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Lumineszierende Filme durch alternierende Adsorption von CdTe-Nanopartikeln und Polyelektrolyten
(2002)
Studien der Funktion des Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. SDD1-Gens in der stomatären Musterbildung
(2002)
Im Großtrappenschutzgebiet "Belziger Landschaftswiesen" wurden an ausgewählten Standorten mikrobielle Aktivitäten, die im Zusammenhang mit dem Stickstoffkreislauf stehen, überprüft und bewertet. Es werden auch Möglichkeiten erörtert, die der Bildung bzw. Akkumulation pflanzenverfügbarer Stickstofformen mit geeigneten Bewirtschaftungsmaßnahmen entgegenwirken.
Savannen sind Landschaften in Trockengebieten der Tropen und Subtropen und bestehen aus Grasland mit darin eingestreuten, einzeln stehenden, großen Bäumen. Interaktionen einzelner Tier- und Pflanzengruppen, gekoppelt mit ökologisch relevanten Faktoren wie Feuer, Niederschlag oder Beweidung, prägen in besonderem Maße die Landschaftsstruktur von Savannen.
Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, katalytische Antikörper zur Hydrolyse von Benzylphenylcarbamaten sowie zahlreiche monoklonale Antikörper gegen Haptene herzustellen. Es wurden verschiedene Hapten-Protein-Konjugate unter Verwendung unterschiedlicher Kopplungsmethoden hergestellt und charakterisiert. Zur Generierung der hydrolytisch aktiven Antikörper wurden Inzuchtmäuse mit KLH-Konjugaten von 4 Übergangszustandsanaloga (ÜZA) immunisiert. Mit Hilfe der Hybridomtechnik wurden verschiedene monoklonale Antikörper gegen diese ÜZA gewonnen. Dabei wurden sowohl verschiedene Immunisierungsschemata als auch verschiedene Inzuchtmausstämme und Fusionstechniken verwendet. Insgesamt wurden 32 monoklonale Antikörper gegen die verwendeten ÜZA selektiert. Diese Antikörper wurden in großen Mengen hergestellt und gereinigt. Zum Nachweis der Antikörper-vermittelten Katalyse wurden verschiedene Methoden entwickelt und eingesetzt, darunter immunologische Nachweismethoden mit Anti-Substrat- und Anti-Produkt-Antikörpern und eine photometrische Methode mit Dimethylaminozimtaldehyd. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität gelang mit Hilfe eines Enzymsensors, basierend auf immobilisierter Tyrosinase. Die Antikörper N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysierten die Benzylphenylcarbamate POCc18, POCc19 und Substanz 27. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität dieser Antikörper gelang auch mit Hilfe der HPLC. Der katalytische Antikörper N1-BC1-D11 wurde kinetisch und thermodynamisch untersucht. Es wurde eine Michaelis-Menten-Kinetik mit Km von 210 µM, vmax von 3 mM/min und kcat von 222 min-1 beobachtet. Diese Werte korrelieren mit den Werten der wenigen bekannten Diphenylcarbamat-spaltenden Abzyme. Die Beschleunigungsrate des Antikörpers N1-BC1-D11 betrug 10. Das ÜZA Hei3 hemmte die hydrolytische Aktivität. Dies beweist, dass die Hydrolyse in der Antigenbindungsstelle stattfindet. Weiter wurde zwischen der Antikörperkonzentration und der Umsatzgeschwindigkeit eine lineare Abhängigkeit festgestellt. Die thermodynamische Gleichtgewichtsdissoziationskonstante KD des Abzyms von 2,6 nM zeugt von einer sehr guten Affinität zum ÜZA. Hydrolytisch aktiv waren nur Antikörper, die gegen das Übergangszustandsanalogon Hei3 hergestellt worden waren. Es wird vermutet, dass die Hydrolyse der Benzylphenylcarbamate über einen Additions-Eliminierungsmechanismus unter Ausbildung eines tetraedrischen Übergangszustandes verläuft, dessen analoge Verbindung Hei3 ist. Im Rahmen der Generierung von Nachweisantikörpern zur Detektion der Substratabnahme bei der Hydrolyse wurden Anti-Diuron-Antikörper hergestellt. Einer der Antikörper (B91-CG5) ist spezifisch für das Herbizid Diuron und hat einen IC50-Wert von 0,19 µg/l und eine untere Nachweisgrenze von 0,04 µg/l. Ein anderer Antikörper (B91-KF5) reagiert kreuz mit einer Palette ähnlicher Herbizide. Mit diesen Antikörpern wurde ein empfindlicher Labortest, der ein Monitoring von Diuron auf Grundlage des durch die Trinkwasserverordnung festgeschriebenen Wertes für Pflanzenschutzmittel von 0,1 µg/l erlaubt, aufgebaut. Der Effekt der Anti-Diuron-Antikörper auf die Diuron-inhibierte Photosynthese wurde in vitro und in vivo untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl in isolierten Thylakoiden, als auch in intakten Algen eine Vorinkubation der Anti-Diuron-Antikörper mit Diuron zur Inaktivierung seiner Photosynthese-hemmenden Wirkung führt. Wurde der Elektronentransport in den isolierten Thylakoiden oder in Algen durch Diuron unterbrochen, so führte die Zugabe der Anti-Diuron-Antikörper zur Reaktivierung der Elektronenübertragung.
Hämoglobin-A1c (HbA1c) ist ein Hämoglobin (Hb)-Subtypus, der durch nicht-enzymatische Glykierung des N-terminalen Valinrestes der Hämoglobin-beta-Kette entsteht. Das gemessene Verhältnis von HbA1c zum Gesamt-Hämoglobin (5-20 % bei Diabetikern) repräsentiert den Mittelwert der Blutglucosekonzentration über einen zweimonatigen Zeitraum und stellt zur Beurteilung der diabetischen Stoffwechsellage eine Ergänzung zur Akutkontrolle der Glukosekonzentration dar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen amperometrischen Biosensor für die Bestimmung des medizinisch relevanten Parameters HbA1c zu entwickeln. Durch Selektion geeigneter Bioerkennungselemente und deren Immobilisierung unter Erhalt der Bindungsfunktion für die Zielmoleküle Hämoglobin bzw. HbA1c wurden spezifische, hochaffine und regenerationsstabile Sensoroberflächen geschaffen. Für die Entwicklung des HbA1c-Biosensors wurden zwei Konzepte - Enzymsensor und Immunosensor - miteinander verglichen. Die enzymatische Umsetzung von HbA1c erfolgte mit der Fructosylamin Oxidase (FAO) aus Pichia pastoris N 1-1 unter Freisetzung von H2O2, welches sowohl optisch über eine Indikatorreaktion als auch elektrochemisch nach Einschluss der FAO in PVA-SbQ und Fixierung des Immobilisats vor einer H2O2-Elektrode nachgewiesen wurde. Die Kalibration des Enzymsensors mit der HbA1c-Modellsubstanz Fructosyl-Valin ergab Nachweisgrenzen, die ausserhalb des physiologisch relevanten HbA1c-Konzentrationsbereich lagen. Aus der Umsetzung von glykierten Peptiden mit einer nicht HbA1c analogen Aminosäurensequenz, z.B. Fructosyl-Valin-Glycin wurde zudem eine geringe HbA1c-Spezifität abgeleitet. Für den Immunosensor wurden zwei heterogene Immunoassay-Formate unter Verwendung von hochaffinen und spezifischen Antikörpern in Kombination mit Glucose Oxidase (GOD) als Markerenzym zum Nachweis von HbA1c untersucht. Beim indirekt-kompetitiven Immunoassay wurde anstelle des kompletten HbA1c-Moleküls das glykierte Pentapeptid Fructosyl-Valin-Histidin-Leucin-Threonin-Prolin (glkPP) als Kompetitor und Affinitätsligand immobilisiert und so eine regenerierfähige Oberfläche geschaffen. Beim Sandwich-Immunoassay wurde im ersten Schritt Gesamt-Hämoglobin an die mit Haptoglobin (Hp) modifizierte Festphase angereichert und im zweiten Schritt der gebundene HbA1c-Anteil nachgewiesen. Für die Konstruktion des HbA1c-Immunosensors wurden Affinitätsmatrizen durch Modifizierung von Cellulose-Dialysemembranen mit glkPP bzw. Hp hergestellt. Grundlegend studiert wurde die Aktivierung der Cellulose-Membranen mit 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) und 1-Cyano-4-dimethylaminopyridintetrafluoroborat (CDAP) als Aktivierungsagenzien. Eine gerichtete Immobilisierung der Liganden wurde realisiert, indem glkPP über dessen C-Terminus (einzige Carboxylatgruppe) und Hp über dessen periodat-oxidiertem Kohlenhydratrest an die amino- oder hydrazidfunktionalisierte Membranen kovalent gekoppelt wurden. Mit dem Einsatz der glkPP- und Hp-modifizierten Membranen in der elektrochemischen Messzelle war erstmalig der biosensorische Nachweis von HbA1c möglich. Als Transduktor diente eine Pt-Elektrode, an der das von der GOD generierte H2O2 umgesetzt und ein mit der HbA1c-Konzentration korrelierendes Stromsignal erzeugt wurde. Die Immunosensoren zeigten Ansprechzeiten von 3 s. Mit dem Immunosensor auf Basis des indirekt-kompetitiven Testprinzips wurde eine Kalibrationskurve für HbA1c im Bereich von 0,25-30 µg/ml (3,9-465 nM, CV 3-9 %) mit Assayzeiten von 60 min und mit dem Immunosensor im Sandwich-Format eine Kalibrationskurve im Bereich von 0,5-5 µg/ml (7,8-78 nM; 5-50 % HbA1c vom Gesamt-Hb, CV 6-10 %, 3 h) aufgenommen.
In der vorliegenden Dissertation wird die Bedeutung von Brachen für Artenvielfalt und Stabilität von Blüte-Bestäuber-Nahrungsnetzen in agrarisch genutzten Landschaften anhand ausgewählter blütenbesuchender Insektengruppen (Syrphidae, Lepidoptera) untersucht. Die Freilandarbeiten fanden von 1998-2000 im Raum der Feldberger Seenlandschaft, Mecklenburg-Vorpommern, statt. Es werden die beiden Hauptnahrungsquellen Nektar und Pollen betrachtet, dabei fanden Untersuchungen zur Intensität der Blüte-Bestäuber-Interaktion auf Stilllegungsflächen, zum flächenbezogenen quantitativen Nektarangebot im Jahresverlauf, zur individuellen Pollennutzung bei Syrphiden und zur Breite und Überlappung der Nahrungsnischen bei den dominanten Arten Episyrphus balteatus, Metasyrphus corollae, Syritta pipiens und Sphaerophoria scripta statt. Im Ergebnis zeigt sich eine hohe Bedeutung der Brachflächen für die Stabilität des Blüte-Bestäuber-Netzes, während die Diversität von anderen, eher landschaftsbezogenen Faktoren abhängig ist.
Modellgestützte Untersuchungen zum Überleben einer Steinkauzpopulation (Athene noctua) in Thüringen
(2002)
Der Rückgang des Steinkauzes (Athene noctua) hat in Thüringen und Sachsen seit den 60er Jahren dramatische Ausmaße angenommen. In den 50er Jahren noch flächendeckend beobachtet, wurden für das Jahr 2000 nur noch 18 Individuen durch Bestandserfassungen registriert. Die vielfach diskutierten Rückgangsursachen beziehen sich vor Allem auf die großflächige Änderung der Landschaftsstrukturen, die zum Verlust der Lebensgrundlagen des Steinkauzes führten. So haben u.a. der Verlust an Brut- und Vorratshöhlen und an ganzjährig kurzgehaltenen Grünlandflächen, sowie der zunehmende Einfluss von Prädatoren erheblich zum Rückgang beigetragen. Eingeleitete Schutzmaßnahmen, ehrenamtlich oder auf dem allgemeinen Naturschutzprogramm des Freistaates Thüringen beruhend, wie das Anbringen von Nisthilfen mit Marderschutz oder Pflegeverträge für Streuobstwiesen, zeigen bisher keine sichtbare Wirkung. Als weitergehende Maßnahmen stehen die Reduzierung von Füchsen (Vulpes vulpes) und Steinmardern (Martes foina), Ausbreitungskorridore für Steinkäuze und ein Auswilderungsprogramm zur Diskussion. Angesichts des Populationsrückgangs des Steinkauz war es Aufgabe dieser Arbeit durch ein Simulationsmodell Untersuchungen zum Überleben einer Steinkauzpopulation (Athene noctua) in Thüringen durchzuführen. Die zusammengetragenen Bestandszahlen ergaben geringe Individuenzahlen in den thüringischen Landkreisen Altenburger Land, Greiz und der Stadt Gera sowie in den sächsischen Landkreisen Chemnitzer Land und Mittweida. Die Bestandszahlen der Jahre 1989-2001, sowie weitere der Literatur entnommene Daten zum populationsökologischen Hintergrund, wie auch Analysen des Gebietes in Thüringen und Sachsen und dessen besetzter Reviere der Jahre 1989- 2001, wurden in ein stochastisches, räumlich-explizites, auf Individuen basierendes Simulationsmodell eingebracht. Es wurde eine Sensitivitätsanalyse durchgeführt, die beruhend auf den erfassten Populationsentwicklungen in Thüringen und Sachsen und auf Literaturangaben, ausgewählte Parameterkonstellationen für die Untersuchungenergab. Die Untersuchungen zum Überleben vor dem Hintergrund möglicher Gefährdungsfaktoren und zur Ermittelung des Nutzens von Managementoptionen, wurden mit Schwerpunkten auf „Prädation“, „Habitatverbesserung“ und „Auswilderung“ durchgeführt. Als Ergebnis der Simulationen kam heraus, dass die Prädation keinen großen Einfluss auf das Überleben der Population hat, und Schutzmaßnahmen die Chancen für das Überleben der Population nicht erhöhen würden. Habitatverbesserungen, die die Juvenilen animieren sich im Umkreis von bis zu 5 km vom elterlichen Revier anzusiedeln, würden aber deutlich zum Überleben der Population, auch in längerfristiger Perspektive, beitragen. Habitatverbesserungen, die zu weiter entfernteren Ansiedlungen animieren, könnten sich dagegen ungünstig auf das Überleben der Population auswirken. Für eine mögliche Auswilderung als Schutzmaßnahme ergab sich im Modell, dass eine Auswilderung von 5 Individuen pro Jahr über einen Zeitraum von 5 Jahren, die Überlebenswahrscheinlichkeit kurzfristig deutlich verbessern würde. Es ergab sich allerdings kein Unterschied, ob 5, 10 oder 15 Individuen ausgewildert werden. Eine länger durchgeführte Auswilderung würde vermutlich die Überlebenswahrscheinlichkeit entsprechend langfristiger verbessern.
Taraxacum Sectio Naevosa M. P. Christiansen (Taraxacum spectabile auct. germ. p. p.) in Deutschland
(2002)
Trends in der Bioanalytik
(2002)
Literaturhinweis
(2002)
Identifizierung und Charakterisierung von löslichen Proteinen aus dem Phloem von Cucurbitaceen
(2002)
Methodik der funktionellen Genomanalyse : wie mit Mikroarrays die Aktivität vieler Gene erfasst wird
(2002)
Vergleich von rekombinanten Vaccinia- und DNA-Vektoren zur Tumorimmuntherapie im C57BL/6-Mausmodell
(2002)
In der vorliegenden Arbeit wurden Tumorimpfstoffe auf der Basis des Plasmid-Vektors pCI, modified vaccinia virus Ankara (MVA) und MVA-infizierten dendritischen Zellen entwickelt und durch Sequenzierung, Western blotting und durchflußzytometrische Analyse überprüft. Die in vivo Wirksamkeit der Vakzinen wurde in verschiedenen Tumormodellen in C57BL/6 Mäusen verglichen. Die auf dem eukaryotischen Expressionsvektor pCI basierende DNA-Vakzinierung induzierte einen sehr wirksamen, antigenspezifischen und langfristigen Schutz vor Muzin, CEA oder beta-Galactosidase exprimierenden Tumoren. Eine MVA-Vakzinierung bietet in den in dieser Arbeit durchgeführten Tumormodellen keinen signifikanten Schutz vor Muzin oder beta-Galactosidase exprimierenden Tumoren. Sowohl humane, als auch murine in vitro generierte dendritische Zellen lassen sich mit MVA – im Vergleich zu anderen viralen Vektoren – sehr gut infizieren. Die Expressionsrate der eingefügten Gene ist aber gering im Vergleich zur Expression in permissiven Wirtszellen des Virus (embryonale Hühnerfibroblasten). Es konnte gezeigt werden, daß eine MVA-Infektion dendritischer Zellen ähnliche Auswirkungen auf den Reifezustand humaner und muriner dendritischer Zellen hat, wie eine Infektion mit replikationskompetenten Vakzinia-Stämmen, und außerdem die Hochregulation von CD40 während der terminalen Reifung von murinen dendritischen Zellen inhibiert wird. Die während der langfristigen in vitro Kultur auf CEF-Zellen entstandenen Deletionen im MVA Genom führten zu einer starken Attenuierung und dem Verlust einiger Gene, die immunmodulatorische Proteine kodieren, jedoch nicht zu einer Verminderung des zytopathischen Effekts in dendritischen Zellen. Die geringe Expressionsrate und die beobachtete Inhibition der Expression kostimulatorischer Moleküle auf dendritischen Zellen kann für eine wenig effektive Induktion einer Immunantwort in MVA vakzinierten Tieren durch cross priming oder die direkte Infektion antigenpräsentierender Zellen verantwortlich sein. Durch die Modifikation einer Methode zur intrazellulären IFN-gamma Färbung konnten in vakzinierten Mäusen tumorantigenspezifische CTL sensitiv und quantitativ detektiert werden. Die so bestimmte CTL-Frequenz, nicht jedoch die humorale Antwort, korrelierte mit der in vivo Wirksamkeit der verschiedenen Vakzinen: DNA vakzinierte Tiere entwickeln starke tumorantigenspezifische CTL-Antworten, wohingegen in MVA-vakzinierten Tieren überwiegend gegen virale Epitope gerichtete CD4 und CD8-T-Zellen detektiert wurden. Die Wirksamkeit der pCI-DNA-Vakzine spricht für die Weiterentwicklung in weiteren präklinischen Mausmodellen, beispielsweise unter Verwendung von MUC1 oder HLA-A2 transgenen Mäusen. Die Methoden zur Detektion Tumorantigen-spezifischer CTL in 96-Loch-Mikrotiterplatten können dabei zur systematischen Suche nach im Menschen immundominanten T-Zell-Epitopen im Muzin-Molekül genutzt werden. Der durchgeführte Vergleich der auf den Vektoren pCI und MVA basierenden Vakzinen und die Analyse neuerer Publikationen führen zu dem Ergebnis, daß vor allem DNA-Vakzinen in Zukunft eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von aktiven Tumorimpfstoffen spielen werden. Rekombinante MVA-Viren, eventuell in Kombination mit DNA- oder anderen Vektoren, haben sich dagegen in zahlreichen Studien als wirksame Impfstoffe zur Kontrolle von durch Pathogene hervorgerufenen Infektionserkrankungen erwiesen.
Offenland - Management auf Truppenübungsplätzen im pleistozänen Flachland Nordostdeutschlands
(2002)
Das Lektin aus Pisum sativum, der Gartenerbse, ist Teil der Familie der Leguminosenlektine. Diese Proteine haben untereinander eine hohe Sequenzhomologie, und die Struktur ihrer Monomere, ein all-ß-Motiv, ist hoch konserviert. Dagegen gibt es innerhalb der Familie eine große Vielfalt an unterschiedlichen Quartärstrukturen, die Gegenstand kristallographischer und theoretischer Arbeiten waren. Das Erbsenlektin ist ein dimeres Leguminosenlektin mit einer Besonderheit in seiner Struktur: Nach der Faltung in der Zelle wird aus einem Loop eine kurze Aminosäuresequenz herausgeschnitten, so dass sich in jeder Untereinheit zwei unabhängige Polypeptidketten befinden. Beide Ketten sind aber stark miteinander verschränkt und bilden eine gemeinsame strukturelle Domäne. Wie alle Lektine bindet Erbsenlektin komplexe Oligosaccharide, doch sind seine physiologische Rolle und der natürliche Ligand unbekannt. In dieser Arbeit wurden Versuche zur Entwicklung eines Funktionstests für Erbsenlektin durchgeführt und seine Faltung, Stabilität und Monomer-Dimer-Gleichgewicht charakterisiert. Um die spezifische Rolle der Prozessierung für Stabilität und Faltung zu untersuchen, wurde ein unprozessiertes Konstrukt in E. coli exprimiert und mit der prozessierten Form verglichen. Beide Proteine zeigen die gleiche kinetische Stabilität gegenüber chemischer Denaturierung. Sie denaturieren extrem langsam, weil nur die isolierten Untereinheiten entfalten können und das Monomer-Dimer-Gleichgewicht bei mittleren Konzentrationen an Denaturierungsmittel auf der Seite der Dimere liegt. Durch die extrem langsame Entfaltung zeigen beide Proteine eine apparente Hysterese im Gleichgewichtsübergang, und es ist nicht möglich, die thermodynamische Stabilität zu bestimmen. Die Stabilität und die Geschwindigkeit der Assoziation und Dissoziation in die prozessierten bzw. nichtprozessierten Untereinheiten sind für beide Proteine gleich. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch unter nicht-denaturierenden Bedingungen die Untereinheiten zwischen den Dimeren ausgetauscht werden. Die Renaturierung der unprozessierten Variante ist unter stark nativen Bedingungen zu 100 % möglich. Das prozessierte Protein dagegen renaturiert nur zu etwa 50 %, und durch die Prozessierung ist die Faltung stark verlangsamt, der Faltungsprozess ist erst nach mehreren Tagen abgeschlossen. Im Laufe der Renaturierung wird ein Intermediat populiert, in dem die längere der beiden Polypeptidketten ein Homodimer mit nativähnlicher Untereinheitenkontaktfläche bildet. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Renaturierung ist die Assoziation der entfalteten kürzeren Kette mit diesem Dimer.
Die Pektat-Lyasen gehören zu einer Proteinfamilie, die meistens von pflanzenpathogenen Mikroorganismen sekretiert werden. Die Enzyme katalysieren den Abbau von Polygalakturonsäure, einem Hauptbestandteil in pflanzlichen Mittellamellen und Primärzellwänden. Der Abbau der alpha-1,4-verbrückten Galakturonsäurereste erfogt durch eine beta-Eliminierungsreaktion, dabei entsteht ein Produkt mit einer ungesättigten C4-C5 Bindung am nicht reduzierenden Ende, das durch spektroskopische Messungen beobachtet werden kann. Für die enzymatische Reaktion der Pektat-Lyasen ist Calcium nötig und das pH-Optimum der Reaktion liegt bei pH 8.5. Alle bis jetzt bekannten Strukturen der Pektat- und Pektin-Lyasen haben das gleiche Strukturmotiv - eine rechtsgängige parallele beta-Helix. Die Struktur der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis (BsPel) ist im Komplex mit Calcium gelöst worden. BsPel ist ein monomeres Protein mit einer ungefähren Molekularmasse von 43 kDa, das keine Disulfidbrücken enthält. Dies erlaubte sowohl eine effiziente rekombinante Expression des Wildtypproteins, als auch von destabilisierten Mutanten im Cytoplasma von E. coli. Parallele beta-Helices sind relativ große, jedoch verhältnismäßig einfach aufgebaute Proteine. Um detailliertere Informationen über die kritischen Schritte bei der in vitro-Faltung von parallelen beta-Helices zu erhalten, sollte in der vorliegenden Arbeit versucht werden, den Faltungsmechanismus dieses Proteins näher zu charakterisieren. Dabei sollte vor allem die Frage geklärt werden, welche Wechselwirkungen für die Stabilität dieses Proteins einerseits und für die Stabilität von essentiellen Faltungsintermediaten andererseits besonders wichtig sind.<BR>Rückfaltung von BsPel, ausgehend vom guanidiniumchlorid-denaturierten Zustand, war bei kleinen Proteinkonzentrationen und niedrigen Temperaturen vollständig möglich. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge waren aber nicht reversibel und zeigten eine apparente Hysterese. Kinetische Messungen des Fluoreszenz- und CD-Signals im fernen UV ergaben eine extreme Denaturierungsmittelabhängigkeit der Rückfaltungsrate im Bereich des Übergangmittelpunktes. Der extreme Abfall der Rückfaltungsraten mit steigender Denaturierungsmittelkonzentration kann als kooperative Entfaltung eines essentiellen Faltungsintermediats verstanden werden. Dieses Faltungsintermediat ist temperaturlabil und kann durch den Zusatz Glycerin im Renaturierungspuffer stabilisiert werden, wobei sich die Hysterese verringert, jedoch nicht vollständig aufgehoben wird. Durch reverse Doppelsprungexperimente konnten zwei transiente Faltungsintermediate nachgewiesen werden, die auf zwei parallelen Faltungswegen liegen und beide zum nativen Zustand weiterreagieren können. Fluoreszenzemissionsspektren der beiden Intermediate zeigten, daß beide schon nativähnliche Struktur aufweisen. Kinetische Daten von Prolin-Doppelsprungexperimenten zeigten, daß Prolinisomerisierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Reaktivierung des denaturierten Enzyms darstellt. Desweiteren konnte durch Prolin-Doppelsprungexperimenten an Mutanten mit Substitutionen im Prolinrest 281 gezeigt werden, daß die langsame Renaturierung von BsPel nicht durch die Isomerisierung der einzigen cis-Peptidbindung an Prolin 281 verursacht wird, sondern durch die Isomerisierung mehrerer trans-Proline. Die beiden beobachteten transienten Faltungsintermediate sind somit wahrscheinlich zwei Populationen von Faltungsintermediaten mit nicht-nativen X-Pro-Peptidbindungen, wobei sich die Populationen durch mindestens eine nicht-native X-Pro-Peptidbindung unterscheiden.<BR>Der Austausch des Prolinrestes 281 gegen verschiedene Aminosäuren (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) führte zu einer starken Destabilisierung des nativen Proteins und daneben auch zu einer Reduktion in der Aktivität, da die Mutationsstelle in der Nähe der putativen Substratbindetasche liegt. Die Rückfaltungskinetiken der Prolinmutanten war bei 10°C annähernd gleich zum Wildtyp und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Faltung waren durch die Mutation nicht verändert. Die durch die Mutation verursachte drastische Destabilisierung des nativen Zustands führte zu einem reversiblen Entfaltungsgleichgewicht bei pH 7 und 10°C. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge der Mutante P281A zeigten bei Messungen der Tryptophanfluoreszenzemission und der Aktivität einen kooperativen Phasenübergang mit einem Übergangsmittelpunkt bei 1.1 M GdmCl. Durch die Übereinstimmung der Faltungsübergänge bei beiden Messparametern konnten die Faltungsübergänge nach dem Zwei-Zustandsmodell ausgewertet werden. Dabei wurde eine freie Sabilisierungsenthalpie der Faltung für die Mutante von <nobr>- 64.2 ± 0.4 kJ/mol</nobr> und eine Kooperativität des Übergangs von <nobr>- 58.2 ± 0.3 kJ/(mol·M)</nobr> bestimmt.<BR> BsPel enthält, wie die meisten monomeren rechtsgängigen parallelen beta-Helix-Proteine, einen internen Stapel wasserstoffverbrückter Asparagin-Seitenketten. Die Mehrheit der erzeugten Mutanten mit Substitutionen im Zentrum der Asn-Leiter (N271X) waren als enzymatisch aktives Protein zugänglich. Die Auswirkung der Mutation auf die Stabilität und Rückfaltung wurde an den Proteinen BsPel-N271T und BsPel-N271A näher analysiert. Dabei führte die Unterbrechung des Asparaginstapels im Inneren der beta-Helix zu keiner drastischen Destabilisierung des nativen Proteins. Allerdings führten diese Mutationen zu einem temperatur-sensitiven Faltungsphänotyp und die Hysterese im Denaturierungsübergang wurde verstärkt. Offenbar wird durch die Unterbrechung des Asparaginstapel ein essentielles, thermolabiles Faltungsintermediat destabilisiert. Der Asparaginstapel wird somit bei der Faltung sehr früh ausgebildet und ist wahrscheinlich schon im Übergangszustand vorhanden.