Beau B. Dronsella

• The carbon demands of an ever-increasing human population and the concomitant rise in net carbon emissions requires CO2 sequestering approaches for production of carbon-containing molecules. Microbial production of carbon-containing products from plant-based sugars could replace current fossil-based production. However, this form of sugar-based microbial production directly competes with human food supply and natural ecosystems. Instead, one-carbon feedstocks derived from CO2 and renewable energy were proposed as an alternative. The one carbon molecule formate is a stable, readily soluble and safe-to-store energetic mediator that can be electrochemically generated from CO2 and (excess off-peak) renewable electricity. Formate-based microbial production could represent a promising approach for a circular carbon economy. However, easy-to-engineer and efficient formate-utilizing microbes are lacking. Multiple synthetic metabolic pathways were designed for better-than-nature carbon fixation. Among them, the reductive glycine pathway wasThe carbon demands of an ever-increasing human population and the concomitant rise in net carbon emissions requires CO2 sequestering approaches for production of carbon-containing molecules. Microbial production of carbon-containing products from plant-based sugars could replace current fossil-based production. However, this form of sugar-based microbial production directly competes with human food supply and natural ecosystems. Instead, one-carbon feedstocks derived from CO2 and renewable energy were proposed as an alternative. The one carbon molecule formate is a stable, readily soluble and safe-to-store energetic mediator that can be electrochemically generated from CO2 and (excess off-peak) renewable electricity. Formate-based microbial production could represent a promising approach for a circular carbon economy. However, easy-to-engineer and efficient formate-utilizing microbes are lacking. Multiple synthetic metabolic pathways were designed for better-than-nature carbon fixation. Among them, the reductive glycine pathway was proposed as the most efficient pathway for aerobic formate assimilation. While some of these pathways have been successfully engineered in microbial hosts, these synthetic strains did so far not exceed the performance of natural strains. In this work, I engineered and optimized two different synthetic formate assimilation pathways in gram-negative bacteria to exceed the limits of a natural carbon fixation pathway, the Calvin cycle. The first chapter solidified Cupriavidus necator as a promising formatotrophic host to produce value-added chemicals. The formate tolerance of C. necator was assessed and a production pathway for crotonate established in a modularized fashion. Last, bioprocess optimization was leveraged to produce crotonate from formate at a titer of 148 mg/L. In the second chapter, I chromosomally integrated and optimized the synthetic reductive glycine pathway in C. necator using a transposon-mediated selection approach. The insertion methodology allowed selection for condition-specific tailored pathway expression as improved pathway performance led to better growth. I then showed my engineered strains to exceed the biomass yields of the Calvin cycle utilizing wildtype C. necator on formate. This demonstrated for the first time the superiority of a synthetic formate assimilation pathway and by extension of synthetic carbon fixation efforts as a whole. In chapter 3, I engineered a segment of a synthetic carbon fixation cycle in Escherichia coli. The GED cycle was proposed as a Calvin cycle alternative that does not perform a wasteful oxygenation reaction and is more energy efficient. The pathways simple architecture and reasonable driving force made it a promising candidate for enhanced carbon fixation. I created a deletion strain that coupled growth to carboxylation via the GED pathway segment. The CO2 dependence of the engineered strain and 13C-tracer analysis confirmed operation of the pathway in vivo. In the final chapter, I present my efforts of implementing the GED cycle also in C. necator, which might be a better-suited host, as it is accustomed to formatotrophic and hydrogenotrophic growth. To provide the carboxylation substrate in vivo, I engineered C. necator to utilize xylose as carbon source and created a selection strain for carboxylase activity. I verify activity of the key enzyme, the carboxylase, in the decarboxylative direction. Although CO2-dependent growth of the strain was not obtained, I showed that all enzymes required for operation of the GED cycle are active in vivo in C. necator. I then evaluate my success with engineering a linear and cyclical one-carbon fixation pathway in two different microbial hosts. The linear reductive glycine pathway presents itself as a much simpler metabolic solution for formate dependent growth over the sophisticated establishment of hard-to-balance carbon fixation cycles. Last, I highlight advantages and disadvantages of C. necator as an upcoming microbial benchmark organism for synthetic metabolism efforts and give and outlook on its potential for the future of C1-based manufacturing.…
• Der Rohstoffbedarf einer ständig wachsenden menschlichen Bevölkerung und der damit einhergehende Anstieg der Kohlenstoffemissionen erfordert Konzepte zur CO2-Bindung für die Produktion von kohlenstoffhaltigen Molekülen. Hier bietet die mikrobielle Produktion von Chemikalien eine nachhaltige Alternative zu den bisher etablierten Syntheseprozessen. Da die Nutzung von pflanzlich hergestelltem Zucker durch die entsprechenden Mikroben allerdings in direkter Konkurrenz zur menschlichen Nahrungsmittelversorgung steht, soll aus CO2 und erneuerbarer Energie synthetisiertes Formiat (Ameisensäure) als alternativer Nährstoff nutzbar gemacht werden. Formiat fungiert als ein stabiler, leicht löslicher und sicher zu lagernder Energiespeicher, der als Ausgangsstoff mikrobieller Produktionen einen vielversprechenden Ansatz für eine nachhaltige Kreislaufwirtschaft eröffnet. Dieses Potenzial wurde bisher nicht realisiert, da es an einfach zu modifizierenden Mikroben, die Formiat effizient nutzen, mangelt. Zwecks mikrobieller Formiatnutzung wurdenDer Rohstoffbedarf einer ständig wachsenden menschlichen Bevölkerung und der damit einhergehende Anstieg der Kohlenstoffemissionen erfordert Konzepte zur CO2-Bindung für die Produktion von kohlenstoffhaltigen Molekülen. Hier bietet die mikrobielle Produktion von Chemikalien eine nachhaltige Alternative zu den bisher etablierten Syntheseprozessen. Da die Nutzung von pflanzlich hergestelltem Zucker durch die entsprechenden Mikroben allerdings in direkter Konkurrenz zur menschlichen Nahrungsmittelversorgung steht, soll aus CO2 und erneuerbarer Energie synthetisiertes Formiat (Ameisensäure) als alternativer Nährstoff nutzbar gemacht werden. Formiat fungiert als ein stabiler, leicht löslicher und sicher zu lagernder Energiespeicher, der als Ausgangsstoff mikrobieller Produktionen einen vielversprechenden Ansatz für eine nachhaltige Kreislaufwirtschaft eröffnet. Dieses Potenzial wurde bisher nicht realisiert, da es an einfach zu modifizierenden Mikroben, die Formiat effizient nutzen, mangelt. Zwecks mikrobieller Formiatnutzung wurden deshalb synthetische Stoffwechselwege entwickelt, die die Ein-Kohlenstoff Quelle deutlich effizienter als natürliche Alternativen in den Metabolismus einbringen. Die effizienteste Variante für die aerobe Formiat-Assimilation ist hierbei der reduktive Glycin-Stoffwechselweg. Während Letzterer zwar bereits erfolgreich in Mikroben eingebracht wurde, übertraf die Leistung dieser synthetischen Stämme trotz der theoretisch höheren Stoffwechseleffizienz nicht die des natürlichen Stoffwechsels. In dieser Arbeit entwickelte und optimierte ich zwei verschiedene synthetische Ein-Kohlenstoff-Fixierungswege in gramnegativen Bakterien, um die Grenzen der natürlichen CO2 Nutzung zu überschreiten. Das erste Kapitel untersuchte das Potenzial von Cupriavidus necator als vielversprechenden formatotrophen Wirt für die Produktion von Chemikalien mit hohem Mehrwert. Die Ameisensäuretoleranz von C. necator wurde getestet und ein Produktionsweg für Crotonat in einer modularen Weise etabliert. Schließlich wurde Bioprozessoptimierung genutzt, um Crotonat aus Formiat mit einem Titer von 148 mg/L zu produzieren. Im zweiten Kapitel integrierte ich den synthetischen reduktiven Glycinweg anstelle der nativen Formiatassimilierung chromosomal in C. necator und optimierte die Expressionsniveaus der beteiligten Enzyme und somit Wachstum des Stammes mit Hilfe eines transposonbasierten Selektionsansatzes. Die Kombination von randomisierter Insertionsmethodik und erzwungener Nutzung des Stoffwechselwegs für Wachstum auf Formiat ermöglichte hier die Selektion für bedingungsspezifisch optimale Expression des Stoffwechselweges, da eine höhere Operationsrate des Stoffwechselweges zu verbessertem Wachstum führte. Anschließend zeigte ich, dass meine optimierten synthetischen Stämme die Biomasseerträge des Calvin-Zyklus von C. necator auf Formiat übertrafen. Dies zeigte zum ersten Mal die bisher nur theoretisch prognostizierte Überlegenheit eines synthetischen Formiat-Assimilationsweges und damit der synthetischen Kohlenstofffixierung gegenüber natürlicher Kohlenstofffixierung. In Kapitel 3 entwickelte ich ein Segment des GED-Zyklus zur synthetischen CO2-Fixierung in Escherichia coli. Der GED-Zyklus ist eine Alternative zum Calvin-Zyklus, die im Gegensatz zu Letzterem keine ungewollte Aktivität mit Sauerstoff hat und somit energieeffizienter CO2 fixiert. Die einfache Architektur des Kreislaufs mit nur einer kritischen Reaktion macht ihn zu einem vielversprechenden Kandidaten für verbesserte Kohlenstofffixierung. Ich erzeugte einen Deletionsstamm, dessen Wachstum an besagte Reaktion, genauer die Carboxylierung mittels des GED-Segments, gekoppelt war. Die Fähigkeit des Stammes, CO2-abhängig zu wachsen, und die 13C-Tracer-Analyse bestätigten die Funktionalität des Weges in vivo. Im letzten Kapitel versuchte ich den GED-Zyklus auch in C. necator zu implementieren, da C. necator durch sein formatotrophes Wachstum potenziell ein vielversprechenderer Wirt sein könnte. Hierbei war das Wachstum des Calvin-Zyklus abhängigen Wildtyps, wie auch für den reduktiven Glycin-Weg, ein guter Referenzwert für den Vergleich mit den synthetischen Stämmen. Ich veränderte C. necator genetisch, sodass es das GED Substrat Xylose nutzt und zeigte, dass alle Enzyme für den Betrieb des Kohlenstofffixierungsweges in separierten Testeinheiten in vivo in C. necator funktional sind. Schließlich vergleiche ich meine Ergebnisse bezüglich der Entwicklung von linearer und zyklischer Ein-Kohlenstoff-Fixierung in zwei verschiedenen mikrobiellen Wirten. Es zeigt sich, dass der simplere lineare reduktive Glycinweg synthetische Formatotrophie von bisher unerschlossener Effizienz erlaubt, während sich die Realisierung komplexer autokatalytischer Kohlenstofffixierungszyklen als deutlich schwieriger erweist. Ich hebe die Vor- und Nachteile von C. necator als zukünftigem Plattformorganismus für synthetische Stoffwechselprozesse hervor und gebe einen Ausblick auf sein Potenzial für die Zukunft der C1-basierten Produktion.…