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Alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (alk-PAK) kommen zusammen mit rein aromatischen polyzyklischen Kohlenwasserstoffen u.a. im Zigarettenrauch, Dieselabgasen sowie einigen Lebensmitteln (z.B. Freilandgemüse, planzliche Öle und Fette) vor. Benzylische Hydroxylierung und nachfolgende Sulfokonjugation ist ein wichtiger Bioaktivierungsweg für einige alk-PAK. Oxidation der benzylischen Alkohole durch Alkoholdehydrogenasen (ADH) und Aldehyddehydrogenasen (ALDH) zur Carbonsäure könnte einen wichtigen Detoxifizierungsweg in Konkurrenz zur Aktivierung durch Sulfotransferasen (SULT) darstellen, was für 1-Hydroxymethylpyren in der Ratte bereits gezeigt wurde (Ma, L., Kuhlow, A. & Glatt, H. (2002). Polycyclic Aromat Compnds 22, 933-946). Durch Hemmung der ADH und/oder ALDH ist eine verstärkte Aktivierung zu erwarten, wie in der besagten Studie ebenfalls nachgewiesen wurde. Insbesondere Ethanol kommt in diesem Zusammenhang eine Rolle als möglicher Risikofaktor für alk-PAK induzierte Kanzerogenese zu. Menschen konsumieren häufig große Mengen Ethanol und oft besteht eine Koexposition mit alk-PAK (z.B. durch Rauchen). Ähnliches gilt für 5-(Hydroxymethyl)-2-furfural (HMF), einem Pyrolyseprodukt reduzierender Zucker, dem gegenüber Menschen in recht hohen Mengen exponiert sind. Auch bei HMF steht der ADH- und ALDH-vermittelte oxidative Metabolismus in Konkurrenz zu einer Aktivierung durch Sulfokonjugation. Um die Bedeutung humaner ADH und ALDH im Metabolismus von alk-PAK und von HMF aufzuklären, wurden alle bekannten humanen ADH sowie die humanen ALDH2 und 3A1 (aus theoretischen Überlegungen heraus die vielversprechendsten Formen) für kinetische Analysen in Bakterien exprimiert. Als Enzymquelle dienten zytosolische Präparationen und durch Anionenaustauschchromatographie partiell gereinigte Enzyme. In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass primäre benzylische Alkohole von Methyl- und Dimethylpyrenen gute Substrate humaner ADH sind. Sekundäre benzylische Alkohole und benzylische Alkohole von alk-PAK mit größerem Kohlenwasserstoffgrundgerüst erwiesen sich dagegen als schlechte Substrate. Vier Formen (ADH1C, 2, 3 und 4) wurden näher analysiert. Dazu wurden sie partiell gereinigt, primär um die störende endogene Bakterien-ADH zu eliminieren. Alle untersuchten ADH waren in der Lage Pyrenylmethanole zu oxidieren. Insbesondere ADH2 katalysierte die Oxidation der Pyrenylmethanole effizient, aber auch für ADH1C und 4 waren die Pyrenylmethanole gute Substrate. ADH3 oxidierte die Pyrenylmethanole mit geringer katalytischer Effizienz. Die Reduktion der entsprechenden Pyrenaldehyde durch ADH1C, 2 und 4 wurde mit noch höherer Effizienz katalysiert als die Oxidation der Pyrenylmethanole, was die Bedeutung von ALDH für die effiziente Detoxifizierung dieser Verbindungen unterstreicht. In einer an diese Arbeit angelehnten Diplomarbeit (Rost, K. (2007). Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät) wurde auch tatsächlich gezeigt, dass humane ALDH2 aber auch ALDH3A1 in der Lage sind, die Pyrenaldehyde zu Pyrenylcarbonsäuren zu oxidieren. Die bestimmten kinetischen Parameter legen nahe, dass insbesondere ALDH2 von Bedeutung für die Detoxifizierung von Methyl- und Dimethylpyrenen ist. Schon allein auf Grund der an der Detoxifizierung beteiligten Enzyme ist Ethanolaufnahme bei Koexposition mit Pyrenderivaten als Risiokofaktor anzusehen. Es ist wahrscheinlich, dass Ethanol und, nach dessen Oxidation, Acetaldehyd als konkurrierende Substrate die ADH- und ALDH-katalysierte Oxidation von Pyrenylmethanolen bzw. Pyrenaldehyden inhibieren und somit zu einer verstärkten SULT-vermittelten Aktivierung der Pyrenylmethanole führen. In der Tat wurde eine effiziente Inhibition der ADH2-katalysierten Oxidation von 1-Hydroxymethylpyren und von 1-(Hydroxymethyl)-8-methylpyren durch physiologisch relevante Ethanolkonzentrationen nachgewiesen. Drei humane ADH (4, 2 und 3), die HMF effizient zum 2,5-Diformylfuran oxidieren können, wurden identifiziert. Durch ALDH-katalysierte Weiteroxidation dieser Substanz entsteht schließlich 2,5-Furandicarbonsäure, die nach HMF-Exposition auch tatsächlich im menschlichen Urin gefunden wurde (Jellum, E., Børresen, H. C. & Eldjarn, L. (1973). Clin Chim Acta 47, 191-201). Weiter wurde gezeigt, dass ALDH3A1, aber auch ALDH2 HMF effizient zur 5-(Hydroxymethyl)-2-furancarbonsäure (HMFA) oxidieren können, ein weiterer nachgewiesener HMF Metabolit in vivo. Dass die ADH-katalysierte Oxidation von HMFA und nachfolgende ALDH-katalysierte Oxidation zur Bildung von 2,5-Furandicarbonsäure einen nennenswerten Anteil beträgt, kann aufgrund der kinetischen Daten für HMFA als Substrat humaner ADH ausgeschlossen werden. Die beobachteten Enzymaktivitäten lassen den Schluss zu, dass Ethanolaufnahme zu einer Reduktion des oxidativen HMF Metabolismus führt und somit eine Aktivierung von HMF durch Sulfokonjugation begünstigt.
Ein hoher Verzehr von Obst und Gemüse scheint das Risiko der Inzidenz verschiedener Erkrankungen zu reduzieren. Es wird vermutet, dass eine Gruppe sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe, die Flavonoide, hierfür verantwortlich sind. Mögliche Effekte auf die intestinale Barrierefunktion dieser Substanzklasse sind jedoch weitgehend ungeklärt. Parazelluläre Eigenschaften epithelialer Zellen werden hauptsächlich durch die Zell-Zell-Kontakte der Tight Junction (TJ) insbesondere durch die Proteine Occludin und die Claudine definiert. Ziel dieser Arbeit war es, die Effekte des am häufigsten vorkommenden Flavonoids Quercetin auf die Barrierefunktion der Kolonkarzinom-Zelllinie Caco-2 zu untersuchen. Hierbei zeigte sich, dass Quercetin konzentrationsabhängig (50-200 µM) den transepithelialen Widerstand erhöhte. Die Wirkung von 200 µM Quercetin war bereits nach 4 h Inkubation erkennbar und erreichte nach 48 h maximale Werte. Der Wirkverlust, welcher nach 72 h Inkubation eintrat, konnte durch eine tägliche Gabe des Flavonoids verhindert werden. Weiterhin zeigte sich, dass der Quercetin-induzierte Widerstandsanstieg durch mukosale oder serosale Zugabe gleichermaßen auslösbar war. Western Blot-Analysen der TJ-Proteine Occludin, Claudin-1, -3, -4 und -7 ergaben, dass der durch Quercetin-induzierte Widerstandsanstieg insbesondere mit einer Zunahme der Expression des abdichtenden TJ-Proteins Claudin-4 einherging. Quercetin erhöhte ebenfalls die mRNA-Expression von Claudin-4 (quantitative RT-PCR) und bewirkte eine Aktivierung des Claudin-4-Promotors (Luciferase-Reportergen-Analysen). Mittels Immunfluoreszenz-Färbungen und Laserscanning-Mikroskopie konnte ein vermehrter Einbau von Claudin-4 in die TJ nachgewiesen werden. Funktionelle Untersuchungen mittels radioaktiven Fluxmessungen zeigten, dass das Flavonoid die parazelluläre Permeabilität für Natrium und Chlorid reduzierte, aber die Durchlässigkeit von Mannitol als parazellulärer Marker unverändert blieb. Wir konnten hiermit erstmals nachweisen, dass Quercetin die Expression des abdichtenden TJ-Proteins Claudin-4 in den TJ-Komplex verstärkte, wodurch die Ionen-Durchlässigkeit für Natrium und Chlorid vermindert wurde. Das führte zu einer Abdichtung der intestinalen Barriere. Dieser direkte Effekte von Quercetin könnte eine neue Möglichkeit für die Behandlung oder Prävention von Diarrhöe-bedingten intestinalen Barrieredefekten darstellen.
Das Metabolische Syndrom stellt eine Kombination verschiedener metabolischer Anomalien in einem Individuum dar. Starkes Übergewicht gilt als maßgebende Größe in der Genese des Syndroms, welches mit einem enormen Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen einhergeht. Um die stark steigende Prävalenz des Metabolischen Syndroms einzudämmen, sind dringend Konzepte für die Behandlung, vor allem jedoch für die Prävention von Übergewicht erforderlich. Einen wichtigen Beitrag leisten diesbezüglich Ballaststoffe in der Ernährung. Sie tragen auf unterschiedlichen Wegen zur Gewichtskontrolle bei und beeinflussen zudem verschiedene mit dem Metabolischen Syndrom assoziierte Blutparameter. Ebenso werden protektive Effekte von Polyphenolen, welche zur Gruppe der sekundären Pflanzenstoffe zählen, beschrieben. Diese wirken u. a. auf den Glukose- sowie den Insulinhaushalt und greifen darüber hinaus in die Regulation der Fettverbrennung sowie des Energieverbrauches ein. Die Kombination beider Substanzgruppen verspricht bedeutendes gesundheitsförderndes Potential; dieses wurde gegenwärtig jedoch kaum untersucht. Carobballaststoff ist ein polyphenolreicher und vorwiegend unlöslicher Extrakt der Frucht des Johannisbrotbaumes (Ceratonia siliqua L). Bislang publizierte Studien zur physiologischen Wirksamkeit dieses Ballaststoffpräparates weisen sowohl beim Tier als auch beim Menschen bemerkenswerte hypocholesterinämische Eigenschaften nach. Inwiefern sich der Verzehr des Carobballaststoffes ebenso auf die Entwicklung von Übergewicht sowie anderen Messgrößen des Metabolischen Syndroms auswirkt, ist allerdings nicht bekannt. Die Zielstellung der Promotionsarbeit bestand darin, die postprandialen Wirkungen des Carobballaststoffverzehrs mit Hilfe einer Humanstudie aufzuzeigen. In die randomisierten, einfach verblindeten Untersuchungen im cross-over-Design wurden 20 gesunde Erwachsene im Alter zwischen 22 und 62 Jahren eingeschlossen. Unter Verwendung variierender Begleitmahlzeiten wurden die postprandialen Effekte verschiedener Mengen des Carobballaststoffes untersucht. Hierbei standen die Veränderungen der Plasmakonzentrationen von Glukose, Triglyceriden (TG), totalem und acyliertem Ghrelin sowie der Serumkonzentrationen von Insulin und nicht-veresterten Fettsäuren (NEFA) im Mittelpunkt der Betrachtungen. Der Verzehr des Carobballaststoffes in Kombination mit 200 ml Wasser und 50 g Glukose erhöhte die postprandialen Glukose- und Insulinkonzentrationen gegenüber der Glukoselösung ohne Ballaststoffzusatz. In Kombination mit 400 ml einer Flüssigmahlzeit verzehrt, senkte Carobballaststoff die postprandialen TG-, NEFA- und Ghrelin- (acyliert) Antworten. Die Untersuchung des respiratorischen Quotienten nach Zusatz von Carobballaststoff zur Flüssigmahlzeit mittels indirekter Respirationskalorimetrie bekräftigte die bereits bekannten Effekte auf den Lipidmetabolismus und wies zudem eine Steigerung der Fettverwertung unter Verminderung der Glukoseoxidation nach. Wurde Carobballaststoff schließlich in Lebensmittel eingebracht, sanken nach dem Verzehr dieser Lebensmittel erneut die postprandialen Konzentrationen an TG und NEFA. Gleichzeitig erhöhten sich die Glukose-, Insulin- sowie Ghrelin- (acyliert) Antworten. Carobballaststoff löst in Abhängigkeit von der jeweils verzehrten Begleitmatrix unterschiedliche Effekte aus. Das Präparat weist beachtliche Wirkungen auf die Blutlipide sowie den Energieverbrauch auf, hat indes ungünstige Wirkungen auf die Blutglukose, sofern er in Kombination mit einer veränderten Nährstoffmatrix aufgenommen wird. Carobballaststoff besitzt starkes gesundheitsförderndes Potential; jedoch sind weitere Studien notwendig, um seine Wirkungen sowie deren Voraussetzungen besser zu verstehen. Ferner sollten Untersuchungen über einen längeren Zeitraum vorgenommen werden, um die langfristige Relevanz der gewonnenen Ergebnisse darzulegen. Danach stellt die Anreicherung spezieller Lebensmittel mit Carobballaststoff einen geeigneten Weg dar, um von den viel versprechenden protektiven Wirkungen des Präparates zu profitieren.
The central melanin-concentrating hormone (MCH) system has been intensively studied for its involvement in the regulation of feeding behaviour and body weight regulation. The importance of the neuropeptide MCH in the control of energy balance has been underlined by MCH knock out and Melanin-concentrating hormone receptor subtype 1 (MCHR-1) knock-out animals. The anorectic and anti-obesity effects of selective MCHR-1 antagonists have confirmed the notion that pharmacological blockade of MCHR-1 is a potential therapeutic approach for obesity. First aim of this work is to study the neurochemical “equipment” of MCHR-1 immunoreactive neurons by double-labelling immunohistochemistry within the rat hypothalamus. Of special interest is the neuroanatomical identification of other hypothalamic neuropeptides that are co-distributed with MCHR-1. A second part of this study deals with the examination of neuronal activation patterns after pharmacological or physiological, feeding-related stimuli and was introduced to further understand central regulatory mechanisms of the MCH system. In the first part of work, I wanted to neurochemically characterize MCHR-1 immunoreactive neurons in the rat hypothalamus for colocalisation with neuropeptides of interest. Therefore I performed an immunohistochemical colocalisation study using a specific antibody against MCHR-1 in combination with antibodies against hypothalamic neuropeptides. I showed that MCHR-1 immunoreactivity (IR) was co-localised with orexin A in the lateral hypothalamus, and with adrenocorticotropic hormone and neuropeptide Y in the arcuate nucleus. Additionally, MCHR-1 IR was co-localised with the neuropeptides vasopressin and oxytocin in magnocellular neurons of the supraoptic and paraventricular hypothalamic nucleus and corticotrophin releasing hormone in the parvocellular division of the paraventricular hypothalamic nucleus. Moreover, for the first time MCHR-1 immunoreactivity was found in both the adenohypophyseal and neurohypophyseal part of the rat pituitary. These results provide the neurochemical basis for previously described potential physiological actions of MCH at its target receptor. In particular, the MCHR-1 may be involved not only in food intake regulation, but also in other physiological actions such as fluid regulation, reproduction and stress response, possibly through here examined neuropeptides. Central activation patterns induced by pharmacological or physiological stimulation can be mapped using c-Fos immunohistochemistry. In the first experimental design, central administration (icv) of MCH in the rat brain resulted in acute and significant increase of food and water intake, but this animal treatment did not induce a specific c-Fos induction pattern in hypothalamic nuclei. In contrast, sub-chronic application of MCHR-1 antagonist promoted a significant decrease in food- and water intake during an eight day treatment period. A qualitative analysis of c-Fos immunohistochemistry of sections derived from MCHR-1 antagonist treated animals showed a specific neuronal activation in the paraventricular nucleus, the supraoptic nucleus and the dorsomedial hypothalamus. These results could be substantiated by quantitative evaluation of an automated, software-supported analysis of the c-Fos signal. Additionally, I examined the activation pattern of rats in a restricted feeding schedule (RFS) to identify pathways involved in hunger and satiety. Animals were trained for 9 days to feed during a three hour period. On the last day, food restricted animals was also allowed to feed for the three hours, while food deprived (FD) animals did not receive food. Mapping of neuronal activation showed a clear difference between stareved (FD) and satiated (FR) rats. FD animals showed significant induction of c-Fos in forebrain regions, several hypothalamic nuclei, amygdaloid thalamus and FR animals in the supraoptic nucleus and the paraventricular nucleus of the hypothalamus, and the nucleus of the solitary tract. In the lateral hypothalamus of FD rats, c-Fos IR showed strong colocalisation for Orexin A, but no co-staining for MCH immunoreactivity. However, a large number of c-Fos IR neurons within activated regions of FD and FR animals was co-localised with MCHR-1 within selected regions. To conclude, the experimental set-up of scheduled feeding can be used to induce a specific hunger or satiety activation pattern within the rat brain. My results show a differential activation by hunger signals of MCH neurons and furthermore, demonstrates that MCHR-1 expressing neurons may be essential parts of downstream processing of physiological feeding/hunger stimuli. In the final part of my work, the relevance of here presented studies is discussed with respect to possible introduction of MCHR-1 antagonists as drug candidates for the treatment of obesity.
Die Zahl der Kolonkarzinome in den westlichen Industrieländern steigt in den letzten Jahren stetig an. Zu den Verbindungen, die mit der Zubereitung der Nahrung entstehen, mit ihr aufgenommen werden und die Kolonkanzerogenese möglicherweise begünstigen, gehört das heterozyklische aromatische PhIP, das bei der Erhitzung proteinreicher Nahrungsmittel entsteht. Neben zahlreichen Fütterungsversuchen an Nagern existieren auch Zellkulturmodelle zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der PhIP-induzierten Kolonkanzerogenese. Die chemische Transformation von Zellen sollte durch wiederholte Exposition gegenüber dem hydroxylierten Metaboliten des Kanzerogens (N2-OH-PhIP) erzielt werden. Es wurden IEC-18-Zellen der Ratte und HCEC-Zellen des Menschen zur Untersuchung verwendet. Die Behandlung der IEC-18-Zellen führt nach 25 Behandlungszyklen mit Konzentrationen von 5 bis 20 µM nicht zur Transformation der Zellen. Die Anwesenheit von N2-OH-PhIP führt zu einer zehnfach erhöhten Induktion der GST-Aktivität, insbesondere der Untereinheiten GST-A1, -A3, -Pi und -T2, die für die effiziente Detoxifizierung des N-Acetoxy-Metaboliten vom N2-OH-PhIP verantwortlich sind. Bereits nach drei Behandlungen mit 1,5 µM N2-OH-PhIP konnte eine maligne Transformation der HCEC-Zellen erzielt werden. Die Zellen zeigten die charakteristischen Zeichen der Transformation: veränderte Wachstumseigenschaften wie klonales dreidimensionales Zellwachstum („pilling up“), Hemmung der Zell-Zell-Kontaktinhibierung, verkürzte Populationsverdopplungszeiten und tumorigene und metastasierende Eigenschaften. Außerdem exprimierten die N2-OH-PhIP-exponierten humanen Kolonzellen mit steigender Anzahl der Behandlungen größere Mengen des trunkierten APC-Proteins. Die bekannten PhIP-spezifischen Mutationen im APC-Gen resultieren in der Expression eines trunkierten Proteinproduktes und werden als frühe Ereignisse in der Kolonkanzerogenese betrachtet. Die zusammenfassende Betrachtung aller Ergebnisse zeigt, dass die IEC-18-Zelllinie zur chemischen Transformation durch N2-OH-PhIP ungeeignet ist. Dagegen wurde erstmalig eine vollständige chemische Transformation von Humandickdarmepithelzellen in vitro durch Exposition der humanen Kolonepithelzelllinie HCEC gegenüber dem Kolonkarzinogen N2-OH-PhIP erzielt.
"Untersuchung kardioprotektiver Wirkungen des Olivenöles und seiner phenolischen Komponenten in einer Gruppe gesunder deutscher Männer" EINLEITUNG: Epidemiologische Daten belegen, dass die mediterrane Ernährung mit einer niedrigen Inzidenz an mit oxidativen Stress assoziierten kardiovaskulären Erkrankungen einhergeht. Dabei wird vor allem dem Olivenöl, als Hauptfettlieferant in der mediterranen Ernährung, eine kardioprotektive Wirkung zugesprochen. Olivenöl zeichnet sich neben dem hohen Gehalt an einfach ungesättigten Fettsäuren (MUFA) durch ein reichhaltiges Spektrum an phenolischen Verbindungen aus, deren antioxidative Wirkung bereits zahlreichen in in vitro Studien beschrieben wurde. Demnach könnte der Verzehr von phenolreichem Olivenöl auch in vivo vor oxidativen Schädigungen schützen und somit das Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen senken. ZIELSTELLUNG: Untersuchung der kardioprotektiven Wirkung von Olivenöl und seiner phenolischen Komponenten in einer Gruppe gesunder deutscher Männer. METHODE: Dazu wurde eine randomisierte cross-over doppelt-verblindete Interventionsstudie an 70 gesunden Männern zwischen 20 - 60 Jahren im Raum Berlin-Brandenburg durchgeführt. In jeweils drei dreiwöchigen Interventionsphasen konsumierten die Probanden täglich 25 ml natives (phenolreich), gemischtes (mittlerer Phenolgehalt) und raffiniertes (annähernd phenolfrei) Olivenöl, was sich ausschließlich im Gehalt an phenolischen Verbindungen unterschied. Das Olivenöl sollte dabei die gewöhnlich verzehrten Fette ersetzen. Die Interventionsphasen waren durch zweiwöchige Wash out-Phasen unterbrochen. Die Erhebung der Blutlipide, Biomarker der Lipidperoxidation und endogene Antioxidantien erfolgte zu Studienbeginn sowie zu Beginn und Ende jeder Verzehrsperiode.ERGEBNISSE: Bei den Blutlipiden sowie den Biomarkern der Lipidperoxidation und den endogenen Antioxidantien konnte keine signifikante Veränderung in Abhängigkeit vom Phenolgehalt der applizierten Olivenöle nachgewiesen werden. Einzig die Glutathion-Reduktase-Aktivität stieg mit zunehmendem Gehalt an phenolischen Verbindungen (pTrend = 0,041). Unabhängig von der Konzentration der Phenole im Olivenöl wurde bei den Probanden durch den Olivenölverzehr eine Senkung von Gesamtcholesterol (p = 0,007) und Triglyzeride (p = 0,013) im Serum erzielt. Diese Wirkung geht einher mit einem gestiegenen MUFA-Anteil in der Ernährung aufgrund des Olivenölkonsums (p < 0,001). SCHLUSSFOLGERUNG: Die Hypothese, dass die Phenole im Olivenöl aufgrund ihrer in in vitro und Tierstudien beschriebenen antioxidativen Wirkung dem Olivenöl neben dem einzigartigen Fettsäureprofil eine zusätzliche kardioprotektive Wirkung bescheren, konnte in der vorliegenden Studie nicht gezeigt werden. Dennoch konnte durch den Olivenölverzehr und der damit einhergehenden Erhöhung des MUFA-Anteils in der Ernährung eine vorteilhafte Beeinflussung der Blutlipide erzielt werden. Obgleich Olivenöl nicht das vorwiegend verzehrte Fett in Deutschland darstellt, zeigten die befragten Probanden eine hohe Akzeptanz. Folglich könnte die Integration von Olivenöl in die habituelle Ernährung einen Beitrag zur Senkung des kardiovaskulären Erkrankungsrisikos leisten.
Nahrungsinhaltsstoffe sind im Organismus an Steuerungsprozessen und Stoffwechselvorgängen beteiligt, wobei die Mechanismen ihrer Wirkung noch nicht völlig aufgeklärt sind. Wie Vitamin E zeigen auch sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe in Zellsystemen sowie in vivo eine Reihe biologischer Wirkungen, deren Erklärung jedoch häufig auf ihre antioxidative Eigenschaft reduziert wird. Ziel der Dissertation war es, den Einfluss von Vitamin E und anderen Pflanzeninhaltsstoffen (in Form von Pflanzenextrakten oder isolierten sekundären Pflanzeninhaltsstoffen, z.B. Polyphenole), die bisher alle hauptsächlich als Antioxidanz klassifiziert wurden, auf die transkriptionelle Regulation von Phase I- und Phase II-Enzymen zu untersuchen. Dazu wurde die Aktivierung des PXR (pregnane X receptor) und des Nrf2 (NF-E2-related factor-2) als zentrale Transkriptionsfaktoren der Phase I- bzw. Phase II-Enzyme getestet. Der Einfluss von verschiedenen Vitamin E-Formen und antioxidativen Pflanzeninhaltsstoffen in Form von Reinsubstanzen (Curcumin, EGCG, Medox, Quercetin, Resveratrol und Sulforaphan) oder Pflanzenextrakten (aus Blaubeeren, Gewürznelken, Himbeeren, Nelkenpfeffer, Thymian oder Walnüssen) auf die Aktivierung von PXR und Nrf2 sowie des Promotors eines jeweiligen Zielgens (CYP3A4 bzw. GI-GPx) wurde in vitro mit Reportergenplasmiden untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl Vitamin E-Formen als auch verschiedene sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe PXR und/oder Nrf2 sowie die Promotoren der jeweiligen Zielgene CYP3A4 bzw. GI-GPx aktivieren. In einem Tierexperiment konnte diese genregulatorische Wirkung von Vitamin E auf die in vivo-Situation übertragen werden. In Lebern von Mäusen, deren Futter unterschiedliche Mengen von Vitamin E enthielt (Mangel-, Normal- und Überflussdiät), wurde eine direkte Korrelation zwischen der alpha-Tocopherol-Konzentration und der Cyp3a11 mRNA-Expression nachgewiesen (Cyp3a11 ist das murine Homolog zum humanen CYP3A4). Entgegen der in vitro-Situation hatte gamma-Tocotrienol in vivo einen nur kaum nachweisbaren Effekt auf die Expression der Cyp3a11 mRNA, induzierte aber die Expression der alpha-TTP mRNA. Es konnte gezeigt werden, dass Vitamin E und sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe Phase I- und Phase II-Enzyme transkriptionell regulieren können. Die Wirkungen des Vitamin E können sich allerdings nur entfalten, wenn die Vitamin E-Formen ausreichend vom Körper aufgenommen werden. Gegenstand der Dissertation waren daher auch Untersuchungen zur Bioverfügbarkeit (zelluläre Akkumulation und Metabolismus) verschiedener Vitamin E-Formen. Es konnte gezeigt werden, dass Unterschiede in der chemischen Struktur der Vitamin E-Formen deren zelluläre Akkumulation und Metabolisierung beeinflussen. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der Dissertation lassen sich protektive Wirkungen von antioxidativen Nahrungsinhaltsstoffen auch unabhängig von ihren antioxidativen Eigenschaften über die Induktion zelleigener Schutzsysteme, einschließlich der Phase I- und Phase II-Enzyme, erklären. Die Induktion der zelleigenen Abwehr lässt sich auch als adaptive Antwort (sog. "adaptive response") des Organismus gegenüber zellschädigenden Ereignissen betrachten.
Das proinflammatorische Zytokin Interleukin-1 (IL-1) spielt eine zentrale Rolle bei Entzündungen und Infektionen. Die zellulären Antworten von IL-1 werden über den IL-1-Rezeptor Typ I (IL-1RI) vermittelt. Adapterproteine und die IL-1RI-assoziierte Kinase IRAK werden nach Ligandenbindung an den Rezeptor rekrutiert. Nach ihrer Phosphorylierung dissoziiert die IRAK vom IL-1RI-Komplex und aktiviert weitere Kinasen, was letztendlich zur Aktivierung von NF-κB und zur Induktion der Transkription von Genen führt. Für eine adäquate Immunantwort ist ein intrazellulärer reduzierter Status von Proteinthiolen essentiell. Vorausgegangene Untersuchungen an der murinen Thymomzelllinie EL-4 zeigten, dass die IL-1-Signalkaskade durch thiolmodifizierende Substanzen wie Menadion (MD) oder Phenylarsinoxid (PAO) gehemmt wird. Eine IL-1-abhängige Aktivierung von IL-1RI-assoziierte Kinasen oder NF-κB fand nicht mehr statt. Ziele dieser Arbeit waren: (i) mögliche Proteine, die für den Angriff von thiolmodifizierenden Agenzien ein Ziel sein könnten, zu identifizieren und (ii) den Einfluss nahrungsrelevanter und redoxaktiver Substanzen auf frühe Ereignisse der IL-1-Signaltransduktion wie der Bildung des IL-1RI-Komplexes zu untersuchen. Als Zellmodell wurden EL-4-Zellen mit stabil überexprimierter IRAK (EL-4<sup>IRAK) verwendet. Um die Bildung des IL-1RI-Komplexes, anschließende Phosphorylierungsereignisse und somit Kinase-Aktivitäten nachzuweisen, wurden Co-Präzipitations-Experimente und in vitro Kinase Tests durchgeführt. Die Markierung von Proteinthiolen erfolgte mit dem thiolspezifischen Reagenz Iodoacetyl-[<sup>125I]-Iodotyrosin ([<sup>125I]-IAIT). Die Vorbehandlung von EL-4<sup>IRAK-Zellen mit MD oder PAO führte zu einer Hemmung der Rekrutierung der IRAK an den IL-1RI und der anschließenden Phosphorylierungen. Zur Identifikation weiterer IL-1RI-assoziierter Proteine wurden IL-1RI-Immunpräzipitate zweidimensional aufgetrennt, Colloidal-Coomassie gefärbte Proteinspots ausgeschnitten und anschließend massenspektrometrisch mittels ESI-Q-TOF analysiert. Bei der Analyse wurden Proteine des Cytoskeletts wie z. B. Actin identifiziert. In Analogie zu den synthetischen Substanzen MD und PAO wurden nahrungsrelevante und redoxaktive Substanzen wie Curcumin (Gelbwurz) und Sulforaphan (Broccoli) eingesetzt, um zu untersuchen, ob sie bereits früh die IL-1-Signaltransduktion beeinflussen. Bislang sind antiinflammatorische Effekte dieser beiden Nahrungsinhaltsstoffe nur auf der Ebene der Zytokin-vermittelten Aktivierung von NF-κB beschrieben. Sowohl Curcumin als auch Sulforaphan blockierten konzentrationsabhängig die Assoziation der IRAK an den IL-1RI in EL-4<sup>IRAK-Zellen, wobei beide Substanzen unterschiedlich wirkten. Curcumin beeinflusste die IRAK-Aktivierung durch direkte Modifikation von Thiolen der IRAK ohne die Bindung von IL-1 mit dem IL-1RI zu beeinträchtigen. Sulforaphan hingegen induzierte auf mRNA- und Proteinebene die Expression von Tollip, welches durch PCR bzw. Western Blot nachgewiesen wurde. Tollip, ein negativer Regulator in TLR/IL-1RI-Signalkaskaden, könnte somit nach Induktion die IRAK-Aktivierung unterdrücken. Die Sulforaphan-abhängige Induktion der Tollip-Expression erfolgte jedoch nicht über Nrf2 und "antioxidant response element" (ARE)-regulierte Transkription, obwohl Sulforaphan ein bekannter Nrf2-Aktivator ist. Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass die IRAK ein redoxsensitives Protein ist und für die Bildung des IL-1RI-Komplexes reduzierte Proteinthiole eine Voraussetzung sind. Der Angriffspunkt für die antiinflammatorische Wirkung der beiden Nahrungsbestandteile Curcumin und Sulforaphan ist die Bildung des IL-1RI-Komplexes als ein frühes Ereignis in der IL-1-Signalkaskade. Die Hemmung dieses Prozesses würde die in der Literatur beobachteten Inhibitionen der abwärts liegenden Signale wie die Aktivierung von NF-κB und die Induktion proinflammatorischer Proteine erklären.
Die Entwicklung von Dickdarmkrebs wird durch eine Reihe von Lebens- und Essgewohnheiten sowie Umweltfaktoren begünstigt. Den letzteren beiden sind Substanzen zuzurechnen, die bei der Zubereitung der Nahrung entstehen und mit ihr aufgenommen werden. Zu diesen Verbindungen gehört das 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin (PhIP) aus der Substanzklasse der heterozyklischen aromatischen Amine. Es entsteht bei der Erhitzung zahlreicher proteinhaltiger Nahrungsmittel und die Zielorgane in Nagerstudien stimmen mit der Häufung von Krebsinzidenzen in westlichen Industrienationen überein. Dieser Zusammenhang konnte jedoch bis heute nicht endgültig bewiesen werden. Fütterungsversuche mit Ratten wurden mit Konzentrationen der Substanz durchgeführt, die weit über der menschlichen Exposition liegen. Durch das Verfüttern einer humanrelevanten Dosis PhIP sollte geklärt werden, ob auch geringe Konzentrationen dickdarmkrebstypische Mutationen, präneoplastische Läsionen oder Tumore induzierten. Die mit humanrelevanten Dosen gefütterten Tiere wiesen weniger Läsionen als die Hoch-Dosis-PhIP-Gruppe auf, in der allerdings keinerlei maligne Tumoren des Dickdarms auftraten. Hinweise auf dickdarmkrebstypische Mutationen fanden sich ebenfalls in beiden Gruppen, wobei hier keine Dosisabhängigkeit beobachtet werden konnte. Die Sequenzierung ergab ein deutlich von Literaturdaten abweichendes Spektrum. In Bezug auf das verwendete Tiermodell wurden erhebliche Abweichungen in der Empfindlichkeit der Tiere gegenüber der Substanz im Vergleich zu ähnlichen Studien festgestellt. Beide Fütterungsgruppen zeigten deutlich weniger Läsionen; als mögliche Gründe wurden Unterschiede in der Futterzusammensetzung und –zubereitung sowie in der Tierhaltung und –herkunft ausgemacht. Es konnte erstmalig ein Zusammenhang zwischen PhIP in niedrigen Dosen in der Nahrung und der Induktion von Entzündungen gezeigt werden. Diese waren sowohl makroskopisch als auch histologisch sichtbar, der genaue Mechanismus ihrer Entstehung ist jedoch unbekannt. Die zusammenfassende Betrachtung aller Ergebnisse lässt vermuten, dass PhIP allein über lange Zeiträume aber in geringen Dosen verabreicht nicht für die hohe Zahl an Krebserkrankungen in westlichen Industrienationen ursächlich ist.
Homocystein (tHcy) gilt als unabhängiger kardiovaskulärer Risikofaktor und korreliert eng mit einer endothelialen Dysfunktion, welche nichtinvasiv mittels der flussinduzierten Vasodilatation (FMD) messbar ist. Experimentelle Hyperhomocysteinämie ist mit einer reduzierten Bioverfügbarkeit von endothelialen Stickstoffmonoxid (NO) bei gleichzeitig erhöhten Spiegeln des kompetetiven Inhibitors der NO-Biosynthese asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) assoziiert. In-vivo senkt eine Östrogenbehandlung neben tHcy auch die ADMA-Spiegel und verbessert signifikant die Endothelfunktion. Hinsichtlich ihrer Wirkung als selektive Östrogenrezeptormodulatoren wird angenommen, dass Phytoöstrogene, speziell Sojaisoflavone, ähnliche Effekte hervorrufen. Innerhalb einer europäischen, multizentrischen, doppelblinden Interventionsstudie an 89 gesunden, postmenopausalen Frauen wurde der Einfluss von Sojaisoflavonen auf den Homocysteinmetabolismus, den Blutdruck und die in-vivo Endothelfunktion untersucht. Die cross-over Studie umfasste zwei achtwöchige Interventionsperioden, die von einer gleichlangen Wash-out-Phase unterbrochen waren. Die Zuteilung zum Isoflavon- (50 mg/d) oder Plazeboregime für die erste Interventionsphase erfolgte randomisiert. Endpunkterhebungen fanden jeweils in den Wochen 0 und 8 der Interventionsperioden statt. Die renale Ausscheidung von Genistein, Daidzein und Equol war während der Isoflavonintervention signifikant erhöht (P>0,001). Die Phyoöstrogene hatten weder einen Effekt auf die tHcy-Konzentration (P=0,286), noch auf ADMA, Erythrozytenfolat und Vitamin B-12 (P>0,05) im Plasma. Während die Summe aus Nitrat und Nitrit (NOx), welche die NO-Bioverfügbarkeit reflektiert, im Verlaufe der Plazebobehandlung abfiel, wurde ein leichter Anstieg bei der Isoflavonsupplementation beobachtet (Delta Wo8-Wo0: -2,60 [-8,75; 2,25] vs. 1,00 [-6,65; 7,85] µmol/L P<0,001), was zu einem signifikanten Behandlungseffekt führte. Weiterhin wurde eine positive Korrelation zwischen ADMA und Vitamin B-12 gefunden (R=0,252; P=0,018). Die flussinduzierte Vasodilatation (P=0,716), ein Maß für die Endothelfunktion, blieb durch die Isoflavonbehandlung unbeeinflusst, obwohl sich diese über die Zeit insgesamt verbesserte (P>0,001). Bis auf einen marginalen Anstieg des systolischen Wertes (P=0,032) im Vergleich zur Plazebobehandlung blieb der Blutdruck während der Isoflavonintervention unverändert. Im Gegensatz zu Östrogen übten Sojaisoflavone weder einen Einfluss auf die in-vivo Endothelfunktion noch auf die traditionellen und neuen kardiovaskulären Risikofaktoren den Blutdruck, tHcy und ADMA aus. Demzufolge ist der gesundheitliche Nutzen isolierter Isoflavone hinsichtlich einer Prävention hormonmangelbedingter Erkrankungen in gesunden postmenopausalen Frauen fraglich.