Regulation of Starch Granule Morphogenesis in Arabidopsis thaliana
- Carbohydrates play a vital role in all living organisms; serving as a cornerstone in primary metabolism through the release of energy from their hydrolysis and subsequent re-utilization (Apriyanto et al., 2022). Starch is the principal carbohydrate reserve in plants, providing essential energy for plant growth. Furthermore, starch serves as a significant carbohydrate source in the human diet. Beyond its nutritional value, starch has extensive industrial application associated with many aspects of human society, such as feed, pharmacy, textiles, and the production of biodegradable plastics. Understanding the mechanisms underlying starch metabolism in plants carries multifaceted benefits. Not only does it contribute to increasing crop yield and refining grain quality, but also can improve the efficiency of industrial applications.
Starch in plants is categorized into two classes based on their location and function: transitory starch and storage starch. Transitory starch is produced in chloroplasts of autotrophic tissues/organs, suchCarbohydrates play a vital role in all living organisms; serving as a cornerstone in primary metabolism through the release of energy from their hydrolysis and subsequent re-utilization (Apriyanto et al., 2022). Starch is the principal carbohydrate reserve in plants, providing essential energy for plant growth. Furthermore, starch serves as a significant carbohydrate source in the human diet. Beyond its nutritional value, starch has extensive industrial application associated with many aspects of human society, such as feed, pharmacy, textiles, and the production of biodegradable plastics. Understanding the mechanisms underlying starch metabolism in plants carries multifaceted benefits. Not only does it contribute to increasing crop yield and refining grain quality, but also can improve the efficiency of industrial applications.
Starch in plants is categorized into two classes based on their location and function: transitory starch and storage starch. Transitory starch is produced in chloroplasts of autotrophic tissues/organs, such as leaves. It is synthesized during the day and degraded during the night. Storage starch is synthesized in heterotrophic tissues/organs, such as endosperm, roots and tubers, which is utilized for plant reproduction and industrial application in human life. Most studies aiming to comprehend starch metabolism of Arabidopsis thaliana primarily focus on transitory starch.
Starch is stored as granular form in chloroplast and amyloplast. The parameters of starch granules, including size, morphology, and quantity per chloroplast serve as indicators of starch metabolism status. However, the understanding of their regulatory mechanism is still incomplete. In this research, I initially employed a simple and adapted method based on laser confocal scanning microscopy (LCSM) to observe size, morphology and quantity of starch granules within chloroplasts in Arabidopsis thaliana in vivo. This method facilitated a rapid and versatile analysis of starch granule parameters across numerous samples. Utilizing this approach, I compared starch granule number per chloroplast between mesophyll cells and guard cells in both wild type plants (Col-0) and several starch related mutants. The results revealed that the granule number is distinct between mesophyll cells and guard cells, even within the same genetic background, suggesting that guard cells operate a unique regulatory mechanism of starch granule number.
Subsequently, I redirected my attention toward examining starch morphology. Through microscopy analyses, I observed a gradual alteration in starch granule morphology in certain mutants during leaf aging. Specifically, in mutants such as sex1-8 and dpe2phs1ss4, there was a progressive alteration in starch granule morphology over time. Conversely, in Col-0 and ss4 mutant, these morphological alterations were not evident. This discovery suggests a new perspective to understand the development of starch morphology.
Further investigation revealed that mutants lacking either Disproportionating enzyme 2 (DPE2) or MALTOSE-EXCESS 1 (MEX1) exhibited gradual alterations in starch morphology with leaf aging. Notably, the most severe effects on starch morphology occurred in double mutants lacking either DPE2 or MEX1 in conjunction with a lack of starch synthase 4 (SS4). In these mutations, a transformation of the starch granule morphology from the typical discoid morphology to oval and eventually to a spherical shape.
To investigate the changes in the internal structure of starch during this alteration, I analyzed the chain length distribution (CLD) of the amylopectin of young, intermediate and old leaves of the mutants. Throughout starch granule development, I found an increased presence of short glucan chains within the granules, particularly evident in dpe2ss4 and mex1ss4 mutants, as well as their parental single mutants. Notably, the single mutant ss4 also showed an affected granule morphology, albeit not influenced by leaf aging..
The CLD pattern of the amylopectin reflects an integrative regulation involving several participants in starch synthesis, including starch synthases (SSs), starch branching/debranching enzymes (SBEs/DBEs). Therefore, I further detected the expression of related genes on transcription level and the enzymatic activity of their respective proteins. Results indicated altered gene expression of several regulators in these mutants, particularly demonstrating dramatic alterations in dpe2 and dpe2ss4 with leaf aging. These changes corresponded with the observed alterations in starch granule morphology.
Taken together, I have identified and characterized a progressive alteration in starch granule morphology primarily resulting from the deficiencies in DPE2 and MEX1. Furthermore, I have associated the CLD pattern with the granule morphogenesis, as well as the gene expression and enzymatic activity of proteins involved in starch synthesis. Unlike SS4, which is implicated in starch initiation, MEX1 and DPE2 are involved into starch degradation. MEX1 is located in chloroplast envelope and DPE2 is situated in the cytosol. Considering the locations and known functions of DPE2/MEX1 and SS4, I infer that there might be two pathways influencing starch morphology: an initiation-affected pathway via SS4 and a degradation-affected pathway via DPE2/MEX1.…
- Kohlenhydrate spielen eine wichtige Rolle in allen lebenden Organismen, als Grundpfeiler im primären Stoffwechsel, indem sie Energie durch ihre Hydrolyse freisetzen und anschließend wiederverwendet werden können (Apriyanto et al., 2022). Stärke ist die Hauptreserve an Kohlenhydraten in Pflanzen und liefert die essentielle Energie für das Pflanzenwachstum. Darüber hinaus dient Stärke als bedeutende Kohlenhydratquelle in der menschlichen Ernährung. Abgesehen von ihrem Nährwert hat Stärke umfangreiche industrielle Anwendungen in Bereichen wie Futtermittel, Pharmazie, Textilien und der Herstellung biologisch abbaubarer Kunststoffe. Das Verständnis der Mechanismen, die dem Stoffwechsel von Stärke in Pflanzen zugrunde liegen, birgt vielfältige Vorteile. Es trägt nicht nur zur Steigerung des Ernteertrags und zur Verbesserung der Kornqualität bei, sondern kann auch die Effizienz industrieller Anwendungen verbessern.
Stärke in Pflanzen wird je nach ihrem Ort und ihrer Funktion in zwei Klassen eingeteilt: transitorische Stärke undKohlenhydrate spielen eine wichtige Rolle in allen lebenden Organismen, als Grundpfeiler im primären Stoffwechsel, indem sie Energie durch ihre Hydrolyse freisetzen und anschließend wiederverwendet werden können (Apriyanto et al., 2022). Stärke ist die Hauptreserve an Kohlenhydraten in Pflanzen und liefert die essentielle Energie für das Pflanzenwachstum. Darüber hinaus dient Stärke als bedeutende Kohlenhydratquelle in der menschlichen Ernährung. Abgesehen von ihrem Nährwert hat Stärke umfangreiche industrielle Anwendungen in Bereichen wie Futtermittel, Pharmazie, Textilien und der Herstellung biologisch abbaubarer Kunststoffe. Das Verständnis der Mechanismen, die dem Stoffwechsel von Stärke in Pflanzen zugrunde liegen, birgt vielfältige Vorteile. Es trägt nicht nur zur Steigerung des Ernteertrags und zur Verbesserung der Kornqualität bei, sondern kann auch die Effizienz industrieller Anwendungen verbessern.
Stärke in Pflanzen wird je nach ihrem Ort und ihrer Funktion in zwei Klassen eingeteilt: transitorische Stärke und Speicherstärke. Transitorische Stärke wird in Chloroplasten autotropher Gewebe/Organe wie Blätter produziert. Sie wird tagsüber synthetisiert und nachts abgebaut. Speicherstärke wird in heterotrophen Geweben/Organen wie Endosperm, Wurzeln und Knollen synthetisiert und für die Pflanzenreproduktion sowie industrielle Anwendungen im menschlichen Leben genutzt. Die meisten Studien zur Aufklärung des Stärkestoffwechsels von Arabidopsis thaliana konzentrieren sich hauptsächlich auf transitorische Stärke.
Stärke wird in granularer Form in Chloroplasten und Amyloplasten gespeichert. Die Parameter der Stärkegranula, einschließlich Größe, Morphologie und Anzahl pro Chloroplast, dienen als Indikatoren für den Status des Stärkestoffwechsels. Das Verständnis ihrer regulatorischen Mechanismen ist jedoch noch unvollständig. In meiner Forschung habe ich zunächst eine Methode auf Basis der laser-konfokalen Rastermikroskopie (LCSM) etabliert, um Größe, Morphologie und Anzahl der Stärkegranula innerhalb der Chloroplaste von Arabidopsis thaliana in vivo zu beobachten. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und vielseitige Analyse der Parameter der Stärkegranula in zahlreichen Proben. Unter Verwendung dieses Ansatzes verglich ich die Anzahl der Stärkegranula pro Chloroplast zwischen Mesophyllzellen und Schließzellen sowohl bei Wildtyp-Pflanzen (Col-0) als auch bei verschiedenen stärkebezogenen Mutanten. Die Ergebnisse zeigten, dass die Granulanzahl zwischen Mesophyllzellen und Schließzellen, selbst im identischen genetischen Hintergrund, unterschiedlich ist, was darauf hindeutet, dass Schließzellen einen einzigartigen regulatorischen Mechanismus der Stärkegranulanzahl aufweisen.
Anschließend richtete ich meine Aufmerksamkeit darauf, die Stärkemorphologie zu untersuchen. Durch mikroskopische Analysen beobachtete ich eine allmähliche Veränderung der Stärkegranulamorphologie bei bestimmten Mutanten während des Blattalters. Insbesondere bei Mutanten wie sex1-8 und dpe2phs1ss4 gab es im Laufe der Zeit eine fortschreitende Veränderung der Stärkegranulamorphologie. Im Gegensatz dazu waren bei Col-0 und den ss4-Mutanten diese morphologischen Veränderungen nicht erkennbar. Diese Entdeckung ermöglicht eine neue Perspektive, um die Entwicklung der Stärkemorphologie zu verstehen.
Weitere Untersuchungen zeigten, dass Mutanten, denen entweder das Disproportionierende Enzym 2 (DPE2) oder MALTOSE-EXCESS 1 (MEX1) fehlen, im Laufe des Blattalters allmähliche Veränderungen in der Stärkemorphologie aufwiesen. Bemerkenswerterweise traten die schwerwiegendsten Auswirkungen auf die Stärkemorphologie bei Doppelmutanten auf, die entweder DPE2 oder MEX1 in Verbindung mit einem Mangel an Stärkesynthase 4 (SS4) aufwiesen. Bei diesen Mutationen wurde eine Transformation der Stärkegranulamorphologie von der typischen scheibenförmigen Morphologie zu ovalen und schließlich zu einer kugelförmigen Form festgestellt.
Um die Veränderungen in der inneren Struktur der Stärke während dieser Veränderung zu untersuchen, analysierte ich die Kettenlängenverteilung (KLV) des Amylopektins von jungen, mittleren und alten Blättern der Mutanten. Während der Entwicklung der Stärkegranula fand ich eine vermehrte Anwesenheit kurzer Glukanketten innerhalb der Granula, insbesondere bei den Mutanten dpe2ss4 und mex1ss4 sowie der zugrundeliegenden Einzelmutanten. Bemerkenswerterweise zeigte auch die Einzelmutant ss4 eine beeinträchtigte Granulamorphologie, die jedoch nicht durch das Blattalter beeinflusst wurde.
Das KLV-Muster des Amylopektins spiegelt eine integrierte Regulation mehrerer an der Stärkesynthese Beteiligter Enzyme wider, einschließlich Stärkesynthasen (SSs) und Stärkeverzweigungs-/entzweigungs-Enzymen (SBEs/DBEs). Daher habe ich die Expression der beteiligten Gene auf Transkriptionsebene und die enzymatische Aktivität ihrer entsprechenden Proteine weiter untersucht. Die Ergebnisse deuten auf veränderte Genexpression mehrerer Regulatoren in diesen Mutanten hin, insbesondere auf dramatische Veränderungen bei dpe2 und dpe2ss4 mit zunehmendem Blattalter. Diese Veränderungen korrelieren mit den beobachteten Veränderungen in der Stärkegranulamorphologie.
Zusammenfassend habe ich eine fortschreitende Veränderung der Stärkegranulat-Morphologie identifiziert und charakterisiert, die hauptsächlich auf Defizite in DPE2 und MEX1 zurückzuführen ist. Des Weiteren habe ich das KLV-Muster mit der Granulatmorphogenese sowie der Genexpression und enzymatischen Aktivität von Proteinen, die an der Stärkesynthese beteiligt sind, in Verbindung gebracht. Im Gegensatz zu SS4, dass in die Stärkeinitiierung involviert ist, spielen MEX1 und DPE2 eine Rolle bei Stärkeabbauprozessen. MEX1 befindet sich in der Chloroplastenhülle und DPE2 im Zytoplasma. Unter Berücksichtigung der Lokalisationen und bekannten Funktionen von DPE2, MEX1 und SS4 schließe ich darauf, dass es möglicherweise zwei Wege gibt, die die Stärkemorphologie beeinflussen: einen unter Beeinflussung von SS4 der mit dem Initiierungsprozess verknüpft ist und einen durch den Stärkeabbauprozess beeinflussten verbunden mit DPE2 bzw. MEX1.…
