Patrick Frank Knox-Brown

• Water-deficits can cause lethal damage to organisms, which is rooted in cellular dehydration. Many plant species, but also other organisms have developed mechanisms to tolerate such stresses, such as the expression of LEA proteins. Many studies report on physiological protective functions of LEA proteins but lack information about their precise mechanisms on a molecular level. Most LEA proteins are intrinsically disordered in dilute solution but may adopt a distinct secondary structure upon changes in solvent conditions. Understanding the molecular mechanism of how LEA proteins contribute to the counteraction of cellular damage during water-deficits may in the long-term pave the way for breeding crops that are resistant to the effects of global warming. The objective of the work at hand is to improve the biophysical understanding of the sequencestructure-function relationship of LEA proteins as membrane stabilizers, based on the LEA_4 family of the model plant A. thaliana. This is pursued by using a combination of spectroscopic andWater-deficits can cause lethal damage to organisms, which is rooted in cellular dehydration. Many plant species, but also other organisms have developed mechanisms to tolerate such stresses, such as the expression of LEA proteins. Many studies report on physiological protective functions of LEA proteins but lack information about their precise mechanisms on a molecular level. Most LEA proteins are intrinsically disordered in dilute solution but may adopt a distinct secondary structure upon changes in solvent conditions. Understanding the molecular mechanism of how LEA proteins contribute to the counteraction of cellular damage during water-deficits may in the long-term pave the way for breeding crops that are resistant to the effects of global warming. The objective of the work at hand is to improve the biophysical understanding of the sequencestructure-function relationship of LEA proteins as membrane stabilizers, based on the LEA_4 family of the model plant A. thaliana. This is pursued by using a combination of spectroscopic and scattering techniques, supported by bioinformatics and computational analyses. Eight out of the 18 LEA_4 proteins are experimentally assessed revealing that a coil-helix transition in response to water-deficit is a common feature, as predicted for the entire family. In addition, they all stabilize simple membrane models during a freeze/ thaw cycle. Three-dimensional structure prediction of representative members suggests that their completely folded states are represented by a sequential arrangement of alpha-helical segments connected by unstructured linkers, which is experimentally verified for the LEA_4 protein COR15A. The unstructured linker region of COR15A represents a conserved motif among its closest homologs and is, therefore, of particular interest. Facilitating a set of seven designed and investigated COR15A mutants uncovers a complex interplay of transient interactions between the amphipathic alpha-helical segments, mediated by the linker, which fine-tunes folding transitions and structural ensembles upon reduced water-availability. Finally, alpha-helicity is also induced in COR15A upon temperature decrease, which is enhanced in the presence of osmolytes. In addition, high solution osmolarity induced secondary structure is followed by oligomerization of COR15A. Interestingly, the functionality of COR15A, in terms of liposome stabilization, strongly correlates with its alpha-helix ratio in the folded state. The present work significantly improves the understanding of the sequence-structure-function relationship for LEA_4 proteins and offers novel findings on folding mechanisms and oligomerization of COR15A.…
• Wasserdefizite können zu letalem Schaden von Organismen führen, der letztendlich aus zellulärer Dehydrierung resultiert. Viele Pflanzen, aber auch andere Organismen haben Mechanismen entwickelt, um solche Stressfaktoren zu tolerieren, z.B. die Expression von LEAProteinen. Diverse Studien beschreiben deren physiologische Schutzfunktionen, es fehlen jedoch Informationen ihrer präzisen Mechanismen auf molekularer Ebene. Die meisten LEA-Proteine sind in wässriger Lösung intrinsisch unstrukturiert, können jedoch in Reaktion auf veränderte Lösungsmittelbedingungen geordnete Strukturen ausbilden. Ein solides Verständnis ihrer molekularen Mechanismen führt daher über die Entschlüsselung ihrer Sequenz-StrukturFunktions-Beziehungen, welche langfristig den Weg zur Entwicklung von Pflanzen ebnen, die Resistenzen gegen die Auswirkungen der globalen Erwärmung aufweisen.. Ziel der vorliegenden Arbeit ist, das Verständnis der Sequenz-Struktur-Funktions-Beziehung der LEA_4-Familie aus der Modellpflanze A. thaliana zu verbessern. Dazu wird eineWasserdefizite können zu letalem Schaden von Organismen führen, der letztendlich aus zellulärer Dehydrierung resultiert. Viele Pflanzen, aber auch andere Organismen haben Mechanismen entwickelt, um solche Stressfaktoren zu tolerieren, z.B. die Expression von LEAProteinen. Diverse Studien beschreiben deren physiologische Schutzfunktionen, es fehlen jedoch Informationen ihrer präzisen Mechanismen auf molekularer Ebene. Die meisten LEA-Proteine sind in wässriger Lösung intrinsisch unstrukturiert, können jedoch in Reaktion auf veränderte Lösungsmittelbedingungen geordnete Strukturen ausbilden. Ein solides Verständnis ihrer molekularen Mechanismen führt daher über die Entschlüsselung ihrer Sequenz-StrukturFunktions-Beziehungen, welche langfristig den Weg zur Entwicklung von Pflanzen ebnen, die Resistenzen gegen die Auswirkungen der globalen Erwärmung aufweisen.. Ziel der vorliegenden Arbeit ist, das Verständnis der Sequenz-Struktur-Funktions-Beziehung der LEA_4-Familie aus der Modellpflanze A. thaliana zu verbessern. Dazu wird eine Kombination von Spektroskopie- und Streutechniken (unterstützt durch prädiktive Computeranalysen) verwendet. Alle acht experimentell untersuchten der insgesamt 18 LEA_4-Proteine zeigen einen Coil-Helix-Übergang in Reaktion auf Wasserdefizit als gemeinsames Merkmal und stabilisieren einfache Membranmodelle während eines Gefrier-/ Tau-Vorgang. Die dreidimensionale Strukturvorhersage repräsentativer LEA_4-Proteine deutet an, dass der gefaltete Zustand einer Abfolge alpha-helikaler Segmente unterbrochen durch unstrukturierte Domänen entspricht, was für das LEA_4-Protein COR15A experimentell belegt wird. Der unstrukturierte Linker, der die beiden alpha-helikalen Segmente von COR15A verbindet, stellt ein Motiv dar, das innerhalb der nächsten Homologen konserviert ist und ist daher von besonderem Interesse. Mithilfe von sieben entworfenen und untersuchten COR15A-Mutanten kann der komplexe Zusammenhang transienter Wechselwirkungen zwischen den amphipathischen, alpha-helikalen Segmenten, vermittelt durch den Linker, gezeigt werden. Dieser spielt eine zentrale Rolle in der Feinabstimmung von Faltungsübergängen und strukturellen Ensembles bei verringerter Wasserverfügbarkeit. Ferner wird gezeigt, dass alpha-helikale Struktur auch durch Temperaturerniedrigung induziert werden kann, was in Gegenwart von Osmolyten stärker ausgeprägt ist. Hohe Osmolaritäten induzieren außerdem eine Oligomerisierung von COR15A. Interessanterweise korreliert die Funktionalität von COR15A (die Stabilisierung von Liposomen) stark mit dem relativen alpha-Helix-Anteil im gefalteten Zustand. Die vorliegende Arbeit verbessert erheblich das Verständnis für eine Sequenz-StrukturFunktions-Beziehung für LEA_4-Proteine und bietet neue Erkenntnisse zu Faltungsmechanismen und Oligomerisierung von COR15A.…