Laura Tegtmeier

• In plant cells, subcellular transport of cargo proteins relies to a large extent on post-Golgi transport pathways, many of which are mediated by clathrin-coated vesicles (CCVs). Vesicle formation is facilitated by different factors like accessory proteins and adaptor protein complexes (APs), the latter serving as a bridge between cargo proteins and the coat protein clathrin. One type of accessory proteins is defined by a conserved EPSIN N-TERMINAL HOMOLOGY (ENTH) domain and interacts with APs and clathrin via motifs in the C-terminal part. In Arabidopsis thaliana, there are three closely related ENTH domain proteins (EPSIN1, 2 and 3) and one highly conserved but phylogenetically distant outlier, termed MODIFIED TRANSPORT TO THE VACUOLE1 (MTV1). In case of the trans-Golgi network (TGN) located MTV1, clathrin association and a role in vacuolar transport have been shown previously (Sauer et al. 2013). In contrast, for EPSIN1 and EPSIN2 limited functional and localization data were available; and EPSIN3 remained completely uncharacterizedIn plant cells, subcellular transport of cargo proteins relies to a large extent on post-Golgi transport pathways, many of which are mediated by clathrin-coated vesicles (CCVs). Vesicle formation is facilitated by different factors like accessory proteins and adaptor protein complexes (APs), the latter serving as a bridge between cargo proteins and the coat protein clathrin. One type of accessory proteins is defined by a conserved EPSIN N-TERMINAL HOMOLOGY (ENTH) domain and interacts with APs and clathrin via motifs in the C-terminal part. In Arabidopsis thaliana, there are three closely related ENTH domain proteins (EPSIN1, 2 and 3) and one highly conserved but phylogenetically distant outlier, termed MODIFIED TRANSPORT TO THE VACUOLE1 (MTV1). In case of the trans-Golgi network (TGN) located MTV1, clathrin association and a role in vacuolar transport have been shown previously (Sauer et al. 2013). In contrast, for EPSIN1 and EPSIN2 limited functional and localization data were available; and EPSIN3 remained completely uncharacterized prior to this study (Song et al. 2006; Lee et al. 2007). The molecular details of ENTH domain proteins in plants are still unknown. In order to systematically characterize all four ENTH proteins in planta, we first investigated expression and subcellular localization by analysis of stable reporter lines under their endogenous promotors. Although all four genes are ubiquitously expressed, their subcellular distribution differs markedly. EPSIN1 and MTV1 are located at the TGN, whereas EPSIN2 and EPSIN3 are associated with the plasma membrane (PM) and the cell plate. To examine potential functional redundancy, we isolated knockout T-DNA mutant lines and created all higher order mutant combinations. The clearest evidence for functional redundancy was observed in the epsin1 mtv1 double mutant, which is a dwarf displaying overall growth reduction. These findings are in line with the TGN localization of both MTV1 and EPS1. In contrast, loss of EPSIN2 and EPSIN3 does not result in a growth phenotype compared to wild type, however, a triple knockout of EPSIN1, EPSIN2 and EPSIN3 shows partially sterile plants. We focused mainly on the epsin1 mtv1 double mutant and addressed the functional role of these two genes in clathrin-mediated vesicle transport by comprehensive molecular, biochemical, and genetic analyses. Our results demonstrate that EPSIN1 and MTV1 promote vacuolar transport and secretion of a subset of cargo. However, they do not seem to be involved in endocytosis and recycling. Importantly, employing high-resolution imaging, genetic and biochemical experiments probing the relationship of the AP complexes, we found that EPSIN1/AP1 and MTV1/AP4 define two spatially and molecularly distinct subdomains of the TGN. The AP4 complex is essential for MTV1 recruitment to the TGN, whereas EPSIN1 is independent of AP4 but presumably acts in an AP1-dependent framework. Our findings suggest that this ENTH/AP pairing preference is conserved between animals and plants.…
• In pflanzlichen Zellen hängt der Transport von Proteinen von vielen dem Golgi-Apparat nachfolgenden Transportwegen ab, welche zum Großteil durch Clathrin-bedeckte Vesikel (CCV) vermittelt werden. Die Vesikelbildung wird durch verschiedene Helferproteine und Adapterproteinkomplexe (AP) ermöglicht. Letztere dienen als Brücke zwischen den Transportproteinen und dem Hüllprotein Clathrin. Eine Gruppe von Hilfsproteinen interagiert mit APs und Clathrin mittels des C-Terminus und ist durch eine konservierte EPSIN N-TERMINAL HOMOLOGY (ENTH)-Domäne definiert. In Arabidopsis thaliana wurden drei eng verwandte ENTH-Domänenproteine (EPSIN1, 2 und 3) sowie ein stark konservierter phylogenetischer Außenseiter MODIFIED TRANSPORT TO THE VACUOLE1 (MTV1), gefunden. Im Falle des im trans-Golgi Netzwerk (TGN) lokalisierten MTV1 wurde die Assoziation mit Clathrin und eine Rolle im vakuolären Transport nachgewiesen (Sauer et al. 2013). Im Vergleich dazu gab es für EPSIN1 und EPSIN2 nur limitierte Daten und EPSIN3 war bisher unerforscht (Song et al. 2006;In pflanzlichen Zellen hängt der Transport von Proteinen von vielen dem Golgi-Apparat nachfolgenden Transportwegen ab, welche zum Großteil durch Clathrin-bedeckte Vesikel (CCV) vermittelt werden. Die Vesikelbildung wird durch verschiedene Helferproteine und Adapterproteinkomplexe (AP) ermöglicht. Letztere dienen als Brücke zwischen den Transportproteinen und dem Hüllprotein Clathrin. Eine Gruppe von Hilfsproteinen interagiert mit APs und Clathrin mittels des C-Terminus und ist durch eine konservierte EPSIN N-TERMINAL HOMOLOGY (ENTH)-Domäne definiert. In Arabidopsis thaliana wurden drei eng verwandte ENTH-Domänenproteine (EPSIN1, 2 und 3) sowie ein stark konservierter phylogenetischer Außenseiter MODIFIED TRANSPORT TO THE VACUOLE1 (MTV1), gefunden. Im Falle des im trans-Golgi Netzwerk (TGN) lokalisierten MTV1 wurde die Assoziation mit Clathrin und eine Rolle im vakuolären Transport nachgewiesen (Sauer et al. 2013). Im Vergleich dazu gab es für EPSIN1 und EPSIN2 nur limitierte Daten und EPSIN3 war bisher unerforscht (Song et al. 2006; Lee et al. 2007). Die Funktionen der ENTH-Domänenproteine in Pflanzen blieben unklar. Um die vier ENTH-Proteine in planta zu charakterisieren, untersuchten wir zunächst deren Expression sowie subzelluläre Lokalisation anhand stabiler Reporterlinien, welche Fusionsproteine vom jeweils endogenen Promotor exprimierten. Obwohl unsere Ergebnisse zeigten, dass alle ENTH-Domänenproteine ubiquitär exprimiert wurden, war die subzelluläre Verteilung deutlich unterschiedlich. EPSIN1 und MTV1 lokalisierten am TGN, während EPSIN2 und EPSIN3 in der Nähe der Plasmamembran (PM) und der Zellplatte zu finden waren. Um eine mögliche funktionelle Redundanz zu untersuchen, nutzten wir komplette Funktionsverlust-Mutanten und erzeugten daraus Mutanten höherer Ordnung. Deutliche Hinweise auf funktionelle Redundanz ergab die epsin1 mtv1-Doppelmutante, die eine starke Wachstumsreduktion aufwies, was zur Lokalisierung beider Proteine am TGN passte. Im Gegensatz dazu verursachte der Verlust von EPSIN2 und EPSIN3 keinen vom Wildtyp abweichenden Phänotyp, jedoch zeigte die epsin1 epsin2 epsin3-Dreifachmutante partielle Sterilität. Wir fokussierten uns daher hauptsächlich auf epsin1 mtv1 und untersuchten die funktionelle Rolle im Clathrin-vermittelten Vesikeltransport durch vergleichende molekulare, biochemische und genetische Analysen. EPSIN1 und MTV1 unterstützten den vakuolären und sekretorischen Transport, waren aber nicht an Endozytose oder Recycling beteiligt. Durch hochauflösende Mikroskopie, genetische und biochemische Analysen der Beziehung zwischen verschiedenen AP-Komplexen und EPSIN1/MTV1 konnten wir zeigen, dass EPSIN1/AP1 und MTV1/AP4 zwei räumlich und molekular distinkte Subdomänen des TGNs definierten. AP4 war essenziell für die MTV1- jedoch nicht die EPSIN1-Rekrutierung zum TGN und EPSIN1 assoziierte bevorzugt mit AP1. Ähnliche Beobachtungen an EPSIN1- und MTV1-Homologen in tierischen Zellen legen eine evolutionär konservierte Paarung von AP-Komplexen und ENTH-Proteinen nahe.…