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Identifikation des mitochondrialen Proteins Frataxin als stoffwechselmodulierenden Tumorsuppressor
(2004)
Die Krebsentstehung wurde vor rund 80 Jahren auf veränderten zellulären Energiestoffwechsel zurückgeführt. Diese Hypothese konnte bisher weder experimentell bewiesen noch widerlegt werden. Durch den Einsatz zweier Modellsysteme mit unterschiedlicher Expression des mitochondrialen Proteins Frataxin konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass der mitochondriale Energiestoffwechsel einen Einfluss auf die Tumorentstehung zu besitzen scheint. Eine Reduktion des mitochondrialen Energiestoffwechsels wurde durch die hepatozytenspezifische Ausschaltung des mitochondrialen Proteins Frataxin in Mäusen erreicht. Der durch das Cre-/loxP-Rekombinasesystem erreichte organspezifische Knock-out wurde auf Transkriptions- und Translationsebene nachgewiesen. Anhand verminderter Aconitaseaktivität, geringeren Sauerstoffverbrauches und reduzierten ATP-Gehaltes im Lebergewebe wurde ein signifikant verminderter Energiestoffwechsel dargestellt. Zwar entsprach die Genotypenverteilung in den Versuchsgruppen der erwarteten Mendelschen Verteilung, dennoch war die mittlere Lebenserwartung der Knock-out-Tiere mit ca. 30 Wochen stark reduziert. Bereits in jungem Alter war bei diesen Tieren die Ausbildung von präneoplastischen Herden zu beobachten. Mit proteinbiochemischen Nachweistechniken konnte in Lebergewebe 4-8 Wochen alter Tiere eine verstärkte Aktivierung des Apoptosesignalweges (Cytochrom C im Zytosol, verstärkte Expression von Bax) sowie eine Modulation stressassoziierter Proteine (geringere Phosphorylierungsrate p38-MAPK, vermehrte Expression HSP-25, verminderte Expression HSP-70) aufgezeigt werden. Im inversen Ansatz wurde eine Steigerung des mitochondrialen Energiestoffwechsels durch stabile transgene Frataxinüberexpression in zwei Kolonkarzinomzelllinien erreicht. Diese Steigerung zeigte sich durch erhöhte Aconitaseaktivität, erhöhten Sauerstoffverbrauch, gesteigertes mitochondriales Membranpotenzial und erhöhten ATP-Gehalt in den Zellen. Die frataxinüberexprimierenden Zellen wuchsen signifikant langsamer als Kontrollzellen und zeigten im Soft-Agar-Assay und im Nacktmausmodell ein deutlich geringeres Potenzial zur Ausbildung von Kolonien bzw. Tumoren. Mittels Immunoblot war hier eine vermehrte Phosphorylierung der p38-MAPK festzustellen. Die zusammenfassende Betrachtung beider Modelle zeigt, dass ein reduzierter mitochondrialer Energiestoffwechsel durch Regulation der p38-MAPK und apoptotischer Signalwege ein erhöhtes Krebsrisiko zu verursachen vermag.
Substanzen der pharmazeutischen und chemischen Industrie müssen nach internationalen Richtlinien auf deren Toxizität gegenüber Mensch und Umwelt geprüft werden. Dazu gehören u. a. Prüfungen zur Vorhersage des embryotoxischen Potentials, die am lebenden Organismus durchgeführt werden. Mit dem Ziel die Anzahl der Tierversuche zu verringern, die notwendig sind um das toxikologische Profil einer Prüfsubstanz zu bestimmen, wurde der Embryonale Stammzelltest (EST) entwickelt. Als Grundlage des EST dienen embryonale Stammzellen (ES-Zellen) einer Zelllinie. ES-Zellen sind Zellen, die sich in der frühen embryonalen Entwicklung in die Zellen der Keimblätter entwickeln können. Daraus wiederum differenzieren die vielen verschiedenen, unterschiedlich spezialisierten Zelltypen des komplexen Organismus. Im EST wird die Konzentration einer Prüfsubstanz bestimmt, bei der die Differenzierung von ES-Zellen zu Herzmuskelzellen zu 50 % inhibiert wird. Zusätzlich wird die Konzentration der Prüfsubstanz bestimm°t, bei der 50 % der ES-Zellen (IC50D3) bzw. Fibroblastenzellen (IC503T3) absterben. Die allgemeine Toxizität ist damit von der spezifischen Toxizität der Prüfsubstanz auf die ES-Zellen und deren Differenzierung unterscheidbar. Die Parameter fliessen in ein biostatistisches Modell zur Prädiktion des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanzen ein. Es wurde ein Versuchsprotokoll entwickelt, wonach die ES-Zellen sich verstärkt zu Endothelzellen differenzieren. Die Endothelzellen, die im lebenden Organismus die Wand der späteren Blutgefässe, wie Venen und Arterien bilden, wurden mittels molekularbiologischer Methoden auf der RNA- und der Protein-Ebene nachgewiesen und quantifiziert. Verschiedene Zellkulturmethoden, Wachstumsfaktoren, als auch Wachstumsfaktorkonzentrationen wurden auf deren Vermögen die Differenzierung der ES-Zellen zu Endothelzellen zu induzieren, untersucht. Nach der Etablierung des Differenzierungsprotokolls wurden sieben Substanzen auf deren Vermögen geprüft, die Differenzierung von ES-Zellen zu Endothelzellen zu inhibieren. Die Endothelzellen wurden dabei über die Expression der RNA von zwei endothelzellspezifischen Genen quantifiziert. Im Vergleich dazu wurden die IC50D3 und die IC503T3 der Prüfsubstanz bestimmt, um eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanz zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der sieben Prüfsubstanzen in nicht-, schwach- oder stark embryotoxisch vorgenommen werden konnte. Es ist zu schlussfolgern, dass der weiterentwickelte in vitro Embryotoxizitätsassay sensitiv und reproduzierbar ist. Mit der Verwendung von verschiedenen Differenzierungsendpunkten kann die Prädiktionskraft des Assays deutlich verbessert, und die Anzahl von Tierversuchen verringert werden. Durch die Verwendung von molekularbiologischen Markern kann der Assay einem Hochdurchsatzscreening zugängig gemacht werden und damit die Anzahl von Prüfsubstanzen deutlich erhöht werden.
Entsprechend der sogenannten Set-point-Theorie besitzt jeder Mensch eine individuell festgelegte Körpermasse, die über große Zeiträume konstant gehalten und gegen Abweichungen verteidigt wird. Es wird angenommen, dass der Körper auf noch unbekannte Weise Änderungen in der Körpermasse per se wahrnimmt und daraufhin Mechanismen aktiviert, die zur Regenerierung der ursprünglichen Masse führen. In dieser Arbeit wurde die Hypothese getestet, dass eine künstliche Erhöhung der Körpermasse zu einer kompensatorischen Reduktion in der Körpermasse führt, um das Ausgangsgewicht wieder zu regenerieren. Die Körpermasse von männlichen und weiblichen Mäusen wurde akut durch die Implantation von Gewichten mit einer Masse von 10% der aktuellen Körpermasse in die Bauchhöhle erhöht. Bei Gültigkeit der Set-point-Theorie sollte die Körpermassereduktion der Masse des zusätzlichen Gewichtsimplantats entsprechen. Die Mäuse reagierten auf die künstlich erhöhte Körpermasse geschlechtsspezifisch. Männchen zeigten eine partielle Reduktion in der Körpermasse. Weibchen zeigten langfristig jedoch keine Änderungen in der Körpermasse. Die Reduktion der Körpermasse erfolgte bei den Männchen durch eine Abnahme in der Fettmasse. Die fettfreie Masse war in beiden Geschlechtern nicht verändert. Änderungen in der Körpermasse wurden vor allem durch Änderungen in der Energieaufnahme hervorgerufen. Ein Einfluss des Energieumsatzes auf Änderungen in der Körpermasse konnte nicht nachgewiesen werden. Die Regulation der Körpermasse entsprechend eines massespezifischen Set-points konnte partiell für die Männchen gezeigt werden. Bei den Männchen könnte daher die Wahrnehmung der Körpermasse in die Regulation der Körpermasse teilweise integriert sein. Weibchen verminderten ihre Körpermasse dagegen trotz der künstlichen Körpermasseerhöhung nicht. Das führte zur Bewahrung der Energiereserven und spricht eher für die Regulation der Körpermasse entsprechend des notwendigen Energiebedarfs im Vergleich zu Änderungen in der Körpermasse per se. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Regulation der Körpermasse geschlechtsspezifischen Mechanismen unterliegt. Dementsprechend sind auch geschlechtsspezifische Ansätze zur Therapie von Übergewicht und Adipositas notwendig.
Menschen nehmen Tausende von Stoffen als bitter wahr. Die chemische Struktur der verschiedenen Bitterstoffe ist sehr vielfältig: Sie reicht von kleinen Molekülen wie Kaliumchlorid oder Harnstoff, bis zu sehr komplexen organischen Verbindungen. Die Größe der einzigen bekannten menschlichen Familie von Bitterrezeptoren (TAS2Rs) wurde auf nur ca. 80-120 Mitglieder geschätzt. In Anbetracht der hohen Zahl und Komplexität der Bitterstoffe erscheint die Zahl von Rezeptoren als sehr gering. Dies führt natürlich zu einer Reihe von Fragen: Wie viele Mitglieder hat die menschliche TAS2R-Genfamilie? Wie viele verschiedene Substanzen können denselben Rezeptor aktivieren? Scheint die Zahl der TAS2R-Rezeptoren ausreichend, alle Bitterstoffe wahrnehmen zu können oder muss es noch andere Bitterrezeptorfamilien geben? Diese Fragen zu beantworten, ist das Ziel der vorliegenden Arbeit. Hier durchgeführte Analysen des menschlichen Genomprojektes zeigen, dass Menschen ca. 25 TAS2R-Rezeptoren besitzt, die eine sehr divergente Aminosäurestruktur aufweisen. Diese Rezeptoren wurden in eine neu entwickelte Expressionskassette kloniert, die den Transport des Rezeptors an die Zelloberfläche ermöglicht. Um Liganden für die menschliche TAS2R-Rezeptoren zu identifizieren, wurden die Rezeptoren in HEK293 Zellen exprimiert und mit verschiedenen Bitterstoffen stimuliert. Der Nachweis der Rezeptoraktivierung erfolgte durch Calcium-Imaging. Es konnte gezeigt werden, dass hTAS2R16 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Salicin und verwandten bitteren Pyranosiden ist. So wird hTAS2R16 in HEK293 Zellen durch Salicin und chemisch verwandte Substanzen aktiviert. Ein Vergleich der in diesem Messsystem erhaltenen Daten mit psychophysikalisch ermittelten Geschmackswahrnehmungen beim Menschen, ergab eine hohe Übereinstimmung. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Desensitiverung einzelner Rezeptoren die Ursache für die Adaption des Bittergeschmacks ist. Der Nachweis der Expression des Rezeptors in menschlichen Geschmackspapillen, sowie die festgestellte Assoziation des G/A Polymorpphismus an Position 665 des hTAS2R16 Gens mit einer reduzierten Salicinwahrnehmung, sind weitere unabhängige Beweise für diese These. Ein anderer menschlicher Rezeptor, hTAS2R10, wird durch die Bitterstoffe Strychnin, Brucin und Denatonium aktiviert. Dies sowie die Tatsache, dass die zur Aktivierung benutzten Konzentrationen eine sinnvolle Korrelation zu dem menschlichen Geschmacksschwellwert von Strychnin zeigen, sind starke Hinweise, dass hTAS2R10 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Strychnin und verwandten Substanzen ist. Die vorliegenden Daten zeigen eindeutig, dass die TAS2R-Rezeptoren auch beim Menschen Bitterrezeptoren darstellen. Sowohl hTAS2R16, als auch hTAS2R10 werden durch ein Spektrum strukturell sehr unterschiedlicher Bitterstoffe aktiviert. Falls die anderen Mitglieder der TAS2R-Familie ebenfalls dieses Verhalten zeigen, wäre es möglich, dass die nur ca. 25 Mitglieder umfassende TAS2R-Rezeptorfamilie des Menschen tatsächlich zur Wahrnehmung aller Bitterstoffe ausreicht.
Zur Ermittlung der Akzeptanz und ihres prädiktiven Wertes für den Verzehr von Lebensmitteln bzw. Getränken, sind Beliebtheitsprüfungen mit Konsumenten unter standardisierten Bedingungen im Sensoriklabor üblich. Die prädiktive Aussagekraft dieser Laboruntersuchungen wird jedoch durch folgende Aspekte eingeschränkt: (1) Der situative Kontext wird ausgeschaltet, d.h. die Verzehrssituation, in der ein Produkt üblicherweise konsumiert wird, ist im Labor bewusst eliminiert und das zu bewertende Produkt wird nicht in einer kompletten Mahlzeit dargeboten (2) Der Produktkontakt im Labor ist im Gegensatz zu der anhaltenden Konfrontation unter alltäglichen Bedingungen nur kurzfristig, was Langzeitaussagen bzw. Dauerpräferenzen nicht zuläßt; (3) Im Labortest ist die freie Auswahl auf eine geringe Anzahl angebotener Produkte beschränkt. In dieser Arbeit soll daher die Frage beantwortet werden, welchen prädiktiven Wert sensorische Beliebtheitsuntersuchungen im Labor für Lebensmittelakzeptanz und -verzehr unter Alltagssituationen haben. Dies wird für verschiedene Altersgruppen gezeigt, die frei in ihrer Entscheidungsfindung sind. Dazu gaben 56 Studenten (23,1±3,7 Jahre) und zwei Seniorengruppen, zum einen aus einer Begegnungsstätte (20 Probanden; 75,6±8,1 Jahre) und zum anderen aus dem betreuten Wohnen (14 Probanden; 76,1±12,5 Jahre), in einer ersten Laboruntersuchung Beliebtheitsbewertungen (Akzeptanz und Rangordnungsprüfung) zu 6 Erfrischungsgetränken ab. Anschließend folgte ein mindestens vierwöchiger Zeitraum, in denen die Probanden aus einem speziell für die Studie konzipierten Automaten Getränke in Einrichtungen der Gemeinschaftsverpflegung entnehmen konnten. Die Entnahme war via Chipkarte ad libitum möglich. Computergestützt wurden dabei individuelle Getränkewahl, Menge und Entnahmezeit aufgezeichnet. Unmittelbar nach der Automatenphase wurde eine erneute Laboruntersuchung durchgeführt. In allen Untersuchungsphasen wurden dieselben Erfrischungsgetränke aus Konzentrat, variiert in Apfel- oder Orangensaftgeschmack, ohne oder mit Zusatz von Zucker (20g/l) und Kohlensäure (4 g/l CO2), angeboten. Eine Quntitativ Deskriptive Analyse bestätigte unterschiedliche Profile bei den Produkten, so dass von sensorisch wahrnehmbaren Unterschieden zwischen den Produkten ausgegangen werden konnte. Die Probanden bekamen zu keiner Zeit Informationen über die exakte Zusammensetzung der Getränke. Sowohl in der Laborbewertung als auch nach Getränkekonsum via Automat, fanden sich unterschiede zwischen den Altersgruppen. In der Akzeptanzprüfung bewerteten Studenten die Apfelvarianten besser als die Orangenvarianten. Senioren, die insgesamt höhere Akzeptanzwerte vergaben, bewerteten alle Getränke in fast allen Attributen gleichermaßen gut. Nach der 4-wöchigen Automatenphase hatte sich die Akzeptanz der sechs Getränke nicht wesentlich geändert. Auch in beiden Rangordnungsprüfungen waren bei den Studenten „Apfel“ und „Apfel mit Kohlensäure“ auf den ersten Plätzen, „Orange mit Zuckerzusatz“ auf dem letzten Platz. Nach Adjustierung auf die individuelle Trinkmenge (in Wenig-, Mittel- Vieltrinker) und wurde „Apfel mit Kohlensäure“ in der Automatenphase von den Studenten am meisten getrunken. In der Vieltrinkergruppe wurde „Orange mit Zuckerzusatz“ deutlich vernachlässigt. Der Automatenkonsum der Studenten bestätigte damit im Wesentlichen die Ergebnisse der Beliebtheitsprüfung im Labor. Bei den Senioren waren in der Rangordnungsprüfung, die eine Lieblingsreihenfolge erzwang, alle süßeren Getränke (mit Zuckerzusatz) auf den ersten Plätzen. In der Automatenphase wurden jedoch viele Getränke ohne Zuckerzusatz bevorzugt. Dies zeigte sich sowohl in der individuellen Präferenz, als auch im Gesamtkonsum. Aufgrund der Ergebnisse kann der prädiktive Wert von Laboruntersuchungen mit Senioren in Bezug auf die Auswahl und den Konsum unter alltäglichen Bedingungen als gering beurteilt werden. Die Getränke mit der individuell höchsten Laborpräferenz wurden unter Alltagsumgebung in der Gemeinschaftsverpflegung in deutlich geringeren Umfang als erwartet verzehrt. In der Vergleichsgruppe der Studenten ist die Übereinstimmung größer(p<0,05). In Häufigkeitsfragebögen vor und nach der Automatenphase wurde das Trinkverhalten speziell von kohlensäurehaltigen Getränken erfragt. Der Anteil von kohlensäurehaltigen Getränken ist sehr variabel, und kann tagesabhängig von einem geringen bis zum Hauptanteil ausmachen. Senioren tranken von den Automatengetränken weniger kohlensäurehaltige Getränke als Studenten(p<0,001). Trotzdem zeigte nur eine Minderheit einen völligen Verzicht, wie sich durch Fragebogen und auch Automatenkonsum ermitteln ließ. Die Verwendung eines computergestützten Getränkeautomaten bietet eine neue Möglichkeit, die Langzeitpräferenz und den tatsächlichen Konsum unter gewohnten Alltagsbedingungen und bei freier Produktauswahl zu ermitteln. Selbst bei Altersgruppen, die mit Laboruntersuchungen überfordert sind, können Vorlieben untersucht werden.
Aromatische Amine und Amide (aAA) sind aufgrund ihrer starken Verbreitung in der menschlichen Umwelt und ihres kanzerogenen Potenzials von großer toxikologischer Bedeutung. Die Kanzerogenität der aAA wird durch die Mutagenität hochreaktiver Stoffwechselprodukte vermittelt, die in zwei sequenziellen katalytischen Reaktionen entstehen. Die erste ist meistens eine N-Hydroxylierung, die oft durch Cytochrom P450 1A2 (CYP1A2) katalysiert wird. Daran schließt sich eine O-Konjugation durch Sulfotransferasen (SULT) oder N-Acetyltransferasen (NAT) an. Die Bioaktivierung ist ein kritischer Parameter für die Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tiermodellen auf den Menschen. Rekombinante in vitro Systeme, die fremdstoffmetabolisierende Enzyme verschiedener Spezies exprimieren, ermöglichen die vergleichende Untersuchung der Bioaktivierung im Menschen und in Versuchstieren. Ziel des Projektes war die Aufklärung der Bioaktivierung der aAA durch humane Enzyme. Im Vordergrund stand die Untersuchung der Rolle humaner SULT in diesem Prozess. Es wurden rekombinante in vitro Systeme, konstruiert, die CYP1A2 und SULT des Menschen koexprimieren. SULT-cDNAs wurden in den Säugerzell Expressionsvektor pMPSV kloniert und in Standardindikatorzellen für Mutagenitätsuntersuchungen (V79 Zellen aus dem Chinesischen Hamster) transfiziert. Das Expressionsniveau von CYP1A2 und SULT wurde mittels Immunblotanalyse und radiometrischen Aktivitätsmessungen charakterisiert. In den rekombinanten Zellen wurden vier aAA als Modellsubstanzen (2-Acetylaminofluoren, 2-Aminoanthracen, 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol, 2,4-Diaminotoluol) auf ihre Mutagenität am hprt-Locus hin untersucht.Die aAA waren in Zellen, die keine rekombinanten Enzyme oder lediglich CYP1A2 exprimierten, nicht mutagen. In Zellen, die CYP1A2 und SULT der Subfamilie 1A koexprimierten, erzeugten sie bereits in geringen Konzentrationen klare mutagene Effekte (0,3 µM für 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol; 0,1 µM für 2-Aminoanthracen; 10 µM für 2,4-Diaminotoluol). Die stärkste Aktivierung von 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A2 koexprimierte; die stärkste Aktivierung von 2,4-Diaminotoluol und 2-Aminoanthracen erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A1 koexprimierte. Sowohl SULT1A1 als auch SULT1A2 sind im Menschen genetisch polymorph. Ein unterschiedlich starkes Aktivierungspotenzial der Alloenzyme könnte eine individuell unterschiedliche Suszeptibilität für die durch aAA ausgelöste Kanzerogenese bedingen. In HPRT-Mutationsuntersuchungen mit rekombinanten Zellen zeigten die allelischen Varianten der SULT1A2 starke Unterschiede in ihrem Aktivierungpotenzial. Nur in der Zelllinie, die das Alloenzym SULT1A2*1 mit CYP1A2 koexprimierte, wurde 2-Acetylaminofluoren zum Mutagen aktiviert. Zur Aktivierung von 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol waren jedoch sowohl das Alloenzym SULT1A2*1 als auch das Alloenzym SULT1A2*2 in der Lage. Die Alloenzyme der SULT1A1 zeigten ein ähnlich gutes Aktivierungspotenzial für aAA. In früheren Studien wurde gezeigt, dass die SULT1C1 der Ratte eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der aAA in dieser Spezies spielt. Dahingegen war die humane SULT1C1 nicht in der Lage die untersuchten aAA zu aktivieren. Die Kenntnis solcher Spezieunterschiede könnte wichtig sein um unterschiedliche Organotropismen aAA in Menschen und Tiermodellen zu erklären, da SULT mit starker Gewebespezifität exprimiert werden und das Expressionsmuster für die einzelnen SULT-Formen in Menschen und Ratten sich stark unterscheidet.
Comparative study of gene expression during the differentiation of white and brown preadipocytes
(2002)
Introduction Mammals have two types of adipose tissue: the lipid storing white adipose tissue and the brown adipose tissue characterised by its capacity for non-shivering thermogenesis. White and brown adipocytes have the same origin in mesodermal stem cells. Yet nothing is known so far about the commitment of precursor cells to the white and brown adipose lineage. Several experimental approaches indicate that they originate from the differentiation of two distinct types of precursor cells, white and brown preadipocytes. Based on this hypothesis, the aim of this study was to analyse the gene expression of white and brown preadipocytes in a systematic approach. Experimental approach The white and brown preadipocytes to compare were obtained from primary cell cultures of preadipocytes from the Djungarian dwarf hamster. Representational difference analysis was used to isolate genes potentially differentially expressed between the two cell types. The thus obtained cDNA libraries were spotted on microarrays for a large scale gene expression analysis in cultured preadipocytes and adipocytes and in tissue samples. Results 4 genes with higher expression in white preadipocytes (3 members of the complement system and a fatty acid desaturase) and 8 with higher expression in brown preadipocytes were identified. From the latter 3 coded for structural proteins (fibronectin, metargidin and a actinin 4), 3 for proteins involved in transcriptional regulation (necdin, vigilin and the small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A) and 2 are of unknown function. Cluster analysis was applied to the gene expression data in order to characterise them and led to the identification of four major typical expression profiles: genes up-regulated during differentiation, genes down-regulated during differentiation, genes higher expressed in white preadipocytes and genes higher expressed in brown preadipocytes. Conclusion This study shows that white and brown preadipocytes can be distinguished by different expression levels of several genes. These results draw attention to interesting candidate genes for the determination of white and brown preadipocytes (necdin, vigilin and others) and furthermore indicate that potential importance of several functional groups in the differentiation of white and brown preadipocytes, mainly the complement system and extracellular matrix.
Am Beispiel der Wiederkäuer wurde unter Zuhilfenahme von biochemischen und molekularbiologischen Methoden die Adaptation von Pflanzenfressern (Herbivoren) an pflanzliche Sekundärmetabolite wie z.B. Tannine untersucht. Tannine können in nicht an ihren Verzehr adaptierten Spezies durch ihr Proteinbindungsvermögen die Nahrungsverwertung und damit Wachstum und Gesundheit des Pflanzenfressers beeinträchtigen (antinutritive Wirkung). Einige Wiederkäuerarten wie z.B. das Reh (Capreolus capreolus) haben in ihrem Nahrungsspektrum viele stark tanninhaltige Pflanzen, leiden aber nicht unter den erwähnten postdigestiven Konsequenzen. Eine Möglichkeit, die antinutritive Wirkung von Tanninen zu neutralisieren, besteht in der Produktion tanninbindender Speichelproteine. Der Speichel verschiedener Wiederkäuerarten wurde auf das Vorhandensein tanninbindender Proteine untersucht. Diese Arten wurden so ausgewählt, dass alle drei Ernährungstypen (Konzentratselektierer, Intermediärtyp, Gras- und Rauhfutterfresser) in den Vergleich eingeschlossen werden konnten. Als Referenzspezies wurde der Konzentratselektierer Reh herangezogen. Die Speichelproteine des Rehs und die der Intermediärtypen (Rentier, Rangifer tarandus; Damhirsch, Cervus dama; Moschusochse, Ovibos moschatus) banden ungefähr doppelt so effektiv an hydrolysierbare Tannine (Tanninsäure), wie die der untersuchten Gras- und Rauhfutterfresser (Rind, Bos taurus; und Mufflon, Ovis orientalis musimon). Diese Abstufung zeigte sich auch bei der Untersuchung der Bindung an kondensierte Tannine (Quebracho). Eine Ausnahme stellte Mufflonspeichel dar, dieser band ebenso gut an Quebracho wie die Speichelproteine der anderen Ernährungstypen. Über eine Aminosäuretotalanalyse konnte festgestellt werden, dass der Speichel einiger untersuchter Wiederkäuerarten prolinreiche Proteine (PRPs) enthielt. Unter Ausnutzung ihrer Trichloressigsäure (TCA)-Löslichkeit wurden diese angereichert und genauer untersucht. Die Analyse der TCA-löslichen Speichelproteine der Konzentratselektierer (Reh, Elch) ergab einen relativen Prolingehalt von über 35 %, während beim Moschusochsen noch 29 % gemessen wurden. In Damhirsch- und Rinderspeichel wurden keine prolinreichen Proteine gefunden. Für die TCA-löslichen Speichelproteine des Rehs konnte eine hohe Tanninbindungskapazität nachgewiesen werden. Diese banden 24 - 30 x effektiver an Tannine als die TCA-löslichen Speichelproteine des Rindes. Die Tanninbindungskapazitäten der TCA-löslichen Speichelproteine von Moschusochse und Damhirsch waren ebenfalls höher als die des Rindes, aber niedriger als die des Rehs. Die Kohlenhydrat-Analyse der TCA-löslichen Speichelproteine des Rehs erbrachte, dass es sich bei ihnen um Glykoproteine handelt. Mittels Gelfiltration und zweidimensionaler Polyacrylamidgelektrophorese konnten fünf Proteingruppen mit Molekulargewichten zwischen 15 und 50 kd sowie isoelektrischen Punkten zwischen 4,0 und 8,2 detektiert werden. Von 15 dieser Proteine konnten die N-terminalen Aminosäuresequenzen ermittelt werden. Ausgehend von diesen Informationen wurden Reh-PRP spezifische mRNAs isoliert und partiell sequenziert. Die meisten dieser Fragmente hatten eine gemeinsame 18 Aminosäuren lange C-terminale Sequenz PPPEEQPEE/QSPDEE/DSPSE. Die Suche nach Übereinstimmungen der analysierten Sequenzen mit anderen Säugetier-PRPs in der Genbank ergab keine sinnvollen Ähnlichkeiten. Die Ergebnisse können zu Informationen über tanninbindende Proteine anderer Wiederkäuer führen. Die Sequenzinformationen stellen einen Ausgangspunkt bei der Analyse der evolutiven Zusammenhänge der Cerviden dar.
Mercaptursäure und Nukleosidaddukt im Harn als Biomarker in 1-Hydroxymethylpyren-exponierten Ratten
(2002)
1-Methylpyren (MP) ist hepatokanzerogen in neugeborenen männlichen Mäusen. Durch Hydroxylierung an der benzylischen Stelle und anschließende Sulfonierung wird MP zu DNA-reaktivem 1-Sulfooxymethylpyren (SMP) aktiviert. In der Ratte führt die Exposition des benzylischen Alkohols, 1-Hydroxymethylpyren (HMP), zur DNA-Adduktbildung in verschiedenen Geweben. Eventuelle Konsequenz der Toxifizierung ist die Ausscheidung entsprechender Mercaptursäure und Nukleosidaddukt im Harn, welche aufgrund ihrer Herkunft als Biomarker eignen könnten. In dieser Arbeit wird die Ausscheidung der Mercaptursäure und des N2-Desoxyguanosinadduktes in HMP-exponierten Ratten untersucht. Nach der Applikation von HMP bzw. MP wurden weniger als 1 % der Dosis als MPMA über Urin und Faeces ausgeschieden (0 - 48 h). Die Ausscheidung erfolgt hauptsächlich in den ersten 24 h nach der Applikation. MPdG konnte weder in Urin noch in Faeces der HMP-behandelten Tieren identifiziert werden. Nach direkter SMP-Applikation wurde MPdG nur in sehr geringe Menge (weniger als 0,9 ppm in 12 h) im Urin gefunden. Aufgrund der geringen Menge eignet sich MPdG nicht als Biomarker. MPMA dagegen, lässt sich analytisch gut erfassen. Es sollte daher untersucht werden, ob MPMA die Toxifizierung des HMP wiederspiegelt. Die Voraussetzung dafür ist die Kenntnisse über das Metabolismusmuster von HMP. Es wurde daher umfassende Untersuchungen zum Metabolismus des HMP durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass mehr als 80 % der Metaboiten in ihrer oxidierten Form (PCS, deren Glucuronsäure-Konjugate sowie phenolische Sulfatester der PCS) ausgeschieden wurden. Demnach spielt die Oxidation des HMP zu PCS eine sehr wichtige Rolle bei der Detoxifizierung und Ausscheidung von HMP. Ferne konnte nachgewiesen werden, dass die Enzyme Alkohol- und Aldehyd-Dehydrogenase an der Oxidation von HMP beteiligt waren. Die Inhibitoren Disulfiram und Ethanol der o. g. Enzyme wurde daher zur Modulation der Detoxifizierung in vivo eingesetzt. Die Veränderungen in der Toxifizierung von HMP zu SMP wurden durch die SMP-Konzentration im Plasma, die DNA-Addukthäufigkeit und die MPMA-Ausscheidung erfasst. Die Vorbehandlung von Disulfiram und Ethanol führte zu tendentielle Erhöhung der SMP-Konzentration im Plasma, DNA-Addukthäufigkeit in der Leber und die MPMA-Ausscheidung. Bemerkenswert ist jedoch, dass bereits eine Dosis von 0,2 g Ethanol/kg Körpermasse bereits zu statistisch signifikanten Erhöhungen der MPMA-Ausscheidung bei weiblichen Ratten.
In der randomisierten, multizentrischen DASH-Studie (Dietary Approaches to Stop Hy-pertension), die unter kontrollierten Bedingungen stattfand, führte eine fettreduzierte Mischkost, reich an Obst, Gemüse und Milchprodukten, bei Borderline-Hypertonikern zu einer signifikanten Blutdrucksenkung. Während der Studienphase wurden Körpermasse, Natrium-Aufnahme sowie Alkoholzufuhr aufgrund der bekannten Einflussnahme auf den Blutdruck konstant gehalten. In der eigenen Pilot-Studie sollte untersucht werden, ob das Ergebnis der DASH-Studie (i) mit deutschen Hypertonikern und (ii) unter habituellen Ernährungs- und Lebensbedingungen mit regelmäßig durchgeführter Ernährungsberatung und ad libitum Verzehr anstelle des streng kontrollierten Studienansatzes bestätigt werden kann. Eine Konstanz der Körpermasse, der Natrium-Urinausscheidung (unter diesem Studienansatz valider als die Aufnahme) und des Alkoholkonsums wurde vorausgesetzt. Die Studienpopulation setzte sich aus 53 übergewichtigen Probanden mit einer nicht medikamentös therapierten Borderline-Hypertonie und ohne Stoffwechselerkrankungen zusammen. Die Studienteilnehmer wurden randomisiert entweder der Idealgruppe mit einer fettarmen Kost reich an Milchprodukten, Obst und Gemüse (ähnlich der DASH-Idealgruppe) oder der Kontrollgruppe mit habitueller Ernährungsweise zugeteilt. Über einen Zeitraum von fünf Wochen wurde den Probanden etwa 50% ihres täglichen Lebensmittelbedarfes entsprechend ihrer Gruppenzugehörigkeit kostenfrei zur Verfügung gestellt. Gelegenheitsblutdruckmessungen und 24h-Blutdruckmessungen, Ernährungs- und Aktivitätsprotokolle, Blut- und Urinproben sowie anthropometrische Messungen wurden vor, während und fünf Wochen nach der Interventionsphase durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass in der Idealgruppe keine signifikante Blutdrucksenkung beobachtet werden konnte. Dies lässt sich durch die Tatsache erklären, dass die Lebens-mittel- und Nährstoffaufnahme der deutschen Kontrollgruppe eher der amerikanischen Idealgruppe entsprach. In der Pilot-Studie waren die Unterschiede in der Nährstoffzufuhr zwischen den beiden Gruppen viel geringer als in der DASH-Studie; für eine blutdrucksenkende Ernährungsumstellung bestand somit nur ein geringer Spielraum. Eine weitere Erklärung besteht in der unterschiedlichen Zusammensetzung der Studienpopulation. Bei DASH wurden vorwiegend farbige Probanden (40% höhere Hypertonieprävalenz) untersucht. Die Studienergebnisse lassen also den Schluss zu, dass Ernährungs- und Lebensstilgewohnheiten sowie der genetische Hintergrund der entsprechenden Bevölkerungsgruppe bei der Formulierung von nährstoff- oder lebensmittelbezogenen Empfehlungen zur Senkung des Bluthochdruckes Berücksichtigung finden müssen.
Die Ausstattung der gastrointestinalen Mukosa des Menschen und der Ratte mit Sulfotransferasen wurde mit Hilfe von Immunodetektion und Enzymaktivitätsmessungen untersucht. In Proben aus Colon und Rektum von 39 Personen wurden die Formen h1A1, h1A3 und h1B1 identifiziert, wobei in einer weiteren Probe, die als einzige von einem an Colitis Ulcerosa erkrankten Patienten stammte, keine Sulfotransferasen nachgewiesen werden konnten. Bei der Immunblot-Analyse war das Expressionsmuster der einzelnen Formen in allen Proben ähnlich. In wenigen Proben waren die relativen Signalintensitäten der h1A1 und der h1B1 um die Hälfte erniedrigt. Der Gehalt von SULT an zytosolischem Protein zeigte einen bis zu 8 - 10fachen Unterschied, er betrug jedoch bei zwei Dritteln der Proben zwischen 0,15 und 0,3 (h1A1 und h1A3) bzw. 0,6 und 0,8 Promille (h1B1). Die Variation konnte nicht auf Alter, Geschlecht oder Krankheitsbild der Patienten zurückgeführt werden. Auch der für die allelischen Varianten der h1A1 beschriebene Effekt auf die Enzymaktiviät bzw. Stabilität konnte in der Menge an immunreaktivem Protein nicht in diesem Ausmaß detektiert werden. Die Allelhäufigkeit von h1A1*R und h1A1*H war gegenüber der gesunden Bevölkerung nicht verändert. In den sieben Proben aus dem Dünndarm (Coecum, viermal Ileum, Jejunum) konnten zusätzlich die Formen h1E1 und h2A1 identifiziert werden. Ein möglicherweise der Form h1C1 entsprechendes Protein wurde im Magen detektiert. Im Vergleich zum Menschen war die Expression in der Ratte stärker auf die Leber konzentriert. Während beim Menschen in allen untersuchten Abschnitten Sulfotransferasen in Mengen detektiert wurden, die in zwei Fällen (h1B1 und h1A3) sogar den Gehalt in der Leber überstiegen, beschränkte sich die Expression in der Ratte auf im Vergleich zur Leber geringe Mengen im Magen und Dickdarm. Nachgewiesen wurden die r1B1, r1A1 sowie eine nicht identifizierte Form von 35kD, bei der es sich vermutlich um die r1C2 handelt. Im Vergleich zur Leber enthielt der Dickdarm der Ratte 20 - 30 % an r1B1 und 3 % an r1A1, während im Dickdarm des Menschen die 3 - 5fache Menge an h1B1 und 25 - 50 % an h1A1 gefunden wurden. Die nicht identifizierte Form verhielt sich wie die r1B1. Die für die Leber der Ratte bekannte geschlechtsabhängige Expression wurde im Gastrointestinaltrakt nicht beobachtet. Die Verteilung der Sulfotransferasen im Colon und Ileum des Menschen wurde immunhistochemisch untersucht; für die Gewebe der Ratte war die Spezifität der zur Verfügung stehenden Antiseren nicht ausreichend. Im Colon traten h1B1-spezifische Färbungen in den differenzierten Enterozyten am oberen Ende der Krypten auf, im Dünndarm wurden die Epithelzellen der Zotten gefärbt. Die Färbung konzentrierte sich auf das Zytoplasma. Eine ähnliche Verteilung zeigte sich für h1A1 und h1A3, außer daß zusätzlich eine intensive Färbung der Endothelzellen der Kapillaren in der Submukosa des Ileums auftrat. Im Dickdarm war dies nur bei den Kapillaren in den Lymphfollikeln zu erkennen. Die h2A1 war lediglich im Zytoplasma der Epithelzellen der Zotten des Ileums nachzuweisen, während im Colon keine Farbreaktion auftrat. Durch die Verwendung der rekombinanten Indikatorstämme TA1538-h1A1, -h1A3 und -h1B1 und des Ausgangsstammes Salmonella typhimurium TA1538 im Ames-Test wurde gezeigt, daß verschiedene benzylische und allylische Alkohole durch im humanen Colon exprimierte Sulfotransferasen zu Mutagenen aktiviert werden. In den meisten Fällen erwies sich eine der drei Sulfotransferasen als besonders effizient in der Bioaktivierung, während durch die anderen Formen kein oder nur ein schwacher Effekt verursacht wurde. Die Bioaktivierung von Promutagenen durch Sulfotransferasen im Colon muß im Zusammenhang mit der Lokalisation diskutiert werden. Die Zellen im Darm, in denen immunhistochemisch Sulfotransferasen detektiert wurden, haben mit Ausnahme des Endothels je nach Abschnitt eine Lebensdauer von maximal fünf Tagen und machen keine weiteren Zellteilungen mehr durch. Daher sind DNA-Schäden in diesen Zellen ein sehr geringes Risiko für den Organismus. Soweit die reaktiven Metabolite in diesen Zellen gefangen bleiben, kann die Bioaktivierung in diesen Zellen und die Bildung von Addukten als protektiv betrachten werden, da letztere nach wenigen Tagen mit den toten Zellen in das Darmlumen abgegeben werden. Für den Vergleich der Bioaktiverung von Promutagenen durch die Form 1B1 des Menschen und der Ratte wurden aus V79 Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters abgeleitete Zellinien hergestellt, die je eine der beiden Formen stabil exprimieren. Damit standen 1B1-profiziente Indikatorzellen für den HPRT-Genmutationstest zur Verfügung, und die 1B1-abhängige Bioaktivierung konnte in einem System untersucht werden, die dem eukaryontischen Organismus näher steht als die für die Ames-Tests verwendeten Bakterien. So war z.B. die Sulfotransferase wie im Gewebe im Zytoplasma lokalisiert. Als Modellsubstanzen wurden hierbei die bereits in TA1538-h1B1 mutagen wirkenden benzylischen Alkohole 6-Hydroxymethylbenzo[a]pyren und 4-Hydroxycyclopenta-[def]chrysen getestet. Da die Sensitivität einer Sulfotransferase-exprimierenden V79-Zellinie sowohl durch die Menge an Sulfotransferase als auch durch die Verfügbarkeit des Sulfodonors limitiert sein könnte, wurden die Mutagenitätsexperimente mit V79-r1B1-Zellinien durchgeführt, die sich in ihrer Enzymaktivität um das Zwanzigfache unterschieden: V79-r1B1/A und -/B. Eine starke Erhöhung der Mutantenfrequenz wurde nur in der hoch exprimierenden Zellinie V79-r1B1/A (1019 ± 224 pmol/mg/min) beobachtet, so daß eine gravierende Beeinträchtigung der Sensitivität durch einen Mangel an Kosubstrat ausgeschlossen wurde. In der niedriger exprimierenden Zellinie V79-r1B1/B (57 ± 9 pmol/mg/min) war nur mit 6-Hydroxymethylbenzo[a]pyren ein schwacher Anstieg der Mutantenfrequenz zu erkennen, der mit 0,3 µM bei einer in etwa 100fach höheren Konzentration begann als bei V79-r1B1/A. Die zytosolische Fraktion aus V79-r1B1/B-Zellen enthielt in etwa die dreifache Menge an r1B1-Protein wie die aus Colonmucosa der Ratte. Da zumindest für die humane Mukosa gezeigt wurde, daß die 1B1 nur im einschichtigen Epithel, nicht aber in allen Zellen der Mukosa exprimiert wird, repräsentiert die zytosolische Fraktion aus der Mukosa nur bedingt die Expression in den Epithelzellen und der Vergleich mit den V79-1B1-Zellen ist grob. Im Gegensatz zu V79-r1B1/B war die Zellinie V79-h1B1, die ebenfalls nur mit Darm und Leber vergleichbare Mengen an h1B1 exprimierte, in der Lage, beide benzylischen Alkohole zu aktivieren. Der Erhöhung der Mutantenfrequenz im Vergleich zur KontrollZellinie war ähnlich wie bei der stark exprimierenden Zellinie V79-r1B1/A, erforderte aber 10fach höhere Konzentrationen. Somit unterscheiden sich Mensch und Ratte nicht nur insgesamt in ihrer Ausstattung des Gastrointestinaltrakts mit Sulfotransferasen, auch bei Betrachtung einer einzelnen Form zeigten sich deutliche Unterschiede in der Aktivierung von zwei Promutagenen. Die Ratte ist daher ein ungeeignetes Modell, um die Rolle von Sulfotransferasen bei tumorinitiierenden Prozessen im Darm zu untersuchen. Dies unterstreicht die Bedeutung von rekombinanten in-vitro-Systemen für die Erfassung des humanen Metabolismus von Fremdstoffen. Insgesamt kennt man nur eine geringe Anzahl von Substanzen, die im Tierexperiment Colontumore erzeugen, und mit Ausnahme der heterozyklischen aromatischen Amine sind diese lediglich von experimenteller Bedeutung. Dies spricht für effiziente Schutzmechanismen der Darmmukosa gegenüber Mutagenen und läßt die Frage nach der hohen Inzidenz des Kolorektalkarzinoms offen.