Alexandra Wetzel

• Epigenetische Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von Colitis ulcerosa (CU). Ihr Einfluss auf das beobachtete Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-inflammatorischen Cytokinen ist hingegen weitgehend unerforscht. Einige der wichtigsten immunmodulatorischen Cytokine sind die Mitglieder der heterodimeren Interleukin- (IL-) 12-Familie, die durch das Kombinieren einer der drei α-Ketten (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) mit den ß-Untereinheiten IL-12p40 oder EBI3 (Epstein-Barr Virus-induziertes Gen 3) charakterisiert sind. IL-35 (IL-12p35/EBI3) spielt eine bedeutende anti-inflammatorische Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, wohingegen seine Level bei chronischen Entzündungen erniedrigt sind. Eine mögliche Ursache könnte eine transkriptionelle Stilllegung über epigenetische Modifikationen sein. Tatsächlich konnte durch die Stimulation mit dem DNA-Methyltransferase-Inhibitor (DNMTi) Decitabin (DAC; Dacogen®) eine Induktion von EBI3 in humanen Epithelzellen aus gesundem Colon (HCEC) erreicht werden, die als ModellEpigenetische Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von Colitis ulcerosa (CU). Ihr Einfluss auf das beobachtete Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-inflammatorischen Cytokinen ist hingegen weitgehend unerforscht. Einige der wichtigsten immunmodulatorischen Cytokine sind die Mitglieder der heterodimeren Interleukin- (IL-) 12-Familie, die durch das Kombinieren einer der drei α-Ketten (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) mit den ß-Untereinheiten IL-12p40 oder EBI3 (Epstein-Barr Virus-induziertes Gen 3) charakterisiert sind. IL-35 (IL-12p35/EBI3) spielt eine bedeutende anti-inflammatorische Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, wohingegen seine Level bei chronischen Entzündungen erniedrigt sind. Eine mögliche Ursache könnte eine transkriptionelle Stilllegung über epigenetische Modifikationen sein. Tatsächlich konnte durch die Stimulation mit dem DNA-Methyltransferase-Inhibitor (DNMTi) Decitabin (DAC; Dacogen®) eine Induktion von EBI3 in humanen Epithelzellen aus gesundem Colon (HCEC) erreicht werden, die als Modell für ein lokales Entzündungsgeschehen dienten. Diese Regulation über DNA-Methylierung konnte in weiteren humanen Zellen unterschiedlichen Ursprungs sowie durch Stimulation von HCEC-Zellen mit zwei weiteren DNMTi, dem Cytosin-Analogon Azacytidin (AZA; Vidaza®) und dem natürlich vorkommenden, epigenetisch wirksamen Polyphenol Epigallocatechingallat (EGCG), verifiziert werden. Die kombinierte Inkubation mit Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα) resultierte jeweils in einer über-additiven Induktion von EBI3. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass TNFα trotz Beeinflussung der epigenetischen DNMT- und Ten-eleven Translocation- (TET-) Enzyme keinen Einfluss auf die globalen Methylierungs- oder Hydroxymethylierungslevel hatte, jedoch eine genspezifische DNA-Hypomethylierung im EBI3-Promotor induzierte. Durch Nutzung verschiedener Inhibitoren konnte darüber hinaus nachgewiesen werden, dass der beobachtete synergistische Effekt der gemeinsamen DAC und TNFα-Stimulation hauptsächlich über NFκB (Nuclear factor “kappa-light-chain-enhancer” of activated B-cells) vermittelt wird. Ein Teil verläuft dabei über p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases), während die JNK- (c-Jun N-terminale Kinasen-) und ERK- (extracellular-signal-regulated kinases) Signalwege keine Rolle spielen. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem gezeigt, dass die DNA-Hypomethylierung während eines entzündlichen Zustandes auch in einer erhöhten EBI3-Proteinexpression resultiert. Die Höhe der immunologisch detektierten Banden wies auf eine Dimerbildung sowohl im Zelllysat als auch im Überstand hin. Humane Colonepithelzellen sind demnach in der Lage, Cytokine zu bilden und zu sezernieren, was die Bedeutung von Nicht-Immunzellen bei der lokalen Immunantwort unterstreicht. Mittels Genexpressionsanalysen wurden IL-12p35 und IL-23p19 als mögliche Bindungspartner identifiziert. Aufgrund kreuzreaktiver Antikörper ist ein direkter Nachweis der EBI3-Dimere derzeit nicht möglich. Die stattdessen genutzte Kombination verschiedener Methoden dient als geeigneter Ersatz für die problematischen Antikörper-basierten Analysen wie Immunpräzipitation oder ELISA. Durch molekularbiologische, immunologische und massenspektrometrische Methoden konnte IL-35 identifiziert werden, während IL-39 (IL-23p19/EBI3) nicht detektiert wurde. Dies ist in Einklang mit den Erkenntnissen mehrerer Forschungsgruppen, die eine Bildung des nativen humanen Dimers aus IL-23p19 und EBI3 bezweifeln. Des Weiteren wurde die biologische Aktivität des behandlungsinduzierten IL 35-Proteins durch einen Funktionsassay nachgewiesen. Neben einer DNMTi-bedingten transkriptionellen Aktivierung konnte eine Regulation von EBI3 über Histonacetylierungen gezeigt werden. Der EBI3-induzierende Effekt des Histondeacetylasen-Inhibitors (HDACi) Trichostatin A (TSA) wurde durch SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat; Zolinza®)) verifiziert. Ähnlich zu der Stimulation mit den hypomethylierenden Substanzen wurde ein synergistischer Effekt bei paralleler Inkubation mit TNFα beobachtet, der in einer gesteigerten Bildung des EBI3-Proteins resultierte. Um die Befunde in einem komplexeren in vivo-Modell zu untersuchen, wurde eine chronische Colitis in Ebi3-defizienten Mäusen und dem dazugehörigen Wildtypstamm C57BL/6 durch zyklische Applikation von Natriumdextransulfat (Dextran sodium sulfate (DSS)) induziert. Der Vergleich klinischer Parameter wie Mortalitätsrate und Körper- sowie Milzgewicht wies bei Abwesenheit von Ebi3 signifikant stärkere colitische Symptome auf. Dies bestätigte die zentrale Rolle von Ebi3 in der Colitisentwicklung und deutete auf eine bevorzugte Bildung des anti-inflammatorisch wirkenden IL-35 statt des pro-inflammatorischen IL-39 in den Wildtyptieren hin. Durch zusätzliche therapeutische Behandlung der C57BL/6-Mäuse nach der DSS-Gabe konnte die in der Literatur beschriebene positive Wirkung von SAHA auf die Colitismanifestation bestätigt werden. Im Gegensatz dazu war der HDACi in den Ebi3-defizienten Tieren nicht in der Lage, die colitischen Parameter zu verbessern beziehungsweise verschlimmerte den Krankheitsphänotyp. Expressionsanalysen von Up- und Downstream-Target-Genen lieferten weitere Hinweise darauf, dass bei Anwesenheit von Ebi3 IL-35 statt IL-39 gebildet wird, was in Einklang mit den in vitro-Untersuchungen steht. Die vorliegende Arbeit konnte durch den Vergleich der C57BL/6-Mäuse mit den Ebi3-defizienten Tieren neue Erkenntnisse über die Wirkungsweise von SAHA erbringen. Histonacetylierende Bedingungen verbessern colitische Symptome über einen Mechanismus, der die epigenetische Induktion von Ebi3 mit nachfolgender IL-35-Bildung involviert. Durch Kooperation der epigenetischen Mechanismen Hypomethylierung und Histonacetylierung wurde der stärkste Effekt auf die EBI3-Induktion bewirkt. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit durch in vitro- und in vivo-Analysen die epigenetische und NFκB-vermittelte Induktion von EBI3 über DNA-Demethylierung und Histonacetylierung mit nachfolgender IL-35-Bildung und –Sezernierung nachgewiesen werden. Da IL-35 in der Lage ist, colitische Symptome zu mildern, stellt die epigenetische Reaktivierbarkeit von EBI3 durch DNMTi und HDACi eine vielversprechende Alternative für die derzeit genutzten, oft nicht oder nur kurzfristig wirksamen Therapien bei der Behandlung einer CU dar. Einer übermäßigen Immunantwort während schubweiser entzündlicher Phasen könnte entgegengewirkt und Komplikationen wie die Bildung Colitis-assoziierter Karzinome verhindert werden.…
• Aberrant epigenetic alterations are becoming increasingly relevant in the development of multiple diseases. Epigenetic mechanisms also play a crucial role in the pathogenesis of ulcerative colitis (CU). In contrast, their influence on the observed imbalance between pro- and anti-inflammatory cytokines is largely unexplored. Several of the most important immunomodulatory cytokines are the members of the heterodimeric interleukin- (IL-) 12 family, which are characterized by combining one of the three α-chains (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) with the ß-subunits IL-12p40 or EBI3 (Epstein-Barr virus induced gene 3). IL-35 (IL-12p35/EBI3) plays a significant anti-inflammatory role in various diseases, while its levels are decreased in chronic inflammation. One possible reason could be transcriptional silencing via epigenetic modifications. Indeed, stimulation with the DNA methyltransferase inhibitor (DNMTi) decitabine (DAC; Dacogen®) resulted in reactivation of EBI3 in Human Colon Epithelial Cells (HCEC) generated from healthy tissue, whichAberrant epigenetic alterations are becoming increasingly relevant in the development of multiple diseases. Epigenetic mechanisms also play a crucial role in the pathogenesis of ulcerative colitis (CU). In contrast, their influence on the observed imbalance between pro- and anti-inflammatory cytokines is largely unexplored. Several of the most important immunomodulatory cytokines are the members of the heterodimeric interleukin- (IL-) 12 family, which are characterized by combining one of the three α-chains (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) with the ß-subunits IL-12p40 or EBI3 (Epstein-Barr virus induced gene 3). IL-35 (IL-12p35/EBI3) plays a significant anti-inflammatory role in various diseases, while its levels are decreased in chronic inflammation. One possible reason could be transcriptional silencing via epigenetic modifications. Indeed, stimulation with the DNA methyltransferase inhibitor (DNMTi) decitabine (DAC; Dacogen®) resulted in reactivation of EBI3 in Human Colon Epithelial Cells (HCEC) generated from healthy tissue, which served as a model for a local inflammatory process. This regulation via DNA methylation could be verified in other human cells of different origin as well as by stimulating HCEC cells with two additional DNMTi, the cytosine analog azacytidine (AZA; Vidaza®) and the naturally occurring, epigenetically active polyphenol epigallocatechin gallate (EGCG). Combined incubation with tumor necrosis factor α (TNFα) resulted in synergistic induction of EBI3. Further studies showed that TNFα had no effect on global methylation or hydroxymethylation levels despite its influence on epigenetic DNMT and ten-eleven translocation (TET) enzymes, but induced gene-specific DNA hypomethylation in the EBI3 promoter. Moreover, by using several inhibitors, it has been demonstrated that the synergistic effect of DAC and TNFα stimulation is mediated mainly via NFκB (nuclear factor "kappa-light-chain-enhancer" of activated B-cells). Part of this occurs via p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases), while the JNK (c-Jun N-terminal kinases) and ERK (extracellular-signal-regulated kinases) signaling pathways are not involved. In the present work, it was also shown that DNA hypomethylation during an inflammatory condition also results in increased EBI3 protein expression. The level of immunologically detected bands indicated dimer formation in both cell lysate and supernatant. Human epithelial cells are therefore capable of producing and secreting cytokines, underlining the importance of non-immune cells in the local immune response. Gene expression analyses identified IL-12p35 and IL-23p19 as possible binding partners. Due to cross-reactive antibodies, direct detection of EBI3 dimers is currently not possible. The combination of different methods used instead serves as a suitable alternative to the problematic antibody-based analyses such as immunoprecipitation or ELISA. Molecular biology, immunology, and mass spectrometry methods identified IL-35, whereas IL-39 (IL-23p19/EBI3) was not detected. This is in agreement with the findings of several research groups that doubt formation of the native human dimer. Furthermore, the biological activity of treatment-induced IL-35 protein was detected by a functional assay. In addition to DNMTi-induced reactivation, regulation of EBI3 via histone acetylation was demonstrated. The EBI3-inducing effect of the histone deacetylase inhibitor (HDACi) trichostatin A (TSA) was verified by SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat; Zolinza®)). Similar to stimulation with the hypomethylating agents, a synergistic effect was observed with parallel incubation with TNFα, resulting in increased EBI3 protein formation. To investigate the effects in a more complex in vivo model, chronic colitis was induced in Ebi3-deficient mice and the corresponding wild-type strain C57BL/6 by cyclic application of dextran sodium sulfate (DSS). Comparison of clinical parameters such as mortality rate and body as well as spleen weight showed significantly more severe colitic symptoms in the absence of Ebi3. This confirmed the central role of Ebi3 in colitis development and indicated preferential formation of the anti-inflammatory IL-35 rather than the pro-inflammatory IL-39 in wild-type animals. Additional therapeutic treatment of C57BL/6 mice after DSS administration confirmed the beneficial effect of SAHA on colitis manifestation reported in the literature. In contrast, HDACi in the Ebi3-deficient animals was not able to improve colitic parameters and even appeared to exacerbate the disease phenotype. Expression analyses of up- and downstream target genes provided further evidence that IL-35 rather than IL-39 is produced in the presence of Ebi3, consistent with the in vitro studies. Thus, comparison of the C57BL/6 mice with the Ebi3-deficient animals could provide insights into the mode of action of SAHA. Histone acetylating conditions ameliorate colitic symptoms via a mechanism involving epigenetic induction of Ebi3 followed by IL-35 formation. Based on the cooperation of epigenetic mechanisms and the drastic EBI3 induction shown by parallel hypomethylating and histone acetylating conditions, combined treatment with low-dose DNMTi and HDACi represents a therapeutic option for CU. In summary, the present work demonstrated epigenetic and NFκB-mediated reactivation of EBI3 via DNA demethylation and histone acetylation with subsequent IL-35 formation and secretion by in vitro and in vivo analyses. Since IL-35 is able to alleviate colitic symptoms, the epigenetic inducibility of EBI3 by DNMTi and HDACi represents a promising alternative for the currently used therapies in the treatment of CU, which are often not successful or only short-term effective. An excessive immune response during relapsing inflammatory phases could be counteracted and complications such as the formation of colitis-associated carcinomas prevented.…