Etablierung einer Antigen-spezifischen Aktivierung von B-Lymphozyten in vitro

  • Monoklonale Antikörper sind essenzielle Werkzeuge in der modernen Laboranalytik sowie in der medizinischen Therapie und Diagnostik. Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist ein zeit- und arbeitsintensiver Prozess. Herkömmliche Methoden beruhen auf der Immunisierung von Labortieren, die mitunter mehrere Monate in Anspruch nimmt. Anschließend werden die Antikörper-produzierenden B-Lymphozyten bzw. deren Antikörpergene isoliert und in Screening-Verfahren untersucht, um geeignete Binder zu identifizieren. Der Transfer der humoralen Immunantwort in eine in vitro Umgebung erlaubt eine Verkürzung des Prozesses und umgeht die Notwendigkeit der in vivo Immunisierung. Das komplexe Zusammenspiel aller involvierten Immunzellen in vitro abzubilden, stellt sich allerdings als schwierig dar. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war deshalb die Realisierung einer vereinfachten In vitro Immunisierung, die sich auf die Protagonisten der Antikörper-Produktion konzentriert: die B-Lymphozyten. Darüber hinaus sollte eine permanente Zelllinie etabliertMonoklonale Antikörper sind essenzielle Werkzeuge in der modernen Laboranalytik sowie in der medizinischen Therapie und Diagnostik. Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist ein zeit- und arbeitsintensiver Prozess. Herkömmliche Methoden beruhen auf der Immunisierung von Labortieren, die mitunter mehrere Monate in Anspruch nimmt. Anschließend werden die Antikörper-produzierenden B-Lymphozyten bzw. deren Antikörpergene isoliert und in Screening-Verfahren untersucht, um geeignete Binder zu identifizieren. Der Transfer der humoralen Immunantwort in eine in vitro Umgebung erlaubt eine Verkürzung des Prozesses und umgeht die Notwendigkeit der in vivo Immunisierung. Das komplexe Zusammenspiel aller involvierten Immunzellen in vitro abzubilden, stellt sich allerdings als schwierig dar. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war deshalb die Realisierung einer vereinfachten In vitro Immunisierung, die sich auf die Protagonisten der Antikörper-Produktion konzentriert: die B-Lymphozyten. Darüber hinaus sollte eine permanente Zelllinie etabliert werden, die zur Antikörper-Herstellung eingesetzt werden und die Verwendung von Primärzellen ersetzen würde. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Protokoll zur In vitro Immunisierung muriner BLymphozyten etabliert. In Vorversuchen wurden die optimalen Konditionen für die Antigenspezifische Aktivierung gereinigter Milz-B-Lymphozyten aus nicht-immunisierten Mäusen determiniert. Dazu wurde der Einfluss verschiedener Stimuli auf die Produktion unspezifischer und spezifischer Antikörper untersucht. Eine Kombination aus dem Modellantigen VP1 (Hamster Polyomavirus Hüllprotein 1), einem Anti-CD40-Antikörper, Interleukin 4 (IL 4) und Lipopolysaccharid (LPS) oder IL 7 induzierte nachweislich eine Antigen-spezifische Antikörper-Antwort in vitro. Als Indikatoren einer erfolgreichen Aktivierung der B-Lymphozyten infolge der in vitro Stimulation wurden die rapide Proliferation und die Expression charakteristischer Aktivierungsmarker auf der Zelloberfläche nachgewiesen. In einer Zeitreihe über zehn Tage wurde am zehnten Tag der In vitro Immunisierung die verhältnismäßig höchste Konzentration Antigen-spezifischer IgG-Antikörper im Kulturüberstand der stimulierten Zellen nachgewiesen. Als nächster Schritt sollte eine permanente Zelllinie hergestellt werden, die statt primärer BLymphozyten für die zuvor etablierte In vitro Immunisierung eingesetzt werden könnte. Zu diesem Zweck wurden retrovirale Vektoren hergestellt, die durch den Transfer verschiedener Onkogene in murine B-Lymphozyten bzw. deren Vorläuferzellen das Proliferationsverhalten der Zellen manipulieren sollen. Es wurden Retroviren mit Doxycyclin-induzierbaren Expressionskassetten mit den Onkogenen cmyc, Bcl2, BclxL und dem Fusionsgen NUP98HOXB4 generiert. Eine Testzelllinie wurde erfolgreich mit den hergestellten Retroviren transduziert und die Funktionalität der hergestellten Viren anhand verschiedener Assays belegt. Die transferierten Gene konnten in der Testzelllinie auf DNAEbene nachgewiesen oder die Überexpression der entsprechenden Proteine im Western Blot detektiert werden. Es wurden schließlich B-Lymphozyten bzw. unreife Vorläuferzellen derselben mit den generierten Retroviren transduziert und mit Knochenmark-ähnlichen Stromazellen co-kultiviert. Aus keinem der transduzierten Ansätze konnte bisher eine Zelllinie oder eine Langzeit-Kultur etabliert werden. Im letzten Teil der Arbeit wurde die Effektivität und Übertragbarkeit des zuvor etablierten Protokolls zur In vitro Immunisierung muriner B-Lymphozyten anhand verschiedener Antigene gezeigt. Es konnten in vitro spezifische IgG-Antworten gegen VP1, Legionella pneumophila und das Protein Mip, von dem ein Peptid in das zur Immunisierung eingesetzte VP1 integriert wurde, induziert werden. Die stimulierten B-Lymphozyten wurden durch Fusion mit Myelomzellen in permanente Antikörper-produzierende Zelllinien transformiert. Dabei konnten mehrere Hybridomzelllinien generiert werden, die spezifische IgGAntikörper gegen VP1 oder Mip produzieren. Die generierten Antikörper konnten sowohl im Western Blot als auch im ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) das entsprechende Antigen spezifisch binden. Die hier etablierte In vitro Immunisierung bietet eine effektive Alternative zu bisherigen Verfahren zur Herstellung spezifischer Antikörper. Sie ersetzt die Immunisierung von Versuchstieren und reduziert den Zeitaufwand erheblich. In Kombination mit der Hybridomtechnologie können die in vitro immunisierten Zellen, wie hier demonstriert, zur Generation von Hybridomzelllinien und zur Herstellung monoklonaler Antikörper genutzt werden. Um die Verwendung von Versuchstieren in dieser Methode durch eine adäquate permanente Zelllinie zu ersetzen, muss die genetische Veränderung von B-Lymphozyten und unreifen hämatopoetischen Zellen optimiert werden. Die Ergebnisse bieten eine Basis für eine universelle, Spezies-unabhängige Methodik zur Antikörperherstellung und für die Etablierung einer idealen, tierfreien In vitro Immunisierung.show moreshow less
  • Monoclonal antibodies are essential tools in modern analytics as well as medical therapy and diagnostics. The production of such is a time consuming and labor intensive process. Common methods rely on the immunization of laboratory animals which comprises up to several months. Subsequently antibody producing B lymphocytes or their antibody coding genes are isolated and screened for suitable binders. The transfer of the humoral immune reaction into an in vitro setting allows to shorten this process and circumvents the necessity of in vivo immunization. The imitation of the complex interaction between all involved immune cells however is difficult to mimic in vitro. Consequently, the main focus of this thesis was the establishment of a simplified in vitro immunization focusing only on the protagonists of antibody production: B lymphocytes. Furthermore a permanent cell line should be generated for the implementation in antibody production and to replace the use of primary cells. In the first part of this work a protocol for the inMonoclonal antibodies are essential tools in modern analytics as well as medical therapy and diagnostics. The production of such is a time consuming and labor intensive process. Common methods rely on the immunization of laboratory animals which comprises up to several months. Subsequently antibody producing B lymphocytes or their antibody coding genes are isolated and screened for suitable binders. The transfer of the humoral immune reaction into an in vitro setting allows to shorten this process and circumvents the necessity of in vivo immunization. The imitation of the complex interaction between all involved immune cells however is difficult to mimic in vitro. Consequently, the main focus of this thesis was the establishment of a simplified in vitro immunization focusing only on the protagonists of antibody production: B lymphocytes. Furthermore a permanent cell line should be generated for the implementation in antibody production and to replace the use of primary cells. In the first part of this work a protocol for the in vitro immunization of murine B lymphocytes was established. In preliminary experiments the optimal conditions for the antigen specific activation of spleen B lymphocytes isolated from non-immunized mice were determined. Therefore the influence of various stimuli on the production of unspecific and specific antibodies was investigated. A combination of the model antigen VP1 (Hamster Polyomavirus capsid protein 1), an anti-CD40 antibody, interleukin 4 (IL 4) and lipopolysaccharide (LPS) or IL 7 evidently induced an antigen specific antibody response in vitro. To proof successful B lymphocyte activation following the in vitro stimulation rapid cell proliferation and the expression of characteristic activation markers on cell surfaces were shown. Over the course of ten days of in vitro immunization the production of antigen specific IgG antibodies in the supernatant of stimulated B lymphocytes was monitored peaking on day ten. Next a permanent cell line was to be established for replacing primary B lymphocytes in the previously established in vitro immunization. For this purpose several retroviral vectors were generated to manipulate the proliferative behavior of B lymphocytes or their progenitor cells by transferring different oncogenes into those cells. Retroviruses with doxycycline inducible expression cassettes carrying the oncogenes cmyc, Bcl2, BclxL and the fusion gene NUP98HOXB4 were generated. A model cell line was successfully transduced with the generated retroviruses. The functionality of these viruses was shown in several assays. In the model cell line the transferred genes were shown to be part of their genome or the overexpression of the corresponding proteins was shown in Western Blots or fluorescent microscopy. Finally, B lymphocytes or respectively immature progenitor cells of such were transduced with the generated retroviruses and co-cultured with bone marrow-like stroma cells. Cells could be cultured for several weeks past their natural lifespan. However, none of the approaches led to the generation of a permanent cell line or the establishment of a long term culture system. In the final part of this thesis the effectivity and transferability of the previously established protocol for the in vitro immunization of murine B lymphocytes was shown by applying various antigens. Specific IgG responses were induced in vitro against VP1, Legionella pneumophila and the protein Mip, a peptide of which had been included in a VP1 carrier protein used for immunization. The stimulated B lymphocytes were fused with myeloma cells to produce permanent antibody secreting cell lines. Thereby several hybridoma cell lines were generated producing specific IgG antibodies against VP1 or Mip. The generated antibodies were purified and shown to specifically bind their antigen in ELISA and Western Blot. This protocol for in vitro immunization presented here poses an effective alternative to conventional methods for the production of specific antibodies. It replaces the immunization of laboratory animals and greatly reduces the time needed. As shown here, in combination with the hybridoma technology these in vitro immunized cells can be used for the generation of hybridoma cell lines and subsequently for the production of monoclonal antibodies. To replace the use of laboratory animals used in this method by a permanent cell line the genetic manipulation of B lymphocytes and immature hematopoietic cells needs to be optimized. The results provide a foundation for a universal, species-independent method for antibody production and for the establishment of an ideal, animal-free in vitro immunization.show moreshow less

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Metadaten
Author details:Sophia MichelchenORCiD
URN:urn:nbn:de:kobv:517-opus4-530272
DOI:https://doi.org/10.25932/publishup-53027
Reviewer(s):Katja HanackORCiDGND, Nina BabelORCiDGND, Diana PaulyORCiD
Supervisor(s):Katja Hanack
Publication type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of first publication:2021
Completion year:2021
Publishing institution:Universität Potsdam
Granting institution:Universität Potsdam
Date of final exam:2021/11/25
Release date:2022/01/13
Tag:Antikörper; B-Lymphozyten; In vitro-Immunisierung
Antibodies; B lymphocytes; in vitro immunization
Number of pages:XII,107
RVK - Regensburg classification:WF 9880, WF 9900
Organizational units:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Biochemie und Biologie
DDC classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 50 Naturwissenschaften / 500 Naturwissenschaften und Mathematik
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