Nico Dreymann

• Aptamers are single-stranded DNA (ssDNA) or RNA molecules that can bind specifically and with high affinity to target molecules due to their unique three-dimensional structure. For this reason, they are often compared to antibodies and sometimes even referred to as “chemical antibodies”. They are simple and inexpensive to synthesize, easy to modify, and smaller than conventional antibodies. Enzymes, especially hydrolases, are interesting targets in this context. This class of enzymes is capable of hydrolytically cleaving various macromolecules such as proteins, as well as smaller molecules such as antibiotics. Hence, they play an important role in many biological processes including diseases and their treatment. Hydrolase detection as well as the understanding of their function is therefore of great importance for diagnostics and therapy. Due to their various desirable features compared to antibodies, aptamers are being discussed as alternative agents for analytical and diagnostic use in various applications. The use of aptamers inAptamers are single-stranded DNA (ssDNA) or RNA molecules that can bind specifically and with high affinity to target molecules due to their unique three-dimensional structure. For this reason, they are often compared to antibodies and sometimes even referred to as “chemical antibodies”. They are simple and inexpensive to synthesize, easy to modify, and smaller than conventional antibodies. Enzymes, especially hydrolases, are interesting targets in this context. This class of enzymes is capable of hydrolytically cleaving various macromolecules such as proteins, as well as smaller molecules such as antibiotics. Hence, they play an important role in many biological processes including diseases and their treatment. Hydrolase detection as well as the understanding of their function is therefore of great importance for diagnostics and therapy. Due to their various desirable features compared to antibodies, aptamers are being discussed as alternative agents for analytical and diagnostic use in various applications. The use of aptamers in therapy is also frequently investigated, as the binding of aptamers can have effects on the catalytic activity, protein-protein interactions, or proteolytic cascades. Aptamers are generated by an in vitro selection process. Potential aptamer candidates are selected from a pool of enriched nucleic acid sequences with affinity to the target, and their binding affinity and specificity is investigated. This is one of the most important steps in aptamer generation to obtain specific aptamers with high affinity for use in analytical and diagnostic applications. The binding properties or binding domains and their effects on enzyme functions form the basis for therapeutic applications. In this work, the binding properties of DNA aptamers against two different hydrolases were investigated. In view of their potential utility for analytical methods, aptamers against human urokinase (uPA) and New Delhi metallo-β-lactamase-1 (NDM-1) were evaluated for their binding affinity and specificity using different methods. Using the uPA aptamers, a protocol for measuring the binding kinetics of an aptamer-protein-interaction by surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) was developed. Based on the increased expression of uPA in different types of cancer, uPA is discussed as a prognostic and diagnostic tumor marker. As uPA aptamers showed different binding sites on the protein, microtiter plate-based aptamer sandwich assay systems for the detection of uPA were developed. Because of the function of urokinase in cancer cell proliferation and metastasis, uPA is also discussed as a therapeutic target. In this regard, the different binding sites of aptamers showed different effects on uPA function. In vitro experiments demonstrated both inhibition of uPA binding to its receptor as well as the inhibition of uPA catalytic activity for different aptamers. Thus, in addition to their specificity and affinity for their targets, the utility of the aptamers for potential diagnostic and therapeutic applications was demonstrated. First, as an alternative inhibitor of human urokinase for therapeutic purposes, and second, as valuable recognition molecules for the detection of urokinase, as a prognostic and diagnostic marker for cancer, and for NDM-1 to detect resistance to carbapenem antibiotics.…
• Aptamere sind einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die aufgrund ihrer charakteristischen dreidimensionalen Struktur spezifisch und mit hoher Affinität an Zielmoleküle binden. Häufig werden sie mit Antikörpern verglichen und als „chemische Antikörper“ bezeichnet. Sie sind einfach und kostengünstig zu synthetisieren, leicht zu modifizieren und kleiner als herkömmliche Antikörper. Enzyme, insbesondere Hydrolasen, sind hierbei unter anderem interessante Zielmoleküle. Diese Klasse von Enzymen ist in der Lage verschiedene Makromoleküle wie z.B. Proteine, aber auch kleinere Moleküle, wie z.B. Antibiotika, hydrolytisch zu spalten. Sie spielen in vielen biologischen Prozessen und somit auch in Erkrankungen und deren Behandlung eine wichtige Rolle. Daher ist ihre Detektion, sowie das Verständnis ihrer Funktion für die Diagnostik und Therapie von hoher Bedeutung. Durch ihre Vorteile gegenüber Antikörpern werden Aptamere als Alternativen für den analytischen und diagnostischen Einsatz in verschiedenen Applikationen diskutiert. Der Einsatz vonAptamere sind einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die aufgrund ihrer charakteristischen dreidimensionalen Struktur spezifisch und mit hoher Affinität an Zielmoleküle binden. Häufig werden sie mit Antikörpern verglichen und als „chemische Antikörper“ bezeichnet. Sie sind einfach und kostengünstig zu synthetisieren, leicht zu modifizieren und kleiner als herkömmliche Antikörper. Enzyme, insbesondere Hydrolasen, sind hierbei unter anderem interessante Zielmoleküle. Diese Klasse von Enzymen ist in der Lage verschiedene Makromoleküle wie z.B. Proteine, aber auch kleinere Moleküle, wie z.B. Antibiotika, hydrolytisch zu spalten. Sie spielen in vielen biologischen Prozessen und somit auch in Erkrankungen und deren Behandlung eine wichtige Rolle. Daher ist ihre Detektion, sowie das Verständnis ihrer Funktion für die Diagnostik und Therapie von hoher Bedeutung. Durch ihre Vorteile gegenüber Antikörpern werden Aptamere als Alternativen für den analytischen und diagnostischen Einsatz in verschiedenen Applikationen diskutiert. Der Einsatz von Aptameren in der Therapie wird ebenfalls häufig untersucht, da die Bindung der Aptamere Auswirkungen auf die katalytische Aktivität, Protein-Protein-Interaktionen oder proteolytische Kaskaden haben kann. Aptamere werden mittels in vitro Selektion generiert. Aus einem Pool angereicherter Nukleinsäuren mit Affinität zum Zielmolekül werden anschließend potentielle Aptamerkandidaten identifiziert und ihre Bindung zum Zielmolekül untersucht. Dies ist einer der wichtigsten Schritte in der Aptamergenerierung, um spezifische Aptamere mit hoher Affinität für den späteren Einsatz in analytischen und diagnostischen Applikationen zu erhalten. Die Bindungseigenschaften einschließlich der Bindedomänen und deren Auswirkungen auf die Funktion des Zielmoleküls stellen die Grundlage für spätere therapeutische Anwendungen dar. In dieser Arbeit wurden die Bindungseigenschaften von DNA Aptameren gegen zwei verschiedene Hydrolasen untersucht. Für den potentiellen Nutzen in analytischen Methoden wurden Aptamere gegen die humane Urokinase (uPA), sowie gegen die New-Delhi metallo β-lactamase-1 (NDM-1) mittels molekularbiologischer Methoden auf deren Bindungsaffinität und Spezifität untersucht. Anhand der uPA-Aptamere wurde ein Protokoll für die Messung der Bindungskinetik einer Aptamer-Protein-Bindung mittels Oberflächenplasmonenresonanz Spektroskopie (SPR) entwickelt. Durch die erhöhte Expression von uPA in vielen Krebserkrankungen, wird dieser als prognostischer und diagnostischer Tumormarker diskutiert. Die in dieser Arbeit untersuchten Aptamere gegen die Urokinase zeigten unterschiedliche Bindestellen, wodurch Aptamer-basierte Sandwich Assay Systeme auf Mikrotiterplattenbasis für die Detektion von uPA etabliert werden konnten. Durch die Funktion der Urokinase in der Zellproliferation und Metastasierung in Krebserkrankungen wird uPA ebenfalls als therapeutisches Zielprotein diskutiert. Hierbei zeigten die unterschiedlichen Bindestellen der Aptamere verschiedene Auswirkungen auf die Funktion von uPA. Mittels in vitro Experimenten konnte die Inhibierung der Bindung von uPA zu ihrem Rezeptor, sowie die Inhibierung der katalytischen Aktivität von uPA mit Hilfe verschiedener Aptamere nachgewiesen werden. Somit wurde für die Aptamere, neben ihrer Spezifität und Affinität zu ihren Zielmolekülen, der Nutzen für potentielle diagnostische und therapeutische Anwendungen gezeigt. Zum einen als alternativer Inhibitor der Urokinase für therapeutische Zwecke, als auch als wertvolle Erkennungsmoleküle für den Nachweis von Urokinase, als prognostischer und diagnostischer Marker für Krebserkrankungen, sowie für NDM-1, zum Nachweis der Resistenz gegen Carbapenem-Antibiotika.…