeweils nur Gene eines Rezeptortyps vorkommen. Hierbei handelt es sich um ‚immunoglobulin-like transcript′ -Gene (ILT) und ‚killer cell Ig-like receptor′-Gene (KIR). Die KIR- und ILT-Cluster werden von weiteren stammesgeschichtlich verwandten Genen unterbrochen und flankiert. Je nach Individuum können im LRC bis zu 31 solcher verwandten Rezeptorgene lokalisiert sein. Auf der Grundlage der Kartierungsdaten und von Daten des humanen Genomprojekts war es zudem möglich, evolutionäre Untersuchungen zur Entwicklung des LRC durchzuführen. Dabei wurde eine Hypothese zur Entstehung des LRC entworfen und zu anderen Spezies in Beziehung gesetzt. Im zweiten Teil der Arbeit habe ich aufbauend auf der sogenannten HRCA-Methode eine Technik entwickelt, die es erlaubt kleinste Unterschiede zwischen DNA-Sequenzen, sogenannte Einzelbasenpaaraustausche, nachzuweisen. Die entwickelte Methode kann verwendet werden, um sehr ähnliche DNA-Sequenzen, wie z.B. verschiedene KIR-Sequenzen, zu unterscheiden und ihre Menge zu bestimmen. Sie ist außerdem geeignet Mutationen, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind, nachzuweisen und könnte somit in der Diagnostik Anwendung finden.
Red cell development in adult humans results in the mean daily production of 2x1011 erythrocytes. Mature hemoglobinized and enucleated erythrocytes develop from multipotent hematopoietic stem/progenitor cells through more committed progenitor cell types such as BFU-E and CFU-E. The studies on the molecular mechanisms of erythropoiesis in the human system require a sufficient number of purified erythroid progenitors of the different stages of erythropoiesis. Primary human erythroid progenitors are difficult to obtain as a homogenous population in sufficiently high cell numbers. Various culture conditions for the in vitro cell culture of primary human erythroid progenitors have been previously described. Mainly, the culture resulted in the generation of rather mature stages of Epo-dependent erythroid progenitors. In this study our efforts were directed towards the isolation and characterization of more early red cell progenitors that are Epo-independent. To identify such progenitors, CD34+ cells were purified from cord blood and cultured under serum free conditions in the presence of the growth factors SCF, IL-3 and hyper-IL-6, referred to as SI2 culture conditions. By immunomagnetic bead selection of E-cadherin (E-cad) positive cells, E-cad+ progenitors were isolated. These Epo-independent E-cad+ progenitors have been amplified under SI2 conditions to large cell numbers. The E-cad+ progenitors were characterized for surface antigen expression by flow cytometry, response to growth factors in proliferation assay and for their differentiation potential into mature red cells. Additionally, the properties of E-cad+ progenitors were compared to those of two other erythroid progenitors: Epo-dependent progenitors described by Panzenböck et al. (referred to as SCF/Epo progenitor), and CD36+ progenitors described by Freyssinier et al. (Panzenböck et al., 1998; Freyssinier et al., 1999). Finally, the gene expression profile of E-cad+ progenitors was compared to the profiles of SCF/Epo progenitors and CD36+ progenitors using the DNA microarray technique. Based on our studies we propose that Epo-independent E-cad+ progenitors are early stage, BFU-E like progenitors. They respond to Epo, despite the fact that they were generated in the absence of Epo, and can completely undergo erythroid differentiation. Furthermore, we demonstrate that the growth properties, the growth factor response and the surface marker expression of E-cad+ progenitors are similar to those of the SCF/Epo progenitors and the CD36+ progenitors. By the comparison of gene profiles, we were also able to demonstrate that the Epo-dependent and Epo-independent red cell progenitors are very similar. Analyzing the molecular differences between E-cad+ and SCF/Epo progenitors revealed several candidate genes such as galectin-3, cyclin D1, AMHR, PDF and IGFBP4, which are potential regulators involved in red cell development. We also demonstrate that the CD36+ progenitors, isolated by immunomagentic bead selection, are a heterogeneous progenitor population containing an E-cad+ and an E-cad- subpopulation. Based on their gene expression profile, CD36+ progenitors seem to exhibit both erythroid and megakaryocytic features. These studies led to a more updated model of erythroid cell development that should pave the way for further studies on molecular mechanisms of erythropoiesis.
Es ist schon seit längerer Zeit bekannt, dass nach Kontakt des Biomaterials mit der biologischen Umgebung bei Implantation oder extrakorporaler Wechselwirkung zunächst Proteine aus dem umgebenden Milieu adsorbiert werden, wobei die Oberflächeneigenschaften des Materials die Zusammensetzung der Proteinschicht und die Konformation der darin enthaltenden Proteine determinieren. Die nachfolgende Wechselwirkung von Zellen mit dem Material wird deshalb i.d.R. von der Adsorbatschicht vermittelt. Der Einfluss der Oberflächen auf die Zusammensetzung und Konformation der Proteine und die nachfolgende Wechselwirkung mit Zellen ist von besonderem Interesse, da einerseits eine Aussage über die Anwendbarkeit ermöglicht wird, andererseits Erkenntnisse über diese Zusammenhänge für die Entwicklung neuer Materialien mit verbesserter Biokompatibilität genutzt werden können. In der vorliegenden Habilitationsschrift wurde deshalb der Einfluss der Zusammensetzung von Polymeren bzw. von deren Oberflächeneigenschaften auf die Adsorption von Proteinen, den Aktivitätszustand der plasmatischen Gerinnung und die Adhäsion von Zellen untersucht. Dabei wurden auch Möglichkeiten zur Beeinflussung dieser Vorgänge über eine Veränderung der Volumenzusammensetzung oder durch Oberflächenmodifikationen von Biomaterialien vorgestellt. Erkenntnisse aus diesen Arbeiten konnten für die Entwicklung von Membranen für Biohybrid-Organe genutzt werden.
Der Buchfinkengesang wurde in Potsdam in zwei Hauptpopulationen über drei Jahre aufgenommen. Jedes Individuum wurde eindeutig am individuellen Strophentypenrepertoire identifiziert. Ein weiterer Punkt der die individuelle Wiedererkennung bestätigt ist die hohe Standorttreue der adulten Männchen. Die beschriebene Methode eignet sich für die Untersuchung von gesamten Populationen, um den Wandel des Gesangs von Populationen in Raum und Zeit zu beschreiben. Die Haupterkenntnisse der Arbeit sind: - Die Gesamtanzahl der Grundstrophentypen innerhalb einer Population bleibt über Jahre konstant. - Die relative Häufigkeit jedes einzelnen Strophentyps variiert von Jahr zu Jahr und von Population zu Population. - Gesangslernen erfolgt exakt mit einem Korrektheitsgrad von mindestens 96%. - Das Song-Sharing ist innerhalb der Population hoch. Die diskutierten Mechanismen für das Song-Sharing sind: Die Lebenserwartung, das Zugverhalten, das Lernverhalten, die Etabliertheit von Strophentypen, Weibchenpräferenzen und die Reaktionen der territorialen Männchen. - Weiterhin wurde ein Modell zur kulturellen Evolution des Buchfinkengesangs programmiert, um die Rolle der Einflussfaktoren, wie Fehlerquote, Abwanderungsrate und Laufzeit zu ermitteln. Der Wandel des Dialektes erfolgt graduell in Raum und Zeit. Daher sind keine scharfen Dialektgrenzen anzutreffen. Trotz dieser Tatsache markieren die etablierten Strophentypen die Population. 50 % der Juvenilen siedeln am Geburtsort, auf diese Weise bleibt der Dialekt erhalten und Inzest wird vermieden. -Analysiert man das Repertoire benachbarten Männchen bei isolierten Alleen, so entspricht die Gesangsangleichung in etwa dem Zufall. -Intraindividuelle Vergleiche der quantitativen Parameter des jeweiligen Strophentyps wurden saisonal und annuell durchgeführt. Saisonal konnten für einen Strophentyp ein Trend ermittelt werden. Bei jährlichen Vergleichen konnten intraindividuell ausschließlich nicht signifikante Ergebnisse ermittelt werden, wohingegen die interindividuelle Variation in zwei Fällen signifikant war. In einem Fall bestand ein Trend und in einem weiteren Fall war die Variationsunterschiede nicht signifikant. - Der Verlauf der Brutsaison lässt sich an der jährlichen Gesangsaktivität nachvollziehen.
Aromatische Amine und Amide (aAA) sind aufgrund ihrer starken Verbreitung in der menschlichen Umwelt und ihres kanzerogenen Potenzials von großer toxikologischer Bedeutung. Die Kanzerogenität der aAA wird durch die Mutagenität hochreaktiver Stoffwechselprodukte vermittelt, die in zwei sequenziellen katalytischen Reaktionen entstehen. Die erste ist meistens eine N-Hydroxylierung, die oft durch Cytochrom P450 1A2 (CYP1A2) katalysiert wird. Daran schließt sich eine O-Konjugation durch Sulfotransferasen (SULT) oder N-Acetyltransferasen (NAT) an. Die Bioaktivierung ist ein kritischer Parameter für die Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tiermodellen auf den Menschen. Rekombinante in vitro Systeme, die fremdstoffmetabolisierende Enzyme verschiedener Spezies exprimieren, ermöglichen die vergleichende Untersuchung der Bioaktivierung im Menschen und in Versuchstieren. Ziel des Projektes war die Aufklärung der Bioaktivierung der aAA durch humane Enzyme. Im Vordergrund stand die Untersuchung der Rolle humaner SULT in diesem Prozess. Es wurden rekombinante in vitro Systeme, konstruiert, die CYP1A2 und SULT des Menschen koexprimieren. SULT-cDNAs wurden in den Säugerzell Expressionsvektor pMPSV kloniert und in Standardindikatorzellen für Mutagenitätsuntersuchungen (V79 Zellen aus dem Chinesischen Hamster) transfiziert. Das Expressionsniveau von CYP1A2 und SULT wurde mittels Immunblotanalyse und radiometrischen Aktivitätsmessungen charakterisiert. In den rekombinanten Zellen wurden vier aAA als Modellsubstanzen (2-Acetylaminofluoren, 2-Aminoanthracen, 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol, 2,4-Diaminotoluol) auf ihre Mutagenität am hprt-Locus hin untersucht.Die aAA waren in Zellen, die keine rekombinanten Enzyme oder lediglich CYP1A2 exprimierten, nicht mutagen. In Zellen, die CYP1A2 und SULT der Subfamilie 1A koexprimierten, erzeugten sie bereits in geringen Konzentrationen klare mutagene Effekte (0,3 µM für 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol; 0,1 µM für 2-Aminoanthracen; 10 µM für 2,4-Diaminotoluol). Die stärkste Aktivierung von 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A2 koexprimierte; die stärkste Aktivierung von 2,4-Diaminotoluol und 2-Aminoanthracen erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A1 koexprimierte. Sowohl SULT1A1 als auch SULT1A2 sind im Menschen genetisch polymorph. Ein unterschiedlich starkes Aktivierungspotenzial der Alloenzyme könnte eine individuell unterschiedliche Suszeptibilität für die durch aAA ausgelöste Kanzerogenese bedingen. In HPRT-Mutationsuntersuchungen mit rekombinanten Zellen zeigten die allelischen Varianten der SULT1A2 starke Unterschiede in ihrem Aktivierungpotenzial. Nur in der Zelllinie, die das Alloenzym SULT1A2*1 mit CYP1A2 koexprimierte, wurde 2-Acetylaminofluoren zum Mutagen aktiviert. Zur Aktivierung von 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol waren jedoch sowohl das Alloenzym SULT1A2*1 als auch das Alloenzym SULT1A2*2 in der Lage. Die Alloenzyme der SULT1A1 zeigten ein ähnlich gutes Aktivierungspotenzial für aAA. In früheren Studien wurde gezeigt, dass die SULT1C1 der Ratte eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der aAA in dieser Spezies spielt. Dahingegen war die humane SULT1C1 nicht in der Lage die untersuchten aAA zu aktivieren. Die Kenntnis solcher Spezieunterschiede könnte wichtig sein um unterschiedliche Organotropismen aAA in Menschen und Tiermodellen zu erklären, da SULT mit starker Gewebespezifität exprimiert werden und das Expressionsmuster für die einzelnen SULT-Formen in Menschen und Ratten sich stark unterscheidet.
In der vorliegenden Arbeit habe ich wichtige Teilmechanismen der Erregungs-Sekretionskopplung in der Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana (L.) untersucht. Die Speicheldrüse ist von dopaminergen und serotonergen Fasern innerviert (Baumann et al., 2002). Beide Transmitter stimulieren eine unterschiedliche Reaktion der Drüse: Dopamin (DA) stimuliert die P-Zellen der Acini und die Ausführgangzellen, während Serotonin (5-HT) die P- und C-Zellen der Acini stimuliert, nicht jedoch die Ausführgangzellen. Der Endspeichel ist nach einer DA-Stimulierung proteinfrei. Dagegen enthält er nach einer 5-HT-Stimulierung Proteine, die von den C-Zellen sezerniert werden (Just & Walz, 1996). Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich mittels Kapillarelektrophoretischer Analyse (CE-Analyse) die Elektrolytkonzentrationen im Endspeichel untersucht sowie die Raten der Flüssigkeitssekretion gemessen. Damit wollte ich klären, welche Transporter an der Sekretion des Primärspeichels und an dessen Modifikation beteiligt sind. Ausserdem wollte ich die Rolle der transportaktiven Epithelzellen der Ausführgänge für die Modifikation des Primärspeichels untersuchen. Dafür habe ich einen Vergleich der Elektrolytkonzentrationen im DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichel durchgeführt. Der Elektrolytgehalt des DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichels unterscheidet sich nicht signifikant voneinander. Er ist nach beiden Stimulierungen hypoosmotisch zum verwendeten Ringer. Die Ausführgangzellen werden durch DA stimuliert und modifizieren den Primärspeichel durch eine netto-Ionenreabsorption. Meine Versuche zeigen jedoch, dass auch die während einer 5-HT-Stimulierung der Drüse unstimulierten Ausführgangzellen den Primärspeichel modifizieren. In einer nachfolgenden Versuchsreihe habe ich den Einfluss von Ouabain, einem Hemmstoff der Na+-K+-ATPase, und Bumetanid, einem Hemmstoff des NKCC, auf die Raten der Flüssigkeitssekretion sowie den Elektrolytgehalt des Endspeichels untersucht. Ich habe gefunden, dass die Aktivität der Na+-K+-ATPase wichtig für die Modifikation des DA-stimulierten Primärspeichels ist. Im Gegensatz dazu ist sie für die Modifikation des 5-HT-stimulierten Primärspeichels nicht von Bedeutung. Bezüglich der Flüssigkeitssekretion habe ich keinen Einfluss der Na+-K+-ATPase-Aktivität auf die DA-stimulierten Sekretionsraten gefunden, dagegen ist die 5-HT-stimulierte Sekretionsrate in Anwesenheit von Ouabain gesteigert. Die Aktivität des NKCC ist für beide sekretorische Prozesse, die Ionen- und die Flüssigkeitssekretion, wichtig. Eine Hemmung des NKCC bewirkt eine signifikante Verringerung der Raten der Flüssigkeitssekretion nach DA- und 5-HT-Stimulierung sowie in beiden Fällen einen signifikanten Abfall der Ionenkonzentrationen im Endspeichel. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich versucht, Änderungen der intrazellulären Ionenkonzentrationen in den Acinuszellen während einer DA- oder 5-HT-Stimulierung zu messen. Diese Experimente sollten mit der Methode des "ratiometric imaging" durchgeführt werden. Messungen mit dem Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 zeigten keinen globalen Anstieg in der intrazellulären Ca2+-Konzentration der P-Zellen. Aufgrund von Problemen mit einer schlechten Beladung der Zellen, einer starken und sich während der Stimulierung ändernden Autofluoreszenz der Zellen sowie Änderungen im Zellvolumen wurden keine Messungen mit Na+- und K+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt. Im dritten Teil dieser Arbeit habe ich die intrazellulären Signalwege untersucht, die zwischen einer 5-HT-Stimulierung der Drüse und der Proteinsekretion vermitteln. Dazu wurde der Proteingehalt im Endspeichel biochemisch mittels eines modifizierten Bradford Assay gemessen. Eine erstellte Dosis-Wirkungskurve zeigt, dass die Rate der Proteinsekretion von der zur Stimulierung verwendeten 5-HT-Konzentration abhängt. In einer Serie von Experimenten habe ich die intrazellulären Konzentrationen von Ca2+, cAMP und / oder cGMP erhöht und anschließend den Proteingehalt im Endspeichel gemessen. Ein Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert nur eine geringe Rate der Proteinsekretion. Dagegen kann die Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration eine stärkere Proteinsekretion aktivieren, die sich nicht signifikant von der nach 5-HT-Stimulierung unterscheidet. Die cAMP-stimulierte Proteinsekretion kann durch gleichzeitige Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration weiter gesteigert werden. Dagegen aktivierte eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration die Proteinsekretion nicht. Aufgrund dieser Ergebnisse postuliere ich die Existenz eines die Adenylatcyclase aktivierenden 5-HT-Rezeptors in der Basolateralmembran der C-Zellen.
Im Bereich der medizinischen Diagnostik spielen DNA-Chips eine immer wichtigere Rolle. Dabei werden Glas- oder Silikon-Oberflächen mit Tausenden von einzelsträngigen DNA-Fragmenten, sog. Sonden, bestückt, die mit den passenden DNA-Fragmenten in der zugefügten Patientenprobe verschmelzen. Die Auswertung solcher Messungen liefert die Diagnose für Krankheiten wie z.B. Krebs, Alzheimer oder für den Nachweis pathogener Erreger. Durch fortschreitende Miniaturisierung dieser Meßsysteme können bis zu 40.000 Genfragmente des Menschen in einer einzigen Messung analysiert werden. Neben den DNA-Fragmenten können Bio-Chips auch für andere biologische Komponenten wie Antikörper und Proteine eingesetzt werden, wobei bei letzteren neben der Bindung auch die Aktivität ein wichtiger Diagnoseparamter ist. Am Fraunhofer-Institut für medizinische Technik und am Lehrstuhl für Analytische Biochemie der Universität Potsdam wurden im Rahmen einer Doktorarbeit Methoden entwickelt, die es ermöglichen auf nukleinsäuremodifizierten Sensoroberflächen die Aktivität von Proteinen zu messen. Es wurden Nukleinsäuren auf Oberflächen optischer Sensoren verankert. Diese fungierten als Rezeptor für die Proteine sowie auch als Substrat für Restriktionsenzyme, die Nukleinsäuren schneiden und Polymerasen, die Nukleinsäuren synthetisieren und verlängern können. Seine Anwendung fand diese Messmethode in der Messung der Aktivität des Proteins Telomerase, das in 90% aller Tumore erhöhte Aktivität gegenüber gesunden Zellen aufweist. Die Vorteile dieses neuen Assays gegenüber älteren Methoden liegt im Verzicht auf radioaktiv-markierten Komponenten und einer deutlich verkürzten Analysezeit. Die Arbeit schliesst mit einem funktionsfähigen Nachweis der Telomeraseaktivität im Zellextrakt von gesunden und kranken Zellen. Der direkte Einfluß von Hemmstoffen auf die Aktivität konnte sichtbar gemacht werden, und steht daher bei der Entwicklung neuer Tumor-Diagnostika und Therapeutika zur Verfügung.
In this thesis, I investigated the factors influencing the growth and vertical distribution of planktonic algae in extremely acidic mining lakes (pH 2-3). In the focal study site, Lake 111 (pH 2.7; Lusatia, Germany), the chrysophyte, Ochromonas sp., dominates in the upper water strata and the chlorophyte, Chlamydomonas sp., in the deeper strata, forming a pronounced deep chlorophyll maximum (DCM). Inorganic carbon (IC) limitation influenced the phototrophic growth of Chlamydomonas sp. in the upper water strata. Conversely, in deeper strata, light limited its phototrophic growth. When compared with published data for algae from neutral lakes, Chlamydomonas sp. from Lake 111 exhibited a lower maximum growth rate, an enhanced compensation point and higher dark respiration rates, suggesting higher metabolic costs due to the extreme physico-chemical conditions. The photosynthetic performance of Chlamydomonas sp. decreased in high-light-adapted cells when IC limited. In addition, the minimal phosphorus (P) cell quota was suggestive of a higher P requirement under IC limitation. Subsequently, it was shown that Chlamydomonas sp. was a mixotroph, able to enhance its growth rate by taking up dissolved organic carbon (DOC) via osmotrophy. Therefore, it could survive in deeper water strata where DOC concentrations were higher and light limited. However, neither IC limitation, P availability nor in situ DOC concentrations (bottom-up control) could fully explain the vertical distribution of Chlamydomonas sp. in Lake 111. Conversely, when a novel approach was adopted, the grazing influence of the phagotrophic phototroph, Ochromonas sp., was found to exert top-down control on its prey (Chlamydomonas sp.) reducing prey abundance in the upper water strata. This, coupled with the fact that Chlamydomonas sp. uses DOC for growth, leads to a pronounced accumulation of Chlamydomonas sp. cells at depth; an apparent DCM. Therefore, grazing appears to be the main factor influencing the vertical distribution of algae observed in Lake 111. The knowledge gained from this thesis provides information essential for predicting the effect of strategies to neutralize the acidic mining lakes on the food-web.
In der vorliegenden Dissertation wird die Bedeutung von Brachen für Artenvielfalt und Stabilität von Blüte-Bestäuber-Nahrungsnetzen in agrarisch genutzten Landschaften anhand ausgewählter blütenbesuchender Insektengruppen (Syrphidae, Lepidoptera) untersucht. Die Freilandarbeiten fanden von 1998-2000 im Raum der Feldberger Seenlandschaft, Mecklenburg-Vorpommern, statt. Es werden die beiden Hauptnahrungsquellen Nektar und Pollen betrachtet, dabei fanden Untersuchungen zur Intensität der Blüte-Bestäuber-Interaktion auf Stilllegungsflächen, zum flächenbezogenen quantitativen Nektarangebot im Jahresverlauf, zur individuellen Pollennutzung bei Syrphiden und zur Breite und Überlappung der Nahrungsnischen bei den dominanten Arten Episyrphus balteatus, Metasyrphus corollae, Syritta pipiens und Sphaerophoria scripta statt. Im Ergebnis zeigt sich eine hohe Bedeutung der Brachflächen für die Stabilität des Blüte-Bestäuber-Netzes, während die Diversität von anderen, eher landschaftsbezogenen Faktoren abhängig ist.
Today, analytical chemistry does not longer consist of only the big measuring devices and methods which are time consuming and expensive, which can furthermore only be handled by the qualified staff and in addition the results can also only be evaluated by this qualified staff. Usually, this technique, which shall be described in the following as 'classic analytic measuring technique', requires also rooms equipped especially and often a relative big quantity of the test compounds which should be prepared especially. Beside this classic analytic measuring technique, limited on definite substance groups and requests, a new measuring technique has gained acceptance particularly within the last years, which one can often be used by a layman, too. Often the new measuring technique has very little pieces of equipment. The needed sample volumes are also small and a special sample preparation isn't required. In addition, the new measuring instruments are simple to handle. They are cheap both in their production and in the use and they permit even a continuous measurement recording usually. Numerous of this new measuring instruments base on the research in the field of Biosensorik during the last 40 years. Since Clark and Lyon in the year 1962 were able to measure glucose with a simple oxygen electrode, completed by an enzyme the development of the new measuring technique did not have to be held back any longer. Biosensors, special pickups which consists of a combination from a biological component (permits a specific recognition of the analyte also without purification of the sample previously) and a physical pickup (convert the primary physicochemical effect into an electronically measurable signal), conquered the market. In the context of this thesis different tyrosinasesensors were developed which fulfilling the various requests, depending on origin and features of the used tyrosinase. One of the tyrosinasesensors for example was used for quantification of phenolic compounds in river and sea water and the results could correlated very well with the corresponding DIN-test for the determination of phenolic compounds. An other developed tyrosinasesensor showed a very high sensitiveness for catecholamines, substances which are of special importance in the medical diagnostics. In addition, the investigations of two different tyrosinases, which were carried out also in the context of this thesis, have shown, that a special tyrosinase (tyrosinase from Streptomyces antibioticus) will be the better choice as tyrosinase from Agaricus bisporus, which is used in the area of biosensor research till now, if one wants to develop in future even more sensitive tyrosinasesensors. Furthermore, first successes became reached on a molecular biological field, the production of tyrosinasemutants with special, before well-considered features. These successes can be used to develop a new generation of tyrosinasesensors, tyrosinasesensors in which tyrosinase can be bound directionally both to the corresponding physical pickup or also to another enzyme. From this one expects to achieve ways minimized which the substance to be determined (or whose product) otherwise must cover. Finally, this should result in an clearly visible increase of sensitivity of the Biosensor.
Das Lektin aus Pisum sativum, der Gartenerbse, ist Teil der Familie der Leguminosenlektine. Diese Proteine haben untereinander eine hohe Sequenzhomologie, und die Struktur ihrer Monomere, ein all-ß-Motiv, ist hoch konserviert. Dagegen gibt es innerhalb der Familie eine große Vielfalt an unterschiedlichen Quartärstrukturen, die Gegenstand kristallographischer und theoretischer Arbeiten waren. Das Erbsenlektin ist ein dimeres Leguminosenlektin mit einer Besonderheit in seiner Struktur: Nach der Faltung in der Zelle wird aus einem Loop eine kurze Aminosäuresequenz herausgeschnitten, so dass sich in jeder Untereinheit zwei unabhängige Polypeptidketten befinden. Beide Ketten sind aber stark miteinander verschränkt und bilden eine gemeinsame strukturelle Domäne. Wie alle Lektine bindet Erbsenlektin komplexe Oligosaccharide, doch sind seine physiologische Rolle und der natürliche Ligand unbekannt. In dieser Arbeit wurden Versuche zur Entwicklung eines Funktionstests für Erbsenlektin durchgeführt und seine Faltung, Stabilität und Monomer-Dimer-Gleichgewicht charakterisiert. Um die spezifische Rolle der Prozessierung für Stabilität und Faltung zu untersuchen, wurde ein unprozessiertes Konstrukt in E. coli exprimiert und mit der prozessierten Form verglichen. Beide Proteine zeigen die gleiche kinetische Stabilität gegenüber chemischer Denaturierung. Sie denaturieren extrem langsam, weil nur die isolierten Untereinheiten entfalten können und das Monomer-Dimer-Gleichgewicht bei mittleren Konzentrationen an Denaturierungsmittel auf der Seite der Dimere liegt. Durch die extrem langsame Entfaltung zeigen beide Proteine eine apparente Hysterese im Gleichgewichtsübergang, und es ist nicht möglich, die thermodynamische Stabilität zu bestimmen. Die Stabilität und die Geschwindigkeit der Assoziation und Dissoziation in die prozessierten bzw. nichtprozessierten Untereinheiten sind für beide Proteine gleich. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch unter nicht-denaturierenden Bedingungen die Untereinheiten zwischen den Dimeren ausgetauscht werden. Die Renaturierung der unprozessierten Variante ist unter stark nativen Bedingungen zu 100 % möglich. Das prozessierte Protein dagegen renaturiert nur zu etwa 50 %, und durch die Prozessierung ist die Faltung stark verlangsamt, der Faltungsprozess ist erst nach mehreren Tagen abgeschlossen. Im Laufe der Renaturierung wird ein Intermediat populiert, in dem die längere der beiden Polypeptidketten ein Homodimer mit nativähnlicher Untereinheitenkontaktfläche bildet. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Renaturierung ist die Assoziation der entfalteten kürzeren Kette mit diesem Dimer.
Vergleich von rekombinanten Vaccinia- und DNA-Vektoren zur Tumorimmuntherapie im C57BL/6-Mausmodell
(2002)
In der vorliegenden Arbeit wurden Tumorimpfstoffe auf der Basis des Plasmid-Vektors pCI, modified vaccinia virus Ankara (MVA) und MVA-infizierten dendritischen Zellen entwickelt und durch Sequenzierung, Western blotting und durchflußzytometrische Analyse überprüft. Die in vivo Wirksamkeit der Vakzinen wurde in verschiedenen Tumormodellen in C57BL/6 Mäusen verglichen. Die auf dem eukaryotischen Expressionsvektor pCI basierende DNA-Vakzinierung induzierte einen sehr wirksamen, antigenspezifischen und langfristigen Schutz vor Muzin, CEA oder beta-Galactosidase exprimierenden Tumoren. Eine MVA-Vakzinierung bietet in den in dieser Arbeit durchgeführten Tumormodellen keinen signifikanten Schutz vor Muzin oder beta-Galactosidase exprimierenden Tumoren. Sowohl humane, als auch murine in vitro generierte dendritische Zellen lassen sich mit MVA – im Vergleich zu anderen viralen Vektoren – sehr gut infizieren. Die Expressionsrate der eingefügten Gene ist aber gering im Vergleich zur Expression in permissiven Wirtszellen des Virus (embryonale Hühnerfibroblasten). Es konnte gezeigt werden, daß eine MVA-Infektion dendritischer Zellen ähnliche Auswirkungen auf den Reifezustand humaner und muriner dendritischer Zellen hat, wie eine Infektion mit replikationskompetenten Vakzinia-Stämmen, und außerdem die Hochregulation von CD40 während der terminalen Reifung von murinen dendritischen Zellen inhibiert wird. Die während der langfristigen in vitro Kultur auf CEF-Zellen entstandenen Deletionen im MVA Genom führten zu einer starken Attenuierung und dem Verlust einiger Gene, die immunmodulatorische Proteine kodieren, jedoch nicht zu einer Verminderung des zytopathischen Effekts in dendritischen Zellen. Die geringe Expressionsrate und die beobachtete Inhibition der Expression kostimulatorischer Moleküle auf dendritischen Zellen kann für eine wenig effektive Induktion einer Immunantwort in MVA vakzinierten Tieren durch cross priming oder die direkte Infektion antigenpräsentierender Zellen verantwortlich sein. Durch die Modifikation einer Methode zur intrazellulären IFN-gamma Färbung konnten in vakzinierten Mäusen tumorantigenspezifische CTL sensitiv und quantitativ detektiert werden. Die so bestimmte CTL-Frequenz, nicht jedoch die humorale Antwort, korrelierte mit der in vivo Wirksamkeit der verschiedenen Vakzinen: DNA vakzinierte Tiere entwickeln starke tumorantigenspezifische CTL-Antworten, wohingegen in MVA-vakzinierten Tieren überwiegend gegen virale Epitope gerichtete CD4 und CD8-T-Zellen detektiert wurden. Die Wirksamkeit der pCI-DNA-Vakzine spricht für die Weiterentwicklung in weiteren präklinischen Mausmodellen, beispielsweise unter Verwendung von MUC1 oder HLA-A2 transgenen Mäusen. Die Methoden zur Detektion Tumorantigen-spezifischer CTL in 96-Loch-Mikrotiterplatten können dabei zur systematischen Suche nach im Menschen immundominanten T-Zell-Epitopen im Muzin-Molekül genutzt werden. Der durchgeführte Vergleich der auf den Vektoren pCI und MVA basierenden Vakzinen und die Analyse neuerer Publikationen führen zu dem Ergebnis, daß vor allem DNA-Vakzinen in Zukunft eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von aktiven Tumorimpfstoffen spielen werden. Rekombinante MVA-Viren, eventuell in Kombination mit DNA- oder anderen Vektoren, haben sich dagegen in zahlreichen Studien als wirksame Impfstoffe zur Kontrolle von durch Pathogene hervorgerufenen Infektionserkrankungen erwiesen.
Hämoglobin-A1c (HbA1c) ist ein Hämoglobin (Hb)-Subtypus, der durch nicht-enzymatische Glykierung des N-terminalen Valinrestes der Hämoglobin-beta-Kette entsteht. Das gemessene Verhältnis von HbA1c zum Gesamt-Hämoglobin (5-20 % bei Diabetikern) repräsentiert den Mittelwert der Blutglucosekonzentration über einen zweimonatigen Zeitraum und stellt zur Beurteilung der diabetischen Stoffwechsellage eine Ergänzung zur Akutkontrolle der Glukosekonzentration dar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen amperometrischen Biosensor für die Bestimmung des medizinisch relevanten Parameters HbA1c zu entwickeln. Durch Selektion geeigneter Bioerkennungselemente und deren Immobilisierung unter Erhalt der Bindungsfunktion für die Zielmoleküle Hämoglobin bzw. HbA1c wurden spezifische, hochaffine und regenerationsstabile Sensoroberflächen geschaffen. Für die Entwicklung des HbA1c-Biosensors wurden zwei Konzepte - Enzymsensor und Immunosensor - miteinander verglichen. Die enzymatische Umsetzung von HbA1c erfolgte mit der Fructosylamin Oxidase (FAO) aus Pichia pastoris N 1-1 unter Freisetzung von H2O2, welches sowohl optisch über eine Indikatorreaktion als auch elektrochemisch nach Einschluss der FAO in PVA-SbQ und Fixierung des Immobilisats vor einer H2O2-Elektrode nachgewiesen wurde. Die Kalibration des Enzymsensors mit der HbA1c-Modellsubstanz Fructosyl-Valin ergab Nachweisgrenzen, die ausserhalb des physiologisch relevanten HbA1c-Konzentrationsbereich lagen. Aus der Umsetzung von glykierten Peptiden mit einer nicht HbA1c analogen Aminosäurensequenz, z.B. Fructosyl-Valin-Glycin wurde zudem eine geringe HbA1c-Spezifität abgeleitet. Für den Immunosensor wurden zwei heterogene Immunoassay-Formate unter Verwendung von hochaffinen und spezifischen Antikörpern in Kombination mit Glucose Oxidase (GOD) als Markerenzym zum Nachweis von HbA1c untersucht. Beim indirekt-kompetitiven Immunoassay wurde anstelle des kompletten HbA1c-Moleküls das glykierte Pentapeptid Fructosyl-Valin-Histidin-Leucin-Threonin-Prolin (glkPP) als Kompetitor und Affinitätsligand immobilisiert und so eine regenerierfähige Oberfläche geschaffen. Beim Sandwich-Immunoassay wurde im ersten Schritt Gesamt-Hämoglobin an die mit Haptoglobin (Hp) modifizierte Festphase angereichert und im zweiten Schritt der gebundene HbA1c-Anteil nachgewiesen. Für die Konstruktion des HbA1c-Immunosensors wurden Affinitätsmatrizen durch Modifizierung von Cellulose-Dialysemembranen mit glkPP bzw. Hp hergestellt. Grundlegend studiert wurde die Aktivierung der Cellulose-Membranen mit 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) und 1-Cyano-4-dimethylaminopyridintetrafluoroborat (CDAP) als Aktivierungsagenzien. Eine gerichtete Immobilisierung der Liganden wurde realisiert, indem glkPP über dessen C-Terminus (einzige Carboxylatgruppe) und Hp über dessen periodat-oxidiertem Kohlenhydratrest an die amino- oder hydrazidfunktionalisierte Membranen kovalent gekoppelt wurden. Mit dem Einsatz der glkPP- und Hp-modifizierten Membranen in der elektrochemischen Messzelle war erstmalig der biosensorische Nachweis von HbA1c möglich. Als Transduktor diente eine Pt-Elektrode, an der das von der GOD generierte H2O2 umgesetzt und ein mit der HbA1c-Konzentration korrelierendes Stromsignal erzeugt wurde. Die Immunosensoren zeigten Ansprechzeiten von 3 s. Mit dem Immunosensor auf Basis des indirekt-kompetitiven Testprinzips wurde eine Kalibrationskurve für HbA1c im Bereich von 0,25-30 µg/ml (3,9-465 nM, CV 3-9 %) mit Assayzeiten von 60 min und mit dem Immunosensor im Sandwich-Format eine Kalibrationskurve im Bereich von 0,5-5 µg/ml (7,8-78 nM; 5-50 % HbA1c vom Gesamt-Hb, CV 6-10 %, 3 h) aufgenommen.
Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, katalytische Antikörper zur Hydrolyse von Benzylphenylcarbamaten sowie zahlreiche monoklonale Antikörper gegen Haptene herzustellen. Es wurden verschiedene Hapten-Protein-Konjugate unter Verwendung unterschiedlicher Kopplungsmethoden hergestellt und charakterisiert. Zur Generierung der hydrolytisch aktiven Antikörper wurden Inzuchtmäuse mit KLH-Konjugaten von 4 Übergangszustandsanaloga (ÜZA) immunisiert. Mit Hilfe der Hybridomtechnik wurden verschiedene monoklonale Antikörper gegen diese ÜZA gewonnen. Dabei wurden sowohl verschiedene Immunisierungsschemata als auch verschiedene Inzuchtmausstämme und Fusionstechniken verwendet. Insgesamt wurden 32 monoklonale Antikörper gegen die verwendeten ÜZA selektiert. Diese Antikörper wurden in großen Mengen hergestellt und gereinigt. Zum Nachweis der Antikörper-vermittelten Katalyse wurden verschiedene Methoden entwickelt und eingesetzt, darunter immunologische Nachweismethoden mit Anti-Substrat- und Anti-Produkt-Antikörpern und eine photometrische Methode mit Dimethylaminozimtaldehyd. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität gelang mit Hilfe eines Enzymsensors, basierend auf immobilisierter Tyrosinase. Die Antikörper N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysierten die Benzylphenylcarbamate POCc18, POCc19 und Substanz 27. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität dieser Antikörper gelang auch mit Hilfe der HPLC. Der katalytische Antikörper N1-BC1-D11 wurde kinetisch und thermodynamisch untersucht. Es wurde eine Michaelis-Menten-Kinetik mit Km von 210 µM, vmax von 3 mM/min und kcat von 222 min-1 beobachtet. Diese Werte korrelieren mit den Werten der wenigen bekannten Diphenylcarbamat-spaltenden Abzyme. Die Beschleunigungsrate des Antikörpers N1-BC1-D11 betrug 10. Das ÜZA Hei3 hemmte die hydrolytische Aktivität. Dies beweist, dass die Hydrolyse in der Antigenbindungsstelle stattfindet. Weiter wurde zwischen der Antikörperkonzentration und der Umsatzgeschwindigkeit eine lineare Abhängigkeit festgestellt. Die thermodynamische Gleichtgewichtsdissoziationskonstante KD des Abzyms von 2,6 nM zeugt von einer sehr guten Affinität zum ÜZA. Hydrolytisch aktiv waren nur Antikörper, die gegen das Übergangszustandsanalogon Hei3 hergestellt worden waren. Es wird vermutet, dass die Hydrolyse der Benzylphenylcarbamate über einen Additions-Eliminierungsmechanismus unter Ausbildung eines tetraedrischen Übergangszustandes verläuft, dessen analoge Verbindung Hei3 ist. Im Rahmen der Generierung von Nachweisantikörpern zur Detektion der Substratabnahme bei der Hydrolyse wurden Anti-Diuron-Antikörper hergestellt. Einer der Antikörper (B91-CG5) ist spezifisch für das Herbizid Diuron und hat einen IC50-Wert von 0,19 µg/l und eine untere Nachweisgrenze von 0,04 µg/l. Ein anderer Antikörper (B91-KF5) reagiert kreuz mit einer Palette ähnlicher Herbizide. Mit diesen Antikörpern wurde ein empfindlicher Labortest, der ein Monitoring von Diuron auf Grundlage des durch die Trinkwasserverordnung festgeschriebenen Wertes für Pflanzenschutzmittel von 0,1 µg/l erlaubt, aufgebaut. Der Effekt der Anti-Diuron-Antikörper auf die Diuron-inhibierte Photosynthese wurde in vitro und in vivo untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl in isolierten Thylakoiden, als auch in intakten Algen eine Vorinkubation der Anti-Diuron-Antikörper mit Diuron zur Inaktivierung seiner Photosynthese-hemmenden Wirkung führt. Wurde der Elektronentransport in den isolierten Thylakoiden oder in Algen durch Diuron unterbrochen, so führte die Zugabe der Anti-Diuron-Antikörper zur Reaktivierung der Elektronenübertragung.
Im ersten Teil der Arbeit wurden Strategien zur Analyse von Transkripten erarbeitet. Die ersten Versuche zielten darauf ab, in mit Glaskapillaren genommenen Einzelzellproben verschiedener Gewebeschichten RT-PCR durchzuführen, um spezifische Transkripte nachweisen zu können. Dies gelang für eine Reihe von Genen aus verschiedenen Pflanzenspezies. Dabei konnten sowohl Transkripte stark wie auch schwach exprimierter Gene nachgewiesen werden. Für die Erstellung von Gewebe-spezifischen Expressionsprofilen war es notwendig, die in vereinigten Zellproben enthaltene mRNA zunächst zu amplifizieren, um eine ausreichende Menge für Arrayhybridisierungen zu erhalten. Vor der Vermehrung wurde die mRNA revers transkribiert. Es wurden daran anschließend verschiedene Amplifikationsstrategien getestet: Die neben Tailing, Adapterligation und anderen PCR-basierenden Protokollen getestete Arbitrary-PCR hat sich in dieser Arbeit als einfache und einzige Methode herausgestellt, die mit so geringen cDNA-Mengen reproduzierbar arbeitet. Durch Gewebe-spezifische Array-hybridisierungen mit der so amplifizierten RNA konnten schon bekannte Expressionsmuster verschiedener Gene, vornehmlich solcher, die an der Photosynthese beteiligt sind, beobachtet werden. Es wurden aber auch eine ganze Reihe neuer offensichtlich Gewebe-spezifisch exprimierter Gene gefunden. Exemplarisch für die differentiell exprimierten Gene konnte das durch Arrayhybridisierungen gefundene Expressionsmuster der kleinen Untereinheit von Rubisco verifiziert werden. Hierzu wurden Methoden zum Gewebe-spezifischen Northernblot sowie semiquantitativer und Echtzeit-Einzelzell-RT-PCR entwickelt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Methoden zur Analyse von Metaboliten einschließlich anorganischer Ionen verwendet. Es stellte sich heraus, daß die multiparallele Methode der Gaschromatographie-Massenspektrometrie keine geeignete Methode für die Analyse selbst vieler vereinigter Zellinhalte ist. Daher wurde auf Kapillarelektrophorese zurückgegriffen. Eine Methode, die mit sehr kleinen Probenvolumina auskommt, eine hohe Trennung erzielt und zudem extrem geringe Detektionslimits besitzt. Die Analyse von Kohlenhydraten und Anionen erfordert eine weitere Optimierung. Über UV-Detektion konnte die K+-Konzentration in verschiedenen Geweben von A. thaliana bestimmt werden. Sie lag in Epidermis und Mesophyll mit ca. 25 mM unterhalb der für andere Pflanzenspezies (Solanum tuberosum und Hordeum vulgare) publizierten Konzentration. Weiter konnte gezeigt werden, daß zwölf freie Aminosäuren mittels einer auf Kapillarelektrophorese basierenden Methode in vereinigten Zellproben von Cucurbita maxima identifiziert werden konnten. Die Übertragung der Methode auf A. thaliana-Proben muß jedoch weiter optimiert werden, da die Sensitivität selbst bei Laser induzierter Fluoreszenz-Detektion nicht ausreichte. Im dritten und letzten Teil der Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die die Analyse bekannter wie unbekannter Proteine in Gewebe-spezifischen Proben ermöglicht. Hierzu wurde zur Probennahme mittels mechanischer Mikrodissektion eine alternative Methode zur Laser Capture Microdissection verwendet, um aus eingebetteten Gewebeschnitten distinkte Bereiche herauszuschneiden und somit homogenes Gewebe anzureichern. Aus diesem konnten die Proteine extrahiert und über Polyacrylamidgelelektrophorese separariert werden. Banden konnten ausgeschnitten, tryptisch verdaut und massenspektrometrisch die Primärsequenz der Peptidfragmente bestimmt werden. So konnten als Hauptproteine im Mesophyll die große Untereinheit von Rubisco sowie ein Chlorophyll bindendes Protein gefunden werden. Die in dieser Arbeit entwickelten und auf die Modellpflanze Arabidopsis thaliana angewandten Einzelzellanalysetechniken erlauben es in Zukunft, physiologische Prozesse besser sowohl räumlich als auch zeitlich aufzulösen. Dies wird zu einem detaillierteren Verständnis mannigfaltiger Vorgänge wie Zell-Zell-Kommunikation, Signalweiterleitung oder Pflanzen-Pathogen-Interaktionen führen.
In der randomisierten, multizentrischen DASH-Studie (Dietary Approaches to Stop Hy-pertension), die unter kontrollierten Bedingungen stattfand, führte eine fettreduzierte Mischkost, reich an Obst, Gemüse und Milchprodukten, bei Borderline-Hypertonikern zu einer signifikanten Blutdrucksenkung. Während der Studienphase wurden Körpermasse, Natrium-Aufnahme sowie Alkoholzufuhr aufgrund der bekannten Einflussnahme auf den Blutdruck konstant gehalten. In der eigenen Pilot-Studie sollte untersucht werden, ob das Ergebnis der DASH-Studie (i) mit deutschen Hypertonikern und (ii) unter habituellen Ernährungs- und Lebensbedingungen mit regelmäßig durchgeführter Ernährungsberatung und ad libitum Verzehr anstelle des streng kontrollierten Studienansatzes bestätigt werden kann. Eine Konstanz der Körpermasse, der Natrium-Urinausscheidung (unter diesem Studienansatz valider als die Aufnahme) und des Alkoholkonsums wurde vorausgesetzt. Die Studienpopulation setzte sich aus 53 übergewichtigen Probanden mit einer nicht medikamentös therapierten Borderline-Hypertonie und ohne Stoffwechselerkrankungen zusammen. Die Studienteilnehmer wurden randomisiert entweder der Idealgruppe mit einer fettarmen Kost reich an Milchprodukten, Obst und Gemüse (ähnlich der DASH-Idealgruppe) oder der Kontrollgruppe mit habitueller Ernährungsweise zugeteilt. Über einen Zeitraum von fünf Wochen wurde den Probanden etwa 50% ihres täglichen Lebensmittelbedarfes entsprechend ihrer Gruppenzugehörigkeit kostenfrei zur Verfügung gestellt. Gelegenheitsblutdruckmessungen und 24h-Blutdruckmessungen, Ernährungs- und Aktivitätsprotokolle, Blut- und Urinproben sowie anthropometrische Messungen wurden vor, während und fünf Wochen nach der Interventionsphase durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass in der Idealgruppe keine signifikante Blutdrucksenkung beobachtet werden konnte. Dies lässt sich durch die Tatsache erklären, dass die Lebens-mittel- und Nährstoffaufnahme der deutschen Kontrollgruppe eher der amerikanischen Idealgruppe entsprach. In der Pilot-Studie waren die Unterschiede in der Nährstoffzufuhr zwischen den beiden Gruppen viel geringer als in der DASH-Studie; für eine blutdrucksenkende Ernährungsumstellung bestand somit nur ein geringer Spielraum. Eine weitere Erklärung besteht in der unterschiedlichen Zusammensetzung der Studienpopulation. Bei DASH wurden vorwiegend farbige Probanden (40% höhere Hypertonieprävalenz) untersucht. Die Studienergebnisse lassen also den Schluss zu, dass Ernährungs- und Lebensstilgewohnheiten sowie der genetische Hintergrund der entsprechenden Bevölkerungsgruppe bei der Formulierung von nährstoff- oder lebensmittelbezogenen Empfehlungen zur Senkung des Bluthochdruckes Berücksichtigung finden müssen.
Die Ausstattung der gastrointestinalen Mukosa des Menschen und der Ratte mit Sulfotransferasen wurde mit Hilfe von Immunodetektion und Enzymaktivitätsmessungen untersucht. In Proben aus Colon und Rektum von 39 Personen wurden die Formen h1A1, h1A3 und h1B1 identifiziert, wobei in einer weiteren Probe, die als einzige von einem an Colitis Ulcerosa erkrankten Patienten stammte, keine Sulfotransferasen nachgewiesen werden konnten. Bei der Immunblot-Analyse war das Expressionsmuster der einzelnen Formen in allen Proben ähnlich. In wenigen Proben waren die relativen Signalintensitäten der h1A1 und der h1B1 um die Hälfte erniedrigt. Der Gehalt von SULT an zytosolischem Protein zeigte einen bis zu 8 - 10fachen Unterschied, er betrug jedoch bei zwei Dritteln der Proben zwischen 0,15 und 0,3 (h1A1 und h1A3) bzw. 0,6 und 0,8 Promille (h1B1). Die Variation konnte nicht auf Alter, Geschlecht oder Krankheitsbild der Patienten zurückgeführt werden. Auch der für die allelischen Varianten der h1A1 beschriebene Effekt auf die Enzymaktiviät bzw. Stabilität konnte in der Menge an immunreaktivem Protein nicht in diesem Ausmaß detektiert werden. Die Allelhäufigkeit von h1A1*R und h1A1*H war gegenüber der gesunden Bevölkerung nicht verändert. In den sieben Proben aus dem Dünndarm (Coecum, viermal Ileum, Jejunum) konnten zusätzlich die Formen h1E1 und h2A1 identifiziert werden. Ein möglicherweise der Form h1C1 entsprechendes Protein wurde im Magen detektiert. Im Vergleich zum Menschen war die Expression in der Ratte stärker auf die Leber konzentriert. Während beim Menschen in allen untersuchten Abschnitten Sulfotransferasen in Mengen detektiert wurden, die in zwei Fällen (h1B1 und h1A3) sogar den Gehalt in der Leber überstiegen, beschränkte sich die Expression in der Ratte auf im Vergleich zur Leber geringe Mengen im Magen und Dickdarm. Nachgewiesen wurden die r1B1, r1A1 sowie eine nicht identifizierte Form von 35kD, bei der es sich vermutlich um die r1C2 handelt. Im Vergleich zur Leber enthielt der Dickdarm der Ratte 20 - 30 % an r1B1 und 3 % an r1A1, während im Dickdarm des Menschen die 3 - 5fache Menge an h1B1 und 25 - 50 % an h1A1 gefunden wurden. Die nicht identifizierte Form verhielt sich wie die r1B1. Die für die Leber der Ratte bekannte geschlechtsabhängige Expression wurde im Gastrointestinaltrakt nicht beobachtet. Die Verteilung der Sulfotransferasen im Colon und Ileum des Menschen wurde immunhistochemisch untersucht; für die Gewebe der Ratte war die Spezifität der zur Verfügung stehenden Antiseren nicht ausreichend. Im Colon traten h1B1-spezifische Färbungen in den differenzierten Enterozyten am oberen Ende der Krypten auf, im Dünndarm wurden die Epithelzellen der Zotten gefärbt. Die Färbung konzentrierte sich auf das Zytoplasma. Eine ähnliche Verteilung zeigte sich für h1A1 und h1A3, außer daß zusätzlich eine intensive Färbung der Endothelzellen der Kapillaren in der Submukosa des Ileums auftrat. Im Dickdarm war dies nur bei den Kapillaren in den Lymphfollikeln zu erkennen. Die h2A1 war lediglich im Zytoplasma der Epithelzellen der Zotten des Ileums nachzuweisen, während im Colon keine Farbreaktion auftrat. Durch die Verwendung der rekombinanten Indikatorstämme TA1538-h1A1, -h1A3 und -h1B1 und des Ausgangsstammes Salmonella typhimurium TA1538 im Ames-Test wurde gezeigt, daß verschiedene benzylische und allylische Alkohole durch im humanen Colon exprimierte Sulfotransferasen zu Mutagenen aktiviert werden. In den meisten Fällen erwies sich eine der drei Sulfotransferasen als besonders effizient in der Bioaktivierung, während durch die anderen Formen kein oder nur ein schwacher Effekt verursacht wurde. Die Bioaktivierung von Promutagenen durch Sulfotransferasen im Colon muß im Zusammenhang mit der Lokalisation diskutiert werden. Die Zellen im Darm, in denen immunhistochemisch Sulfotransferasen detektiert wurden, haben mit Ausnahme des Endothels je nach Abschnitt eine Lebensdauer von maximal fünf Tagen und machen keine weiteren Zellteilungen mehr durch. Daher sind DNA-Schäden in diesen Zellen ein sehr geringes Risiko für den Organismus. Soweit die reaktiven Metabolite in diesen Zellen gefangen bleiben, kann die Bioaktivierung in diesen Zellen und die Bildung von Addukten als protektiv betrachten werden, da letztere nach wenigen Tagen mit den toten Zellen in das Darmlumen abgegeben werden. Für den Vergleich der Bioaktiverung von Promutagenen durch die Form 1B1 des Menschen und der Ratte wurden aus V79 Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters abgeleitete Zellinien hergestellt, die je eine der beiden Formen stabil exprimieren. Damit standen 1B1-profiziente Indikatorzellen für den HPRT-Genmutationstest zur Verfügung, und die 1B1-abhängige Bioaktivierung konnte in einem System untersucht werden, die dem eukaryontischen Organismus näher steht als die für die Ames-Tests verwendeten Bakterien. So war z.B. die Sulfotransferase wie im Gewebe im Zytoplasma lokalisiert. Als Modellsubstanzen wurden hierbei die bereits in TA1538-h1B1 mutagen wirkenden benzylischen Alkohole 6-Hydroxymethylbenzo[a]pyren und 4-Hydroxycyclopenta-[def]chrysen getestet. Da die Sensitivität einer Sulfotransferase-exprimierenden V79-Zellinie sowohl durch die Menge an Sulfotransferase als auch durch die Verfügbarkeit des Sulfodonors limitiert sein könnte, wurden die Mutagenitätsexperimente mit V79-r1B1-Zellinien durchgeführt, die sich in ihrer Enzymaktivität um das Zwanzigfache unterschieden: V79-r1B1/A und -/B. Eine starke Erhöhung der Mutantenfrequenz wurde nur in der hoch exprimierenden Zellinie V79-r1B1/A (1019 ± 224 pmol/mg/min) beobachtet, so daß eine gravierende Beeinträchtigung der Sensitivität durch einen Mangel an Kosubstrat ausgeschlossen wurde. In der niedriger exprimierenden Zellinie V79-r1B1/B (57 ± 9 pmol/mg/min) war nur mit 6-Hydroxymethylbenzo[a]pyren ein schwacher Anstieg der Mutantenfrequenz zu erkennen, der mit 0,3 µM bei einer in etwa 100fach höheren Konzentration begann als bei V79-r1B1/A. Die zytosolische Fraktion aus V79-r1B1/B-Zellen enthielt in etwa die dreifache Menge an r1B1-Protein wie die aus Colonmucosa der Ratte. Da zumindest für die humane Mukosa gezeigt wurde, daß die 1B1 nur im einschichtigen Epithel, nicht aber in allen Zellen der Mukosa exprimiert wird, repräsentiert die zytosolische Fraktion aus der Mukosa nur bedingt die Expression in den Epithelzellen und der Vergleich mit den V79-1B1-Zellen ist grob. Im Gegensatz zu V79-r1B1/B war die Zellinie V79-h1B1, die ebenfalls nur mit Darm und Leber vergleichbare Mengen an h1B1 exprimierte, in der Lage, beide benzylischen Alkohole zu aktivieren. Der Erhöhung der Mutantenfrequenz im Vergleich zur KontrollZellinie war ähnlich wie bei der stark exprimierenden Zellinie V79-r1B1/A, erforderte aber 10fach höhere Konzentrationen. Somit unterscheiden sich Mensch und Ratte nicht nur insgesamt in ihrer Ausstattung des Gastrointestinaltrakts mit Sulfotransferasen, auch bei Betrachtung einer einzelnen Form zeigten sich deutliche Unterschiede in der Aktivierung von zwei Promutagenen. Die Ratte ist daher ein ungeeignetes Modell, um die Rolle von Sulfotransferasen bei tumorinitiierenden Prozessen im Darm zu untersuchen. Dies unterstreicht die Bedeutung von rekombinanten in-vitro-Systemen für die Erfassung des humanen Metabolismus von Fremdstoffen. Insgesamt kennt man nur eine geringe Anzahl von Substanzen, die im Tierexperiment Colontumore erzeugen, und mit Ausnahme der heterozyklischen aromatischen Amine sind diese lediglich von experimenteller Bedeutung. Dies spricht für effiziente Schutzmechanismen der Darmmukosa gegenüber Mutagenen und läßt die Frage nach der hohen Inzidenz des Kolorektalkarzinoms offen.