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Due to continuously intensifying human usage of the marine environment worldwide ranging cetaceans face an increasing number of threats. Besides whaling, overfishing and by-catch, new technical developments increase the water and noise pollution, which can negatively affect marine species. Cetaceans are especially prone to these influences, being at the top of the food chain and therefore accumulating toxins and contaminants. Furthermore, they are extremely noise sensitive due to their highly developed hearing sense and echolocation ability. As a result, several cetacean species were brought to extinction during the last century or are now classified as critically endangered. This work focuses on two odontocetes. It applies and compares different molecular methods for inference of population status and adaptation, with implications for conservation. The worldwide distributed sperm whale (Physeter macrocephalus) shows a matrilineal population structure with predominant male dispersal. A recently stranded group of male sperm whales provided a unique opportunity to investigate male grouping for the first time. Based on the mitochondrial control region, I was able to infer that male bachelor groups comprise multiple matrilines, hence derive from different social groups, and that they represent the genetic variability of the entire North Atlantic. The harbor porpoise (Phocoena phocoena) occurs only in the northern hemisphere. By being small and occurring mostly in coastal habitats it is especially prone to human disturbance. Since some subspecies and subpopulations are critically endangered, it is important to generate and provide genetic markers with high resolution to facilitate population assignment and subsequent protection measurements. Here, I provide the first harbour porpoise whole genome, in high quality and including a draft annotation. Using it for mapping ddRAD seq data, I identify genome wide SNPs and, together with a fragment of the mitochondrial control region, inferred the population structure of its North Atlantic distribution range. The Belt Sea harbors a distinct subpopulation oppose to the North Atlantic, with a transition zone in the Kattegat. Within the North Atlantic I could detect subtle genetic differentiation between western (Canada-Iceland) and eastern (North Sea) regions, with support for a German North Sea breading ground around the Isle of Sylt. Further, I was able to detect six outlier loci which show isolation by distance across the investigated sampling areas. In employing different markers, I could show that single maker systems as well as genome wide data can unravel new information about population affinities of odontocetes. Genome wide data can facilitate investigation of adaptations and evolutionary history of the species and its populations. Moreover, they facilitate population genetic investigations, providing a high resolution, and hence allowing for detection of subtle population structuring especially important for highly mobile cetaceans.
MHC genes encode proteins that are responsible for the recognition of foreign antigens and the triggering of a subsequent, adequate immune response of the organism. Thus they hold a key position in the immune system of vertebrates. It is believed that the extraordinary genetic diversity of MHC genes is shaped by adaptive selectional processes in response to the reoccurring adaptations of parasites and pathogens. A large number of MHC studies were performed in a wide range of wildlife species aiming to understand the role of immune gene diversity in parasite resistance under natural selection conditions. Methodically, most of this work with very few exceptions has focussed only upon the structural, i.e. sequence diversity of regions responsible for antigen binding and presentation. Most of these studies found evidence that MHC gene variation did indeed underlie adaptive processes and that an individual’s allelic diversity explains parasite and pathogen resistance to a large extent. Nevertheless, our understanding of the effective mechanisms is incomplete. A neglected, but potentially highly relevant component concerns the transcriptional differences of MHC alleles. Indeed, differences in the expression levels MHC alleles and their potential functional importance have remained unstudied. The idea that also transcriptional differences might play an important role relies on the fact that lower MHC gene expression is tantamount with reduced induction of CD4+ T helper cells and thus with a reduced immune response. Hence, I studied the expression of MHC genes and of immune regulative cytokines as additional factors to reveal the functional importance of MHC diversity in two free-ranging rodent species (Delomys sublineatus, Apodemus flavicollis) in association with their gastrointestinal helminths under natural selection conditions. I established the method of relative quantification of mRNA on liver and spleen samples of both species in our laboratory. As there was no available information on nucleic sequences of potential reference genes in both species, PCR primer systems that were established in laboratory mice have to be tested and adapted for both non-model organisms. In the due course, sets of stable reference genes for both species were found and thus the preconditions for reliable measurements of mRNA levels established. For D. sublineatus it could be demonstrated that helminth infection elicits aspects of a typical Th2 immune response. Whereas mRNA levels of the cytokine interleukin Il4 increased with infection intensity by strongyle nematodes neither MHC nor cytokine expression played a significant role in D. sublineatus. For A. flavicollis I found a negative association between the parasitic nematode Heligmosomoides polygyrus and hepatic MHC mRNA levels. As a lower MHC expression entails a lower immune response, this could be evidence for an immune evasive strategy of the nematode, as it has been suggested for many micro-parasites. This implies that H. polygyrus is capable to interfere actively with the MHC transcription. Indeed, this parasite species has long been suspected to be immunosuppressive, e.g. by induction of regulatory T-helper cells that respond with a higher interleukin Il10 and tumor necrosis factor Tgfb production. Both cytokines in turn cause an abated MHC expression. By disabling recognition by the MHC molecule H. polygyrus might be able to prevent an activation of the immune system. Indeed, I found a strong tendency in animals carrying the allele Apfl-DRB*23 to have an increased infection intensity with H. polygyrus. Furthermore, I found positive and negative associations between specific MHC alleles and other helminth species, as well as typical signs of positive selection acting on the nucleic sequences of the MHC. The latter was evident by an elevated rate of non-synonymous to synonymous substitutions in the MHC sequences of exon 2 encoding the functionally important antigen binding sites whereas the first and third exons of the MHC DRB gene were highly conserved. In conclusion, the studies in this thesis demonstrate that valid procedures to quantify expression of immune relevant genes are also feasible in non-model wildlife organisms. In addition to structural MHC diversity, also MHC gene expression should be considered to obtain a more complete picture on host-pathogen coevolutionary selection processes. This is especially true if parasites are able to interfere with systemic MHC expression. In this case advantageous or disadvantageous effects of allelic binding motifs are abated. The studies could not define the role of MHC gene expression in antagonistic coevolution as such but the results suggest that it depends strongly on the specific parasite species that is involved.
Glycosylphosphatidylinositols (GPIs) are highly complex glycolipids that serve as membrane anchors to a large variety of eukaryotic proteins. These are covalently attached to a group of peripheral proteins called GPI-anchored proteins (GPI-APs) through a post-translational modification in the endoplasmic reticulum. The GPI anchor is a unique structure composed of a glycan, with phospholipid tail at one end and a phosphoethanolamine linker at the other where the protein attaches. The glycan part of the GPI comprises a conserved pseudopentasaccharide core that could branch out to carry additional glycosyl or phosphoethanolamine units. GPI-APs are involved in a diverse range of cellular processes, few of which are signal transduction, protein trafficking, pathogenesis by protozoan parasites like the malaria- causing parasite Plasmodium falciparum. GPIs can also exist freely on the membrane surface without an attached protein such as those found in parasites like Toxoplasma gondii, the causative agent of Toxoplasmosis. These molecules are both structurally and functionally diverse, however, their structure-function relationship is still poorly understood. This is mainly because no clear picture exists regarding how the protein and the glycan arrange with respect to the lipid layer. Direct experimental evidence is rather scarce, due to which inconclusive pictures have emerged, especially regarding the orientation of GPIs and GPI-APs on membrane surfaces and the role of GPIs in membrane organization. It appears that computational modelling through molecular dynamics simulations would be a useful method to make progress. In this thesis, we attempt to explore characteristics of GPI anchors and GPI-APs embedded in lipid bilayers by constructing molecular models at two different resolutions – all-atom and coarse-grained.
First, we show how to construct a modular molecular model of GPIs and GPI-anchored proteins that can be readily extended to a broad variety of systems, addressing the micro-heterogeneity of GPIs. We do so by creating a hybrid link to which GPIs of diverse branching and lipid tails of varying saturation with their optimized force fields, GLYCAM06 and Lipid14 respectively, can be attached. Using microsecond simulations, we demonstrate that GPI prefers to “flop-down” on the membrane, thereby, strongly interacting with the lipid heads, over standing upright like a “lollipop”. Secondly, we extend the model of the GPI core to carry out a systematic study of the structural aspects of GPIs carrying different side chains (parasitic and human GPI variants) inserted in lipid bilayers. Our results demonstrate the importance of the side branch residues as these are the most accessible, and thereby, recognizable epitopes. This finding qualitatively agrees with experimental observations that highlight the role of the side branches in immunogenicity of GPIs and the specificity thereof. The overall flop-down orientation of the GPIs with respect to the bilayer surface presents the side chain residues to face the solvent. Upon attaching the green fluorescent protein (GFP) to the GPI, it is seen to lie in close proximity to the bilayer, interacting both with the lipid heads and glycan part of the GPI. However the orientation of GFP is sensitive to the type of GPI it is attached to. Finally, we construct a coarse-grained model of the GPI and GPI-anchored GFP using a modified version of the MARTINI force-field, using which the timescale is enhanced by at least an order of magnitude compared to the atomistic system.
This study provides a theoretical perspective on the conformational behavior of the GPI core and some of its branched variations in presence of lipid bilayers, as well as draws comparisons with experimental observations. Our modular atomistic model of GPI can be further employed to study GPIs of variable branching, and thereby, aid in designing future experiments especially in the area of vaccines and drug therapies. Our coarse-grained model can be used to study dynamic aspects of GPIs and GPI-APs w.r.t plasma membrane organization. Furthermore, the backmapping technique of converting coarse-grained trajectory back to the atomistic model would enable in-depth structural analysis with ample conformational sampling.
Die Tailspike Proteine (TSP) der Bakteriophagen P22, Sf6 und HK620 dienen der Erkennung von Kohlenhydratstrukturen auf ihren gram-negativen Wirtsbakterien und zeigen, von den ersten 110 Aminosäuren des N-Terminus abgesehen, keine Sequenzübereinstimmung. Mit Röntgenkristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, dass HK620TSP und Sf6TSP ebenfalls zu einer parallelen, rechtsgängigen beta-Helix falten, wie dies schon für P22TSP bekannt war. Die Kohlenhydratbindestelle ist bei Sf6TSP im Vergleich zu P22TSP zwischen die Untereinheiten verschoben.
Cyanobacteria are an abundant bacterial group and are found in a variety of ecological niches all around the globe. They can serve as a real threat for fish or mammals and can restrict the use of lakes or rivers for recreational purposes or as a source of drinking water, when they form blooms. One of the most abundant bloom-forming cyanobacteria is Microcystis aeruginosa.
In the first part of the study, the role and possible dynamics of RubisCO in M. aeruginosa during high-light irradiation were examined. Its response was analyzed on the protein and peptide level via immunoblotting, immunofluorescence microscopy and with high performance liquid chromatography (HPLC). It was revealed that large amounts of RubisCO were located outside of carboxysomes under the applied high light stress. RubisCO aggregated mainly underneath the cytoplasmic membrane. There it forms a putative Calvin-Benson-Bassham (CBB) super complex together with other enzymes of photosynthesis. This complex could be part of an alternative carbon-concentrating mechanism (CCM) in M. aeruginosa, which enables a faster, and energy saving adaptation to high light stress of the whole bloom.
Furthermore, the re-localization of RubisCO was delayed in the microcystin-deficient mutant ΔmcyB and RubisCO was more evenly distributed over the cell in comparison to the wild type. Since ΔmcyB is not harmed in its growth, possibly other produced cyanopeptides as aeruginosin or cyanopeptolin also play a role in the stabilization of RubisCO and the putative CBB complex, especially in the microcystin-free mutant.
In the second part of this work, the possible role of microcystin as an extracellular signaling peptide during the diurnal cycle was studied. HPLC analysis showed a strong increase of extracellular microcystin in the wild type when the population entered nighttime and it resumed into the next day as well. Together with the increase of extracellular microcystin, a strong decrease of protein-bound intracellular microcystin was observed via immunoblot analysis. Interestingly, the signal of the large subunit of RubisCO (RbcL) also diminished when high amounts of microcystin were present in the surrounding medium. Microcystin addition experiments to M. aeruginosa WT and ΔmcyB cultures support this observation, since the immunoblot signal of both subunits of RubisCO and CcmK, a shell protein of carboxysomes, diminished after the addition of microcystin. In addition, the fluctuation of cyanopeptolin during the diurnal cycle indicates a more prominent role of other cyanopeptides besides microcystin as a signaling peptide, intracellularly as well as extracellularly.
The life cycle of higher plants is based on recurring phases of growth and development based on repetitive sequences of cell division, cell expansion and cell differentiation. This dissertation deals with two projects, each of them investigating two different topics that are related to cell expansion. The first project is examining an Arabidopsis thaliana mutant exhibiting overall cell enlargement and the second project is analysing two naturally occurring floral morphs of Amsinckia spectabilis (Boraginaceae) differing (amongst others) in style length and anther heights due to differences in longitudinal cell elongation. The EMS-mutant eop1 was shown to exhibit a petal size increase of 26% caused by cell enlargement. Further phenotypes were detected, such as cotyledon size increase (based on larger cells) as well as increased carpel, sepal, leaf and pollen sizes. Plant height was shown to be increased and more highly branched trichomes explained the hairy eop1 phenotype. Fine mapping revealed the causal SNP to be a C to T transition at the last nucleotide of intron 7 of the INCURVATA11 (ICU11) gene, a 2-oxoglutarate /Fe(II)-dependant dioxygenase, and thus causing missplicing of the mRNA. Two T-DNA insertion lines (icu11-2 & icu11-4) confirmed ICU11 as causal gene by exhibiting increased petal size. A comparison of three icu11 alleles, which possessed different mutation-related changes, either overexpressing ICU11 or modified mRNAs, was the base for investigating the molecular mechanism that underlies the observed phenotype. Different approaches revealed contradictory results regarding ICU11 protein functionality in the icu11 mutants. A complementation assay proved the three mutants to be exchangeable and ICU11 overexpression in the wild-type led to an icu11-like phenotype, arguing for all three icu11 mutants to be GOF mutants. Contradicting this conclusion, the icu11-4 line could be rescued by a genomic ICU11 transgene. A model, based on the assumption that an overexpression of ICU11 is inhibiting the function of the protein, and thus causing the same effect as a LOF protein was proposed. Further, icu11-3 (eop1) mutants were shown to have an increased resistance towards paclobutrazol, a gibberellin (GA) inhibitor and an upregulation of AtGA20ox2, a main GA biosynthesis gene. Additionally, ICU11 subcellular localization was discovered to be cytoplasmic, supporting the assumption, that ICU11 affects GA biosynthesis and overall GA level, possibly explaining the observed (GA-overdose) phenotype.
The second project aimed to identify the genetic base of the S-locus in Amsinckia spectabilis, as the Amsinckia genus represents untypical characteristics for a heterostylous species, such as no obvious self-incompatibility (SI) and the repeated transition towards homostylous and fully selfing variants. The work was based on three Amsinckia spectabilis forms: a heterostylous form, consisting of two floral morphs with reciprocal positioning of sexual organs (S-morph: high anthers and a short style and L-morph: low anthers and a long style), and two homostylous forms, one large-flowered and partially selfing and the other small-flowered and fully selfing. The maintenance of the two floral morphs is genetically based on the S-locus region, containing genes that encode for the morph-specific traits, which are marked by a tight linkage due to suppressed recombination. Natural populations are found to possess a 1:1 S:L morph ratio, that can be explained by predominant disassortative mating of the two morphs, causing the occurrence of the dominant S-allele only in the heterozygous state (heterozygous (Ss) for the S-morph and homozygous recessive (ss) for the L-morph). Investigation of morph-specific phenotypes detected 56% elongated L-morph styles and 58% higher positioned S-morph anthers. Approximately 50% of the observed size differences were explained by an increase in cell elongation. Moreover, additional phenotypes were found, such as 21% enlarged S-morph pollen and no obvious SI, confirmed by hand pollinated seed counts, in vivo pollen tube growth and the development of homozygous dominant SS individuals via selfing. The Amsinckia spec. S-locus was assumed to at least consist of the G- (style length), the A- (anther height) and the P- (pollen size) locus. Comparative Transcriptomics of the two morphs revealed 22 differentially expressed markers that were found to be located within two contigs of a SS individual PacBio genome assembly, allowing the localization of the S-locus to be delimited to a region of approximately 23 Mb. Contradictory to revealed S-loci within the plant kingdom, no strong argument for a present hemizygous region was found to be causal for the suppressed recombination of the S-locus, so that an inversion was assumed to be the causal mechanism.
Complex networks have been successfully employed to represent different levels of biological systems, ranging from gene regulation to protein-protein interactions and metabolism. Network-based research has mainly focused on identifying unifying structural properties, including small average path length, large clustering coefficient, heavy-tail degree distribution, and hierarchical organization, viewed as requirements for efficient and robust system architectures. Existing studies estimate the significance of network properties using a generic randomization scheme - a Markov-chain switching algorithm - which generates unrealistic reactions in metabolic networks, as it does not account for the physical principles underlying metabolism. Therefore, it is unclear whether the properties identified with this generic approach are related to the functions of metabolic networks. Within this doctoral thesis, I have developed an algorithm for mass-balanced randomization of metabolic networks, which runs in polynomial time and samples networks almost uniformly at random. The properties of biological systems result from two fundamental origins: ubiquitous physical principles and a complex history of evolutionary pressure. The latter determines the cellular functions and abilities required for an organism’s survival. Consequently, the functionally important properties of biological systems result from evolutionary pressure. By employing randomization under physical constraints, the salient structural properties, i.e., the smallworld property, degree distributions, and biosynthetic capabilities of six metabolic networks from all kingdoms of life are shown to be independent of physical constraints, and thus likely to be related to evolution and functional organization of metabolism. This stands in stark contrast to the results obtained from the commonly applied switching algorithm. In addition, a novel network property is devised to quantify the importance of reactions by simulating the impact of their knockout. The relevance of the identified reactions is verified by the findings of existing experimental studies demonstrating the severity of the respective knockouts. The results suggest that the novel property may be used to determine the reactions important for viability of organisms. Next, the algorithm is employed to analyze the dependence between mass balance and thermodynamic properties of Escherichia coli metabolism. The thermodynamic landscape in the vicinity of the metabolic network reveals two regimes of randomized networks: those with thermodynamically favorable reactions, similar to the original network, and those with less favorable reactions. The results suggest that there is an intrinsic dependency between thermodynamic favorability and evolutionary optimization. The method is further extended to optimizing metabolic pathways by introducing novel chemically feasibly reactions. The results suggest that, in three organisms of biotechnological importance, introduction of the identified reactions may allow for optimizing their growth. The approach is general and allows identifying chemical reactions which modulate the performance with respect to any given objective function, such as the production of valuable compounds or the targeted suppression of pathway activity. These theoretical developments can find applications in metabolic engineering or disease treatment. The developed randomization method proposes a novel approach to measuring the significance of biological network properties, and establishes a connection between large-scale approaches and biological function. The results may provide important insights into the functional principles of metabolic networks, and open up new possibilities for their engineering.
Durch die anthropogene Nutzung sind viele Auen in Mitteleuropa verändert worden, wobei insbesondere die Retentionsflächen stark verringert wurden. Während Auen seit längerem im Fokus der wissenschaftlichen Bearbeitung stehen, gibt es bisher große Wissensdefizite in der Frage der Auenreaktivierungen. Zum einen sind derartige Projekte bisher kaum verwirklicht und zum anderen ist ein langfristiges Monitoring notwendig, um die Anpassung von Biozönosen an die veränderten Standortbedingungen beobachten zu können. Um die Folgen derartiger Eingriffe zu analysieren, bieten sich computergestützte Modellierungen der Landschaftsentwicklung an, wie sie in der vorliegenden Arbeit verwirklicht wurden. Ziel der Arbeit war, mit Hilfe eines Geografischen Informationssystems (GIS) das Entwicklungspotenzial der Landschaft bei verschiedenen Rückdeichungsvarianten auf der Ebene der Biotoptypen darzustellen. Dabei ging es nicht um die Erstellung eines allgemein gültigen Auenmodells sondern um die Erarbeitung eines Modells für einen konkreten Anwendungsfall. Der erarbeitete Ansatz sollte zudem für die landschaftsplanerische Praxis geeignet sein. Als Beispielgebiete wurden Flächen an der Mittleren Elbe bei Rogätz und Sandau, beide im nördlichen Teil von Sachsen-Anhalt, ausgewählt. Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Im ersten Teil werden Erhebungen und Auswertungen als Grundlage der Modellentwicklung dargestellt. Dazu wurden die Biotoptypen der Beispielgebiete flächendeckend erhoben und mit punktuellen Vegetationserhebungen ergänzt. Aus dem Forschungsprojekt "Rückgewinnung von Retentionsflächen und Altauenreaktivierung an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt" des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) standen standortökologische Daten der Hydrologie und Bodenkunde zur Verfügung. Ziel der Auswertung war, Schlüsselfaktoren für Hydrologie und Bodenbedingungen innerhalb der rezenten Aue zu identifizieren, die zur Ausprägung bestimmter Biotoptypen führen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Modell für Biotoptypenpotenziale auf den geplanten Rück–deichungsflächen entwickelt. Das Modell bearbeitet die Datenbank der verwendeten GIS-Dateien, die auf Daten zum Bestand beruht und um solche der Prognose der Standortökologie (Hydrologie und Boden) im Rückdeichungsfalle aus dem BMBF-Projekt erweitert wurde. Weitere Voraussetzung für die Modellierung war die Erarbeitung von Leitbildern, in denen unterschiedliche Nutzungsszenarios für die Landschaft nach Deichrückverlegung hypothetisch festgelegt wurden. Insbesondere die Nutzungsintensität wurde variiert, von einer Variante intensiver land- und forstwirtschaftlicher Nutzung über sogenannte integrierte Entwicklungsziele aus dem BMBF-Projekt bis hin zu einer Variante der Naturschutznutzung. Zusätzlich wurde eine zukünftige Potentielle Natürliche Vegetation modelliert. Eine Überprüfung des Modell fand für den Raum der rezenten Aue in der intensiven Nutzungsvariante statt, die der gegenwärtigen Nutzung am nächsten kommt. Werden Informationen des Bestandsbiotoptyps als Korrekturgröße in das Modell einbezogen, konnte für viele Biotoptypen eine Trefferquote von über 90 % erreicht werden. Bei flächenmäßig weniger bedeutenden Bio–toptypen lag dieser Wert aufgrund der schmaleren Datenbasis zwischen 20 und 40 %. Als Ergebnis liegt für unterschiedliche Deichvarianten und Leitbilder in den Beispielgebieten die Landschaftsentwicklung als Biotoppotenzial vor. Als eine vereinfachte Regionalisierung der punktuellen Vegetationsdaten wurde im Modell geprüft, inwieweit die modellierten Biotopflächen der Charakteristik der pflanzensoziologischen Aufnahmen aus der rezenten Aue entsprechen. In dem Falle wurde die Pflanzengesellschaft der jeweiligen ökologisch im Rahmen der Untersuchung einheitlichen Flächeneinheit zugeordnet. Anteilig lässt sich damit die Biotopprognosefläche pflanzensoziologisch konkretisieren. Die vorliegende Arbeit gehört zu den bisher wenigen Arbeiten, die sich mit den Folgen von Auenreaktivierung auf die Entwicklung der Landschaft auseinandersetzen. Sie zeigt eine Möglichkeit auf, Prognosemodelle für Biotoptypen und Vegetation anhand begrenzter Felduntersuchungen zu entwerfen. Derartige Modelle können zum Verständnis von Eingriffen in den Naturhaushalt, wie sie die Deichrückverlegungen darstellen, beitragen und eine Folgenabschätzung unterstützen.
Internalin J (InlJ) gehört zu der Klasse der bakteriellen, cysteinhaltigen (leucine-rich repeat) LRR Proteine. Bei den Internalinen handelt es sich um meist invasions-assoziierte Proteine der Listerien. Die LRR-Domäne von InlJ ist aus 15 regelmäßig wiederkehrenden, stark konservierten Sequenzeinheiten (repeats, 21 Aminosäuren) aufgebaut. Ein interessantes Detail dieses Internalins ist das stark konservierte Cystein innerhalb der repeats. Daraus ergibt sich eine ungewöhnliche Anordnung von 12 Cysteinen in einem Stapel. Die Häufigkeit von Cysteinen in InlJ ist für ein extrazelluläres Protein von L. monocytogenes außergewöhnlich, und die Frage nach ihrer Funktion daher umso brennender. Im Vergleich zum ubiquitären Vorkommen der sogenannten repeat-Proteine in der Natur sind Studien zu ihrer Stabilität und Faltung nicht äquivalent vertreten. Die zentrale Eigenschaft der repeat-Proteine ist ihr modularer Aufbau, der durch einfache Topologie gekennzeichnet ist und auf kurzreichenden Wechselwirkungen basiert. Diese Topologie macht repeat-Proteine zu idealen Modellproteinen, um die stabilitätsrelevanten Wechselwirkungen zu separieren und zuzuordnen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Faltung und Entfaltung von InlJ umfassend charakterisiert und die Relevanz der Cysteine näher beleuchtet. Die spektroskopische Charakterisierung von InlJ zeigte, dass dessen Faltungszustand durch zwei Tryptophane im N- und C-Terminus fluoreszenzspektroskopisch gut zugänglich ist. Die thermodynamische Stabilität wurde mittels fluoreszenz-detektierten, Guanidiniumchlorid-induzierten Gleichgewichtsexperimenten bestimmt. Um die kinetischen Eigenschaften von InlJ zu erfassen, wurden die Faltungs- sowie die Entfaltungsreaktion spektroskopisch untersucht. Die Identifizierung der produktiven Faltungsreaktion war lediglich durch die Anwendung des reversen Doppelsprungexperiments möglich. Die Auswertung erfolgte nach dem Zweizustandsmodell, wonach die Faltung dem „Alles-oder-Nichts“ Prinzip folgt. Die Gültigkeit dieser Annahme wurde durch die kinetische Charakterisierung bestätigt. Es wurde sowohl in den Gleichgewichtsexperimenten als auch in den kinetisch erhaltenen Daten eine hohe freie Stabilisierungsenthalpie festgestellt. Die hohe Stabilität von InlJ geht mit hoher Kooperativität einher. Die kinetischen Daten zeigen zudem, dass die hohe Kooperativität hauptsächlich der Faltungsreaktion entstammt. Der Tanford-Wert von 0.93 impliziert, dass die Oberflächenänderung während der Faltung bereits zum größten Teil erfolgt ist, bevor der Übergangszustand ausgebildet wurde. Direkte strukturelle Informationen über den Übergangszustand wurden mit Hilfe von Mutationsstudien erhalten. Zu diesem Zweck wurden 12 der 14 Cysteine gegen ein Alanin ausgetauscht. Die repeats 1 bis 11 von InlJ beinhalten jeweils ein Cystein, deren Anordnung eine Leiter ergibt. Deren Substitutionen haben einen vergleichbar destabilisierenden Effekt auf InlJ von durchschnittlich 4.8 kJ/mol. Die Verlangsamung der Faltung deutet daraufhin, dass die Interaktionen der repeats 5 bis 11 im Übergangszustand bereits voll ausgebildet sind. Demnach liegt bei InlJ ein zentraler Faltungsnukleus vor. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurde eine hohe Stabilität und ein stark-kooperatives Verhalten für das extrazelluläre Protein InlJ beobachtet. Diese Erkenntnisse könnten wichtige Beiträge zur Entwicklung artifizieller repeat-Proteine leisten, deren Verwendung sich stetig ausweitet.
Das homotrimere Tailspikeadhäsin des Bakteriophagen P22 ist ein etabliertes Modellsystem, dessen Faltung, Assemblierung und Stabilität in vivo und in vitro umfassend charakterisiert ist. Das zentrale Strukturmotiv des Proteins ist eine parallele beta-Helix mit 13 Windungen, die von einer N‑terminalen Kapsidbindedomäne und einer C‑terminalen Trimerisierungsdomäne flankiert wird. Jede Windung beinhaltet drei kurze beta-Stränge, die durch turns und loops unterschiedlicher Länge verbunden sind. Durch den sich strukturell wiederholenden, spulenförmigen Aufbau formen beta-Stränge benachbarter Windungen elongierte beta-Faltblätter. Das Lumen der beta-Helix beinhaltet größtenteils hydrophobe Seitenketten, welche linear und sehr regelmäßig entlang der Längsachse gestapelt sind. Eine hoch repetitive Struktur, ausgedehnte beta-Faltblätter und die regelmäßige Anordnung von ähnlichen oder identischen Seitenketten entlang der beta-Faltblattachse sind ebenfalls typische Kennzeichen von Amyloidfibrillen, die bei Proteinfaltungskrankheiten wie Alzheimer, der Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Chorea Huntington und Typ-II-Diabetes gebildet werden. Es wird vermutet, dass die hohe Stabilität des Tailspikeproteins und auch die der Amyloidfibrille durch Seitenkettenstapelung, einem geordneten Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen und den rigiden, oligomeren Verbund bedingt ist. Um den Einfluss der Seitenkettenstapelung auf die Stabilität, Faltung und Struktur des P22 Tailspikeproteins zu untersuchen, wurden sieben Valine in einem im Lumen der beta-Helix begrabenen Seitenkettenstapel gegen das kleinere und weniger hydrophobe Alanin und das voluminösere Leucin substituiert. Der Einfluss der Mutationen wurde anhand zweier Tailspikevarianten, dem trimeren, N‑terminal verkürzten TSPdeltaN‑Konstrukt und der monomeren, isolierten beta-Helix Domäne analysiert. Generell wurde in den Experimenten deutlich, dass Mutationen zu Alanin stärkere Effekte auslösen als Mutationen zu Leucin. Die dichte und hydrophobe Packung im Kern der beta-Helix bildet somit die Basis für Stabilität und Faltung des Proteins. Anhand hoch aufgelöster Kristallstrukturen jeweils zweier Alanin‑ und Leucin‑Mutanten konnte verdeutlicht werden, dass das Strukturmotiv der parallelen beta-Helix stark formbar ist und mutationsbedingte Änderungen des Seitenkettenvolumens durch kleine und lokale Verschiebung der Haupt‑ und Seitenketten ausgeglichen werden, sodass mögliche Kavitäten gefüllt und sterische Spannung abgebaut werden können. Viele Mutanten zeigten in vivo und in vitro einen temperatursensitiven Faltungsphänotyp (temperature sensitive for folding, tsf), d.h. bei Temperaturerhöhung waren die Ausbeuten des N‑terminal verkürzten Trimers im Vergleich zum Wildtyp deutlich verringert. Weiterführende Experimente zeigten, dass der tsf‑Phänotyp durch die Beeinflussung unterschiedlicher Stadien des Reifungsprozesses oder auch durch die Verminderung der kinetischen Stabilität des nativen Trimers ausgelöst wurde. Durch Untersuchungen am vollständigen und am N‑terminal verkürzten Wildtypprotein wurde gezeigt, dass die Entfaltungsreaktion des Tailspiketrimers komplex ist. Die Verläufe der Kinetiken folgen zwar einem apparenten Zweizustandsverhalten, jedoch sind bei Darstellung der Entfaltungsäste im Chevronplot die Abhängigkeiten der Geschwindigkeitskonstanten vom Denaturierungsmittel nicht linear, sondern in unterschiedliche Richtungen gewölbt. Dieses Verhalten könnte durch ein hoch energetisches Entfaltungsintermediat, einen breiten Übergangsbereich oder parallele Entfaltungswege hervorgerufen sein. Mit Hilfe der monomeren, isolierten beta-Helix Domäne, bei der die N‑terminale Capsidbindedomäne und die C‑terminale Trimerisierungsdomäne deletiert sind und welche als unabhängige Faltungseinheit fungiert, wurde gezeigt, dass alle Mutanten im Harnstoff‑induzierten Gleichgewicht analog zum Wildtypprotein einem Zweizustandsverhalten mit vergleichbaren Kooperativitäten folgen. Die konformationellen Stabilitäten von in der beta-Helix zentral gelegenen Alanin‑ und Leucin‑Mutanten sind stark vermindert, während Mutationen in äußeren Bereichen der Domäne keinen Einfluss auf die Stabilität der beta-Helix haben. Bei Verlängerung der Inkubationszeiten der Gleichgewichtsexperimente konnte die langsame Bildung von Aggregaten im Übergangsbereich der destabilisierten Mutanten detektiert werden. Die in der Arbeit erlangten Erkenntnisse lassen vermuten, dass die isolierte beta-Helix einem für die Reifung des Tailspikeproteins entscheidenden thermolabilen Faltungsintermediat auf Monomerebene sehr ähnlich ist. Im Intermediat ist ein zentraler Kern, der die Windungen 4 bis 7 und die „Rückenflosse“ beinhaltet, stabilitätsbestimmend. Dieser Kern könnte als Faltungsnukleus dienen, an den sich sequenziell weitere Helixwindungen anlagern und im Zuge der „Monomerreifung“ kompaktieren.
The cytoskeletal motor protein kinesin-1 (conventional kinesin) is the fast carrier for intracellular cargo transport along microtubules. So far most studies aimed at investigating the transport properties of individual motor molecules. However, the transport in cells usually involves the collective work of more than one motor. In the present work, we have studied the movement of beads as artificial loads/organelles pulled by several kinesin-1 motors in vitro. For a wide range of motor coverage of the beads and different bead (cargo) sizes the transport parameters walking distance or run length, velocity and force generation are measured. The results indicate that the transport parameters are influenced by the number of motors carrying the bead. While the transport velocity slightly decreases, an increase in the run length was measured and higher forces are determined, when more motors are involved. The effective number of motors pulling a bead is estimated by measuring the change in the hydrodynamic diameter of kinesin-coated beads using dynamic light scattering. The geometrical constraints imposed by the transport system have been taken into account. Thus, results for beads of different size and motor-surface coverage could be compared. In addition, run length-distributions obtained for the smallest bead size were matched to theoretically calculated distributions. The latter yielded an average number of pulling motors, which is in agreement with the effective motor numbers determined experimentally.
Thermoresponsive Zellkultursubstrate für zeitlich-räumlich gesteuertes Auswachsen neuronaler Zellen
(2019)
Ein wichtiges Ziel der Neurowissenschaften ist das Verständnis der komplexen und zugleich faszinierenden, hochgeordneten Vernetzung der Neurone im Gehirn, welche neuronalen Prozessen, wie zum Beispiel dem Wahrnehmen oder Lernen wie auch Neuropathologien zu Grunde liegt. Für verbesserte neuronale Zellkulturmodelle zur detaillierten Untersuchung dieser Prozesse ist daher die Rekonstruktion von geordneten neuronalen Verbindungen dringend erforderlich. Mit Oberflächenstrukturen aus zellattraktiven und zellabweisenden Beschichtungen können neuronale Zellen und ihre Neuriten in vitro strukturiert werden. Zur Kontrolle der neuronalen Verbindungsrichtung muss das Auswachsen der Axone zu benachbarten Zellen dynamisch gesteuert werden, zum Beispiel über eine veränderliche Zugänglichkeit der Oberfläche.
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob mit thermoresponsiven Polymeren (TRP) beschichtete Zellkultursubstrate für eine dynamische Kontrolle des Auswachsens neuronaler Zellen geeignet sind. TRP können über die Temperatur von einem zellabweisenden in einen zellattraktiven Zustand geschaltet werden, womit die Zugänglichkeit der Oberfläche für Zellen dynamisch gesteuert werden kann. Die TRP-Beschichtung wurde mikrostrukturiert, um einzelne oder wenige neuronale Zellen zunächst auf der Oberfläche anzuordnen und das Auswachsen der Zellen und Neuriten über definierte TRP-Bereiche in Abhängigkeit der Temperatur zeitlich und räumlich zu kontrollieren. Das Protokoll wurde mit der neuronalen Zelllinie SH-SY5Y etabliert und auf humane induzierte Neurone übertragen. Die Anordnung der Zellen konnte bei Kultivierung im zellabweisenden Zustand des TRPs für bis zu 7 Tage aufrecht erhalten werden. Durch Schalten des TRPs in den zellattraktiven Zustand konnte das Auswachsen der Neuriten und Zellen zeitlich und räumlich induziert werden. Immunozytochemische Färbungen und Patch-Clamp-Ableitungen der Neurone demonstrierten die einfache Anwendbarkeit und Zellkompatibilität der TRP-Substrate.
Eine präzisere räumliche Kontrolle des Auswachsens der Zellen sollte durch lokales Schalten der TRP-Beschichtung erreicht werden. Dafür wurden Mikroheizchips mit Mikroelektroden zur lokalen Jouleschen Erwärmung der Substratoberfläche entwickelt. Zur Evaluierung der generierten Temperaturprofile wurde eine Temperaturmessmethode entwickelt und die erhobenen Messwerte mit numerisch simulierten Werten abgeglichen. Die Temperaturmessmethode basiert auf einfach zu applizierenden Sol-Gel-Schichten, die den temperatursensitiven Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin B enthalten. Sie ermöglicht oberflächennahe Temperaturmessungen in trockener und wässriger Umgebung mit hoher Orts- und Temperaturauflösung. Numerische Simulationen der Temperaturprofile korrelierten gut mit den experimentellen Daten. Auf dieser Basis konnten Geometrie und Material der Mikroelektroden hinsichtlich einer lokal stark begrenzten Temperierung optimiert werden. Ferner wurden für die Kultvierung der Zellen auf den Mikroheizchips eine Zellkulturkammer und Kontaktboard für die elektrische Kontaktierung der Mikroelektroden geschaffen.
Die vorgestellten Ergebnisse demonstrieren erstmalig das enorme Potential thermoresponsiver Zellkultursubstrate für die zeitlich und räumlich gesteuerte Formation geordneter neuronaler Verbindungen in vitro. Zukünftig könnte dies detaillierte Studien zur neuronalen Informationsverarbeitung oder zu Neuropathologien an relevanten, humanen Zellmodellen ermöglichen.
Das Superoxidradikal kann mit fast allen Bestandteilen von Zellen reagieren und diese schädigen. Die medizinische Forschung stellte eine Beteiligung des Radikals an Krebs, Herzinfarkten und neuraler Degeneration fest. Ein empfindlicher Superoxidnachweis ist daher zum besseren Verständnis von Krankheitsverläufen wichtig. Dabei stellen die geringen typischen Konzentrationen und seine kurze Lebensdauer große Anforderungen. Ziel dieser Arbeit war es zum einen, zwei neuartige Proteinarchitekturen auf Metallelektroden zu entwickeln und deren elektrochemisches Ansprechverhalten zu charakterisieren. Zum anderen waren diese Elektroden zur empfindlichen quantitativen Superoxiddetektion einzusetzen. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Protein-Multischichtelektrode aus Cytochrom c und dem Polyelektrolyten Poly(anilinsulfonsäure) nach dem Layer-by-layer-Verfahren aufgebaut. Für zwei bis 15 Schichten an Protein wurde eine deutliche Zunahme an elektrodenaktivem Cytochrom c mit jedem zusätzlichen Aufbringungsschritt nachgewiesen. Die Zunahme verlief linear und ergab bei 15 Schichten eine Zunahme der redoxaktiven Proteinmenge um deutlich mehr als eine Größenordnung. Während das formale Potential im Multischichtsystem sich im Vergleich zur Monoschichtelektrode nicht veränderte, wurde für die Kinetik eine Abhängigkeit der Geschwindigkeit des Elektronentransfers von der Zahl der Proteinschichten beobachtet. Mit zunehmender Scangeschwindigkeit trat ein reversibler Kontaktverlust zu den äußeren Schichten auf. Die lineare Zunahme an elektroaktivem Protein mit steigender Zahl an Depositionsschritten unterscheidet sich deutlich von in der Literatur beschriebenen Protein/Polyelektrolyt-Multischichtelektroden, bei denen ab etwa 6-8 Schichten keine Zunahme an elektroaktivem Protein mehr festgestelltwurde. Auch ist bei diesen die Zunahme an kontaktierbaren Proteinmolekülen auf das Zwei- bis Fünffache limitiert. Diese Unterschiede des neu vorgestellten Systems zu bisherigen Multischichtassemblaten erklärt sich aus einem in dieser Arbeit für derartige Systeme erstmals beschriebenen Elektronentransfermechanismus. Der Transport von Elektronen zwischen der Elektrodenoberfläche und den Proteinmolekülen in den Schichten verläuft über einen Protein-Protein-Elektronenaustausch. Dieser Mechanismus beruht auf dem schnellen Selbstaustausch von Cytochrom c-Molekülen und einer verbleibenden Rotationsflexibilität des Proteins im Multischichtsystem. Die Reduzierung des Proteins durch das Superoxidradikal und eine anschließende Reoxidation durch die Elektrode konnten nachgewiesen werden. In einem amperometrischen Messansatz wurde das durch Superoxidradikale hervorgerufene elektrochemische Signal in Abhängigkeit von der Zahl an Proteinschichten gemessen. Ein maximales Ansprechverhalten auf das Radikal wurde mit 6-Schichtelektroden erzielt. Die Empfindlichkeit der 6-Schichtelektroden wurde im Vergleich zum Literaturwert der Monoschichtelektrode um Faktor 14, also mehr als eine Größenordnung, verbessert. Somit konnte eine Elektrode mit 6 Schichten aus Cytochrom c und Poly(anilinsulfonsäure) als neuartiger Superoxidsensor mit einer 14-fachen Verbesserung der Empfindlichkeit im Vergleich zum bislang benutzten System entwickelt werden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt die Auswahl, Gewinnung und Charakterisierung von Mutanten des Proteins Cu,Zn-Superoxiddismutase zur elektrochemischen Quantifizierung von Superoxidradikalen. Monomere Mutanten des humanen dimeren Enzyms wurden entworfen, die durch Austausch von Aminosäuren ein oder zwei zusätzliche Cysteinreste besaßen, mit welchem sie direkt auf der Goldelektrodenoberfläche chemisorbieren sollten. 6 derartige Mutanten konnten in ausreichender Menge und Reinheit in aktiver Form gewonnen werden. Die Bindung der Superoxiddismutase-Mutanten an Goldoberflächen konnte durch Oberflächen-plasmonresonanz und Impedanzspektroskopie nachgewiesen werden. Alle Mutanten wiesen einen quasi-reversiblen Elektronentransfer zwischen SOD und Elektrode auf. Durch Untersuchung von kupferfreien SOD-Mutanten sowie des Wildtyps konnte nachgewiesen werden, das die Mutanten über die eingefügten Cysteinreste auf der Elektrode chemisorptiv gebunden wurden und der Elektronentransfer zwischen der Elektrode und dem Kupfer im aktiven Zentrum der SOD erfolgte. Die Superoxiddismutase katalysiert die Zersetzung von Superoxidmolekülen durch Oxidation und durch Reduktion der Radikale. Somit sind beide Teilreaktionen von analytischem Interesse. Zyklovoltammetrisch konnte sowohl die Oxidation als auch die Reduktion des Radikals durch die immobilisierten Superoxiddismutase-Mutanten nachgewiesen werden. In amperometrischen Messanordnungen konnten beide Teilreaktionen zur analytischen Quantifizierung von Superoxidradikalen genutzt werden. Im positiven Potentialfenster wurde die Empfindlichkeit um einen Faktor von etwa 10 gegenüber der Cytochrom c–Monoschichtelektrode verbessert.
Characterization of the Clp protease complex and identification of putative substrates in N. tabacum
(2016)
For more than two centuries, plant ecologists have aimed to understand how environmental gradients and biotic interactions shape the distribution and co-occurrence of plant species. In recent years, functional trait–based approaches have been increasingly used to predict patterns of species co-occurrence and species distributions along environmental gradients (trait–environment relationships). Functional traits are measurable properties at the individual level that correlate well with important processes. Thus, they allow us to identify general patterns by synthesizing studies across specific taxonomic compositions, thereby fostering our understanding of the underlying processes of species assembly. However, the importance of specific processes have been shown to be highly dependent on the spatial scale under consideration. In particular, it remains uncertain which mechanisms drive species assembly and allow for plant species coexistence at smaller, more local spatial scales. Furthermore, there is still no consensus on how particular environmental gradients affect the trait composition of plant communities. For example, increasing drought because of climate change is predicted to be a main threat to plant diversity, although it remains unclear which traits of species respond to increasing aridity. Similarly, there is conflicting evidence of how soil fertilization affects the traits related to establishment ability (e.g., seed mass). In this cumulative dissertation, I present three empirical trait-based studies that investigate specific research questions in order to improve our understanding of species distributions along environmental gradients.
In the first case study, I analyze how annual species assemble at the local scale and how environmental heterogeneity affects different facets of biodiversity—i.e. taxonomic, functional, and phylogenetic diversity—at different spatial scales. The study was conducted in a semi-arid environment at the transition zone between desert and Mediterranean ecosystems that features a sharp precipitation gradient (Israel). Different null model analyses revealed strong support for environmentally driven species assembly at the local scale, since species with similar traits tended to co-occur and shared high abundances within microsites (trait convergence). A phylogenetic approach, which assumes that closely related species are functionally more similar to each other than distantly related ones, partly supported these results. However, I observed that species abundances within microsites were, surprisingly, more evenly distributed across the phylogenetic tree than expected (phylogenetic overdispersion). Furthermore, I showed that environmental heterogeneity has a positive effect on diversity, which was higher on functional than on taxonomic diversity and increased with spatial scale. The results of this case study indicate that environmental heterogeneity may act as a stabilizing factor to maintain species diversity at local scales, since it influenced species distribution according to their traits and positively influenced diversity. All results were constant along the precipitation gradient.
In the second case study (same study system as case study one), I explore the trait responses of two Mediterranean annuals (Geropogon hybridus and Crupina crupinastrum) along a precipitation gradient that is comparable to the maximum changes in precipitation predicted to occur by the end of this century (i.e., −30%). The heterocarpic G. hybridus showed strong trends in seed traits, suggesting that dispersal ability increased with aridity. By contrast, the homocarpic C. crupinastrum showed only a decrease in plant height as aridity increased, while leaf traits of both species showed no consistent pattern along the precipitation gradient. Furthermore, variance decomposition of traits revealed that most of the trait variation observed in the study system was actually found within populations. I conclude that trait responses towards aridity are highly species-specific and that the amount of precipitation is not the most striking environmental factor at this particular scale.
In the third case study, I assess how soil fertilization mediates—directly by increased nutrient addition and indirectly by increased competition—the effect of seed mass on establishment ability. For this experiment, I used 22 species differing in seed mass from dry grasslands in northeastern Germany and analyzed the interacting effects of seed mass with nutrient availability and competition on four key components of seedling establishment: seedling emergence, time of seedling emergence, seedling survival, and seedling growth. (Time of) seedling emergence was not affected by seed mass. However, I observed that the positive effect of seed mass on seedling survival is lowered under conditions of high nutrient availability, whereas the positive effect of seed mass on seedling growth was only reduced by competition. Based on these findings, I developed a conceptual model of how seed mass should change along a soil fertility gradient in order to reconcile conflicting findings from the literature. In this model, seed mass shows a U-shaped pattern along the soil fertility gradient as a result of changing nutrient availability and competition.
Overall, the three case studies highlight the role of environmental factors on species distribution and co-occurrence. Moreover, the findings of this thesis indicate that spatial heterogeneity at local scales may act as a stabilizing factor that allows species with different traits to coexist. In the concluding discussion, I critically debate intraspecific trait variability in plant community ecology, the use of phylogenetic relationships and easily measured key functional traits as a proxy for species’ niches. Finally, I offer my outlook for the future of functional plant community research.
Sulphur, a macronutrient essential for plant growth, is among the most versatile elements in living organisms. Unfortunately, little is known about regulation of sulphate uptake and assimilation by plants. Identification of sulphate signalling processes will allow to control sulphate acquisition and assimilation and may prove useful in the future to improve sulphur-use efficiency in agriculture. Many of genes involved in sulphate metabolism are regulated on transcriptional level by products of other genes called transcription factors (TF). Several published experiments revealed TF genes that respond to sulphate deprivation, but none of these have been so far been characterized functionally. Thus, we aimed at identifying and characterising transcription factors that control sulphate metabolism in the model plant Arabidopsis thaliana. To achieve that goal we postulated that factors regulating Arabidopsis responses to inorganic sulphate deficiency change their transcriptional levels under sulphur-limited conditions. By comparing TF transcript profiles from plants grown on different sulphate regimes, we identified TF genes that may specifically induce or repress changes in expression of genes that allow plants to adapt to changes in sulphate availability. Candidate genes obtained from this screening were tested by reverse genetics approaches. Transgenic plants constitutively overproducing selected TF genes and mutant plants, lacking functional selected TF genes (knock out), were used. By comparing metabolite and transcript profiles from transgenic and wild type plants we aimed at confirming the role of selected AP2 TF candidate genes in plant adaptation to sulphur unavailability. After preliminary characterisation of WRKY24 and MYB93 TF genes, we postulate that these factors are involved in a complex multifactorial regulatory network, in which WRKY24 and MYB93 would act as superior factors regulating other transcription factors directly involved in the regulation of S-metabolism genes. Results obtained for plants overproducing TOE1 and TOE2 TF genes suggests that these factors may be involved in a mechanism, which is promoting synthesis of an essential amino acid, methionine, over synthesis of another amino acid, cysteine. Thus, TOE1 and TOE2 genes might be a part of transcriptional regulation of methionine synthesis. Approaches creating genetically manipulated plants may produce plant phenotypes of immediate biotechnological interest, such as plants with increased sulphate or sulphate-containing amino acid content, or better adapted to the sulphate unavailability.
Sucrose synthase (Susy) is a key enzyme of sucrose metabolism, catalysing the reversible conversion of sucrose and UDP to UDP-glucose and fructose. Therefore, its activity, localization and function have been studied in various plant species. It has been shown that Susy can play a role in supplying energy in companion cells for phloem loading (Fu and Park, 1995), provides substrates for starch synthesis (Zrenner et al., 1995), and supplies UDP-glucose for cell wall synthesis (Haigler et al., 2001). Analysis of the Arabidopsis genome identifies six Susy isoforms. The expression of these isoforms was investigated using promoter-reporter gene constructs (GUS) and real time RT-PCR. Although these isoforms are closely related at the protein level they have radically different spatial and temporal patterns of expression in the plant with no two isoforms showing the same distribution. More than one isoform is expressed in all organs examined. Some of them have high but specific expression in particular organs or developmental stages whilst others are constantly expressed throughout the whole plant and across various stages of development. The in planta function of the six Susy isoforms were explored through analysis of T-DNA insertion mutants and RNAi lines. Plants without the expression of individual isoforms show no differences in growth and development, and are not significantly different from wild type plants in soluble sugars, starch and cellulose contents under all growth conditions investigated. Analysis of T-DNA insertion mutant lacking Sus3 isoform that was exclusively expressed in stomata cells only had a minor influence on guard cell osmoregulation and/or bioenergetics. Although none of the sucrose synthases appear to be essential for normal growth under our standard growth conditions, they may be necessary for growth under stress conditions. Different isoforms of sucrose synthase respond differently to various abiotic stresses. It has been shown that oxygen deprivation up regulates Sus1 and Sus4 and increases total Susy activity. However, the analysis of the plants with reduced expression of both Sus1 and Sus4 revealed no obvious effects on plant performance under oxygen deprivation. Low temperature up regulates Sus1 expression but the loss of this isoform has no effect on the freezing tolerance of non acclimated and cold acclimated plants. These data provide a comprehensive overview of the expression of this gene family which supports some of the previously reported roles for Susy and indicates the involvement of specific isoforms in metabolism and/or signalling.
From its first use in the field of biochemistry, instrumental analysis offered a variety of invaluable tools for the comprehensive description of biological systems. Multi-selective methods that aim to cover as many endogenous compounds as possible in biological samples use different analytical platforms and include methods like gene expression profile and metabolite profile analysis. The enormous amount of data generated in application of profiling methods needs to be evaluated in a manner appropriate to the question under investigation. The new field of system biology rises to the challenge to develop strategies for collecting, processing, interpreting, and archiving this vast amount of data; to make those data available in form of databases, tools, models, and networks to the scientific community. On the background of this development a multi-selective method for the determination of phytohormones was developed and optimised, complementing the profile analyses which are already in use (Chapter I). The general feasibility of a simultaneous analysis of plant metabolites and phytohormones in one sample set-up was tested by studies on the analytical robustness of the metabolite profiling protocol. The recovery of plant metabolites proved to be satisfactory robust against variations in the extraction protocol by using common extraction procedures for phytohormones; a joint extraction of metabolites and hormones from plant tissue seems practicable (Chapter II). Quantification of compounds within the context of profiling methods requires particular scrutiny (Chapter II). In Chapter III, the potential of stable-isotope in vivo labelling as normalisation strategy for profiling data acquired with mass spectrometry is discussed. First promising results were obtained for a reproducible quantification by stable-isotope in vivo labelling, which was applied in metabolomic studies. In-parallel application of metabolite and phytohormone analysis to seedlings of the model plant Arabidopsis thaliana exposed to sulfate limitation was used to investigate the relationship between the endogenous concentration of signal elements and the ‘metabolic phenotype’ of a plant. An automated evaluation strategy was developed to process data of compounds with diverse physiological nature, such as signal elements, genes and metabolites – all which act in vivo in a conditional, time-resolved manner (Chapter IV). Final data analysis focussed on conditionality of signal-metabolome interactions.