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In den letzten 20 Jahren hat sich der Maiszünsler (Ostrinia nubilalis HÜBNER), aus der Schmetterlingsfamilie der Pyralidae oder Zünsler, zum bedeutendsten tierischen Schädling des Maises (Zea mays) entwickelt. Eine Möglichkeit den Befall des Maiszünslers abzuwenden, bietet der Anbau von Bacillus thuringiensis-Mais (Bt-Mais). Mit Hilfe der Gentechnik wurden Gene des Bakteriums Bacillus thuringiensis übertragen, die einen für Fraßinsekten giftigen Wirkstoff bilden, wodurch die Pflanzen während der kompletten Vegetation vor den Larven des Maiszünslers geschützt sind. Ziel des vorliegenden Projektes war es, in einer 3-jährigen Studie die Auswirkungen des großflächigen Anbaus von Bt-Mais auf die ökologische Situation und den Handlungsrahmen des integrierten Pflanzenschutzes komplex zu untersuchen. Dazu wurden in Betrieben im Oderbruch, das als permanentes Befallsgebiet des Maiszünslers gilt, in den Jahren 2002 bis 2004 jährlich zwei Felder mit jeweils einer Bt-Sorte und einer konventionellen Sorte angelegt. Zusätzlich wurden biologische und chemische Maiszünsler-Bekämpfungsvarianten geprüft. Durch verschiedene Methoden wie Bonituren, Ganzpflanzenernten, Bodenfallenfänge und Beobachtungen des Wahlverhaltens von (Flug-)insekten konnten Aussagen zum Vorkommen von Insekten und Spinnentieren getroffen werden, wobei hierfür Daten aus Untersuchungen der Jahre 2000 und 2001 im Oderbruch ergänzend herangezogen werden konnten. Durch Ertragsmessungen, Energie- und Qualitätsermittlungen, sowie Fusarium- und Mykotoxinanalysen konnte der Anbau von Bt-Mais als neue Alternative zur Bekämpfung des Maiszünslers bewertet werden. Bezüglich des Auftretens von Insekten und Spinnentieren wurden im Mittel der fünfjährigen Datenerhebung beim Vergleich der Bt-Sorte zur konventionellen Sorte, mit Ausnahme der fast 100 %igen Bekämpfung des Maiszünslers, keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Hierfür wurde ein besonderes Augenmerk auf Thripse, Wanzen, Blattläuse und deren Fraßfeinde, sowie mittels Bodenfallenfängen auf Laufkäfer und Spinnen gerichtet. Die erwarteten ökonomischen Vorteile wie etwa Ertragsplus oder bessere Nährstoff- und Energiegehalte durch geringeren Schaden beim Anbau von Bt-Mais als Silomais blieben in den Untersuchungsjahren aus. Allerdings zeigten Fusarium- und Mykotoxinanalysen eine geringere Belastung des Bt-Maises, was möglicherweise auf den geringeren Schaden zurückzuführen ist, da beschädigte Pflanzen für Fusarium und Mykotoxine anfälliger sind. Desweiteren konnten erste methodische Ansätze für ein auf EU-Ebene gefordertes, den Anbau von Bt-Mais begleitendes Monitoring, erarbeitet werden. So konnten Vorschläge für geeignete Methoden, deren Umfang sowie des Zeitpunktes der Durchführungen gemacht werden.
In times of ongoing biodiversity loss, understanding how communities are structured and what mechanisms and local adaptations underlie the patterns we observe in nature is crucial for predicting how future ecological and anthropogenic changes might affect local and regional biodiversity. Aquatic zooplankton are a group of primary consumers that represent a critical link in the food chain, providing nutrients for the entire food web. Thus, understanding the adaptability and structure of zooplankton communities is essential. In this work, the genetic basis for the different temperature adaptations of two seasonally shifted (i.e., temperature-dependent) occurring freshwater rotifers of a formerly cryptic species complex (Brachionus calyciflorus) was investigated to understand the overall genetic diversity and evolutionary scenario for putative adaptations to different temperature regimes. Furthermore, this work aimed to clarify to what extent the different temperature adaptations may represent a niche partitioning process thus enabling co-existence. The findings were then embedded in a metacommunity context to understand how zooplankton communities assemble in a kettle hole metacommunity located in the northeastern German "Uckermark" and which underlying processes contribute to the biodiversity patterns we observe. Using a combined approach of newly generated mitochondrial resources (genomes/cds) and the analysis of a candidate gene (Heat Shock Protein 40kDa) for temperature adaptation, I showed that the global representatives of B. calyciflorus s.s.. are genetically more similar than B. fernandoi (average pairwise nucleotide diversity: 0.079 intraspecific vs. 0.257 interspecific) indicating that both species carry different standing genetic variation. In addition to differential expression in the thermotolerant B. calyciflorus s.s. and thermosensitive B. fernandoi, the HSP 40kDa also showed structural variation with eleven fixed and six positively selected sites, some of which are located in functional areas of the protein. The estimated divergence time of ~ 25-29 Myr combined with the fixed sites and a prevalence of ancestral amino acids in B. calyciflorus s.s. indicate that B. calyciflorus s.s. remained in the ancestral niche, while B. fernandoi partitioned into a new niche. The comparison of mitochondrial and nuclear markers (HPS 40kDa, ITS1, COI) revealed a hybridisation event between the two species. However, as hybridisation between the two species is rare, it can be concluded that the temporally isolated niches (i.e., seasonal-shifted occurrence) they inhabit based on their different temperature preferences most likely represent a pre-zygotic isolation mechanism that allows sympatric occurrence while maintaining species boundaries. To determine the processes underlying zooplankton community assembly, a zooplankton metacommunity comprising 24 kettle holes was sampled over a two-year period. Active (i.e., water samples) and dormant communities (i.e., dormant eggs hatched from sediment) were identified using a two-fragment DNA metabarcoding approach (COI and 18S). Species richness and diversity as well as community composition were analysed considering spatial, temporal and environmental parameters. The analysis revealed that environmental filtering based on parameters such as pH, size and location of the habitat patch (i.e., kettle hole) and surrounding field crops largely determined zooplankton community composition (explained variance: Bray-Curtis dissimilarities: 10.5%; Jaccard dissimilarities: 12.9%), indicating that adaptation to a particular habitat is a key feature of zooplankton species in this system. While the spatial configuration of the kettle holes played a minor role (explained variance: Bray-Curtis dissimilarities: 2.8% and Jaccard dissimilarities: 5.5%), the individual kettle hole sites had a significant influence on the community composition. This suggests monopolisation/priority effects (i.e., dormant communities) of certain species in individual kettle holes. As environmental filtering is the dominating process structuring zooplankton communities, this system could be significantly influenced by future land-use change, pollution and climate change.
In dieser Arbeit wurden die Möglichkeiten und Grenzen für Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung untersucht. Dazu wurde ein Messaufbau für Zirkulardichroismus-Messungen an zwei Strahlrohren am Berliner Elektronenspeicherring für Synchrotronstrahlung eingesetzt, die für Messungen im Bereich des ultravioletten Lichts geeignet sind. Eigenschaften der Strahlrohre und des Messaufbau wurden in einigen wichtigen Punkten mit kommerziellen Zirkulardichroismus-Spektrometern verglichen. Der Schwerpunkt lag auf der Ausdehnung des zugänglichen Wellenlängenbereichs unterhalb von 180 nm zur Untersuchung des Zirkulardichroismus von Proteinen in diesem Bereich. In diesem Bereich ist es nicht nur die Lichtquelle sondern vor allem die Absorption des Lichts durch Wasser, die den Messbereich bei der Messung biologischer Proben in wässriger Lösung einschränkt. Es wurden Bedingungen gefunden, unter denen der Messbereich auf etwa 160 nm, in einigen Fällen bis auf 130 nm ausgedehnt werden konnte. Dazu musste die Pfadlänge deutlich reduziert werden und verschieden Probenküvetten wurden getestet. Der Einfluss der dabei auftretenden Spannungsdoppelbrechung in den Probenküvetten auf das Messsignal konnte mit einem alternativen Messaufbau deutlich reduziert werden. Systematische Fehler im Messsignal und auftretende Strahlenschäden begrenzen jedoch die Zuverlässigkeit der gemessenen Spektren. Bei Proteinfilmen schränkt die Absorption von Wasser den Messbereich kaum ein. Es wurden jedoch meist deutliche Unterschiede zwischen den Spektren von Proteinfilmen und den Spektren von Proteinen in wässriger Lösung festgestellt. Solange diese Unterschiede nicht minimiert werden können, stellen Proteinfilme keine praktikable Alternative zu Messungen in wässriger Lösung dar.
Im ersten Teil der Arbeit wurden Strategien zur Analyse von Transkripten erarbeitet. Die ersten Versuche zielten darauf ab, in mit Glaskapillaren genommenen Einzelzellproben verschiedener Gewebeschichten RT-PCR durchzuführen, um spezifische Transkripte nachweisen zu können. Dies gelang für eine Reihe von Genen aus verschiedenen Pflanzenspezies. Dabei konnten sowohl Transkripte stark wie auch schwach exprimierter Gene nachgewiesen werden. Für die Erstellung von Gewebe-spezifischen Expressionsprofilen war es notwendig, die in vereinigten Zellproben enthaltene mRNA zunächst zu amplifizieren, um eine ausreichende Menge für Arrayhybridisierungen zu erhalten. Vor der Vermehrung wurde die mRNA revers transkribiert. Es wurden daran anschließend verschiedene Amplifikationsstrategien getestet: Die neben Tailing, Adapterligation und anderen PCR-basierenden Protokollen getestete Arbitrary-PCR hat sich in dieser Arbeit als einfache und einzige Methode herausgestellt, die mit so geringen cDNA-Mengen reproduzierbar arbeitet. Durch Gewebe-spezifische Array-hybridisierungen mit der so amplifizierten RNA konnten schon bekannte Expressionsmuster verschiedener Gene, vornehmlich solcher, die an der Photosynthese beteiligt sind, beobachtet werden. Es wurden aber auch eine ganze Reihe neuer offensichtlich Gewebe-spezifisch exprimierter Gene gefunden. Exemplarisch für die differentiell exprimierten Gene konnte das durch Arrayhybridisierungen gefundene Expressionsmuster der kleinen Untereinheit von Rubisco verifiziert werden. Hierzu wurden Methoden zum Gewebe-spezifischen Northernblot sowie semiquantitativer und Echtzeit-Einzelzell-RT-PCR entwickelt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Methoden zur Analyse von Metaboliten einschließlich anorganischer Ionen verwendet. Es stellte sich heraus, daß die multiparallele Methode der Gaschromatographie-Massenspektrometrie keine geeignete Methode für die Analyse selbst vieler vereinigter Zellinhalte ist. Daher wurde auf Kapillarelektrophorese zurückgegriffen. Eine Methode, die mit sehr kleinen Probenvolumina auskommt, eine hohe Trennung erzielt und zudem extrem geringe Detektionslimits besitzt. Die Analyse von Kohlenhydraten und Anionen erfordert eine weitere Optimierung. Über UV-Detektion konnte die K+-Konzentration in verschiedenen Geweben von A. thaliana bestimmt werden. Sie lag in Epidermis und Mesophyll mit ca. 25 mM unterhalb der für andere Pflanzenspezies (Solanum tuberosum und Hordeum vulgare) publizierten Konzentration. Weiter konnte gezeigt werden, daß zwölf freie Aminosäuren mittels einer auf Kapillarelektrophorese basierenden Methode in vereinigten Zellproben von Cucurbita maxima identifiziert werden konnten. Die Übertragung der Methode auf A. thaliana-Proben muß jedoch weiter optimiert werden, da die Sensitivität selbst bei Laser induzierter Fluoreszenz-Detektion nicht ausreichte. Im dritten und letzten Teil der Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die die Analyse bekannter wie unbekannter Proteine in Gewebe-spezifischen Proben ermöglicht. Hierzu wurde zur Probennahme mittels mechanischer Mikrodissektion eine alternative Methode zur Laser Capture Microdissection verwendet, um aus eingebetteten Gewebeschnitten distinkte Bereiche herauszuschneiden und somit homogenes Gewebe anzureichern. Aus diesem konnten die Proteine extrahiert und über Polyacrylamidgelelektrophorese separariert werden. Banden konnten ausgeschnitten, tryptisch verdaut und massenspektrometrisch die Primärsequenz der Peptidfragmente bestimmt werden. So konnten als Hauptproteine im Mesophyll die große Untereinheit von Rubisco sowie ein Chlorophyll bindendes Protein gefunden werden. Die in dieser Arbeit entwickelten und auf die Modellpflanze Arabidopsis thaliana angewandten Einzelzellanalysetechniken erlauben es in Zukunft, physiologische Prozesse besser sowohl räumlich als auch zeitlich aufzulösen. Dies wird zu einem detaillierteren Verständnis mannigfaltiger Vorgänge wie Zell-Zell-Kommunikation, Signalweiterleitung oder Pflanzen-Pathogen-Interaktionen führen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei humane Varianten des von Wang et al., 1999, erstmals beschriebenen muskelspezifischen Proteins Xin (Huhn und Maus) über Sequenzanalyse, Immunofluoreszenzmikroskopie, Transfektionsstudien und biochemischer Analyse näher charakterisiert. Die Proteine wurden mit human Xin related proteins 1 und 2 – hXirp1 und 2 –bezeichnet. Die Xin-Proteine enthielten bisher unbekannte, sowie spezifische, repetitive Motive, die aus jeweils mindestens 16 Aminosäuren bestanden. Ihre Aminosäuresequenz, mit einer Vielzahl weiterer putativer Motivsequenzen, verwies auf eine potentielle Funktion von hXirp als Adapterprotein in Muskelzellen. Das hier näher untersuchte hXirp1 lokalisierte an den Zell-Matrix-Verbindungen der Muskel-Sehnen-Übergangszone im Skelettmuskel, sowie an den Zell-Zell-Verbindungen der Glanzstreifen im Herzmuskel. Während der Muskelentwicklung zeigte hXirp1 eine sehr frühe Expression, zusammen mit einer prägnanten Lokalisation an den Prämyofibrillen und deren Verankerungsstrukturen, die auf eine Funktion des Proteins in der Myofibrillogenese deuten. Ektopische Expressionen von hXirp1 in einer Vielzahl von Nichtmuskel-Kulturzellen zeigten wiederum eine Lokalisation des Proteins an den Zell-Matrix-Kontakten dieser Zellen. Am Beispiel von hXirp1 und 2 wurde stellvertretend für die Familie der Xin-Proteine gezeigt, daß es sich bei den repetitiven Motiven um neuartige, F-Aktin bindende Sequenzmotive handelte. Die Xin-Proteine können somit als muskelspezifische, aktinbindende, potentielle Adapterproteine bezeichnet werden, denen eine strukturelle und funktionelle Beteiligung an der Verankerung der Myofibrillen im adulten Muskel, wie auch während der Myofibrillogenese zukommt.
In der vorliegenden Arbeit habe ich wichtige Teilmechanismen der Erregungs-Sekretionskopplung in der Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana (L.) untersucht. Die Speicheldrüse ist von dopaminergen und serotonergen Fasern innerviert (Baumann et al., 2002). Beide Transmitter stimulieren eine unterschiedliche Reaktion der Drüse: Dopamin (DA) stimuliert die P-Zellen der Acini und die Ausführgangzellen, während Serotonin (5-HT) die P- und C-Zellen der Acini stimuliert, nicht jedoch die Ausführgangzellen. Der Endspeichel ist nach einer DA-Stimulierung proteinfrei. Dagegen enthält er nach einer 5-HT-Stimulierung Proteine, die von den C-Zellen sezerniert werden (Just & Walz, 1996). Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich mittels Kapillarelektrophoretischer Analyse (CE-Analyse) die Elektrolytkonzentrationen im Endspeichel untersucht sowie die Raten der Flüssigkeitssekretion gemessen. Damit wollte ich klären, welche Transporter an der Sekretion des Primärspeichels und an dessen Modifikation beteiligt sind. Ausserdem wollte ich die Rolle der transportaktiven Epithelzellen der Ausführgänge für die Modifikation des Primärspeichels untersuchen. Dafür habe ich einen Vergleich der Elektrolytkonzentrationen im DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichel durchgeführt. Der Elektrolytgehalt des DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichels unterscheidet sich nicht signifikant voneinander. Er ist nach beiden Stimulierungen hypoosmotisch zum verwendeten Ringer. Die Ausführgangzellen werden durch DA stimuliert und modifizieren den Primärspeichel durch eine netto-Ionenreabsorption. Meine Versuche zeigen jedoch, dass auch die während einer 5-HT-Stimulierung der Drüse unstimulierten Ausführgangzellen den Primärspeichel modifizieren. In einer nachfolgenden Versuchsreihe habe ich den Einfluss von Ouabain, einem Hemmstoff der Na+-K+-ATPase, und Bumetanid, einem Hemmstoff des NKCC, auf die Raten der Flüssigkeitssekretion sowie den Elektrolytgehalt des Endspeichels untersucht. Ich habe gefunden, dass die Aktivität der Na+-K+-ATPase wichtig für die Modifikation des DA-stimulierten Primärspeichels ist. Im Gegensatz dazu ist sie für die Modifikation des 5-HT-stimulierten Primärspeichels nicht von Bedeutung. Bezüglich der Flüssigkeitssekretion habe ich keinen Einfluss der Na+-K+-ATPase-Aktivität auf die DA-stimulierten Sekretionsraten gefunden, dagegen ist die 5-HT-stimulierte Sekretionsrate in Anwesenheit von Ouabain gesteigert. Die Aktivität des NKCC ist für beide sekretorische Prozesse, die Ionen- und die Flüssigkeitssekretion, wichtig. Eine Hemmung des NKCC bewirkt eine signifikante Verringerung der Raten der Flüssigkeitssekretion nach DA- und 5-HT-Stimulierung sowie in beiden Fällen einen signifikanten Abfall der Ionenkonzentrationen im Endspeichel. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich versucht, Änderungen der intrazellulären Ionenkonzentrationen in den Acinuszellen während einer DA- oder 5-HT-Stimulierung zu messen. Diese Experimente sollten mit der Methode des "ratiometric imaging" durchgeführt werden. Messungen mit dem Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 zeigten keinen globalen Anstieg in der intrazellulären Ca2+-Konzentration der P-Zellen. Aufgrund von Problemen mit einer schlechten Beladung der Zellen, einer starken und sich während der Stimulierung ändernden Autofluoreszenz der Zellen sowie Änderungen im Zellvolumen wurden keine Messungen mit Na+- und K+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt. Im dritten Teil dieser Arbeit habe ich die intrazellulären Signalwege untersucht, die zwischen einer 5-HT-Stimulierung der Drüse und der Proteinsekretion vermitteln. Dazu wurde der Proteingehalt im Endspeichel biochemisch mittels eines modifizierten Bradford Assay gemessen. Eine erstellte Dosis-Wirkungskurve zeigt, dass die Rate der Proteinsekretion von der zur Stimulierung verwendeten 5-HT-Konzentration abhängt. In einer Serie von Experimenten habe ich die intrazellulären Konzentrationen von Ca2+, cAMP und / oder cGMP erhöht und anschließend den Proteingehalt im Endspeichel gemessen. Ein Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert nur eine geringe Rate der Proteinsekretion. Dagegen kann die Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration eine stärkere Proteinsekretion aktivieren, die sich nicht signifikant von der nach 5-HT-Stimulierung unterscheidet. Die cAMP-stimulierte Proteinsekretion kann durch gleichzeitige Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration weiter gesteigert werden. Dagegen aktivierte eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration die Proteinsekretion nicht. Aufgrund dieser Ergebnisse postuliere ich die Existenz eines die Adenylatcyclase aktivierenden 5-HT-Rezeptors in der Basolateralmembran der C-Zellen.
Dispersal behavior plays an important role for the geographical distribution and population structure of any given species. Individual’s fitness, reproductive and competitive ability, and dispersal behavior can be determined by the age of the individual. Age-dependent as well as density-dependent dispersal patterns are common in many bird species. In this thesis, I first present age-dependent breeding ability and natal site fidelity in white storks (Ciconia ciconia); migratory birds breeding in large parts of Europe. I predicted that both the proportion of breeding birds and natal site fidelity increase with the age. After the seventies of the last century, following a steep population decline, a recovery of the white stork population has been observed in many regions in Europe. Increasing population density in the white stork population in Eastern Germany especially after 1983 allowed examining density- as well as age-dependent breeding dispersal patterns. Therefore second, I present whether: young birds show more often and longer breeding dispersal than old birds, and frequency of dispersal events increase with the population density increase, especially in the young storks. Third, I present age- and density-dependent dispersal direction preferences in the give population. I asked whether and how the major spring migration direction interacts with dispersal directions of white storks: in different age, and under different population densities. The proportion of breeding individuals increased in the first 22 years of life and then decreased suggesting, the senescent decay in aging storks. Young storks were more faithful to their natal sites than old storks probably due to their innate migratory direction and distance. Young storks dispersed more frequently than old storks in general, but not for longer distance. Proportion of dispersing individuals increased significantly with increasing population densities indicating, density- dependent dispersal behavior in white storks. Moreover, the finding of a significant interaction effects between the age of dispersing birds and year (1980–2006) suggesting, older birds dispersed more from their previous nest sites over time due to increased competition. Both young and old storks dispersed along their spring migration direction; however, directional preferences were different in young storks and old storks. Young storks tended to settle down before reaching their previous nest sites (leading to the south-eastward dispersal) while old birds tended to keep migrating along the migration direction after reaching their previous nest sites (leading to the north-westward dispersal). Cues triggering dispersal events may be age-dependent. Changes in the dispersal direction over time were observed. Dispersal direction became obscured during the second half of the observation period (1993–2006). Increase in competition may affect dispersal behavior in storks. I discuss the potential role of: age for the observed age-dependent dispersal behavior, and competition for the density dependent dispersal behavior. This Ph.D. thesis contributes significantly to the understanding of population structure and geographical distribution of white storks. Moreover, presented age- and density (competition)-dependent dispersal behavior helps understanding underpinning mechanisms of dispersal behavior in bird species.
Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriolär aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und mögliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es während der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am stärksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen während der Mitose wird für Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten äußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 führte zur Ausbildung von überzähligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erhöhten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochauflösende Expansion Microscopy für das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den äußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in räumlicher Nähe zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als möglicher Interaktionspartner identifiziert werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und ermöglichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verständnis der Topologie des Centrosoms.
Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Oktober 2002 bis November 2005 an dem Institut für Biochemie und Biologie der Universität Potsdam in Kooperation mit dem Institut für Chemie des GKSS Forschungszentrums in Teltow unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. B. Micheel und Herrn Prof. Dr. Th. Groth angefertigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Wechselwirkungen von Immunzellen mit verschiedenen Kultursubstraten untersucht. Dafür wurden drei verschiedene Hybridomzelllinien eingesetzt. Eine Hybridomzelllinie (K2) ist im Laufe dieser Arbeit hergestellt und etabliert worden. Der Einsatz von synthetischen und proteinbeschichteten Kulturoberflächen führte bei Hybridomzellen zu einer deutlich gesteigerten Antikörpersynthese im Vergleich zu herkömmlichen Zellkulturmaterialien. Obwohl diese Zellen in der Regel als Suspensionszellen kultiviert werden, führten die eingesetzten Polymermembranen (PAN, NVP) zu einer verbesserten Antikörpersynthese (um 30%) gegenüber Polystyrol als Referenz. Es konnte gezeigt werden, dass es einen Zusammenhang zwischen der Produktivität und dem Adh asionsverhalten der Hybridomzellen gibt. Um den Einfluss von Proteinen der extrazellulären Matrix auf Zellwachstum und Antikörpersynthese von Hybridomzellen zu untersuchen, wurden proteinbeschichtete Polystyrol-Oberflächen eingesetzt. Für die Modifikationen wurden Fibronektin, Kollagen I, Laminin und BSA ausgewählt. Die Modifikation der Polystyrol-Oberfläche mit geringen Mengen Fibronektin (0,2-0,4 µg/ml) führte zu einer beträchtlichen Steigerung der Antikörpersynthese um 70-120%. Für Kollagen I- und BSA-Beschichtungen konnten Steigerungen von 40% beobachtet werden. Modifikationen der Polystyrol-Oberfläche mit Laminin zeigten nur marginale Effekte. Durch weitere Versuche wurde bestätigt, dass die Adhäsion der Zellen an Kollagen I- und Laminin-beschichteten Oberflächen verringert ist. Die alpha2-Kette des alpha2beta1-Integrins konnte auf der Zelloberfläche nicht nachgewiesen werden. Durch ihr Fehlen wird wahrscheinlich die Bindungsfähigkeit der Zellen an Kollagen I und Laminin beeinflusst. Durch die Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass Hybridomzellen nicht nur Suspensionszellen sind und das Kultursubstrate das Zellwachstum und die Produktivität dieser Zellen stark beeinflussen können. Der Einsatz von synthetischen und proteinbeschichteten Kultursubstraten zur Steigerung der Antikörpersynthese kann damit für die industrielle Anwendung von großer Relevanz sein. Für die Modellierung einer Lymphknotenmatrix wurden Fibronektin, Kollagen I, Heparansulfat und N-Acetylglucosamin-mannose in verschiedenen Kombinationen an Glasoberflächen adsorbiert und für Versuche zur In-vitro-Immunisierung eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Modifikation der Oberflächen die Aktivierung und Interaktion von dendritischen Zellen, T- und B-Lymphozyten begünstigt, was durch den Nachweis spezifischer Interleukine (IL12, IL6) und durch die Synthese spezifischer Antikörper bestätigt wurde. Eine spezifische Immunreaktion gegen das Antigen Ovalbumin konnte mit den eingesetzten Zellpopulationen aus Ovalbumin-T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen nachgewiesen werden. Die In-vitro-Immunantwort wurde dabei am stärksten durch eine Kombination von Kollagen I, Heparansulfat und N-Acetylglucosamin-mannose auf einer Glasoberfläche gefördert. Die Etablierung einer künstlichen Immunreaktion kann eine gesteuerte Aktivierung bzw. Inaktivierung von körpereigenen dendritischen Zellen gegen bestehende Krankheitsmerkmale in vitro ermöglichen. Durch die Versuche wurden Grundlagen für spezifische Immunantworten erarbeitet, die u.a. für die Herstellung von humanen Antikörpern eingesetzt werden können.
Weltweit versuchen Wissenschaftler, künstliche Viren für den Gentransfer zu konstruieren, die nicht reproduktionsfähig sind. Diese sollen die Vorteile der natürlichen Viren besitzen (effizienter Transport von genetischem Material), jedoch keine Antigene auf ihrer Oberfläche tragen, die Immunreaktionen auslösen. Ziel dieses Projektes ist es, einen künstlichen Viruspartikel herzustellen, dessen Basis eine Polyelektrolytenhohlkugel bildet, die mit einer Lipiddoppelschicht bedeckt ist. Um intakte Doppelschichten zu erzeugen, muss die Wechselwirkung zwischen Lipid und Polyelektrolyt (z.B. DNA) verstanden und optimiert werden. Dazu ist es notwendig, die strukturelle Grundlage der Interaktion aufzuklären. Positiv geladene Lipide gehen zwar starke Wechselwirkungen mit der negativ geladenen DNA ein, sie wirken jedoch toxisch auf biologische Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die durch zweiwertige Kationen vermittelte Kopplung von genomischer oder Plasmid-DNA an zwitterionische oder negativ geladene Phospholipide an zwei Modellsystemen untersucht. 1. Modellsystem: Lipidmonoschicht an der Wasser/Luft-Grenzfläche Methoden: Filmwaagentechnik in Kombination mit IR-Spektroskopie (IRRAS), Röntgenreflexion (XR), Röntgendiffraktion (GIXD), Brewsterwinkel-Mikroskopie (BAM), Röntgenfluoreszenz (XRF) und Oberflächenpotentialmessungen Resultate: A) Die Anwesenheit der zweiwertigen Kationen Ba2+, Mg2+, Ca2+ oder Mn2+ in der Subphase hat keinen nachweisbaren Einfluss auf die Struktur der zwitterionischen DMPE- (1,2-Dimyristoyl-phosphatidyl-ethanolamin) Monoschicht. B) In der Subphase gelöste DNA adsorbiert nur in Gegenwart dieser Kationen an der DMPE-Monoschicht. C) Sowohl die Adsorption genomischer Kalbsthymus-DNA als auch der Plasmid-DNA pGL3 bewirkt eine Reduktion des Neigungswinkels der Alkylketten, die auf einen veränderten Platzbedarf der Kopfgruppe zurückzuführen ist. Durch die Umorientierung der Kopfgruppe wird die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Stickstoffatomen der Lipidkopfgruppen und den negativ geladenen DNA-Phosphaten erhöht. D) Die adsorbierte DNA weist eine geordnete Struktur auf, wenn sie durch Barium-, Magnesium-, Calcium- oder Manganionen komplexiert ist. Der Abstand zwischen parallelen DNA-Strängen hängt dabei von der Größe der DNA-Fragmente sowie von der Art des Kations ab. Die größten Abstände ergeben sich mit Bariumionen, gefolgt von Magnesium- und Calciumionen. Die kleinsten DNA-Abstände werden durch Komplexierung mit Manganionen erhalten. Diese Ionenreihenfolge stellt sich sowohl für genomische DNA als auch für Plasmid-DNA ein. E) Die DNA-Abstände werden durch die Kompression des Lipidfilms nicht beeinflusst. Zwischen der Lipidmonoschicht und der adsorbierten DNA besteht demnach nur eine schwache Wechselwirkung. Offensichtlich befindet sich die durch zweiwertige Kationen komplexierte DNA als weitgehend eigenständige Schicht unter dem Lipidfilm. 2. Modellsystem: Lipiddoppelschicht an der fest/flüssig-Grenzfläche Methoden: Neutronenreflexion (NR) und Quarzmikrowaage (QCM-D) Resultate: A) Das zwitterionische Phospholipid DMPC (1,2-Dimyristoyl-phosphatidylcholin) bildet keine Lipiddoppelschicht auf planaren Polyelektrolytmultischichten aus, deren letzte Lage das positiv geladene PAH (Polyallylamin) ist. B) Hingegen bildet DMPC auf dem negativ geladenen PSS (Polystyrolsulfonat) eine Doppelschicht aus, die jedoch Defekte aufweist. C) Eine Adsorption von genomischer Kalbsthymus-DNA auf dieser Lipidschicht findet nur in Gegenwart von Calciumionen statt. Andere zweiwertige Kationen wurden nicht untersucht. D) Das negativ geladene Phospholipid DLPA (1,2-Dilauryl-phosphatidsäure) bildet auf dem positiv geladenen PAH eine Lipiddoppelschicht aus, die Defekte aufweist. E) DNA adsorbiert ebenfalls erst in Anwesenheit von Calciumionen in der Lösung an die DLPA-Schicht. F) Durch die Zugabe von EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) werden die Calciumionen dem DLPA/DNA-Komplex entzogen, wodurch dieser dissoziiert. Demnach ist die calciuminduzierte Bildung dieser Komplexe reversibel.
Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, katalytische Antikörper zur Hydrolyse von Benzylphenylcarbamaten sowie zahlreiche monoklonale Antikörper gegen Haptene herzustellen. Es wurden verschiedene Hapten-Protein-Konjugate unter Verwendung unterschiedlicher Kopplungsmethoden hergestellt und charakterisiert. Zur Generierung der hydrolytisch aktiven Antikörper wurden Inzuchtmäuse mit KLH-Konjugaten von 4 Übergangszustandsanaloga (ÜZA) immunisiert. Mit Hilfe der Hybridomtechnik wurden verschiedene monoklonale Antikörper gegen diese ÜZA gewonnen. Dabei wurden sowohl verschiedene Immunisierungsschemata als auch verschiedene Inzuchtmausstämme und Fusionstechniken verwendet. Insgesamt wurden 32 monoklonale Antikörper gegen die verwendeten ÜZA selektiert. Diese Antikörper wurden in großen Mengen hergestellt und gereinigt. Zum Nachweis der Antikörper-vermittelten Katalyse wurden verschiedene Methoden entwickelt und eingesetzt, darunter immunologische Nachweismethoden mit Anti-Substrat- und Anti-Produkt-Antikörpern und eine photometrische Methode mit Dimethylaminozimtaldehyd. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität gelang mit Hilfe eines Enzymsensors, basierend auf immobilisierter Tyrosinase. Die Antikörper N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysierten die Benzylphenylcarbamate POCc18, POCc19 und Substanz 27. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität dieser Antikörper gelang auch mit Hilfe der HPLC. Der katalytische Antikörper N1-BC1-D11 wurde kinetisch und thermodynamisch untersucht. Es wurde eine Michaelis-Menten-Kinetik mit Km von 210 µM, vmax von 3 mM/min und kcat von 222 min-1 beobachtet. Diese Werte korrelieren mit den Werten der wenigen bekannten Diphenylcarbamat-spaltenden Abzyme. Die Beschleunigungsrate des Antikörpers N1-BC1-D11 betrug 10. Das ÜZA Hei3 hemmte die hydrolytische Aktivität. Dies beweist, dass die Hydrolyse in der Antigenbindungsstelle stattfindet. Weiter wurde zwischen der Antikörperkonzentration und der Umsatzgeschwindigkeit eine lineare Abhängigkeit festgestellt. Die thermodynamische Gleichtgewichtsdissoziationskonstante KD des Abzyms von 2,6 nM zeugt von einer sehr guten Affinität zum ÜZA. Hydrolytisch aktiv waren nur Antikörper, die gegen das Übergangszustandsanalogon Hei3 hergestellt worden waren. Es wird vermutet, dass die Hydrolyse der Benzylphenylcarbamate über einen Additions-Eliminierungsmechanismus unter Ausbildung eines tetraedrischen Übergangszustandes verläuft, dessen analoge Verbindung Hei3 ist. Im Rahmen der Generierung von Nachweisantikörpern zur Detektion der Substratabnahme bei der Hydrolyse wurden Anti-Diuron-Antikörper hergestellt. Einer der Antikörper (B91-CG5) ist spezifisch für das Herbizid Diuron und hat einen IC50-Wert von 0,19 µg/l und eine untere Nachweisgrenze von 0,04 µg/l. Ein anderer Antikörper (B91-KF5) reagiert kreuz mit einer Palette ähnlicher Herbizide. Mit diesen Antikörpern wurde ein empfindlicher Labortest, der ein Monitoring von Diuron auf Grundlage des durch die Trinkwasserverordnung festgeschriebenen Wertes für Pflanzenschutzmittel von 0,1 µg/l erlaubt, aufgebaut. Der Effekt der Anti-Diuron-Antikörper auf die Diuron-inhibierte Photosynthese wurde in vitro und in vivo untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl in isolierten Thylakoiden, als auch in intakten Algen eine Vorinkubation der Anti-Diuron-Antikörper mit Diuron zur Inaktivierung seiner Photosynthese-hemmenden Wirkung führt. Wurde der Elektronentransport in den isolierten Thylakoiden oder in Algen durch Diuron unterbrochen, so führte die Zugabe der Anti-Diuron-Antikörper zur Reaktivierung der Elektronenübertragung.
Escherichia (E.) coli ist als kommensales Bakterium ein wichtiger Bestandteil des Mikrobioms von Säugern, jedoch zudem der häufigste Infektionserreger des Menschen. Entsprechend des Infektionsortes werden intestinal (InPEC) und extraintestinal pathogene E. coli (ExPEC) unterschieden. Die Pathogenese von E. coli-Infektionen ist durch Virulenzfaktoren determiniert, welche von jeweils spezifischen virulenzassoziierten Genen (inVAGs und exVAGs) kodiert werden. Häufig werden exVAGs auch in E. coli-Isolaten aus dem Darm gesunder Wirte nachgewiesen. Dies führte zu der Vermutung, dass exVAGs die intestinale Kolonisierung des Wirtes durch E. coli unterstützen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, das Wissen über den Einfluss von exVAGs auf die Besiedlung und damit die Adhäsion von E. coli an Epithelzellen des Darmtraktes zu erweitern. Die Durchführung einer solch umfassenden E. coli-Populationsstudie erforderte die Etablierung neuer Screeningmethoden. Für die genotypische Charakterisierung wurden mikropartikelbasierte Multiplex-PCR-Assays zum Nachweis von 44 VAGs und der Phylogenie etabliert. Für die phänotypische Charakterisierung wurden Adhäsions- und Zytotoxizitätsassays etabliert. Die Screeningmethoden basieren auf der VideoScan-Technologie, einem automatisierten bildbasierten Multifluoreszenzdetektionssystem. Es wurden 398 E. coli-Isolate aus 13 Wildsäugerarten und 5 Wildvogelarten sowie aus gesunden und harnwegserkrankten Menschen und Hausschweinen charakterisiert. Die Adhäsionsassays hatten zum Ziel, sowohl die Adhäsionsraten als auch die Adhäsionsmuster der 317 nicht hämolytischen Isolate auf 5 Epithelzelllinien zu bestimmen. Die Zytotoxizität der 81 hämolytischen Isolate wurde in Abhängigkeit der Inkubationszeit auf 4 Epithelzelllinien geprüft. In den E. coli-Isolaten wurde eine Reihe von VAGs nachgewiesen. Potentielle InPEC, insbesondere shigatoxinproduzierende und enteropathogene E. coli wurden aus Menschen, Hausschweinen und Wildtieren, vor allem aus Rehen und Feldhasen isoliert. exVAGs wurden mit stark variierender Prävalenz in Isolaten aus allen Arten detektiert. Die größte Anzahl und das breiteste Spektrum an exVAGs wurde in Isolaten aus Urin harnwegserkrankter Menschen, gefolgt von Isolaten aus Dachsen und Rehen nachgewiesen. In Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 wurden mehr exVAGs detektiert als in den Isolaten der phylogenetischen Gruppen A, B1 und D. Die Ergebnisse der Adhäsionsassays zeigten, dass die meisten Isolate zelllinien-, gewebe- oder wirtsspezifisch adhärierten. Ein Drittel der Isolate adhärierte an keiner Zelllinie und nur zwei Isolate adhärierten stark an allen Zelllinien. Grundsätzlich adhärierten mehr Isolate an humanen sowie an intestinalen Zelllinien. Besonders Isolate aus Eichhörnchen und Amseln sowie aus Urin harnwegserkrankter Menschen und Hausschweine waren in der Lage, stark zu adhärieren. Hierbei bildeten die Isolate als Adhäsionsmuster diffuse Adhäsion, Mikrokolonien, Ketten und Agglomerationen. Mittels statistischer Analysen wurden Assoziationen zwischen exVAGs und einer hohen Adhäsionsrate ersichtlich. So war beispielsweise das Vorkommen von afa/dra mit einer höheren Adhäsionsrate auf Caco-2- und 5637-Zellen und von sfa/foc auf IPEC-J2-Zellen assoziiert. Die Ergebnisse der Zytotoxizitätsassays zeigten eine sehr starke und zeitabhängige Zerstörung der Monolayer aller Epithelzelllinien durch die α-Hämolysin-positiven Isolate. Auffallend war die hohe Toxizität hämolytischer Isolate aus Wildtieren gegenüber den humanen Zelllinien. Mit den innerhalb dieser Arbeit entwickelten Screeningmethoden war es möglich, große Mengen an Bakterien zu charakterisieren. Es konnte ein Überblick über die Verbreitung von VAGs in E. coli aus unterschiedlichen Wirten gewonnen werden. Besonders Wildtiere wurden sowohl durch den Nachweis von VAGs in den entsprechenden Isolaten, verbunden mit deren Adhäsionsfähigkeit und ausgeprägter Zytotoxizität als Reservoire pathogener E. coli identifiziert. Ebenso wurde eine zelllinienspezifische Adhäsion von Isolaten mit bestimmten exVAGs deutlich. Damit konnte der mögliche Einfluss von exVAGs auf die intestinale Kolonisierung bestätigt werden. In weiterführenden Arbeiten sind jedoch Expressions- und Funktionsanalysen der entsprechenden Proteine unerlässlich. Es wird anhand der Mikrokoloniebildung durch kommensale E. coli vermutet, dass Adhäsionsmuster und demzufolge Kolonisierungsstrategien, die bisher pathogenen E. coli zugeschrieben wurden, eher als generelle Kolonisierungsstrategien zu betrachten sind. Das E. coli-α-Hämolysin wirkt im Allgemeinen zytotoxisch auf Epithelzellen. Ein in der Fachliteratur diskutierter adhäsionsunterstützender Mechanismus dieses Toxins ist demnach fragwürdig. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Screeningmethoden umfassende Analysen einer großen Anzahl an E. coli-Isolaten ermöglichen.
Vergleich von rekombinanten Vaccinia- und DNA-Vektoren zur Tumorimmuntherapie im C57BL/6-Mausmodell
(2002)
In der vorliegenden Arbeit wurden Tumorimpfstoffe auf der Basis des Plasmid-Vektors pCI, modified vaccinia virus Ankara (MVA) und MVA-infizierten dendritischen Zellen entwickelt und durch Sequenzierung, Western blotting und durchflußzytometrische Analyse überprüft. Die in vivo Wirksamkeit der Vakzinen wurde in verschiedenen Tumormodellen in C57BL/6 Mäusen verglichen. Die auf dem eukaryotischen Expressionsvektor pCI basierende DNA-Vakzinierung induzierte einen sehr wirksamen, antigenspezifischen und langfristigen Schutz vor Muzin, CEA oder beta-Galactosidase exprimierenden Tumoren. Eine MVA-Vakzinierung bietet in den in dieser Arbeit durchgeführten Tumormodellen keinen signifikanten Schutz vor Muzin oder beta-Galactosidase exprimierenden Tumoren. Sowohl humane, als auch murine in vitro generierte dendritische Zellen lassen sich mit MVA – im Vergleich zu anderen viralen Vektoren – sehr gut infizieren. Die Expressionsrate der eingefügten Gene ist aber gering im Vergleich zur Expression in permissiven Wirtszellen des Virus (embryonale Hühnerfibroblasten). Es konnte gezeigt werden, daß eine MVA-Infektion dendritischer Zellen ähnliche Auswirkungen auf den Reifezustand humaner und muriner dendritischer Zellen hat, wie eine Infektion mit replikationskompetenten Vakzinia-Stämmen, und außerdem die Hochregulation von CD40 während der terminalen Reifung von murinen dendritischen Zellen inhibiert wird. Die während der langfristigen in vitro Kultur auf CEF-Zellen entstandenen Deletionen im MVA Genom führten zu einer starken Attenuierung und dem Verlust einiger Gene, die immunmodulatorische Proteine kodieren, jedoch nicht zu einer Verminderung des zytopathischen Effekts in dendritischen Zellen. Die geringe Expressionsrate und die beobachtete Inhibition der Expression kostimulatorischer Moleküle auf dendritischen Zellen kann für eine wenig effektive Induktion einer Immunantwort in MVA vakzinierten Tieren durch cross priming oder die direkte Infektion antigenpräsentierender Zellen verantwortlich sein. Durch die Modifikation einer Methode zur intrazellulären IFN-gamma Färbung konnten in vakzinierten Mäusen tumorantigenspezifische CTL sensitiv und quantitativ detektiert werden. Die so bestimmte CTL-Frequenz, nicht jedoch die humorale Antwort, korrelierte mit der in vivo Wirksamkeit der verschiedenen Vakzinen: DNA vakzinierte Tiere entwickeln starke tumorantigenspezifische CTL-Antworten, wohingegen in MVA-vakzinierten Tieren überwiegend gegen virale Epitope gerichtete CD4 und CD8-T-Zellen detektiert wurden. Die Wirksamkeit der pCI-DNA-Vakzine spricht für die Weiterentwicklung in weiteren präklinischen Mausmodellen, beispielsweise unter Verwendung von MUC1 oder HLA-A2 transgenen Mäusen. Die Methoden zur Detektion Tumorantigen-spezifischer CTL in 96-Loch-Mikrotiterplatten können dabei zur systematischen Suche nach im Menschen immundominanten T-Zell-Epitopen im Muzin-Molekül genutzt werden. Der durchgeführte Vergleich der auf den Vektoren pCI und MVA basierenden Vakzinen und die Analyse neuerer Publikationen führen zu dem Ergebnis, daß vor allem DNA-Vakzinen in Zukunft eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von aktiven Tumorimpfstoffen spielen werden. Rekombinante MVA-Viren, eventuell in Kombination mit DNA- oder anderen Vektoren, haben sich dagegen in zahlreichen Studien als wirksame Impfstoffe zur Kontrolle von durch Pathogene hervorgerufenen Infektionserkrankungen erwiesen.
Der Buchfinkengesang wurde in Potsdam in zwei Hauptpopulationen über drei Jahre aufgenommen. Jedes Individuum wurde eindeutig am individuellen Strophentypenrepertoire identifiziert. Ein weiterer Punkt der die individuelle Wiedererkennung bestätigt ist die hohe Standorttreue der adulten Männchen. Die beschriebene Methode eignet sich für die Untersuchung von gesamten Populationen, um den Wandel des Gesangs von Populationen in Raum und Zeit zu beschreiben. Die Haupterkenntnisse der Arbeit sind: - Die Gesamtanzahl der Grundstrophentypen innerhalb einer Population bleibt über Jahre konstant. - Die relative Häufigkeit jedes einzelnen Strophentyps variiert von Jahr zu Jahr und von Population zu Population. - Gesangslernen erfolgt exakt mit einem Korrektheitsgrad von mindestens 96%. - Das Song-Sharing ist innerhalb der Population hoch. Die diskutierten Mechanismen für das Song-Sharing sind: Die Lebenserwartung, das Zugverhalten, das Lernverhalten, die Etabliertheit von Strophentypen, Weibchenpräferenzen und die Reaktionen der territorialen Männchen. - Weiterhin wurde ein Modell zur kulturellen Evolution des Buchfinkengesangs programmiert, um die Rolle der Einflussfaktoren, wie Fehlerquote, Abwanderungsrate und Laufzeit zu ermitteln. Der Wandel des Dialektes erfolgt graduell in Raum und Zeit. Daher sind keine scharfen Dialektgrenzen anzutreffen. Trotz dieser Tatsache markieren die etablierten Strophentypen die Population. 50 % der Juvenilen siedeln am Geburtsort, auf diese Weise bleibt der Dialekt erhalten und Inzest wird vermieden. -Analysiert man das Repertoire benachbarten Männchen bei isolierten Alleen, so entspricht die Gesangsangleichung in etwa dem Zufall. -Intraindividuelle Vergleiche der quantitativen Parameter des jeweiligen Strophentyps wurden saisonal und annuell durchgeführt. Saisonal konnten für einen Strophentyp ein Trend ermittelt werden. Bei jährlichen Vergleichen konnten intraindividuell ausschließlich nicht signifikante Ergebnisse ermittelt werden, wohingegen die interindividuelle Variation in zwei Fällen signifikant war. In einem Fall bestand ein Trend und in einem weiteren Fall war die Variationsunterschiede nicht signifikant. - Der Verlauf der Brutsaison lässt sich an der jährlichen Gesangsaktivität nachvollziehen.
Using individual-based modeling to understand grassland diversity and resilience in the Anthropocene
(2020)
The world’s grassland systems are increasingly threatened by anthropogenic change. Susceptible to a variety of different stressors, from land-use intensification to climate change, understanding the mechanisms driving the maintenance of these systems’ biodiversity and stability, and how these mechanisms may shift under human-mediated disturbance, is thus critical for successfully navigating the next century. Within this dissertation, I use an individual-based and spatially-explicit model of grassland community assembly (IBC-grass) to examine several processes, thought key to understanding their biodiversity and stability and how it changes under stress. In the first chapter of my thesis, I examine the conditions under which intraspecific trait variation influences the diversity of simulated grassland communities. In the second and third chapters of my thesis, I shift focus towards understanding how belowground herbivores influence the stability of these grassland systems to either a disturbance that results in increased, stochastic, plant mortality, or eutrophication.
Intraspecific trait variation (ITV), or variation in trait values between individuals of the same species, is fundamental to the structure of ecological communities. However, because it has historically been difficult to incorporate into theoretical and statistical models, it has remained largely overlooked in community-level analyses. This reality is quickly shifting, however, as a consensus of research suggests that it may compose a sizeable proportion of the total variation within an ecological community and that it may play a critical role in determining if species coexist. Despite this increasing awareness that ITV matters, there is little consensus of the magnitude and direction of its influence. Therefore, to better understand how ITV changes the assembly of grassland communities, in the first chapter of my thesis, I incorporate it into an established, individual-based grassland community model, simulating both pairwise invasion experiments as well as the assembly of communities with varying initial diversities. By varying the amount of ITV in these species’ functional traits, I examine the magnitude and direction of ITV’s influence on pairwise invasibility and community coexistence. During pairwise invasion, ITV enables the weakest species to more frequently invade the competitively superior species, however, this influence does not generally scale to the community level. Indeed, unless the community has low alpha- and beta- diversity, there will be little effect of ITV in bolstering diversity. In these situations, since the trait axis is sparsely filled, the competitively inferior may suffer less competition and therefore ITV may buffer the persistence and abundance of these species for some time.
In the second and third chapters of my thesis, I model how one of the most ubiquitous trophic interactions within grasslands, herbivory belowground, influences their diversity and stability. Until recently, the fundamental difficulty in studying a process within the soil has left belowground herbivory “out of sight, out of mind.” This dilemma presents an opportunity for simulation models to explore how this understudied process may alter community dynamics. In the second chapter of my thesis, I implement belowground herbivory – represented by the weekly removal of plant biomass – into IBC-grass. Then, by introducing a pulse disturbance, modelled as the stochastic mortality of some percentage of the plant community, I observe how the presence of belowground herbivores influences the resistance and recovery of Shannon diversity in these communities. I find that high resource, low diversity, communities are significantly more destabilized by the presence of belowground herbivores after disturbance. Depending on the timing of the disturbance and whether the grassland’s seed bank persists for more than one season, the impact of the disturbance – and subsequently the influence of the herbivores – can be greatly reduced. However, because human-mediated eutrophication increases the amount of resources in the soil, thus pressuring grassland systems, our results suggest that the influence of these herbivores may become more important over time.
In the third chapter of my thesis, I delve further into understanding the mechanistic underpinnings of belowground herbivores on the diversity of grasslands by replicating an empirical mesocosm experiment that crosses the presence of herbivores above- and below-ground with eutrophication. I show that while aboveground herbivory, as predicted by theory and frequently observed in experiments, mitigates the impact of eutrophication on species diversity, belowground herbivores counterintuitively reduce biodiversity. Indeed, this influence positively interacts with the eutrophication process, amplifying its negative impact on diversity. I discovered the mechanism underlying this surprising pattern to be that, as the herbivores consume roots, they increase the proportion of root resources to root biomass. Because root competition is often symmetric, herbivory fails to mitigate any asymmetries in the plants’ competitive dynamics. However, since the remaining roots have more abundant access to resources, the plants’ competition shifts aboveground, towards asymmetric competition for light. This leads the community towards a low-diversity state, composed of mostly high-performance, large plant species. We further argue that this pattern will emerge unless the plants’ root competition is asymmetric, in which case, like its counterpart aboveground, belowground herbivory may buffer diversity by reducing this asymmetry between the competitively superior and inferior plants.
I conclude my dissertation by discussing the implications of my research on the state of the art in intraspecific trait variation and belowground herbivory, with emphasis on the necessity of more diverse theory development in the study of these fundamental interactions. My results suggest that the influence of these processes on the biodiversity and stability of grassland systems is underappreciated and multidimensional, and must be thoroughly explored if researchers wish to predict how the world’s grasslands will respond to anthropogenic change. Further, should researchers myopically focus on understanding central ecological interactions through only mathematically tractable analyses, they may miss entire suites of potential coexistence mechanisms that can increase the coviability of species, potentially leading to coexistence over ecologically-significant timespans. Individual-based modelling, therefore, with its focus on individual interactions, will prove a critical tool in the coming decades for understanding how local interactions scale to larger contexts, and how these interactions shape ecological communities and further predicting how these systems will change under human-mediated stress.
Water is essential to life and thus, an essential resource. However, freshwater resources are limited and their maintenance is crucial. Pollution with chemicals and pathogens through urbanization and a growing population impair the quality of freshwater. Furthermore, water can serve as vector for the transmission of pathogens resulting in water-borne illness.
The Interdisciplinary Research Group III – "Water" of the Leibniz alliance project INFECTIONS‘21 investigated water as a hub for pathogens focusing on Clostridioides difficile and avian influenza A viruses that may be shed into the water. Another aim of this study was to characterize the bacterial communities in a wastewater treatment plant (WWTP) of the capital Berlin, Germany to further assess potential health risks associated with wastewater management practices.
Bacterial communities of WWTP inflow and effluent differed significantly. The proportion of fecal/enteric bacteria was relatively low and OTUs related to potential enteric pathogens were largely removed from inflow to effluent. However, a health risk might exist as an increased relative abundance of potential pathogenic Legionella spp. such as L. lytica was observed. Three Clostridioides difficile isolates from wastewater inflow and an urban bathing lake in Berlin (‗Weisser See‘) were obtained and sequenced. The two isolates from the wastewater did not carry toxin genes, whereas the isolate from the lake was positive for the toxin genes. All three isolates were closely related to human strains. This indicates a potential, but rather sporadic health risk. Avian influenza A viruses were detected in 38.8% of sediment samples by PCR, but virus isolation failed. An experiment with inoculated freshwater and sediment samples showed that virus isolation from sediment requires relatively high virus concentrations and worked much better in Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell cultures than in embryonated chicken eggs, but low titre of influenza contamination in freshwater samples was sufficient to recover virus.
In conclusion, this work revealed potential health risks coming from bacterial groups with pathogenic potential such as Legionella spp. whose relative abundance is higher in the released effluent than in the inflow of the investigated WWTP. It further indicates that water bodies such as wastewater and lake sediments can serve as reservoir and vector, even for non-typical water-borne or water-transmitted pathogens such as C. difficile.
Die 11beta-HSD1 reguliert intrazellulär die Cortisolkonzentration durch Regeneration von Cortison z.B. aus dem Blutkreislauf, zu Cortisol. Daher stellt diese ein wichtiges Element in der Glucocorticoid-vermittelten Genregulation dar. Die 11beta-HSD1 wird ubiquitär exprimiert, auf hohem Niveau besonders in Leber, Fettgewebe und glatten Muskelzellen. Insbesondere die Bedeutung der 11beta-HSD1 in Leber und Fettgewebe konnte mehrfach nachgewiesen werden. In der Leber führte eine erhöhte Aktivität aufgrund einer Überexpression in Mäusen zu einer verstärkten Gluconeogeneserate. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression und erhöhte Enzymaktivität der 11beta-HSD1 im subkutanen und viszeralen Fettgewebe assoziiert ist mit Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Dyslipidämie. Über die Regulation ist jedoch noch wenig bekannt. Zur Untersuchung der Promotoraktivität wurde der Promotorbereich von -3034 bis +188, vor und nach dem Translations- und Transkriptionsstart, der 11beta-HSD1 kloniert. 8 Promotorfragmente wurden mittels Dual-Luciferase-Assay in humanen HepG2-Zellen sowie undifferenzierten und differenzierten murinen 3T3-L1-Zellen untersucht. Anschließend wurde mittels nicht-radioaktiven EMSA die Bindung des TATA-Binding Proteins (TBP) sowie von CCAAT/Enhancer-Binding-Proteinen (C/EBP) an ausgewählte Promotorregionen analysiert. Nach der Charakterisierung des Promotors wurden spezifische endogene und exogene Regulatoren untersucht. Fettsäuren modifizieren die Entstehung von Adipositas und Insulinresistenz. Ihre Wirkung wird u.a. PPARgamma-abhängig vermittelt und kann durch das Inkretin (Glucose-dependent insulinotropic Peptide) GIP modifiziert werden. So wurden die Effekte von unterschiedlichen Fettsäuren, vom PPARgamma Agonisten Rosiglitazon sowie dem Inkretin GIP auf die Expression und Enzymaktivität der 11beta-HSD1 untersucht. Dies wurde in-vitro-, tierexperimentell und in humanen in-vivo-Studien realisiert. Zuletzt wurden 2 Single Nucleotide Polymorphismen (SNP) im Promotorbereich der 11beta-HSD1 in der Zellkultur im Hinblick auf potentielle Funktionalität analysiert sowie die Assoziation mit Diabetes mellitus Typ 2 und Körpergewicht in der MeSyBePo-Kohorte bei rund 1.800 Personen untersucht. Die Luciferase-Assays zeigten basal eine zell-spezifische Regulation der 11beta-HSD1, wobei in allen 3 untersuchten Zelltypen die Bindung eines Repressors nachgewiesen werden konnte. Zudem konnte eine mögliche Bindung des TBPs sowie von C/EBP-Proteinen an verschiedene Positionen gezeigt werden. Die Transaktivierungsassays mit den C/EBP-Proteinen -alpha, -beta und -delta zeigten eben-falls eine zellspezifische Regulation des 11beta-HSD1-Promotors. Die Aktivität und Expression der 11beta-HSD1 wurde durch die hier untersuchten endogenen und exogenen Faktoren spezifisch modifiziert, was sowohl in-vitro als auch in-vivo in unterschiedlichen Modellsystemen dargestellt werden konnte. Die Charakterisierung der MeSyBePo-Kohorte ergab keine direkten Assoziationen zwischen Polymorphismus und klinischem Phänotyp, jedoch Tendenzen für eine erhöhtes Körper-gewicht und Typ 2 Diabetes mellitus in Abhängigkeit des Genotyps. Der Promotor der 11beta-HSD1 konnte aufgrund der Daten aus den Luciferaseassays sowie den Daten aus den EMSA-Analysen näher charakterisiert werden. Dieser zeigt eine variable und zell-spezifische Regulation. Ein wichtiger Regulator stellen insbesondere in den HepG2-Zellen die C/EBP-Proteine -alpha, -beta und -delta dar. Aus den in-vivo-Studien ergab sich eine Regulation der 11beta-HSD1 durch endogene, exogene und pharmakologische Substanzen, die durch die Zellkulturversuche bestätigt und näher charakterisiert werden konnten.
Untersuchungen zur pro-inflammatorischen Wirkung von Serum-Amyloid A in glatten Gefäßmuskelzellen
(2014)
Alle Organismen sind für ihr Überleben auf Metalle angewiesen. Hierbei gibt es für jedes Metall einen Konzentrationsbereich, der das Optimum zwischen Metallmangel, -bedarf und -toxizität darstellt. Es gilt mittlerweile als erwiesen, dass alle Organismen zur Aufrechterhaltung des Metallgleichgewichts ein komplexes Netzwerk von Proteinen und niedermolekularen Verbindungen entwickelt haben. Die molekularen Komponenten dieses Netzwerks sind nur zu einem Teil bekannt und charakterisiert: In den letzten Jahren wurden einige Proteinfamilien identifiziert, deren Mitglieder Metalle durch Lipidmembranen transportieren. Eine dieser Metalltransporterfamilien ist die Cation Diffusion Facilitator (CDF)-Familie: Alle charakterisierten Mitglieder exportieren Metalle aus dem Zytoplasma – entweder in zelluläre Kompartimente oder aus der Zelle heraus. Von den zwölf Mitgliedern dieser Familie in Arabidopsis thaliana (A. thaliana) – Metall Toleranz Protein (MTP)-1 bis -12 – wurden bisher AtMTP1 und AtMTP3 charakterisiert. In dieser Arbeit wird die Charakterisierung von AtMTP2 beschrieben. Wie die homologen Proteine AtMTP1 und AtMTP3 führt AtMTP2 zu Zn-Toleranz, wenn es heterolog in Zn-sensitiven Hefemutanten exprimiert wird. Mit AtMTP2 transformierte Hefemutanten zeigten darüber hinaus erhöhte Co-Toleranz. Expression von chimären AtMTP2/GFP Fusionsproteinen in Hefe, A.thaliana protoplasten und in stabil transformierten A.thalinana Planzenlinien deutet auf Lokalisation of AtMTP2 in Membranen des Endoplasmatischen Retikulums (ER) hin, wenn GFP an den C-Terminus von MTP2 fusioniert wird. Fusion of GFP an den N-Terminus von AtMTP2 führte zu Lokalisation in der vakuolären Membran, was wahrscheinlichsten auf Fehllokalisierung durch Maskierung eines ER-Retentionsmotivs (XXRR) am N-Terminus von AtMTP2 zurückgeht. Dies legt nahe, dass AtMTP2 die erwähnten Metalle in das Endomembransystem der Zelle transportieren kann. Eine gewebespezifische Lokalisierung wurde mit Pflanzen durchgeführt, die das β-Glucuronidase (GUS)-Reporterprotein bzw. chimäre Fusionsproteine aus EGFP und AtMTP2 unter Kontrolle des nativen pMTP2-Promotors exprimierten. Diese Experimente bestätigten zum einen, dass der pMTP2-Promotor nur unter Zn-Defizienz aktiv ist. GUS-Aktivität wurde unter diesen Bedingungen in zwei Zonen der Wurzelspitze beobachtet: in den isodiametrischen Zellen der meristematischen Zone und in der beginnenden Wurzelhaarzone. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die EGFP-Fusionsproteine unter Kontrolle des nativen pMTP2-Promotors nur in epidermalen Zellen exprimiert werden. Für eine homozygote Knockout- Linie, mtp2-S3, konnte bisher kein eindeutiger Phänotyp identifiziert werden. Auf Grundlage der bisher durchgeführten Charakterisierung von AtMTP2 erscheinen zwei Modelle der Funktion von AtMTP2 in der Pflanze möglich: AtMTP2 könnte essentiell für die Versorgung des ER mit Zn unter Zn-Mangelbedingungen sein. Hierfür spricht, dass AtMTP2 in jungen, teilungsaktiven und damit Zn-benötigenden Wurzelzonen exprimiert wird. Die auf die Epidermis beschränkte Lokalisation könnte bei diesem Modell auf die Möglichkeit der zwischenzellulären Zn-Verteilung innerhalb des ER über Desmotubules hindeuten. Alternativ könnte AtMTP2 eine Funktion bei der Detoxifizierung von Zn unter Zn-Schock Bedingungen haben: Es ist bekannt, dass unter Zn- Mangelbedingungen die Expression der zellulären Zn-Aufnahmesysteme hochreguliert wird. Wenn nun die Zn-Verfügbarkeit im Boden z. B durch eine pH-Änderung innerhalb kurzer Zeit stark ansteigt, besteht die Notwendigkeit der Entgiftung von Zn innerhalb der Zelle, bis der starke Einstrom von Zn ins Zytoplasma durch die Deaktivierung der Zn-Aufnahmesysteme und einer geringeren Expression in der Pflanze gedrosselt ist. Ein ähnlicher Mechanismus wurde in der Bäckerhefe S. cerevisae beschrieben, in der darüber hinaus ein Zn-Transporter verstärkt exprimiert wird, der Zn durch Transport in die Vakuole entgiften kann. Es ist durchaus möglich, dass in Arabidopsis AtMTP2 die Zn-Detoxifizierung unter diesen speziellen Bedingungen durch Zn-Transport in das ER oder die Vakuole vermittelt. Zur Identifikation weiterer Komponenten des Metallhomöostasenetzwerks sind verschiedene Ansätze denkbar. In dieser Arbeit wurde in Hefe ein heterologer Screen durchgeführt, um Interaktoren für vier Mitglieder der Arabidopsis-CDF-Familie zu identifizieren. Unter den 11 im Hefesystem bestätigten Kandidaten befindet sich mit AtSPL1 ein AtMTP1-Interaktionskandidat, der möglicherweise eine Rolle bei der Cu-,Zn-Homöostase spielt. Als wahrscheinliche AtMTP3-Interaktionskandidaten wurde die c”-Untereinheit der vakuolären H+-ATPase AtVHA identifiziert sowie mit AtNPSN13 ein Protein, das vermutlich eine Rolle bei Fusionen von Vesikeln mit Zielmembranen spielt. Ein anderer Ansatz zur Identifikation neuer Metallhomöostasegene ist die vergleichende Elementanalyse von natürlichen oder mutagenisierten Pflanzenpopulationen. Voraussetzung für diesen Ansatz ist die schnelle und genaue Analyse des Elementgehalts von Pflanzen. Eine etablierte Methode zur simultanen Bestimmung von bis zu 65 Elementen in einer Probe ist die Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (ICP OES). Der limitierende Faktor für einen hohen Probendurchsatz ist die Notwendigkeit, Proben für die Analyse zu verflüssigen. Eine alternative Methode der Probenzuführung zum Analysegerät ist die elektrothermale Verdampfung (ETV) der Probe. Zur weitgehend automatisierten Analyse von Pflanzenmaterial mit minimiertem Arbeitsaufwand wurde eine Methode entwickelt, die auf der Kopplung der ETV mit der ICP OES basiert.
Arachidonsäurelipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind Lipid-peroxidierenden Enzyme, die bei der Zelldifferenzierung und bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen bedeutsam sind. Im menschlichen Genom gibt es sechs funktionelle ALOX-Gene, die als Einzelkopiegene vorliegen. Für jedes humane ALOX-Gen gibt es ein orthologes Mausgen. Obwohl sich die sechs humanen ALOX-Isoformen strukturell sehr ähnlich sind, unterscheiden sich ihre funktionellen Eigenschaften deutlich voneinander. In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Fragestellungen zum Vorkommen, zur biologischen Rolle und zur Evolutionsabhängigkeit der enzymatischen Eigenschaften von Säugetier-ALOX-Isoformen untersucht:
1) Spitzhörnchen (Tupaiidae) sind evolutionär näher mit dem Menschen verwandt als Nagetiere und wurden deshalb als Alternativmodelle für die Untersuchung menschlicher Erkrankungen vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde erstmals der Arachidonsäurestoffwechsel von Spitzhörnchen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass im Genom von Tupaia belangeri vier unterschiedliche ALOX15-Gene vorkommen und die Enzyme sich hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften ähneln. Diese genomische Vielfalt, die weder beim Menschen noch bei Mäusen vorhanden ist, erschwert die funktionellen Untersuchungen zur biologischen Rolle des ALOX15-Weges. Damit scheint Tupaia belangeri kein geeigneteres Tiermodel für die Untersuchung des ALOX15-Weges des Menschen zu sein.
2) Entsprechend der Evolutionshypothese können Säugetier-ALOX15-Orthologe in Arachidonsäure-12-lipoxygenierende- und Arachidonsäure-15-lipoxygenierende Enzyme eingeteilt werden. Dabei exprimieren Säugetierspezies, die einen höheren Evolutionsgrad als Gibbons aufweisen, Arachidonsäure-15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, während evolutionär weniger weit entwickelte Säugetiere Arachidonsäure-12 lipoxygenierende Enzyme besitzen. In dieser Arbeit wurden elf neue ALOX15-Orthologe als rekombinante Proteine exprimiert und funktionell charakterisiert. Die erhaltenen Ergebnisse fügen sich widerspruchsfrei in die Evolutionshypothese ein und verbreitern deren experimentelle Basis. Die experimentellen Daten bestätigen auch das Triadenkonzept.
3) Da humane und murine ALOX15B-Orthologe unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen, können Ergebnisse aus murinen Krankheitsmodellen zur biologischen Rolle der ALOX15B nicht direkt auf den Menschen übertragen werden. Um die ALOX15B-Orthologen von Maus und Mensch funktionell einander anzugleichen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Knock-in Mäuse durch die In vivo Mutagenese mittels CRISPR/Cas9-Technik hergestellt. Diese exprimieren eine humanisierte Mutante (Doppelmutation von Tyrosin603Asparaginsäure+Histidin604Valin) der murinen Alox15b. Diese Mäuse waren lebens- und fortpflanzungsfähig, zeigten aber geschlechtsspezifische Unterschiede zu ausgekreuzten Wildtyp-Kontrolltieren im Rahmen ihre Individualentwicklung.
4) In vorhergehenden Untersuchungen zur Rolle der ALOX15B in Rahmen der Entzündungsreaktion wurde eine antiinflammatorische Wirkung des Enzyms postuliert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Humanisierung der murinen Alox15b die Entzündungsreaktion in zwei verschiedenen murinen Entzündungsmodellen beeinflusst. Eine Humanisierung der murinen Alox15b führte zu einer verstärkten Ausbildung von Entzündungssymptomen im induzierten Dextran-Natrium-Sulfat-Kolitismodell. Im Gegensatz dazu bewirkte die Humanisierung der Alox15b eine Abschwächung der Entzündungssymptome im Freund‘schen Adjuvans Pfotenödemmodell. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich die Rolle der ALOX15B in verschiedenen Entzündungsmodellen unterscheidet.
Untersuchungen zur Entstehung morphogenetisch unterschiedlicher Kallustypen bei Beta vulgaris L.
(1992)
Even though the structure of the plant cell wall is by and large quite well characterized, its synthesis and regulation remains largely obscure. However, it is accepted that the building blocks of the polysaccharidic part of the plant cell wall are nucleotide sugars. Thus to gain more insight into the cell wall biosynthesis, in the first part of this thesis, plant genes possibly involved in the nucleotide sugar interconversion pathway were identified using a bioinformatics approach and characterized in plants, mainly in Arabidopsis. For the computational identification profile hidden markov models were extracted from the Pfam and TIGR databases. Mainly with these, plant genes were identified facilitating the “hmmer” program. Several gene families were identified and three were further characterized, the UDP-rhamnose synthase (RHM), UDP-glucuronic acid epimerase (GAE) and the myo-inositol oxygenase (MIOX) families. For the three-membered RHM family relative ubiquitous expression was shown using variuos methods. For one of these genes, RHM2, T-DNA lines could be obtained. Moreover, the transcription of the whole family was downregulated facilitating an RNAi approach. In both cases a alteration of cell wall typic polysaccharides and developmental changes could be shown. In the case of the rhm2 mutant these were restricted to the seed or the seed mucilage, whereas the RNAi plants showed profound changes in the whole plant. In the case of the six-membered GAE family, the gene expressed to the highest level (GAE6) was cloned, expressed heterologously and its function was characterized. Thus, it could be shown that GAE6 encodes for an enzyme responsible for the conversion of UDP-glucuronic acid to UDP-galacturonic acid. However, a change in transcript level of variuos GAE family members achieved by T-DNA insertions (gae2, gae5, gae6), overexpression (GAE6) or an RNAi approach, targeting the whole family, did not reveal any robust changes in the cell wall. Contrary to the other two families the MIOX gene family had to be identified using a BLAST based approach due to the lack of enough suitable candidate genes for building a hidden markov model. An initial bioinformatic characterization was performed which will lead to further insights into this pathway. In total it was possible to identify the two gene families which are involved in the synthesis of the two pectin backbone sugars galacturonic acid and rhamnose. Moreover with the identification of the MIOX genes a genefamily, important for the supply of nucleotide sugar precursors was identified. In a second part of this thesis publicly available microarray datasets were analyzed with respect to co-responsive behavior of transcripts on a global basis using nearly 10,000 genes. The data has been made available to the community in form of a database providing additional statistical and visualization tools (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de). Using the framework of the database to identify nucleotide sugar converting genes indicated that co-response might be used for identification of novel genes involved in cell wall synthesis based on already known genes.
Mit der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe elektronenmikroskopischer Methoden verschiedene Liposomen-DNA-Komplexe zum Gentransfer charakterisiert sowie die Aufnahme und Verteilung in der Zellkultur untersucht werden. Dabei waren vor allem solche Präparationen von besonderem Interesse, die in unserer Arbeitsgruppe 'Drug Targeting' getestet oder entwickelt und verwendet wurden, wie Sendai-Virus Liposomen (HVJ-Liposomen), Virosomen sowie DAC-Chol und DOCSPER-Liposomen als Vertreter der kationischen Lipide. Im ersten Teil der Arbeit wurden fusogene Liposomen und Virosomen charakterisiert. Bei diesen Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erzielt: ·Sendai-Viren fusionieren mit Liposomen unterschiedlicher Lipidzusammensetzung. ·Die daraus resultierenden HVJ-Liposomen sind mit elektronenmikroskopischen Methoden identifizierbar. ·Die Spikes auf den HVJ-Liposomen besitzen fusogene Eigenschaften. ·HVJ-Liposomen eignen sich auf Grund der geringen Ausbeute sowie der geringen Transfektionseffizienz nicht zum in vitro Gentransfer. ·Virosomen stellen einen weiteren Typ fusogener Gentransfervesikel dar. ·Ihre Größe und fusogenen Eigenschaften sind abhängig von der externen Zugabe einer optimierten Lipidmischung. ·Im Innenraum der Virosomen kann mit Poly-L-Lysin vorkomplexierte DNA verkapselt werden. ·Die fusogenen Eigenschaften der Virosomen wurden mit Hilfe immunelektronenmikroskopischer Techniken und monoklonaler Antikörper gegen Hämagglutinin/Neuraminidase und das Fusionsprotein sowie mit polyklonalen Antiseren gezeigt. ·An Hand goldmarkierter DNA sind Virosomen nach der Transfektion in der Zelle nachweisbar. Da in unserer Arbeitsgruppe bevorzugt kationische Liposomen zum Gentransfer verwendet werden, wurde auch die Struktur der Liposomen untersucht und folgende Ergebnisse dokumentiert: ·Die Struktur und die Größe kationischer Liposomen werden hauptsächlich durch die Lipidzusammensetzung bestimmt. ·Die Bildung von Liposomen-DNA-Komplexen ist mit einer Größenzunahme der Komplexe gekoppelt. ·Die Anzahl gebundener Plasmide steigt mit der Größe der Lipoplexe. ·Gentransferaktive Lipopolyplexe (mit Protaminsulfat komplexierte DNA und DAC-Chol- Liposomen) sind kleiner als Lipoplexe. Ihre Struktur wird von der Zusammensetzung bestimmt. Eine weitere wichtige Frage betrifft den Weg der Gencarrier in der Zelle. Kenntnisse über diese Vorgänge sind vorteilhaft, um die einzelnen Schritte zu verstehen und möglichst gezielt zu verbessern. Bei der Untersuchung der Partikel im Hinblick auf zelluläre Barrieren beim Gentransfer konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: ·Die Bindung der Partikel an die Zellmembran und Aufnahme sind abhängig von den eingesetzten Zellen und Komplexen sowie derInkubationszeit. ·Die Aufnahme erfolgt über endozytotische Mechanismen, wobei Lipopolyplexe schneller als Lipoplexe in die Zellen gelangen. Nicht alle gebundenen Komplexe werden aufgenommen. ·Die aufgenommenen Partikel befinden sich in Endosomen und werden ins Innere der Zelle transportiert. ·Freisetzung der DNA und Eintritt in den Zellkern über Kernporen konnte nicht beobachtet werden. ·DNA-haltige Vesikel in Kernnähe deuten auf einen weiteren Mechanismus hin (Vesikeltransfer zum Zellkern).
Auf dem Weg der genetischen Information stellt die Translation der RNA in eine Aminosäuresequenz den letzten Schritt dar. In Chloroplasten, den grünen Organellen der Pflanzenzellen, findet ein Großteil der Regulation der Genexpression auf Ebene der Initiation dieses Schrittes statt. Eine Vielzahl von Eigenschaften der RNA und von Faktoren, die an die RNA binden, entfalten einen Einfluss auf diesen Schritt. Bisher unvollständig aufgeklärt ist die Rolle einer konservierten Nukleotidsequenz in der untranslatierten Region der RNA -- der Shine-Dalgarno-Sequenz. Diese stellt in Bakterien, wie z.B. E. coli als Ribosomenbindestelle sicher, dass Ribosomen den Anfang der zu translatierenden Sequenz zuverlässig erkennen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diverse DNA-Konstrukte in Plastiden von Tabak eingebracht. Hierzu zählten Konstrukte, die sowohl eine erhöhte Anzahl von Ribosomenbindestellen enthielten als auch vermehrte Startpunkte der Translation. Zusätzlich wurden Konstrukte hergestellt, die die Situation von mehreren zu translatierenden Regionen in der RNA nachstellten. Es konnte festgestellt werden, dass plastidäre Ribosomen die strangaufwärts gelegenen Translationsstartpunkte bevorzugen -- im Gegensatz zu E. coli, wo alle Startpunkte gleichmäßig genutzt wurden. Hierdurch zeigten die prokaryotischen Ribosomen aus Chloroplasten, die sich aus bakteriellen Systemen ableiten, Eigenschaften von eukaryotischen Ribosomen. Ein zweites Teilprojekt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Inkompatibilität von Chloroplasten mit dem Kerngenom. In Kreuzungen von Arten der Gattung Pelargonium fielen Kombinationen auf, bei denen die Tochterpflanzen bleiche Blattbereiche bis hin zu vollständig weißen Pflanzen zeigten. Dieses Phänomen wird als Bastardbleichheit bezeichnet. In der Gattung Pelargonium werden Chloroplasten von beiden Elternteilen an die Tochterpflanzen vererbt. Da das Phänomen der Bastardbleichheit nur in einem der Plastiden vorkommt, nicht jedoch im anderen in der gleichen Pflanze, muss von einem Effekt ausgegangen werden, der von Plastiden ausgeht. Die Interaktionen zwischen Zellkern und Chloroplasten sind offensichtlich stark gestört. Zur detaillierten Untersuchung dieses Effekts wurde die Nukleotidsequenz von drei Chloroplastengenomen aufgeklärt. Es konnte eine Reihe von Sequenzunterschieden der Genome ermittelt werden. Aus diesen wurde eine Reihe von Unterschieden beobachtet, die einen solchen Effekt zur Folge haben können. Aus diesen Unterschieden wurde eine Reihe von potentiellen Kandidatengenen zusammengestellt, die in weiteren Arbeiten auf ihre Rolle in der Entstehung der Bastardbleichheit untersucht werden.
Untersuchungen PEG-basierter thermo-responsiver Polymeroberflächen zur Steuerung der Zelladhäsion
(2010)
Moderne Methoden für die Einzelzellanalyse werden dank der fortschreitenden Weiterentwicklung immer sensitiver. Dabei steigen jedoch auch die Anforderungen an das Probenmaterial. Viele Aufbereitungsprotokolle adhärenter Zellen beinhalten eine enzymatische Spaltung der Oberflächenproteine, um die Ablösung vom Zellkultursubstrat zu ermöglichen. Verschiedene Methoden, wie die Patch-Clamp-Technik oder eine auf der Markierung extrazellulärer Domänen von Membranproteinen basierende Durchflusszytometrie können dann nur noch eingeschränkt eingesetzt werden. Daher ist die Etablierung neuer Zellablösemethoden dringend notwendig. In der vorliegenden Arbeit werden erstmals PEG-basierte thermo-responsive Oberflächen erfolgreich für die Zellkultur eingesetzt. Dabei wird das zerstörungsfreie Ablösen verschiedener Zelllinien von den Oberflächen durch Temperatursenkung realisiert. Die Funktionalität der Oberflächen wird durch Variation der Polymerstruktur, sowie der Konzentration der Beschichtungslösung, durch Beschichtung der Oberflächen mit einem zelladhäsionsfördernden Protein (Fibronektin) und durch Adsorption zelladhäsionsvermittelnder Peptide (RGD) optimiert. Um den Zellablösungsprozess detaillierter zu untersuchen, wird hier zum ersten Mal der direkte Zellkontakt mit thermo-responsiven Oberflächen mittels oberflächensensitiver Mikroskopie (TIRAF) sichtbar gemacht. Mit dieser Technik sind die exakte Quantifizierung und die Analyse der Reduktion der Zelladhäsionsfläche während des Abkühlens möglich. Hierbei werden in Abhängigkeit von der Zelllinie Unterschiede im Zellverhalten während des Ablösens festgestellt: Zellen, wie eine Brustkrebszelllinie und eine Ovarzelllinie, die bekanntermaßen stärker mit ihrer Umgebung in Kontakt treten, vergrößern im Verlauf des Beobachtungszeitraumes den Abstand zwischen Zellmembran und Oberfläche, reduzieren jedoch ihre Zell-Substratkontaktfläche kaum. Mausfibroblasten hingegen verkleinern drastisch die Zelladhäsionsfläche. Der Ablösungsprozess wird vermutlich aktiv von den Zellen gesteuert. Diese Annahme wird durch zwei Beobachtungen gestützt: Erstens verläuft die Reduktion der Zelladhäsionsfläche bei Einschränkung des Zellmetabolismus durch eine Temperatursenkung auf 4 °C verzögert. Zweitens hinterlassen die Zellen Spuren, die nach dem Ablösen der Zellen auf den Oberflächen zurückbleiben. Mittels Kombination von TIRAF- und TIRF-Mikroskopie werden die Zelladhäsionsfläche und die Aktinstruktur gleichzeitig beobachtet. Die Verknüpfung beider Methoden stellt eine neue Möglichkeit dar, intrazelluläre Prozesse mit der Zellablösung von thermo-responsiven Oberflächen zu korrelieren.
Untersuchung und Veränderung der Genexpression und Proteinstabilität in Plastiden höherer Pflanzen
(2009)
The Annamites mountain range of Southeast Asia which runs along the border of Viet Nam and Laos is an important biodiversity hotspot with high levels of endemism. However, that biodiversity is threatened by unsustainable hunting, and many protected areas across the region have been emptied of their wildlife. To better protect the unique species in the Annamites, it is crucial to have a better understanding of their ecology and distribution. Additionally, basic genetic information is needed to provide conservation stakeholders with essential information to facilitate conservation breeding and counteract the illegal wildlife trade. To date, this baseline information is lacking for many Annamites species.
This thesis aims to assess the effectiveness of using non-invasive collection methods, i.e. camera-trap surveys and leech-derived wildlife host DNA, in order to improve and enhance our understanding of ecology, distribution, and genetic diversity of the Annamites terrestrial mammals.
In chapter 1, we analysed data from a systematic landscape camera-trap survey using single-species occupancy models to assess the ecology and distribution of two little-known Annamite endemics, the Annamite dark muntjac (Muntiacus rooseveltorum / truongsonensis) and Annamite striped rabbit (Nesolagus timminsi), in multiple protected areas across the Annamites. This chapter provided the first in-depth information on their ecology, as well as distribution patterns at large spatial scales. Most notably, we found that the Annamite dark muntjac was predominantly found at higher elevations, while responses to elevation varied among study areas for the Annamite striped rabbit. We estimated occupancy probabilities for both endemics by using their responses to environmental and anthropogenic influences and used this information to make recommendations for targeted conservation actions. We discuss how the approach we used for these two Annamites endemics can be expanded for other little-known and threatened species in other tropical regions.
As is the case with ecology and distribution, very little is known about the genetic diversity of the Annamite striped rabbit and other mammals of the Annamites. This poor understanding is mainly attributed to the lack of a comprehensive DNA sample collection that covers the species’ entire distribution range, which is believed to be a consequence of the low density of mammals or the remoteness of species’ habitat. In order to overcome the difficulties when trying to collect DNA samples from elusive mammals, we applied invertebrate-derived DNA (iDNA) sampling via hematophagous leeches to indirectly obtain genetic materials of their terrestrial host mammals.
In chapter 2, leech-derived DNA was used to study the genetic diversity of the Annamite striped rabbit population. By analysing the DNA extracted from leech samples collected at multiple study areas of the central Annamites, we found a genetic variation with five haplotypes among nine obtained sequences. Despite this diversity, we found no clear phylogeographic pattern among the lagomorph’s populations in central Annamites. The findings have direct conservation implications for the species, as local stakeholders are currently establishing a conservation rescue and breeding facility for Annamite endemic species. Thus our results suggested that Annamite striped rabbits from multiple protected areas in central Annamites can be used as founders for the breeding program.
In chapter 3, the genetic material of six mammals, which are frequently found in Indochina's illegal wildlife trade, was extracted from leeches collected at six study sites across the Anamites. Species-specific genetic markers were used to obtain DNA fragments that were analysed together with Genbank reference sequences from other parts of the species’ distribution range. Our results showed that invertebrate-derived DNA can be used to fill the sampling gaps and provide genetic reference data that is needed for conservation breeding programmes or to counteract the illegal wildlife trade.
Overal, this dissertation provides the first insights in the ecology, distribution, and genetics of rare and threatened species of the Annamites by utilising camera traps and leech-derived DNA as two non-invasive collection methods. This information is essential for improving conservation efforts of local stakeholders and managers, especially for the Annamite endemics. Results in this dissertation also show the effectiveness of both non-invasive methods for studying terrestrial mammals at a landscape level. By expanding the application of these methods to other protected areas across the Annamites, we will further our understanding of ecology, distribution, and genetics of Annamite endemics. With such landscape-scale surveys, we are able to provide stakeholders with an overview of the current status of wildlife in the Annamites which supports efforts to protect these secretive species from illegal hunting and thus their extinction.
Leaf senescence is an active process required for plant survival, and it is flexibly controlled, allowing plant adaptation to environmental conditions. Although senescence is largely an age-dependent process, it can be triggered by environmental signals and stresses. Leaf senescence coordinates the breakdown and turnover of many cellular components, allowing a massive remobilization and recycling of nutrients from senescing tissues to other organs (e.g., young leaves, roots, and seeds), thus enhancing the fitness of the plant. Such metabolic coordination requires a tight regulation of gene expression. One important mechanism for the regulation of gene expression is at the transcriptional level via transcription factors (TFs). The NAC TF family (NAM, ATAF, CUC) includes various members that show elevated expression during senescence, including ORE1 (ANAC092/AtNAC2) among others. ORE1 was first reported in a screen for mutants with delayed senescence (oresara1, 2, 3, and 11). It was named after the Korean word “oresara,” meaning “long-living,” and abbreviated to ORE1, 2, 3, and 11, respectively. Although the pivotal role of ORE1 in controlling leaf senescence has recently been demonstrated, the underlying molecular mechanisms and the pathways it regulates are still poorly understood. To unravel the signaling cascade through which ORE1 exerts its function, we analyzed particular features of regulatory pathways up-stream and down-stream of ORE1. We identified characteristic spatial and temporal expression patterns of ORE1 that are conserved in Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum and that link ORE1 expression to senescence as well as to salt stress. We proved that ORE1 positively regulates natural and dark-induced senescence. Molecular characterization of the ORE1 promoter in silico and experimentally suggested a role of the 5’UTR in mediating ORE1 expression. ORE1 is a putative substrate of a calcium-dependent protein kinase named CKOR (unpublished data). Promising data revealed a positive regulation of putative ORE1 targets by CKOR, suggesting the phosphorylation of ORE1 as a requirement for its regulation. Additionally, as part of the ORE1 up-stream regulatory pathway, we identified the NAC TF ATAF1 which was able to transactivate the ORE1 promoter in vivo. Expression studies using chemically inducible ORE1 overexpression lines and transactivation assays employing leaf mesophyll cell protoplasts provided information on target genes whose expression was rapidly induced upon ORE1 induction. First, a set of target genes was established and referred to as early responding in the ORE1 regulatory network. The consensus binding site (BS) of ORE1 was characterized. Analysis of some putative targets revealed the presence of ORE1 BSs in their promoters and the in vitro and in vivo binding of ORE1 to their promoters. Among these putative target genes, BIFUNCTIONAL NUCLEASE I (BFN1) and VND-Interacting2 (VNI2) were further characterized. The expression of BFN1 was found to be dependent on the presence of ORE1. Our results provide convincing data which support a role for BFN1 as a direct target of ORE1. Characterization of VNI2 in age-dependent and stress-induced senescence revealed ORE1 as a key up-stream regulator since it can bind and activate VNI2 expression in vivo and in vitro. Furthermore, VNI2 was able to promote or delay senescence depending on the presence of an activation domain located in its C-terminal region. The plasticity of this gene might include alternative splicing (AS) to regulate its function in different organs and at different developmental stages, particularly during senescence. A model is proposed on the molecular mechanism governing the dual role of VNI2 during senescence.
The sequencing of the human genome in the early 2000s led to an increased interest in cheap and fast sequencing technologies. This interest culminated in the advent of next generation sequencing (NGS). A number of different NGS platforms have arisen since then all promising to do the same thing, i.e. produce large amounts of genetic information for relatively low costs compared to more traditional methods such as Sanger sequencing. The capabilities of NGS meant that researchers were no longer bound to species for which a lot of previous work had already been done (e.g. model organisms and humans) enabling a shift in research towards more novel and diverse species of interest. This capability has greatly benefitted many fields within the biological sciences, one of which being the field of evolutionary biology. Researchers have begun to move away from the study of laboratory model organisms to wild, natural populations and species which has greatly expanded our knowledge of evolution. NGS boasts a number of benefits over more traditional sequencing approaches. The main benefit comes from the capability to generate information for drastically more loci for a fraction of the cost. This is hugely beneficial to the study of wild animals as, even when large numbers of individuals are unobtainable, the amount of data produced still allows for accurate, reliable population and species level results from a small selection of individuals.
The use of NGS to study species for which little to no previous research has been carried out on and the production of novel evolutionary information and reference datasets for the greater scientific community were the focuses of this thesis. Two studies in this thesis focused on producing novel mitochondrial genomes from shotgun sequencing data through iterative mapping, bypassing the need for a close relative to serve as a reference sequence. These mitochondrial genomes were then used to infer species level relationships through phylogenetic analyses. The first of these studies involved reconstructing a complete mitochondrial genome of the bat eared fox (Otocyon megalotis). Phylogenetic analyses of the mitochondrial genome confidently placed the bat eared fox as sister to the clade consisting of the raccoon dog and true foxes within the canidae family. The next study also involved reconstructing a mitochondrial genome but in this case from the extinct Macrauchenia of South America. As this study utilised ancient DNA, it involved a lot of parameter testing, quality controls and strict thresholds to obtain a near complete mitochondrial genome devoid of contamination known to plague ancient DNA studies. Phylogenetic analyses confidently placed Macrauchenia as sister to all living representatives of Perissodactyla with a divergence time of ~66 million years ago. The third and final study of this thesis involved de novo assemblies of both nuclear and mitochondrial genomes from brown and striped hyena and focussed on demographic, genetic diversity and population genomic analyses within the brown hyena. Previous studies of the brown hyena hinted at very low levels of genomic diversity and, perhaps due to this, were unable to find any notable population structure across its range. By incorporating a large number of genetic loci, in the form of complete nuclear genomes, population structure within the brown hyena was uncovered. On top of this, genomic diversity levels were compared to a number of other species. Results showed the brown hyena to have the lowest genomic diversity out of all species included in the study which was perhaps caused by a continuous and ongoing decline in effective population size that started about one million years ago and dramatically accelerated towards the end of the Pleistocene.
The studies within this thesis show the power NGS sequencing has and its utility within evolutionary biology. The most notable capabilities outlined in this thesis involve the study of species for which no reference data is available and in the production of large amounts of data, providing evolutionary answers at the species and population level that data produced using more traditional techniques simply could not.
Plants are unable to move away from unwanted environments and therefore have to locally adapt to changing conditions. Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), a model organism in plant biology, has been able to rapidly colonize a wide spectrum of environments with different biotic and abiotic challenges. In recent years, natural variation in Arabidopsis has shown to be an excellent resource to study genes underlying adaptive traits and hybridization’s impact on natural diversity. Studies on Arabidopsis hybrids have provided information on the genetic basis of hybrid incompatibilities and heterosis, as well as inheritance patterns in hybrids. However, previous studies have focused mainly on global accessions and yet much remains to be known about variation happening within a local growth habitat. In my PhD, I investigated the impact of heterozygosity at a local collection site of Arabidopsis and its role in local adaptation. I focused on two different projects, both including hybrids among Arabidopsis individuals collected around Tübingen in Southern Germany. The first project sought to understand the impact of hybridization on metabolism and growth within a local Arabidopsis collection site. For this, the inheritance patterns in primary and secondary metabolism, together with rosette size of full diallel crosses among seven parents originating from Southern Germany were analyzed. In comparison to primary metabolites, compounds from secondary metabolism were more variable and showed pronounced non-additive inheritance patterns. In addition, defense metabolites, mainly glucosinolates, displayed the highest degree of variation from the midparent values and were positively correlated with a proxy for plant size.
In the second project, the role of ACCELERATED CELL DEATH 6 (ACD6) in the defense response pathway of Arabidopsis necrotic hybrids was further characterized. Allelic interactions of ACD6 have been previously linked to hybrid necrosis, both among global and local Arabidopsis accessions. Hence, I characterized the early metabolic and ionic changes induced by ACD6, together with marker gene expression assays of physiological responses linked to its activation. An upregulation of simple sugars and metabolites linked to non-enzymatic antioxidants and the TCA cycle were detected, together with putrescine and acids linked to abiotic stress responses. Senescence was found to be induced earlier in necrotic hybrids and cytoplasmic calcium signaling was unaffected in response to temperature. In parallel, GFP-tagged constructs of ACD6 were developed.
This work therefore gave novel insights on the role of heterozygosity in natural variation and adaptation and expanded our current knowledge on the physiological and molecular responses associated with ACD6 activation.
Predators can have numerical and behavioral effects on prey animals. While numerical effects are well explored, the impact of behavioral effects is unclear. Furthermore, behavioral effects are generally either analyzed with a focus on single individuals or with a focus on consequences for other trophic levels. Thereby, the impact of fear on the level of prey communities is overlooked, despite potential consequences for conservation and nature management. In order to improve our understanding of predator-prey interactions, an assessment of the consequences of fear in shaping prey community structures is crucial.
In this thesis, I evaluated how fear alters prey space use, community structure and composition, focusing on terrestrial mammals. By integrating landscapes of fear in an existing individual-based and spatially-explicit model, I simulated community assembly of prey animals via individual home range formation. The model comprises multiple hierarchical levels from individual home range behavior to patterns of prey community structure and composition. The mechanistic approach of the model allowed for the identification of underlying mechanism driving prey community responses under fear.
My results show that fear modified prey space use and community patterns. Under fear, prey animals shifted their home ranges towards safer areas of the landscape. Furthermore, fear decreased the total biomass and the diversity of the prey community and reinforced shifts in community composition towards smaller animals. These effects could be mediated by an increasing availability of refuges in the landscape. Under landscape changes, such as habitat loss and fragmentation, fear intensified negative effects on prey communities. Prey communities in risky environments were subject to a non-proportional diversity loss of up to 30% if fear was taken into account. Regarding habitat properties, I found that well-connected, large safe patches can reduce the negative consequences of habitat loss and fragmentation on prey communities. Including variation in risk perception between prey animals had consequences on prey space use. Animals with a high risk perception predominantly used safe areas of the landscape, while animals with a low risk perception preferred areas with a high food availability. On the community level, prey diversity was higher in heterogeneous landscapes of fear if individuals varied in their risk perception compared to scenarios in which all individuals had the same risk perception.
Overall, my findings give a first, comprehensive assessment of the role of fear in shaping prey communities. The linkage between individual home range behavior and patterns at the community level allows for a mechanistic understanding of the underlying processes. My results underline the importance of the structure of the landscape of fear as a key driver of prey community responses, especially if the habitat is threatened by landscape changes. Furthermore, I show that individual landscapes of fear can improve our understanding of the consequences of trait variation on community structures. Regarding conservation and nature management, my results support calls for modern conservation approaches that go beyond single species and address the protection of biotic interactions.
The movement of organisms has formed our planet like few other processes. Movements shape populations, communities, entire ecosystems, and guarantee fundamental ecosystem functions and services, like seed dispersal and pollination. Global, regional and local anthropogenic impacts influence animal movements across ecosystems all around the world. In particular, land-use modification, like habitat loss and fragmentation disrupt movements between habitats with profound consequences, from increased disease transmissions to reduced species richness and abundance. However, neither the influence of anthropogenic change on animal movement processes nor the resulting effects on ecosystems are well understood. Therefore, we need a coherent understanding of organismal movement processes and their underlying mechanisms to predict and prevent altered animal movements and their consequences for ecosystem functions.
In this thesis I aim at understanding the influence of anthropogenically caused land-use change on animal movement processes and their underlying mechanisms. In particular, I am interested in the synergistic influence of large-scale landscape structure and fine-scale habitat features on basic-level movement behaviours (e.g. the daily amount of time spend running, foraging, and resting) and their emerging higher-level movements (home range formation). Based on my findings, I identify the likely consequences of altered animal movements that lead to the loss of species richness and abundances.
The study system of my thesis are hares in agricultural landscapes. European brown hares (Lepus europaeus) are perfectly suited to study animal movements in agricultural landscapes, as hares are hermerophiles and prefer open habitats. They have historically thrived in agricultural landscapes, but their numbers are in decline. Agricultural areas are undergoing strong land-use changes due to increasing food demand and fast developing agricultural technologies. They are already the largest land-use class, covering 38% of the world’s terrestrial surface. To consider the relevance of a given landscape structure for animal movement behaviour I selected two differently structured agricultural landscapes – a simple landscape in Northern Germany with large fields and few landscape elements (e.g. hedges and tree stands), and a complex landscape in Southern Germany with small fields and many landscape elements.
I applied GPS devices (hourly fixes) with internal high-resolution accelerometers (4 min samples) to track hares, receiving an almost continuous observation of the animals’ behaviours via acceleration analyses. I used the spatial and behavioural information in combination with remote sensing data (normalized difference vegetation index, or NDVI, a proxy for resource availability), generating an almost complete idea of what the animal was doing when, why and where. Apart from landscape structure (represented by the two differently structured study areas), I specifically tested whether the following fine-scale habitat features influence animal movements: resource, agricultural management events, habitat diversity, and habitat structure.
My results show that, irrespective of the movement process or mechanism and the type of fine-scale habitat features, landscape structure was the overarching variable influencing hare movement behaviour. High resource variability forces hares to enlarge their home ranges, but only in the simple and not in the complex landscape. Agricultural management events result in home range shifts in both landscapes, but force hares to increase their home ranges only in the simple landscape. Also the preference of habitat patches with low vegetation and the avoidance of high vegetation, was stronger in the simple landscape. High and dense crop fields restricted hare movements temporarily to very local and small habitat patch remnants. Such insuperable barriers can separate habitat patches that were previously connected by mobile links. Hence, the transport of nutrients and genetic material is temporarily disrupted. This mechanism is also working on a global scale, as human induced changes from habitat loss and fragmentation to expanding monocultures cause a reduction in animal movements worldwide.
The mechanisms behind those findings show that higher-level movements, like increasing home ranges, emerge from underlying basic-level movements, like the behavioural modes. An increasing landscape simplicity first acts on the behavioural modes, i.e. hares run and forage more, but have less time to rest. Hence, the emergence of increased home range sizes in simple landscapes is based on an increased proportion of time running and foraging, largely due to longer travelling times between distant habitats and scarce resource items in the landscape. This relationship was especially strong during the reproductive phase, demonstrating the importance of high-quality habitat for reproduction and the need to keep up self-maintenance first, in low quality areas. These changes in movement behaviour may release a cascade of processes that start with more time being allocated to running and foraging, resulting into an increased energy expenditure and may lead to a decline in individual fitness. A decrease in individual fitness and reproductive output will ultimately affect population viability leading to local extinctions.
In conclusion, I show that landscape structure has one of the most important effects on hare movement behaviour. Synergistic effects of landscape structure, and fine-scale habitat features, first affect and modify basic-level movement behaviours, that can scales up to altered higher-level movements and may even lead to the decline of species richness and abundances, and the disruption of ecosystem functions. Understanding the connection between movement mechanisms and processes can help to predict and prevent anthropogenically induced changes in movement behaviour. With regard to the paramount importance of landscape structure, I strongly recommend to decrease the size of agricultural fields and increase crop diversity. On the small-scale, conservation policies should assure the year round provision of areas with low vegetation height and high quality forage. This could be done by generating wildflower strips and additional (semi-) natural habitat patches. This will not only help to increase the populations of European brown hares and other farmland species, but also ensure and protects the continuity of mobile links and their intrinsic value for sustaining important ecosystem functions and services.
This is a publication-based dissertation comprising three original research stud-ies (one published, one submitted and one ready for submission; status March 2019). The dissertation introduces a generic computer model as a tool to investigate the behaviour and population dynamics of animals in cyclic environments. The model is further employed for analysing how migratory birds respond to various scenarios of altered food supply under global change. Here, ecological and evolutionary time-scales are considered, as well as the biological constraints and trade-offs the individual faces, which ultimately shape response dynamics at the population level. Further, the effect of fine-scale temporal patterns in re-source supply are studied, which is challenging to achieve experimentally. My findings predict population declines, altered behavioural timing and negative carry-over effects arising in migratory birds under global change. They thus stress the need for intensified research on how ecological mechanisms are affected by global change and for effective conservation measures for migratory birds. The open-source modelling software created for this dissertation can now be used for other taxa and related research questions. Overall, this thesis improves our mechanistic understanding of the impacts of global change on migratory birds as one prerequisite to comprehend ongoing global biodiversity loss. The research results are discussed in a broader ecological and scientific context in a concluding synthesis chapter.
Uncovering the interplay between nutrient availability and cellulose biosynthesis inhibitor activity
(2022)
All plant cells are surrounded by a dynamic, carbohydrate-rich extracellular matrix known as the cell wall. Nutrient availability affects cell wall composition via uncharacterized regulatory mechanisms, and cellulose deficient mutants develop a hypersensitive root response to growth on high concentrations of nitrate. Since cell walls account for the bulk of plant biomass, it is important to understand how nutrients regulate cell walls. This could provide important knowledge for directing fertilizer treatments and engineering plants with higher nutrient use efficiency. The direct effect of nitrate on cell wall synthesis was investigated through growth assays on varying concentrations of nitrate, measuring cellulose content of roots and shoots, and assessing cellulose synthase activity (CESA) using live cell imaging with spinning disk confocal microscopy. A forward genetic screen was developed to isolate mutants impaired in nutrient-mediated cell wall regulation, revealing that cellulose biosynthesis inhibitor (CBI) activity is modulated by nutrient availability. Various non-CESA mutants were isolated that displayed CBI resistance, with the majority of mutations causing perturbation of mitochondria-localized proteins. To investigate mitochondrial involvement, the CBI mechanism of action was investigated using a reverse genetic screen, a targeted pharmacological screen, and -omics approaches. The results generated suggest that CBI-induced cellulose inhibition is due to off-target effects. This provides the groundwork to investigate uncharacterized processes of CESA regulation and adds valuable knowledge to the understanding of CBI activity, which could be harnessed to develop new and improved herbicides.
Biofilms are heterogeneous structures made of microorganisms embedded in a self-secreted extracellular matrix. Recently, biofilms have been studied as sustainable living materials with a focus on the tuning of their mechanical properties. One way of doing so is to use metal ions. In particular biofilms have been shown to stiffen in presence of some metal cations and to soften in presence of others. However, the specificity and the determinants of those interactions vary between species. While Escherichia coli is a widely studied model organism, little is known concerning the response of its biofilms to metal ions. In this work, we aimed at tuning the mechanics of E. coli biofilms by acting on the interplay between matrix composition and metal cations. To do so, we worked with E. coli strains producing a matrix composed of curli amyloid fibres or phosphoethanolamine-cellulose (pEtN-cellulose) fibres or both. The viscoelastic behaviour of the resulting biofilms was investigated with rheology after incubation with one of the following metal ion solutions: FeCl3, AlCl3, ZnCl2 and CaCl2 or ultrapure water. We observed that the strain producing both fibres stiffen by a factor of two when exposed to the trivalent metal cations Al(III) and Fe(III) while no such response is observed for the bivalent cations Zn(II) and Ca(II). Strains producing only one matrix component did not show any stiffening in response to either cation, but even a small softening. In order to investigate further the contribution of each matrix component to the mechanical properties, we introduced additional bacterial strains producing curli fibres in combination with non-modified cellulose, non-modified cellulose only or neither component. We measured biofilms produced by those different strains with rheology and without any solution. Since rheology does not preserve the architecture of the matrix, we compared those results to the mechanical properties of biofilms probed with the non-destructive microindentation. The microindentation results showed that biofilm stiffness is mainly determined by the presence of curli amyloid fibres in the matrix. However, this clear distinction between biofilm matrices containing or not containing curli is absent from the rheology results, i.e. following partial destruction of the matrix architecture. In addition, rheology also indicated a negative impact of curli on biofilm yield stress and flow stress. This suggests that curli fibres are more brittle and therefore more affected by the mechanical treatments. Finally, to examine the molecular interactions between the biofilms and the metal cations, we used Attenuated total reflectance - Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to study the three E.coli strains producing a matrix composed of curli amyloid fibres, pEtN-cellulose fibres or both. We measured biofilms produced by those strains in presence of each of the aforementioned metal cation solutions or ultrapure water. We showed that the three strains cannot be distinguished based on their FTIR spectra and that metal cations seem to have a non-specific effect on bacterial membranes in absence of pEtN-cellulose. We subsequently conducted similar experiments on purified curli or pEtN-cellulose fibres. The spectra of the pEtN-cellulose fibres revealed a non-valence-specific interaction between metal cations and the phosphate of the pEtN-modification. Altogether, these results demonstrate that the mechanical properties of E. coli biofilms can be tuned via incubation with metal ions. While the mechanism involving curli fibres remains to be determined, metal cations seem to adsorb onto pEtN-cellulose and this is not valence-specific. This work also underlines the importance of matrix architecture to biofilm mechanics and emphasises the specificity of each matrix composition.
The global drylands cover nearly half of the terrestrial surface and are home to more than two billion people. In many drylands, ongoing land-use change transforms near-natural savanna vegetation to agricultural land to increase food production. In Southern Africa, these heterogenous savanna ecosystems are also recognized as habitats of many protected animal species, such as elephant, lion and large herds of diverse herbivores, which are of great value for the tourism industry. Here, subsistence farmers and livestock herder communities often live in close proximity to nature conservation areas. Although these land-use transformations are different regarding the future they aspire to, both processes, nature conservation with large herbivores and agricultural intensification, have in common, that they change the vegetation structure of savanna ecosystems, usually leading to destruction of trees, shrubs and the woody biomass they consist of.
Such changes in woody vegetation cover and biomass are often regarded as forms of land degradation and forest loss. Global forest conservation approaches and international programs aim to stop degradation processes, also to conserve the carbon bound within wood from volatilization into earth’s atmosphere. In search for mitigation options against global climate change savannas are increasingly discussed as potential carbon sinks. Savannas, however, are not forests, in that they are naturally shaped by and adapted to disturbances, such as wildfires and herbivory. Unlike in forests, disturbances are necessary for stable, functioning savanna ecosystems and prevent these ecosystems from forming closed forest stands. Their consequently lower levels of carbon storage in woody vegetation have long been the reason for savannas to be overlooked as a potential carbon sink but recently the question was raised if carbon sequestration programs (such as REDD+) could also be applied to savanna ecosystems. However, heterogenous vegetation structure and chronic disturbances hamper the quantification of carbon stocks in savannas, and current procedures of carbon storage estimation entail high uncertainties due to methodological obstacles. It is therefore challenging to assess how future land-use changes such as agricultural intensification or increasing wildlife densities will impact the carbon storage balance of African drylands.
In this thesis, I address the research gap of accurately quantifying carbon storage in vegetation and soils of disturbance-prone savanna ecosystems. I further analyse relevant drivers for both ecosystem compartments and their implications for future carbon storage under land-use change. Moreover, I show that in savannas different carbon storage pools vary in their persistence to disturbance, causing carbon bound in shrub vegetation to be most likely to experience severe losses under land-use change while soil organic carbon stored in subsoils is least likely to be impacted by land-use change in the future.
I start with summarizing conventional approaches to carbon storage assessment and where and for which reasons they fail to accurately estimated savanna ecosystem carbon storage. Furthermore, I outline which future-making processes drive land-use change in Southern Africa along two pathways of land-use transformation and how these are likely to influence carbon storage. In the following chapters, I propose a new method of carbon storage estimation which is adapted to the specific conditions of disturbance-prone ecosystems and demonstrate the advantages of this approach in relation to existing forestry methods. Specifically, I highlight sources for previous over- and underestimation of savanna carbon stocks which the proposed methodology resolves. In the following chapters, I apply the new method to analyse impacts of land-use change on carbon storage in woody vegetation in conjunction with the soil compartment. With this interdisciplinary approach, I can demonstrate that indeed both, agricultural intensification and nature conservation with large herbivores, reduce woody carbon storage above- and belowground, but partly sequesters this carbon into the soil organic carbon stock. I then quantify whole-ecosystem carbon storage in different ecosystem compartments (above- and belowground woody carbon in shrubs and trees, respectively, as well as topsoil and subsoil organic carbon) of two savanna vegetation types (scrub savanna and savanna woodland). Moreover, in a space-for-time substitution I analyse how land-use changes impact carbon storage in each compartment and in the whole ecosystem. Carbon storage compartments are found to differ in their persistence to land-use change with carbon bound in shrub biomass being least persistent to future changes and subsoil organic carbon being most stable under changing land-use. I then explore which individual land-use change effects act as drivers of carbon storage through Generalized Additive Models (GAMs) and uncover non-linear effects, especially of elephant browsing, with implications for future carbon storage. In the last chapter, I discuss my findings in the larger context of this thesis and discuss relevant implications for land-use change and future-making decisions in rural Africa.
Transport von Proteinen und mikro RNAs im Pholoem von Brassica napus und Arabidopsis thaliana
(2010)
The nutrient exchange between plant and fungus is the key element of the arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis. The fungus improves the plant’s uptake of mineral nutrients, mainly phosphate, and water, while the plant provides the fungus with photosynthetically assimilated carbohydrates. Still, the knowledge about the mechanisms of the nutrient exchange between the symbiotic partners is very limited. Therefore, transport processes of both, the plant and the fungal partner, are investigated in this study. In order to enhance the understanding of the molecular basis underlying this tight interaction between the roots of Medicago truncatula and the AM fungus Rhizophagus irregularis, genes involved in transport processes of both symbiotic partners are analysed here. The AM-specific regulation and cell-specific expression of potential transporter genes of M. truncatula that were found to be specifically regulated in arbuscule-containing cells and in non-arbusculated cells of mycorrhizal roots was confirmed. A model for the carbon allocation in mycorrhizal roots is suggested, in which carbohydrates are mobilized in non-arbusculated cells and symplastically provided to the arbuscule-containing cells. New insights into the mechanisms of the carbohydrate allocation were gained by the analysis of hexose/H+ symporter MtHxt1 which is regulated in distinct cells of mycorrhizal roots. Metabolite profiling of leaves and roots of a knock-out mutant, hxt1, showed that it indeed does have an impact on the carbohydrate balance in the course of the symbiosis throughout the whole plant, and on the interaction with the fungal partner. The primary metabolite profile of M. truncatula was shown to be altered significantly in response to mycorrhizal colonization. Additionally, molecular mechanisms determining the progress of the interaction in the fungal partner of the AM symbiosis were investigated. The R. irregularis transcriptome in planta and in extraradical tissues gave new insight into genes that are differentially expressed in these two fungal tissues. Over 3200 fungal transcripts with a significantly altered expression level in laser capture microdissection-collected arbuscules compared to extraradical tissues were identified. Among them, six previously unknown specifically regulated potential transporter genes were found. These are likely to play a role in the nutrient exchange between plant and fungus. While the substrates of three potential MFS transporters are as yet unknown, two potential sugar transporters are might play a role in the carbohydrate flow towards the fungal partner. In summary, this study provides new insights into transport processes between plant and fungus in the course of the AM symbiosis, analysing M. truncatula on the transcript and metabolite level, and provides a dataset of the R. irregularis transcriptome in planta, providing a high amount of new information for future works.
Translation in plastids : elucidation of decoding mechanisms and functions of ribosomal components
(2008)
Die Strahlentherapie ist neben der Chemotherapie und einer operativen Entfernung die stärkste Waffe für die Bekämpfung bösartiger Tumore in der Krebsmedizin. Nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist Krebs die zweithäufigste Todesursache in der westlichen Welt, wobei Prostatakrebs heutzutage die häufigste, männliche Krebserkrankung darstellt. Trotz technologischer Fortschritte der radiologischen Verfahren kann es noch viele Jahre nach einer Radiotherapie zu einem Rezidiv kommen, was zum Teil auf die hohe Resistenzfähigkeit einzelner, entarteter Zellen des lokal vorkommenden Tumors zurückgeführt werden kann. Obwohl die moderne Strahlenbiologie viele Aspekte der Resistenzmechanismen näher beleuchtet hat, bleiben Fragestellungen, speziell über das zeitliche Ansprechen eines Tumors auf ionisierende Strahlung, größtenteils unbeantwortet, da systemweite Untersuchungen nur begrenzt vorliegen. Als Zellmodelle wurden vier Prostata-Krebszelllinien (PC3, DuCaP, DU-145, RWPE-1) mit unterschiedlichen Strahlungsempfindlichkeiten kultiviert und auf ihre Überlebensfähigkeit nach ionisierender Bestrahlung durch einen Trypanblau- und MTT-Vitalitätstest geprüft. Die proliferative Kapazität wurde mit einem Koloniebildungstest bestimmt. Die PC3 Zelllinie, als Strahlungsresistente, und die DuCaP Zelllinie, als Strahlungssensitive, zeigten dabei die größten Differenzen bezüglich der Strahlungsempfindlichkeit. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurden die beiden Zelllinien ausgewählt, um anhand ihrer transkriptomweiten Genexpressionen, eine Identifizierung potentieller Marker für die Prognose der Effizienz einer Strahlentherapie zu ermöglichen. Weiterhin wurde mit der PC3 Zelllinie ein Zeitreihenexperiment durchgeführt, wobei zu 8 verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 1 Gy die mRNA mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierung quantifiziert wurde, um das dynamisch zeitversetzte Genexpressionsverhalten auf Resistenzmechanismen untersuchen zu können. Durch das Setzen eines Fold Change Grenzwertes in Verbindung mit einem P-Wert < 0,01 konnten aus 10.966 aktiven Genen 730 signifikant differentiell exprimierte Gene bestimmt werden, von denen 305 stärker in der PC3 und 425 stärker in der DuCaP Zelllinie exprimiert werden. Innerhalb dieser 730 Gene sind viele stressassoziierte Gene wiederzufinden, wie bspw. die beiden Transmembranproteingene CA9 und CA12. Durch Berechnung eines Netzwerk-Scores konnten aus den GO- und KEGG-Datenbanken interessante Kategorien und Netzwerke abgeleitet werden, wobei insbesondere die GO-Kategorien Aldehyd-Dehydrogenase [NAD(P)+] Aktivität (GO:0004030) und der KEGG-Stoffwechselweg der O-Glykan Biosynthese (hsa00512) als relevante Netzwerke auffällig wurden. Durch eine weitere Interaktionsanalyse konnten zwei vielversprechende Netzwerke mit den Transkriptionsfaktoren JUN und FOS als zentrale Elemente identifiziert werden. Zum besseren Verständnis des dynamisch zeitversetzten Ansprechens der strahlungsresistenten PC3 Zelllinie auf ionisierende Strahlung, konnten anhand der 10.840 exprimierten Gene und ihrer Expressionsprofile über 8 Zeitpunkte interessante Einblicke erzielt werden. Während es innerhalb von 30 min (00:00 - 00:30) nach Bestrahlung zu einer schnellen Runterregulierung der globalen Genexpression kommt, folgen in den drei darauffolgenden Zeitabschnitten (00:30 - 01:03; 01:03 - 02:12; 02:12 - 04:38) spezifische Expressionserhöhungen, die eine Aktivierung schützender Netzwerke, wie die Hochregulierung der DNA-Reparatursysteme oder die Arretierung des Zellzyklus, auslösen. In den abschließenden drei Zeitbereichen (04:38 - 09:43; 09:43 - 20:25; 20:25 - 42:35) liegt wiederum eine Ausgewogenheit zwischen Induzierung und Supprimierung vor, wobei die absoluten Genexpressionsveränderungen ansteigen. Beim Vergleich der Genexpressionen kurz vor der Bestrahlung mit dem letzten Zeitpunkt (00:00 - 42:53) liegen mit 2.670 die meisten verändert exprimierten Gene vor, was einer massiven, systemweiten Genexpressionsänderung entspricht. Signalwege wie die ATM-Regulierung des Zellzyklus und der Apoptose, des NRF2-Signalwegs nach oxidativer Stresseinwirkung und die DNA-Reparaturmechanismen der homologen Rekombination, des nicht-homologen End Joinings, der MisMatch-, der Basen-Exzision- und der Strang-Exzision-Reparatur spielen bei der zellulären Antwort eine tragende Rolle. Äußerst interessant sind weiterhin die hohen Aktivitäten RNA-gesteuerter Ereignisse, insbesondere von small nucleolar RNAs und Pseudouridin-Prozessen. Demnach scheinen diese RNA-modifizierenden Netzwerke einen bisher unbekannten funktionalen und schützenden Einfluss auf das Zellüberleben nach ionisierender Bestrahlung zu haben. All diese schützenden Netzwerke mit ihren zeitspezifischen Interaktionen sind essentiell für das Zellüberleben nach Einwirkung von oxidativem Stress und zeigen ein komplexes aber im Einklang befindliches Zusammenspiel vieler Einzelkomponenten zu einem systemweit ablaufenden Programm.
Die Etablierung der Transkription von kompletten Genen auf planaren Oberflächen soll eine Verbindung zwischen der Mikroarraytechnologie und der Transkriptomforschung herstellen. Darüber hinaus kann mit diesem Verfahren ein Brückenschlag zwischen der Synthese der Gene und ihrer kodierenden Proteine auf einer Oberfläche erfolgen. Alle transkribierten RNAs wurden mittels RT-PCR in cDNA umgeschrieben und in einer genspezifischen PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden hierfür entweder per Hand oder maschinell auf die Oberfläche transferiert. Über eine Oberflächen-PCR war es möglich, die Gensequenz des Reportergens EGFP direkt auf der Oberfläche zu synthetisieren und anschließend zu transkribieren. Somit war eine Transkription mit weniger als 1 ng an Matrize möglich. Der Vorteil einer Oberflächen-Transkription gegenüber der in Lösung liegt in der mehrfachen Verwendung der immobilisierten Matrize, wie sie in dieser Arbeit dreimal erfolgreich absolviert wurde. Die Oberflächen-Translation des EGFP-Gens konnte ebenfalls zweimal an einer immobilisierten Matrize gezeigt werden, wobei Zweifel über eine echte Festphasen-Translation nicht ausgeräumt werden konnten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Transkription und Translation von immobilisierten Gensequenzen auf planaren Oberflächen möglich ist, wofür die linearen Matrizen direkt auf der Oberfläche synthetisiert werden können.
Transcription factor networks in the initial ohase of drouht stress in rice (Oryza sativa L.)
(2009)
For more than two centuries, plant ecologists have aimed to understand how environmental gradients and biotic interactions shape the distribution and co-occurrence of plant species. In recent years, functional trait–based approaches have been increasingly used to predict patterns of species co-occurrence and species distributions along environmental gradients (trait–environment relationships). Functional traits are measurable properties at the individual level that correlate well with important processes. Thus, they allow us to identify general patterns by synthesizing studies across specific taxonomic compositions, thereby fostering our understanding of the underlying processes of species assembly. However, the importance of specific processes have been shown to be highly dependent on the spatial scale under consideration. In particular, it remains uncertain which mechanisms drive species assembly and allow for plant species coexistence at smaller, more local spatial scales. Furthermore, there is still no consensus on how particular environmental gradients affect the trait composition of plant communities. For example, increasing drought because of climate change is predicted to be a main threat to plant diversity, although it remains unclear which traits of species respond to increasing aridity. Similarly, there is conflicting evidence of how soil fertilization affects the traits related to establishment ability (e.g., seed mass). In this cumulative dissertation, I present three empirical trait-based studies that investigate specific research questions in order to improve our understanding of species distributions along environmental gradients.
In the first case study, I analyze how annual species assemble at the local scale and how environmental heterogeneity affects different facets of biodiversity—i.e. taxonomic, functional, and phylogenetic diversity—at different spatial scales. The study was conducted in a semi-arid environment at the transition zone between desert and Mediterranean ecosystems that features a sharp precipitation gradient (Israel). Different null model analyses revealed strong support for environmentally driven species assembly at the local scale, since species with similar traits tended to co-occur and shared high abundances within microsites (trait convergence). A phylogenetic approach, which assumes that closely related species are functionally more similar to each other than distantly related ones, partly supported these results. However, I observed that species abundances within microsites were, surprisingly, more evenly distributed across the phylogenetic tree than expected (phylogenetic overdispersion). Furthermore, I showed that environmental heterogeneity has a positive effect on diversity, which was higher on functional than on taxonomic diversity and increased with spatial scale. The results of this case study indicate that environmental heterogeneity may act as a stabilizing factor to maintain species diversity at local scales, since it influenced species distribution according to their traits and positively influenced diversity. All results were constant along the precipitation gradient.
In the second case study (same study system as case study one), I explore the trait responses of two Mediterranean annuals (Geropogon hybridus and Crupina crupinastrum) along a precipitation gradient that is comparable to the maximum changes in precipitation predicted to occur by the end of this century (i.e., −30%). The heterocarpic G. hybridus showed strong trends in seed traits, suggesting that dispersal ability increased with aridity. By contrast, the homocarpic C. crupinastrum showed only a decrease in plant height as aridity increased, while leaf traits of both species showed no consistent pattern along the precipitation gradient. Furthermore, variance decomposition of traits revealed that most of the trait variation observed in the study system was actually found within populations. I conclude that trait responses towards aridity are highly species-specific and that the amount of precipitation is not the most striking environmental factor at this particular scale.
In the third case study, I assess how soil fertilization mediates—directly by increased nutrient addition and indirectly by increased competition—the effect of seed mass on establishment ability. For this experiment, I used 22 species differing in seed mass from dry grasslands in northeastern Germany and analyzed the interacting effects of seed mass with nutrient availability and competition on four key components of seedling establishment: seedling emergence, time of seedling emergence, seedling survival, and seedling growth. (Time of) seedling emergence was not affected by seed mass. However, I observed that the positive effect of seed mass on seedling survival is lowered under conditions of high nutrient availability, whereas the positive effect of seed mass on seedling growth was only reduced by competition. Based on these findings, I developed a conceptual model of how seed mass should change along a soil fertility gradient in order to reconcile conflicting findings from the literature. In this model, seed mass shows a U-shaped pattern along the soil fertility gradient as a result of changing nutrient availability and competition.
Overall, the three case studies highlight the role of environmental factors on species distribution and co-occurrence. Moreover, the findings of this thesis indicate that spatial heterogeneity at local scales may act as a stabilizing factor that allows species with different traits to coexist. In the concluding discussion, I critically debate intraspecific trait variability in plant community ecology, the use of phylogenetic relationships and easily measured key functional traits as a proxy for species’ niches. Finally, I offer my outlook for the future of functional plant community research.
The increasing introduction of non-native plant species may pose a threat to local biodiversity. However, the basis of successful plant invasion is not conclusively understood, especially since these plant species can adapt to the new range within a short period of time despite impoverished genetic diversity of the starting populations. In this context, DNA methylation is considered promising to explain successful adaptation mechanisms in the new habitat. DNA methylation is a heritable variation in gene expression without changing the underlying genetic information. Thus, DNA methylation is considered a so-called epigenetic mechanism, but has been studied in mainly clonally reproducing plant species or genetic model plants. An understanding of this epigenetic mechanism in the context of non-native, predominantly sexually reproducing plant species might help to expand knowledge in biodiversity research on the interaction between plants and their habitats and, based on this, may enable more precise measures in conservation biology.
For my studies, I combined chemical DNA demethylation of field-collected seed material from predominantly sexually reproducing species and rearing offsping under common climatic conditions to examine DNA methylation in an ecological-evolutionary context. The contrast of chemically treated (demethylated) plants, whose variation in DNA methylation was artificially reduced, and untreated control plants of the same species allowed me to study the impact of this mechanism on adaptive trait differentiation and local adaptation. With this experimental background, I conducted three studies examining the effect of DNA methylation in non-native species along a climatic gradient and also between climatically divergent regions.
The first study focused on adaptive trait differentiation in two invasive perennial goldenrod species, Solidago canadensis sensu latu and S. gigantea AITON, along a climate gradient of more than 1000 km in length in Central Europe. I found population differences in flowering timing, plant height, and biomass in the temporally longer-established S. canadensis, but only in the number of regrowing shoots for S. gigantea. While S. canadensis did not show any population structure, I was able to identify three genetic groups along this climatic gradient in S. gigantea. Surprisingly, demethylated plants of both species showed no change in the majority of traits studied. In the subsequent second study, I focused on the longer-established goldenrod species S. canadensis and used molecular analyses to infer spatial epigenetic and genetic population differences in the same specimens from the previous study. I found weak genetic but no epigenetic spatial variation between populations. Additionally, I was able to identify one genetic marker and one epigenetic marker putatively susceptible to selection. However, the results of this study reconfirmed that the epigenetic mechanism of DNA methylation appears to be hardly involved in adaptive processes within the new range in S. canadensis.
Finally, I conducted a third study in which I reciprocally transplanted short-lived plant species between two climatically divergent regions in Germany to investigate local adaptation at the plant family level. For this purpose, I used four plant families (Amaranthaceae, Asteraceae, Plantaginaceae, Solanaceae) and here I additionally compared between non-native and native plant species. Seeds were transplanted to regions with a distance of more than 600 kilometers and had either a temperate-oceanic or a temperate-continental climate. In this study, some species were found to be maladapted to their own local conditions, both in non-native and native plant species alike. In demethylated individuals of the plant species studied, DNA methylation had inconsistent but species-specific effects on survival and biomass production. The results of this study highlight that DNA methylation did not make a substantial contribution to local adaptation in the non-native as well as native species studied.
In summary, my work showed that DNA methylation plays a negligible role in both adaptive trait variation along climatic gradients and local adaptation in non-native plant species that either exhibit a high degree of genetic variation or rely mainly on sexual reproduction with low clonal propagation. I was able to show that the adaptive success of these non-native plant species can hardly be explained by DNA methylation, but could be a possible consequence of multiple introductions, dispersal corridors and meta-population dynamics. Similarly, my results illustrate that the use of plant species that do not predominantly reproduce clonally and are not model plants is essential to characterize the effect size of epigenetic mechanisms in an ecological-evolutionary context.
Traffic of molecular motors
(2008)
The horse is a fascinating animal symbolizing power, beauty, strength and grace. Among all the animal species domesticated the horse had the largest impact on the course of human history due to its importance for warfare and transportation. Studying the process of horse domestication contributes to the knowledge about the history of horses and even of our own species.
Research based on molecular methods has increasingly focused on the genetic basis of horse domestication. Mitochondrial DNA (mtDNA) analyses of modern and ancient horses detected immense maternal diversity, probably due to many mares that contributed to the domestic population. However, mtDNA does not provide an informative phylogeographic structure. In contrast, Y chromosome analyses displayed almost complete uniformity in modern stallions but relatively high diversity in a few ancient horses. Further molecular markers that seem to be well suited to infer the domestication history of horses or genetic and phenotypic changes during this process are loci associated with phenotypic traits.
This doctoral thesis consists of three different parts for which I analyzed various single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with coat color, locomotion or Y chromosomal variation of horses. These SNPs were genotyped in 350 ancient horses from the Chalcolithic (5,000 BC) to the Middle Ages (11th century). The distribution of the samples ranges from China to the Iberian Peninsula and Iceland. By applying multiplexed next-generation sequencing (NGS) I sequenced short amplicons covering the relevant positions: i) eight coat-color-associated mutations in six genes to deduce the coat color phenotype; ii) the so-called ’Gait-keeper’ SNP in the DMRT3 gene to screen for the ability to amble; iii) 16 SNPs previously detected in ancient horses to infer the corresponding haplotype. Based on these data I investigated the occurrence and frequencies of alleles underlying the respective phenotypes as well as Y chromosome haplotypes at different times and regions. Also, selection coefficients for several Y chromosome lineages or phenotypes were estimated.
Concerning coat color differences in ancient horses my work constitutes the most comprehensive study to date. I detected an increase of chestnut horses in the Middle Ages as well as differential selection for spotted and solid phenotypes over time which reflects changing human preferences.
With regard to ambling horses, the corresponding allele was present in medieval English and Icelandic horses. Based on these results I argue that Norse settlers, who frequently invaded parts of Britain, brought ambling individuals to Iceland from the British Isles which can be regarded the origin of this trait. Moreover, these settlers appear to have selected for ambling in Icelandic horses.
Relating to the third trait, the paternal diversity, these findings represent the largest ancient dataset of Y chromosome variation in non-humans. I proved the existence of several Y chromosome haplotypes in early domestic horses. The decline of Y chromosome variation coincides with the movement of nomadic peoples from the Eurasian steppes and later with different breeding practices in the Roman period.
In conclusion, positive selection was estimated for several phenotypes/lineages
in different regions or times which indicates that these were preferred by humans. Furthermore, I could successfully infer the distribution and dispersal of horses in association with human movements and actions. Thereby, a better understanding of the influence of people on the changing appearance and genetic diversity of domestic horses could be gained. My results also emphasize the close relationship of ancient genetics and archeology or history and that only in combination well-founded conclusions can be reached.
Water-deficits can cause lethal damage to organisms, which is rooted in cellular dehydration. Many plant species, but also other organisms have developed mechanisms to tolerate such stresses, such as the expression of LEA proteins. Many studies report on physiological protective functions of LEA proteins but lack information about their precise mechanisms on a molecular level. Most LEA proteins are intrinsically disordered in dilute solution but may adopt a distinct secondary structure upon changes in solvent conditions. Understanding the molecular mechanism of how LEA proteins contribute to the counteraction of cellular damage during water-deficits may in the long-term pave the way for breeding crops that are resistant to the effects of global warming. The objective of the work at hand is to improve the biophysical understanding of the sequencestructure-function relationship of LEA proteins as membrane stabilizers, based on the LEA_4 family of the model plant A. thaliana. This is pursued by using a combination of spectroscopic and scattering techniques, supported by bioinformatics and computational analyses. Eight out of the 18 LEA_4 proteins are experimentally assessed revealing that a coil-helix transition in response to water-deficit is a common feature, as predicted for the entire family. In addition, they all stabilize simple membrane models during a freeze/ thaw cycle. Three-dimensional structure prediction of representative members suggests that their completely folded states are represented by a sequential arrangement of alpha-helical segments connected by unstructured linkers, which is experimentally verified for the LEA_4 protein COR15A. The unstructured linker region of COR15A represents a conserved motif among its closest homologs and is, therefore, of particular interest. Facilitating a set of seven designed and investigated COR15A mutants uncovers a complex interplay of transient interactions between the amphipathic alpha-helical segments, mediated by the linker, which fine-tunes folding transitions and structural ensembles upon reduced water-availability. Finally, alpha-helicity is also induced in COR15A upon temperature decrease, which is enhanced in the presence of osmolytes. In addition, high solution osmolarity induced secondary structure is followed by oligomerization of COR15A. Interestingly, the functionality of COR15A, in terms of liposome stabilization, strongly correlates with its alpha-helix ratio in the folded state. The present work significantly improves the understanding of the sequence-structure-function relationship for LEA_4 proteins and offers novel findings on folding mechanisms and oligomerization of COR15A.
This work presents mathematical and computational approaches to cover various aspects of metabolic network modelling, especially regarding the limited availability of detailed kinetic knowledge on reaction rates. It is shown that precise mathematical formulations of problems are needed i) to find appropriate and, if possible, efficient algorithms to solve them, and ii) to determine the quality of the found approximate solutions. Furthermore, some means are introduced to gain insights on dynamic properties of metabolic networks either directly from the network structure or by additionally incorporating steady-state information. Finally, an approach to identify key reactions in a metabolic networks is introduced, which helps to develop simple yet useful kinetic models. The rise of novel techniques renders genome sequencing increasingly fast and cheap. In the near future, this will allow to analyze biological networks not only for species but also for individuals. Hence, automatic reconstruction of metabolic networks provides itself as a means for evaluating this huge amount of experimental data. A mathematical formulation as an optimization problem is presented, taking into account existing knowledge and experimental data as well as the probabilistic predictions of various bioinformatical methods. The reconstructed networks are optimized for having large connected components of high accuracy, hence avoiding fragmentation into small isolated subnetworks. The usefulness of this formalism is exemplified on the reconstruction of the sucrose biosynthesis pathway in Chlamydomonas reinhardtii. The problem is shown to be computationally demanding and therefore necessitates efficient approximation algorithms. The problem of minimal nutrient requirements for genome-scale metabolic networks is analyzed. Given a metabolic network and a set of target metabolites, the inverse scope problem has as it objective determining a minimal set of metabolites that have to be provided in order to produce the target metabolites. These target metabolites might stem from experimental measurements and therefore are known to be produced by the metabolic network under study, or are given as the desired end-products of a biotechological application. The inverse scope problem is shown to be computationally hard to solve. However, I assume that the complexity strongly depends on the number of directed cycles within the metabolic network. This might guide the development of efficient approximation algorithms. Assuming mass-action kinetics, chemical reaction network theory (CRNT) allows for eliciting conclusions about multistability directly from the structure of metabolic networks. Although CRNT is based on mass-action kinetics originally, it is shown how to incorporate further reaction schemes by emulating molecular enzyme mechanisms. CRNT is used to compare several models of the Calvin cycle, which differ in size and level of abstraction. Definite results are obtained for small models, but the available set of theorems and algorithms provided by CRNT can not be applied to larger models due to the computational limitations of the currently available implementations of the provided algorithms. Given the stoichiometry of a metabolic network together with steady-state fluxes and concentrations, structural kinetic modelling allows to analyze the dynamic behavior of the metabolic network, even if the explicit rate equations are not known. In particular, this sampling approach is used to study the stabilizing effects of allosteric regulation in a model of human erythrocytes. Furthermore, the reactions of that model can be ranked according to their impact on stability of the steady state. The most important reactions in that respect are identified as hexokinase, phosphofructokinase and pyruvate kinase, which are known to be highly regulated and almost irreversible. Kinetic modelling approaches using standard rate equations are compared and evaluated against reference models for erythrocytes and hepatocytes. The results from this simplified kinetic models can simulate acceptably the temporal behavior for small changes around a given steady state, but fail to capture important characteristics for larger changes. The aforementioned approach to rank reactions according to their influence on stability is used to identify a small number of key reactions. These reactions are modelled in detail, including knowledge about allosteric regulation, while all other reactions were still described by simplified reaction rates. These so-called hybrid models can capture the characteristics of the reference models significantly better than the simplified models alone. The resulting hybrid models might serve as a good starting point for kinetic modelling of genome-scale metabolic networks, as they provide reasonable results in the absence of experimental data, regarding, for instance, allosteric regulations, for a vast majority of enzymatic reactions.