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Die immunologische Kontrazeption mittels Zona pellucida (ZP) Proteinen gilt als vielversprechender Ansatz für die Reproduktionskontrolle verwilderter Haus- und Wildtierbestände. Da die Applikation von nativer ZP mit Nebenwirkungen verbunden ist, wird die Verwendung einzelner ZP Peptide als Bestandteil kontrazeptiver Vakzine als besonders aussichtsreich erachtet. Das Prinzip dieser nebenwirkungsfreien ZP Immunisierung ist die gezielte Trennung der Entzündungsreaktionen auslösenden T-Zell-Epitope der ZP von den kontrazeptiv wirkenden B-Zell-Epitopen. Niedermolekulare synthetische oder rekombinante Peptide allein sind gering immunogen und können somit keine ausreichende Immunantwort induzieren. Die Verwendung von Peptiden für die immunologische Kontrazeption erfordert daher ein „Vakzin-Design“, d. h. die gezielte Kombination der Peptide mit immunstimulierenden Substanzen (Liposomen, Carrierproteinen, Adjuvantien). Zielstellung der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Potentials synthetischer Peptide für die Immunokontrazeption von verwilderten Hauskatzen (Felis catus). Dazu wurden zunächst relevante B-Zell-Epitope des felinen Zona pellucida Proteins, ZPB2, identifiziert und synthetisiert. Zwei der synthetischen Peptide (P3, P6) wurden zur Herstellung von Antikörpern an BSA konjugiert und zusammen mit Freundschem Adjuvans in Ratten verimpft. Die kontrazeptive Relevanz beider Peptide sowie der Ratten Anti-Peptid Antiseren wurde im in vitro Befruchtungssystem der Hauskatze geprüft. Zur Untersuchung der Immunogenität der Peptide in der Zielspezies Hauskatze erfolgte die Entwicklung von Vakzin-Prototypen für die einmalige Applikation. Neben der Eruierung der Stärke und Dauer der Immunantwort wurde durch Verpaarung der Tiere auch das kontrazeptive Potential in vivo abgeschätzt.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen Signaltransduktionsprozesse in den Strukturen der Kraftübertragung quergestreifter Muskelzellen, d. h. in den Costameren (Zell-Matrix-Kontakten) und den Glanzstreifen (Zell-Zell-Kontakten der Kardiomyozyten).Es ließ sich zeigen, dass sich die Morphologie der Zell-Matrix-Kontakte während der Differenzierung von Skelettmuskelzellen dramatisch ändert, was mit einer veränderten Proteinzusammensetzung einhergeht. Immunfluoreszenz-Analysen von Skelettmuskelzellen verschiedener Differenzierungsstadien implizieren, dass die Signalwege, welche die Dynamik der Fokalkontakte in Nichtmuskelzellen bestimmen, nur für frühe Stadien der Muskeldifferenzierung Relevanz haben können. Ausgehend von diesem Befund wurde begonnen, noch unbekannte Signalwege zu identifizieren, welche die Ausbildung von Costameren kontrollieren: In den Vorläuferstrukturen der Costamere gelang es, eine transiente Interaktion der Proteine Paxillin und Ponsin zu identifizieren. Biochemische Untersuchungen legen nahe, dass Ponsin über eine Skelettmuskel-spezifische Insertion im Carboxyterminus das Adapterprotein Nck2 in diesen Komplex rekrutiert. Es wird vorgeschlagen, dass die drei Proteine einen ternären Signalkomplex bilden, der die Umbauvorgänge der Zell-Matrix-Kontakte kontrolliert und dessen Aktivität von mitogen activated protein kinases (MAPK) reguliert wird.Die Anpassungsvorgänge der Strukturen der Kraftübertragung an pathologische Situtation (Kardiomyopathien) in der adulten quergestreiften Muskulatur wurden ausgehend von einem zweiten Protein, dem muscle LIM protein (MLP), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein mutiertes MLP-Protein, das im Menschen eine hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) auslöst, strukturelle Defekte aufweist und weniger stabil ist. Weiterhin zeigte dieses mutierte Protein eine verringerte Bindungsfähigkeit an die beiden Liganden N-RAP und alpha-Actinin. Die molekulare Grundlage der HCM-verursachenden Mutationen im MLP-Gen könnte folglich eine Veränderung der Homöostase im ternären Komplex MLP – N-RAP – alpha-Actinin sein. Die Expressionsdaten eines neu generierten monoklonalen MLP-Antikörpers deuten darauf hin, dass die Funktionen des MLP nicht nur für die Integrität des Myokards, sondern auch für die der Skelettmuskulatur notwendig sind.
Für ein tiefergehendes Verständnis von Entwicklung und Funktion der quergestreiften Muskulatur ist eine Betrachtung der am Aufbau der Myofibrillen, den kontraktilen Organellen, beteiligten Proteine essentiell. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Myomesin, einem Protein der sarkomeren M-Bande. Zunächst wurde die cDNA des humanen Myomesins vollständig kloniert, sequenziert und nachfolgend die komplette Größe der aminoterminalen Kopfdomäne bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß Myomesin in vitro mit den Domänen 1 und 12 an Myosin bindet. Die muskelspezifische Isoform der Kreatinkinase bindet an die Domänen 7 und 8. Stimulations- und Inhibitionsexperimente belegen, daß Myomesin an Serin 618 in vivo durch die Proteinkinase A phosphoryliert wird und daß diese Phosphorylierung durch Aktivierung beta2-adrenerger Rezeptoren stimulierbar ist. In Muskelgewebeproben von Patienten, die an der Hypertrophen Kardiomyopathie, einer genetisch bedingten Herzmuskelkrankheit, erkrankt sind, konnte mit einem neu hergestellten phosphorylierungsabhängigen Antikörper eine Verminderung der Menge phosphorylierten Myomesins nachgewiesen werden. Mögliche Ursachen werden diskutiert. Myomesin bildet Dimere, wie durch hefegenetische und biochemische Experimente gezeigt werden konnte. Die Dimerisierung von Myomesin könnte eine zentrale Rolle für den Einbau der Myosinfilamente in die naszierende Myofibrille haben. Anhand der gewonnenen Daten wurde ein verbessertes Modell der zentralen M-Bande erstellt.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. Für die Analyse wurde ein faseroptischer Affinitätssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensität. Die Versuche am faseroptischen Affinitätssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied lässt sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten kD quantitativ erfassen. Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfläche sowie die Hybridisierungs- und Dissoziationsparameter essentiell für die Methodenentwicklung war, wurden die Parameter für ein optimales Spotting und die Immobilisierung von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberflächen sowie die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode. Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenität als auch im Signal/Rausch-Verhältnis wurden an NeutrAvidin-Oberflächen erreicht. Für die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenlänge, Puffersystem, Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glasträger zu spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden erreicht werden. In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch mit der Analyse der Fluoreszenzintensität wurde der Genotyp der Proben identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse (PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die Genauigkeit lag bei 96%. In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen bestätigt werden. Ursache für die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte Signal/Rausch-Verhältnis. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte Analysesystem für die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet ist, homocygote Patientenproben zuverlässig zu analysieren. Prinzipiell ist das auch bei heterocygoter DNA möglich. Da nach aktuellem Kenntnisstand eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht veröffentlicht wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist sich der reverse Ansatz der Methode. Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kostengünstigere und weniger hoch dimensionierte Lösung für Fragestellungen beispielsweise in der Ernährungswissenschaft, bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann diese Methode zukünftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden.
Charakterisierung von ausgewählten Protein-Phosphatasen und MATE-Proteinen aus Arabidopsis thaliana
(2004)
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression der Protein Phosphatase-gene TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 und STH2 analysiert. Alle fünf ausgewählten Gene kodieren für PP des PP1/PP2A-Typs. Es wurde untersucht, ob homologen PP-Isoformen individuelle Expressionsmuster zugewiesen werden konnten. Besonderes Augenmerk richtete sich dabei auf die Expression von PP-Genen in den Schließzellen von A. thaliana. In mehreren Inhibitorstudien wurde beschrieben, dass PP1/PP2A-Proteine eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion pflanzlicher Schließzellen spielen. Bisher konnte allerdings noch keine der entsprechenden katalytischen Untereinheiten auf molekularer Ebene identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass mit TOPP1 ein Protein des PP1-Typs präferenziell in den Schließzellen von A. thaliana exprimiert wird. Ein Vergleich der Genexpression von TOPP1, TOPP2 und TOPP5 zeigte für die drei homologen Gene sehr Isoform-spezifische Expressionsmuster. Dies war ein deutlicher Hinweis, dass diese eng verwandten PP trotz großer Übereinstimmung auf Aminosäureebene vermutlich unterschiedliche Funktionen in planta haben. Die Untersuchung der Genexpression von STH1 und STH2 zeigte, dass die fast identischen Proteine zum Teil in unterschiedlichen Geweben vorkommen. Die Transkripte der beiden Gene, welche eine eigene Untergruppe von PP2A-verwandten Sequenzen bilden, konnten aus EF isoliert werden. Der in dieser Arbeit entwickelte Screeningansatz ermöglichte es, die sehr ähnlichen cDNA-Fragmente eindeutig voneinander zu unterscheiden. Die gefundenen Isoform-spezifischen Expressionsmuster waren ein deutlicher Hinweis auf unterschiedliche Funktionen in planta. Zur weiteren Untersuchung der PP-Funktionen in planta wurden Pflanzen mit veränderter Genaktivität von TOPP2 oder STH1 untersucht. In Pflanzen mit RNAi-vermittelter Reduktion des TOPP2-Transkriptgehalts ließ sich ein deutlich verändertes Blattwachstum beobachten. Die eingerollten oder asymmetrisch entwickelten Blätter waren vermutlich ein Hinweis, dass diese PP1-Isoform auch in A. thaliana eine Rolle bei der Zellteilung spielt. Für TOPP2-Expression in Hefen wurde diese Funktion schon nachgewiesen. Die Analyse von Insertions-mutanten mit T-DNA Insertionen in beiden STH1-Allelen waren neben den Expressions-studien ein weiterer Hinweis, dass sich STH1 nicht funktionell durch STH2 ersetzen lässt. Die Experimente in dieser Arbeit zeigten, dass das Fehlen der STH1-Genaktivität zu einem deutlichen Blattphänotyp mit gezahnten Blatträndern führte. Für STH2-Insertionsmutanten wurde dieses veränderte Wachstum nicht beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Gen NIC1, welches für ein MATE-Membranprotein kodiert, identifiziert und charakterisiert. Die Sequenzierung des Genoms von A. thaliana hatte gezeigt, dass mindestens 56 MATE-Gene in dieser Pflanze vorhanden sind. Zum Zeitpunkt der Identifikation von NIC1 war keines dieser Gene charakterisiert. Außer für das MATE-Protein ERC1 aus S. cerevisiae gab es keine Studien zu eukaryotischen Mitgliedern dieser großen Familie von Membranproteinen. Anhand NIC1 wurden heterologe Expressionssysteme zur funktionellen Charakterisierung von MATE-Proteinen aus Pflanzen etabliert. Die cDNA von NIC1 wurde nach ihrer Klonierung in X. laevis Oozyten und S. cerevisiae exprimiert. In S. cerevisiae erhöhte die NIC1-Expression die Lithumtoleranz der Hefen und führte zu einer Verminderung der Natriumtoleranz. Parallele Versuche mit NIC2 und NIC4 (in den Diplomarbeiten von Blazej Dolniak und Mandy Kursawe) zeigten, dass auch diese beiden Proteine die Salztoleranz von S. cerevisiae beeinflussten. Während NIC2 die Lithium- und Natriumtoleranz erhöhte, führte NIC4-Expresion zu einer höheren Sensibilität gegenüber diesen beiden Kationen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der drei homologen Proteine zeigten sich auch bei ihrer Expression in X. laevis Oozyten. NIC1 induzierte in den Oozyten auswärts gerichtete Chloridströme, die spannungsabhängig waren und durch mikromolare Konzentrationen der trivalenten Kationen Lanthan oder Gadolinium inhibiert werden konnten. NIC4 induzierte Barium-inhibierbare Kaliumströme, die spannungsunabhängig waren. Für NIC2 ließ sich in diesem Expressionssystem keine Aktivität detektieren. Zur Untersuchung der NIC1-Funktion in planta wurde die Genaktivität in transgenen Pflanzen lokalisiert und reduziert. Die NIC1-Genexpression war hauptsächlich in den vaskulären Geweben der Pflanze detektierbar und einer Verminderung des NIC1-Transkriptgehalts beeinflusste die Entwicklungsgeschwindigkeit der Pflanzen. Sie entwickelten sich deutlich langsamer als der parallel kultivierte Wildtyp. Der deutliche Phänotyp bei Veränderung der Genaktivität von nur einem der mindestens 56 vorhandenen MATE-Gene in A. thaliana zeigte, dass vermutlich keine weitere MATE-Isoform in der Lage ist, die Funktion von NIC1 zu übernehmen.
Für das Verständnis der Strukturbildung bei Proteinen ist es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilität und Faltung zu verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Erörterung von Gesetzmäßigkeiten zu den Faltungseigenschaften von globulären Proteinen investiert. Die große Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat- (LRR-) oder Ankyrin-Proteine gehören, wurde dahingegen noch wenig untersucht. Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelförmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Tertiärstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Stabilität und Faltung eines LRR-Proteins mittels verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als Untersuchungsobjekt diente die für die Infektion ausreichende zentrale LRR-Domäne des Invasionsproteins Internalin B (InlB241) des Bakteriums Listeria monocytogenes. Des weiteren sollten die Integrität und die Stabilitäts- und Faltungseigenschaften der sogenannten Internalin-Domäne (InlB321) untersucht werden. Hierbei handelt es sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Domäne, welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Domäne mit einer Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domäne besteht. Von beiden Konstrukten konnte eine vollständige thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw. thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungsübergängen durchgeführt werden. Sowohl InlB241 als auch InlB321 zeigen einen reversiblen und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichtsübergänge, was die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte. Die zusätzliche Ig-ähnliche Domäne im InlB321 resultierte im Vergleich zum InlB241 in einer Erhöhung der freien Enthalpie der Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese Stabilitätszunahme äußerte sich sowohl in einer Verschiebung des Übergangsmittelpunktes zu höheren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch in einer Erhöhung der Kooperativität des Gleichgewichtsübergangs (9.7 kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Domäne nicht unabhängig voneinander falten und dass die Ig-ähnliche Domäne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor während der Invasion interagiert, eine kritische Rolle für die <i style='mso-bidi-font-style:normal'>in vivo Stabilität des Internalin B spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativität des Übergangs die Integrität der Internalin-Domäne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen keine Intermediate vorliegen. Kinetische Messungen über Tryptophanfluoreszenz und Fern-UV<span style='color:red'> </span>Circulardichroismus deuteten auf die Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der LRR-Domäne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH 2 denaturierten Zustand zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen über ein Intermediat. Eine Erhöhung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins führte zu einer Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im Übergang zu einem alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Domäne deuteten kinetische Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals während der Entfaltung möglicherweise auf die Präsenz von zwei Prozessen hin. Der erste langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem Übergangsmittelpunkt zeigte eine starke Abhängigkeit von der Temperatur, während der zweite schnellere Prozess der Entfaltung stärker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing. Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten für die Erklärung der langsamen Faltungsphase zunächst keinen Hinweis auf dass Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollständige Amplitude während der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann. Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die InlB-Konstrukte als Modelle für die Untersuchung der Faltung von Solenoidproteinen verwendet werden können.<span lang=EN-GB style='mso-ansi-language: EN-GB'><o:p></o:p></span>
In der vorliegenden Arbeit habe ich wichtige Teilmechanismen der Erregungs-Sekretionskopplung in der Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana (L.) untersucht. Die Speicheldrüse ist von dopaminergen und serotonergen Fasern innerviert (Baumann et al., 2002). Beide Transmitter stimulieren eine unterschiedliche Reaktion der Drüse: Dopamin (DA) stimuliert die P-Zellen der Acini und die Ausführgangzellen, während Serotonin (5-HT) die P- und C-Zellen der Acini stimuliert, nicht jedoch die Ausführgangzellen. Der Endspeichel ist nach einer DA-Stimulierung proteinfrei. Dagegen enthält er nach einer 5-HT-Stimulierung Proteine, die von den C-Zellen sezerniert werden (Just & Walz, 1996). Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich mittels Kapillarelektrophoretischer Analyse (CE-Analyse) die Elektrolytkonzentrationen im Endspeichel untersucht sowie die Raten der Flüssigkeitssekretion gemessen. Damit wollte ich klären, welche Transporter an der Sekretion des Primärspeichels und an dessen Modifikation beteiligt sind. Ausserdem wollte ich die Rolle der transportaktiven Epithelzellen der Ausführgänge für die Modifikation des Primärspeichels untersuchen. Dafür habe ich einen Vergleich der Elektrolytkonzentrationen im DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichel durchgeführt. Der Elektrolytgehalt des DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichels unterscheidet sich nicht signifikant voneinander. Er ist nach beiden Stimulierungen hypoosmotisch zum verwendeten Ringer. Die Ausführgangzellen werden durch DA stimuliert und modifizieren den Primärspeichel durch eine netto-Ionenreabsorption. Meine Versuche zeigen jedoch, dass auch die während einer 5-HT-Stimulierung der Drüse unstimulierten Ausführgangzellen den Primärspeichel modifizieren. In einer nachfolgenden Versuchsreihe habe ich den Einfluss von Ouabain, einem Hemmstoff der Na+-K+-ATPase, und Bumetanid, einem Hemmstoff des NKCC, auf die Raten der Flüssigkeitssekretion sowie den Elektrolytgehalt des Endspeichels untersucht. Ich habe gefunden, dass die Aktivität der Na+-K+-ATPase wichtig für die Modifikation des DA-stimulierten Primärspeichels ist. Im Gegensatz dazu ist sie für die Modifikation des 5-HT-stimulierten Primärspeichels nicht von Bedeutung. Bezüglich der Flüssigkeitssekretion habe ich keinen Einfluss der Na+-K+-ATPase-Aktivität auf die DA-stimulierten Sekretionsraten gefunden, dagegen ist die 5-HT-stimulierte Sekretionsrate in Anwesenheit von Ouabain gesteigert. Die Aktivität des NKCC ist für beide sekretorische Prozesse, die Ionen- und die Flüssigkeitssekretion, wichtig. Eine Hemmung des NKCC bewirkt eine signifikante Verringerung der Raten der Flüssigkeitssekretion nach DA- und 5-HT-Stimulierung sowie in beiden Fällen einen signifikanten Abfall der Ionenkonzentrationen im Endspeichel. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich versucht, Änderungen der intrazellulären Ionenkonzentrationen in den Acinuszellen während einer DA- oder 5-HT-Stimulierung zu messen. Diese Experimente sollten mit der Methode des "ratiometric imaging" durchgeführt werden. Messungen mit dem Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 zeigten keinen globalen Anstieg in der intrazellulären Ca2+-Konzentration der P-Zellen. Aufgrund von Problemen mit einer schlechten Beladung der Zellen, einer starken und sich während der Stimulierung ändernden Autofluoreszenz der Zellen sowie Änderungen im Zellvolumen wurden keine Messungen mit Na+- und K+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt. Im dritten Teil dieser Arbeit habe ich die intrazellulären Signalwege untersucht, die zwischen einer 5-HT-Stimulierung der Drüse und der Proteinsekretion vermitteln. Dazu wurde der Proteingehalt im Endspeichel biochemisch mittels eines modifizierten Bradford Assay gemessen. Eine erstellte Dosis-Wirkungskurve zeigt, dass die Rate der Proteinsekretion von der zur Stimulierung verwendeten 5-HT-Konzentration abhängt. In einer Serie von Experimenten habe ich die intrazellulären Konzentrationen von Ca2+, cAMP und / oder cGMP erhöht und anschließend den Proteingehalt im Endspeichel gemessen. Ein Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert nur eine geringe Rate der Proteinsekretion. Dagegen kann die Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration eine stärkere Proteinsekretion aktivieren, die sich nicht signifikant von der nach 5-HT-Stimulierung unterscheidet. Die cAMP-stimulierte Proteinsekretion kann durch gleichzeitige Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration weiter gesteigert werden. Dagegen aktivierte eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration die Proteinsekretion nicht. Aufgrund dieser Ergebnisse postuliere ich die Existenz eines die Adenylatcyclase aktivierenden 5-HT-Rezeptors in der Basolateralmembran der C-Zellen.
Der Buchfinkengesang wurde in Potsdam in zwei Hauptpopulationen über drei Jahre aufgenommen. Jedes Individuum wurde eindeutig am individuellen Strophentypenrepertoire identifiziert. Ein weiterer Punkt der die individuelle Wiedererkennung bestätigt ist die hohe Standorttreue der adulten Männchen. Die beschriebene Methode eignet sich für die Untersuchung von gesamten Populationen, um den Wandel des Gesangs von Populationen in Raum und Zeit zu beschreiben. Die Haupterkenntnisse der Arbeit sind: - Die Gesamtanzahl der Grundstrophentypen innerhalb einer Population bleibt über Jahre konstant. - Die relative Häufigkeit jedes einzelnen Strophentyps variiert von Jahr zu Jahr und von Population zu Population. - Gesangslernen erfolgt exakt mit einem Korrektheitsgrad von mindestens 96%. - Das Song-Sharing ist innerhalb der Population hoch. Die diskutierten Mechanismen für das Song-Sharing sind: Die Lebenserwartung, das Zugverhalten, das Lernverhalten, die Etabliertheit von Strophentypen, Weibchenpräferenzen und die Reaktionen der territorialen Männchen. - Weiterhin wurde ein Modell zur kulturellen Evolution des Buchfinkengesangs programmiert, um die Rolle der Einflussfaktoren, wie Fehlerquote, Abwanderungsrate und Laufzeit zu ermitteln. Der Wandel des Dialektes erfolgt graduell in Raum und Zeit. Daher sind keine scharfen Dialektgrenzen anzutreffen. Trotz dieser Tatsache markieren die etablierten Strophentypen die Population. 50 % der Juvenilen siedeln am Geburtsort, auf diese Weise bleibt der Dialekt erhalten und Inzest wird vermieden. -Analysiert man das Repertoire benachbarten Männchen bei isolierten Alleen, so entspricht die Gesangsangleichung in etwa dem Zufall. -Intraindividuelle Vergleiche der quantitativen Parameter des jeweiligen Strophentyps wurden saisonal und annuell durchgeführt. Saisonal konnten für einen Strophentyp ein Trend ermittelt werden. Bei jährlichen Vergleichen konnten intraindividuell ausschließlich nicht signifikante Ergebnisse ermittelt werden, wohingegen die interindividuelle Variation in zwei Fällen signifikant war. In einem Fall bestand ein Trend und in einem weiteren Fall war die Variationsunterschiede nicht signifikant. - Der Verlauf der Brutsaison lässt sich an der jährlichen Gesangsaktivität nachvollziehen.
Die Präeklampsie ist eine schwangerschaftsspezifische Bluthochdruck-Erkrankung, die im Allgemeinen nach der 20. Schwangerschaftswoche auftritt. Neben der Hypertonie sind die Proteinurie und die Ödembildung charakteristische Symptome der Präeklampsie. Obwohl heute die Pathophysiologie der Präeklampsie zum großen Teil verstanden ist, ist die Ätiologie dieser Erkrankung noch unklar. 1999 konnten wir in den Seren von Präeklampsie-Patientinnen agonistische Autoantikörper, die gegen den Angiotensin II AT1-Rezeptor gerichtet sind (AT1-AAK), nachweisen. Diese AT1-AAK gehören zur Antikörpersubklasse IgG3. Die AT1-AAK führen in Kulturen neonataler Rattenkardiomyozyten AT1-Rezeptor spezifisch zu einem positiv chronotropen Effekt. Mittels Immunpräzipitation wurde gezeigt, dass AT1-AAK spezifisch den AT1-Rezeptor präzipitieren. Kontrollproben, aus denen die AT1-AAK entfernt wurden, führen zu keiner Präzipitation des AT1-Rezeptors. Die Präzipitation des AT1-Rezeptors bleibt ebenfalls aus, wenn die AT1-AAK mit einem Peptid, welches der Aminosäuresequenz des zweiten extrazellulären Loops des humanen AT1-Rezeptors entspricht, behandelt wurden. Eine Langzeitbehandlung der Kulturen neonataler Rattenherzzellen mit AT1-AAK vermindert die funktionelle Ansprechbarkeit der Zellen auf einen erneuten AT1-Rezeptor-Stimulus. Eine veränderte AT1-Rezeptorexpression wurde nicht nachgewiesen. In guter Übereinstimmung mit den in vitro-Expressionsdaten wurde gezeigt, dass die plazentare AT1-Rezeptorexpression bei Präeklampsie-Patientinnen nicht verschieden von der plazentaren AT1-Rezeptorexpression gesunder Schwangerer mit nicht pathogen verändertem Blutdruck ist. Im Zellsystem der neonatalen Rattenherzzellen führen die AT1-AAK zur Aktivierung von Gi-Proteinen und zu verringerten intrazellulären cAMP-Spiegeln. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die AT1-AAK in Kulturen neonataler Rattenherzzellen die Transkriptionsfaktoren AP-1 und NFkB aktivieren. Die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB wurde vornehmlich in den Nicht-Myozyten der Rattenherzzellkultur nachgewiesen. Generell wurde festgestellt, dass sich die AT1-AAK pharmakologisch wie der natürliche Agonist des AT1-Rezeptors, Angiotensin II, verhalten. Erste Daten dieser Arbeit deuten auf einen eventuellen Einfluss der AT1-AAK auf die Expression von Komponenten der extrazellulären Matrix bzw. assoziierter Faktoren (Kollagen III, MMP-2, TIMP-2, Colligin) hin. In allen in dieser Arbeit untersuchten Seren von klinisch diagnostizierten Präeklampsie-Patientinnen wurden agonistische AT1-AAK nachgewiesen. Wir vermuten daher, dass die AT1-AAK möglicherweise bedeutend in der Pathogenese der Präeklampsie sind.
Der "Leukocyte Receptor Complex" (LRC) ist ein DNA-Sequenzabschnitt auf dem Chromosom 19 des Menschen, der eine Länge von über 900.000 Basenpaaren umfaßt. In diesem Chromosomenabschnitt ist eine Vielzahl von Genen lokalisiert, die für die Funktion verschiedener weißer Blutzellen (Leukozyten) von entscheidender Bedeutung sind. Bei den aus diesen Genen synthetisierten Proteinen (Eiweißen) handelt es sich um Strukturen, die auf der Oberfläche dieser Zellen lokalisiert sind und zur Interaktion der Leukozyten mit ihrer Umgebung dienen. Diese auch als Rezeptoren bezeichneten Proteine können mit Oberflächenproteinen auf anderen Körperzellen wechselwirken und daraus resultierende Signale in das Innere der Blutzelle weiterleiten. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde der LRC im Detail untersucht. Hierzu wurde zunächst der gesamte Chromosomenabschnitt aus kleineren, einander überlappenden DNA-Fragmenten rekonstruiert. Aufgrund der in diesen DNA-Fragmenten enthaltenen DNA-Sequenzen war es möglich, den gesamten Chromosomenabschnitt ähnlich einem Puzzle zusammenzusetzen. Die anschließende Analyse des LRC zeigte, daß sich dieser in drei Bereiche, sogenannte Cluster, unterteilen läßt. Diese Cluster sind dadurch gekennzeichnet, daß in ihnen jeweils nur Gene eines Rezeptortyps vorkommen. Hierbei handelt es sich um ‚immunoglobulin-like transcript′ -Gene (ILT) und ‚killer cell Ig-like receptor′-Gene (KIR). Die KIR- und ILT-Cluster werden von weiteren stammesgeschichtlich verwandten Genen unterbrochen und flankiert. Je nach Individuum können im LRC bis zu 31 solcher verwandten Rezeptorgene lokalisiert sein. Auf der Grundlage der Kartierungsdaten und von Daten des humanen Genomprojekts war es zudem möglich, evolutionäre Untersuchungen zur Entwicklung des LRC durchzuführen. Dabei wurde eine Hypothese zur Entstehung des LRC entworfen und zu anderen Spezies in Beziehung gesetzt. Im zweiten Teil der Arbeit habe ich aufbauend auf der sogenannten HRCA-Methode eine Technik entwickelt, die es erlaubt kleinste Unterschiede zwischen DNA-Sequenzen, sogenannte Einzelbasenpaaraustausche, nachzuweisen. Die entwickelte Methode kann verwendet werden, um sehr ähnliche DNA-Sequenzen, wie z.B. verschiedene KIR-Sequenzen, zu unterscheiden und ihre Menge zu bestimmen. Sie ist außerdem geeignet Mutationen, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind, nachzuweisen und könnte somit in der Diagnostik Anwendung finden.