570 Biowissenschaften; Biologie
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Für alle Organismen ist die Aufrechterhaltung ihres energetischen Gleichgewichts unter fluktuierenden Umweltbedingungen lebensnotwendig. In Eukaryoten steuern evolutionär konservierte Proteinkinasen, die in Pflanzen als SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) bezeichnet werden, die Adaption an Stresssignale aus der Umwelt und an die Limitierung von Nährstoffen und zellulärer Energie. Die Aktivierung von SnRK1 bedingt eine umfangreiche transkriptionelle Umprogrammierung, die allgemein zu einer Repression energiekonsumierender Prozesse wie beispielsweise Zellteilung und Proteinbiosynthese und zu einer Induktion energieerzeugender, katabolischer Stoffwechselwege führt. Wie unterschiedliche Signale zu einer generellen sowie teilweise gewebe- und stressspezifischen SnRK1-vermittelten Antwort führen ist bisher noch nicht ausreichend geklärt, auch weil bislang nur wenige Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion identifiziert wurden. In dieser Arbeit konnte ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk um die SnRK1αUntereinheiten aus Arabidopsis AKIN10/AKIN11 etabliert werden. Dadurch wurden zunächst Mitglieder der pflanzenspezifischen DUF581-Proteinfamilie als Interaktionspartner der SnRK1α-Untereinheiten identifiziert. Diese Proteine sind über ihre konservierte DUF581Domäne, in der ein Zinkfinger-Motiv lokalisiert ist, fähig mit AKIN10/AKIN11 zu interagieren. In planta Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass die DUF581-Proteine eine Verschiebung der nucleo-cytoplasmatischen Lokalisierung von AKIN10 hin zu einer nahezu ausschließlichen zellkernspezifischen Lokalisierung begünstigen sowie die Ko-Lokalisierung von AKIN10 und DUF581-Proteinen im Nucleus. In Bimolekularen Fluoreszenzkomplementations-Analysen konnte die zellkernspezifische Interaktion von DUF581-Proteinen mit SnRK1α-Untereinheiten in planta bestätigt werden. Außerhalb der DUF581-Domäne weisen die Proteine einander keine große Sequenzähnlichkeit auf. Aufgrund ihrer Fähigkeit mit SnRK1 zu interagieren, dem Fehlen von SnRK1Phosphorylierungsmotiven sowie ihrer untereinander sehr variabler gewebs-, entwicklungs- und stimulusspezifischer Expression wurde für DUF581-Proteine eine Funktion als Adaptoren postuliert, die unter bestimmten physiologischen Bedingungen spezifische Substratproteine in den SnRK1-Komplex rekrutieren. Auf diese Weise könnten DUF581Proteine die Interaktion von SnRK1 mit deren Zielproteinen modifizieren und eine Feinjustierung der SnRK1-Signalweiterleitung ermöglichen. Durch weiterführende Interaktionsstudien konnten DUF581-interagierende Proteine darunter Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen sowie regulatorische Proteine gefunden werden, die teilweise ebenfalls Wechselwirkungen mit SnRK1α-Untereinheiten aufzeigten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eines dieser Proteine für das eine Beteiligung an der SnRK1Signalweiterleitung als Transkriptionsregulator vermutet wurde näher charakterisiert. STKR1 (STOREKEEPER RELATED 1), ein spezifischer Interaktionspartner von DUF581-18, gehört zu einer pflanzenspezifischen Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktorfamilie und interagiert in Hefe sowie in planta mit SnRK1. Die zellkernspezifische Interaktion von STKR1 und AKIN10 in Pflanzen unterstützt die Vermutung der kooperativen Regulation von Zielgenen. Weiterhin stabilisierte die Anwesenheit von AKIN10 die Proteingehalte von STKR1, das wahrscheinlich über das 26S Proteasom abgebaut wird. Da es sich bei STKR1 um ein Phosphoprotein mit SnRK1-Phosphorylierungsmotiv handelt, stellt es sehr wahrscheinlich ein SnRK1-Substrat dar. Allerdings konnte eine SnRK1-vermittelte Phosphorylierung von STKR1 in dieser Arbeit nicht gezeigt werden. Der Verlust von einer Phosphorylierungsstelle beeinflusste die Homo- und Heterodimerisierungsfähigkeit von STKR1 in Hefeinteraktionsstudien, wodurch eine erhöhte Spezifität der Zielgenregulation ermöglicht werden könnte. Außerdem wurden Arabidopsis-Pflanzen mit einer veränderten STKR1-Expression phänotypisch, physiologisch und molekularbiologisch charakterisiert. Während der Verlust der STKR1-Expression zu Pflanzen führte, die sich kaum von Wildtyp-Pflanzen unterschieden, bedingte die konstitutive Überexpression von STKR1 ein stark vermindertes Pflanzenwachstum sowie Entwicklungsverzögerungen hinsichtlich der Blühinduktion und Seneszenz ähnlich wie sie auch bei SnRK1α-Überexpression beschrieben wurden. Pflanzen dieser Linien waren nicht in der Lage Anthocyane zu akkumulieren und enthielten geringere Gehalte an Chlorophyll und Carotinoiden. Neben einem erhöhten nächtlichen Stärkeumsatz waren die Pflanzen durch geringere Saccharosegehalte im Vergleich zum Wildtyp gekennzeichnet. Eine Transkriptomanalyse ergab, dass in den STKR1-überexprimierenden Pflanzen unter Energiemangelbedingungen, hervorgerufen durch eine verlängerte Dunkelphase, eine größere Anzahl an Genen im Vergleich zum Wildtyp differentiell reguliert war als während der Lichtphase. Dies spricht für eine Beteiligung von STKR1 an Prozessen, die während der verlängerten Dunkelphase aktiv sind. Ein solcher ist beispielsweise die SnRK1-Signaltransduktion, die unter energetischem Stress aktiviert wird. Die STKR1Überexpression führte zudem zu einer verstärkten transkriptionellen Induktion von Abwehrassoziierten Genen sowie NAC- und WRKY-Transkriptionsfaktoren nach verlängerter Dunkelphase. Die Transkriptomdaten deuteten auf eine stimulusunabhängige Induktion von Abwehrprozessen hin und konnten eine Erklärung für die phänotypischen und physiologischen Auffälligkeiten der STKR1-Überexprimierer liefern.
Menschen nehmen Tausende von Stoffen als bitter wahr. Die chemische Struktur der verschiedenen Bitterstoffe ist sehr vielfältig: Sie reicht von kleinen Molekülen wie Kaliumchlorid oder Harnstoff, bis zu sehr komplexen organischen Verbindungen. Die Größe der einzigen bekannten menschlichen Familie von Bitterrezeptoren (TAS2Rs) wurde auf nur ca. 80-120 Mitglieder geschätzt. In Anbetracht der hohen Zahl und Komplexität der Bitterstoffe erscheint die Zahl von Rezeptoren als sehr gering. Dies führt natürlich zu einer Reihe von Fragen: Wie viele Mitglieder hat die menschliche TAS2R-Genfamilie? Wie viele verschiedene Substanzen können denselben Rezeptor aktivieren? Scheint die Zahl der TAS2R-Rezeptoren ausreichend, alle Bitterstoffe wahrnehmen zu können oder muss es noch andere Bitterrezeptorfamilien geben? Diese Fragen zu beantworten, ist das Ziel der vorliegenden Arbeit. Hier durchgeführte Analysen des menschlichen Genomprojektes zeigen, dass Menschen ca. 25 TAS2R-Rezeptoren besitzt, die eine sehr divergente Aminosäurestruktur aufweisen. Diese Rezeptoren wurden in eine neu entwickelte Expressionskassette kloniert, die den Transport des Rezeptors an die Zelloberfläche ermöglicht. Um Liganden für die menschliche TAS2R-Rezeptoren zu identifizieren, wurden die Rezeptoren in HEK293 Zellen exprimiert und mit verschiedenen Bitterstoffen stimuliert. Der Nachweis der Rezeptoraktivierung erfolgte durch Calcium-Imaging. Es konnte gezeigt werden, dass hTAS2R16 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Salicin und verwandten bitteren Pyranosiden ist. So wird hTAS2R16 in HEK293 Zellen durch Salicin und chemisch verwandte Substanzen aktiviert. Ein Vergleich der in diesem Messsystem erhaltenen Daten mit psychophysikalisch ermittelten Geschmackswahrnehmungen beim Menschen, ergab eine hohe Übereinstimmung. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Desensitiverung einzelner Rezeptoren die Ursache für die Adaption des Bittergeschmacks ist. Der Nachweis der Expression des Rezeptors in menschlichen Geschmackspapillen, sowie die festgestellte Assoziation des G/A Polymorpphismus an Position 665 des hTAS2R16 Gens mit einer reduzierten Salicinwahrnehmung, sind weitere unabhängige Beweise für diese These. Ein anderer menschlicher Rezeptor, hTAS2R10, wird durch die Bitterstoffe Strychnin, Brucin und Denatonium aktiviert. Dies sowie die Tatsache, dass die zur Aktivierung benutzten Konzentrationen eine sinnvolle Korrelation zu dem menschlichen Geschmacksschwellwert von Strychnin zeigen, sind starke Hinweise, dass hTAS2R10 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Strychnin und verwandten Substanzen ist. Die vorliegenden Daten zeigen eindeutig, dass die TAS2R-Rezeptoren auch beim Menschen Bitterrezeptoren darstellen. Sowohl hTAS2R16, als auch hTAS2R10 werden durch ein Spektrum strukturell sehr unterschiedlicher Bitterstoffe aktiviert. Falls die anderen Mitglieder der TAS2R-Familie ebenfalls dieses Verhalten zeigen, wäre es möglich, dass die nur ca. 25 Mitglieder umfassende TAS2R-Rezeptorfamilie des Menschen tatsächlich zur Wahrnehmung aller Bitterstoffe ausreicht.
Die Mykorrhiza (griechisch: mýkēs für „Pilz”; rhiza für „Wurzel”) stellt eine Symbiose zwischen Pilzen und einem Großteil der Landpflanzen dar. Der Pilz verbessert durch die Symbiose die Versorgung der Pflanze mit Nährstoffen, während die Pflanze den Pilz mit Kohlenhydraten versorgt. Die arbuskuläre Mykorrhiza (AM) stellt dabei einen beson-dere Form der Mykorrhiza dar. Der AM-Pilz bildet dabei während der Symbiose die namensgebenden Arbuskeln innerhalb der Wurzelzellen als Ort des primären Nährstoff- austausches aus. Die AM-Symbiose (AMS) ist der Forschungsschwerpunkt dieser Arbeit. Als Modellorganismen wurden Medicago truncatula und Glomus intraradices verwendet. Es wurden Transkriptionsanalysen durchgeführt um u.a. AMS regulierte Transkriptions- faktoren (TFs) zu identifizieren. Die Aktivität der Promotoren von drei der so identifizier-ten AMS-regulierten TFs (MtOFTN, MtNTS, MtDES) wurde mit Hilfe eine Reportergens visualisiert. Der Bereich der größten Promotoraktivität waren in einem Fall nur die ar- buskelhaltigen Zellen (MtOFTN). Im zweiten Fall war der Promotor auch aktiv in nicht arbuskelhaltigen Zellen, jedoch am stärksten aktiv in den arbuskelhaltigen Zellen (MtNTS). Ein weiterer Promotor war in arbuskelhaltigen Zellen und den diesen benach-barten Zellen gleich aktiv (MtDES). Zusätzlich wurden weitere Gene als AMS-reguliert identifiziert und es wurde für drei dieser Gene (MtPPK, MtAmT, MtMDRL) ebenfalls eine Promotor::Reporter-Aktivitäts- studie durchgeführt. Die Promotoren der Kinase (MtPPK) und des Ammoniumtrans-porters (MtAmt) waren dabei ausschließlich in arbuskelhaltigen Zellen aktiv, während die Aktivität des ABC-Transporters (MtMDRL) keinem bestimmten Zelltyp zuzuordnen war. Für zwei weitere identifizierte Gene, ein Kupfertransporter (MtCoT) und ein Zucker- bzw. Inositoltransporter (MtSuT), wurden RNA-Interferenz (RNAi)-Untersuchungen durchgeführt. Dabei stellte sich in beiden Fällen heraus, dass, sobald ein RNAi-Effekt in den transformierten Wurzeln vorlag, diese in einem deutlich geringerem Ausmaß wie in der Wurzelkontrolle von G. intraradices kolonisiert worden sind. Im Falle von MtCoT könnte das aus dem selben Grund geschehen, wie im Falle von MtPt4. Welche Rolle MtSuT genau in der Ausbildung der AMS spielt und welche Rolle Inositol in der Aus- bildung der AMS spielt müsste durch weitere Untersuchungen am Protein untersucht werden. Weitere Untersuchen an den in dieser Arbeit als spezifisch für arbuskelhaltige Zellen gezeigten Genen MtAmT, MtPPK und MtOFTN könnten ebenfalls aufschlussreich für das weitere Verständnis der AMS sein. Dies trifft auch auf die TFs MtNTS und MtDES zu, die zwar nicht ausschließlich arbuskelspezifisch transkribiert werden, aber auch eine Rolle in der Regulation der AMS innerhalb von M. truncatula Wurzeln zu spielen scheinen.
Die Folgen einer lebensmittelbedingten Erkrankung sind zum Teil gravierend, insbesondere für Kinder und immunsupprimierte Menschen. Hierbei gehören Salmonella und Campylobacter zu den häufigsten Erregern, die verantwortlich für gastrointestinale Erkrankungen in Deutschland sind. Trotz umfassender Maßnahmen der EU zur Prävention und Bekämpfung von Salmonellen in Geflügelbeständen und der Lebensmittel-Industrie, wird von einem stagnierenden Trend von Infektionszahlen berichtet. Zoonose-Erreger wie Salmonellen können über Nutztiere in die Nahrungskette des Menschen gelangen, wodurch sich Infektionsherde schnell ausbreiten können. Dabei sind bestehende Präventionsstrategien für Geflügel vorhanden, die aber nicht auf den Menschen übertragbar sind. Folglich sind Diagnostik und Prävention in der Lebensmittelindustrie essentiell. Deshalb besteht ein hoher Bedarf für spezifische, sensitive und zuverlässige Nachweismethoden, die eine Point-of-care Diagnostik gewährleisten. Durch ein wachsendes Verständnis der wirtsspezifischen Faktoren von S. enterica Serovaren kann die Entwicklung sowohl neuartiger diagnostischer Methoden, als auch neuartiger Therapien und Impfstoffe maßgeblich vorangetrieben werden.
Infolgedessen wurde in dieser Arbeit ein infektionsähnliches in vitro Modell für S. Enteritidis etabliert und darauf basierend eine umfassende Untersuchung zur Identifizierung neuer Zielstrukturen für den Erreger durchgeführt. Während einer Salmonellen-Infektion ist die erste zelluläre Barriere im Wirt die Epithelschicht. Dementsprechend wurde eine humane Zelllinie (CaCo 2, Darmepithel) für die Pathogen-Wirt-Studie ausgewählt. Das Salmonellen-Transkriptom und morphologische Eigenschaften der Epithelzellen wurden in verschiedenen Phasen der Salmonellen-Infektion untersucht und mit bereits gut beschriebenen Virulenzfaktoren und Beobachtungen in Bezug gesetzt. Durch dieses Infektionsmodell konnte ein spezifischer Phänotyp für die intrazellulären Salmonellen in den Epithelzellen nachgewiesen werden. Zudem wurde aufgezeigt, dass bereits die Kultivierung in Flüssigmedium einen invasionsaktiven Zustand der Salmonellen erzeugt. Allerdings wurde durch die Kokultivierung mit Epithelzellen eine zusätzliche Expression relevanter Gene induziert, um eine effiziente Adhäsion und Transmembran-Transport zu gewährleisten. Letzterer ist charakteristisch für die intrazelluläre Limitierung von Nährstoffen und prägt den infektionsrelevanten Status. Unter Berücksichtigung dieser Faktoren ergab sich ein Phänotyp, der eindeutig Mechanismen zur Wirtsadaptation und möglicherweise auch Pathogenese aufzeigt. Die intrazellulären Bakterien müssen vom Wirt separiert werden, was ein wesentlicher Schritt für Pathogen-bestimmende Analysen ist. Hierbei wurde mithilfe einer Detergenz-basierten Lyse der eukaryotischen Zellmembran und differentieller Zentrifugation, der eukaryotische Eintrag minimal gehalten. Unter Verwendung der Virulenz-adaptierten Salmonellen wurden Untersuchungen in Hinblick auf die Identifizierung neuer Zielstrukturen für S. Enteritidis durchgeführt. Mithilfe eines immunologischen Screenings wurden neue potentielle Antigene entdeckt. Zu diesem Zweck wurden bakterielle cDNA-basierte Expressionsbibliotheken hergestellt, die durch eine vereinfachte Microarray-Anwendung ein Hochdurchsatzscreening von Proteinen als potentielle Binder ermöglichen. Folglich konnten neue unbeschriebene Proteine identifiziert werden, die sich durch eine Salmonella-Spezifität oder Membranständigkeit auszeichnen. Ebenso wurde ein Vergleich der im Screening identifizierten Proteine mit der Regulation der kodierenden Gene im infektionsähnlichen Modell durchgeführt. Dabei wurde deutlich, dass die Häufigkeit von Transkripten einen Einfluss auf die Verfügbarkeit in der cDNA-Bibliothek und folglich auch auf die Expressionsbibliothek nimmt. Angesichts eines Ungleichgewichts zwischen der Gesamtzahl protein-kodierender Gene in S. Enteritidis zu möglichen Klonen, die während des Microarray-Screenings untersucht werden können, besteht der Bedarf einer Anreicherung von Proteinen in der Expressionsbibliothek. Das infektionsähnliche Modell zeigte, dass nicht nur Virulenz-assoziierte, sondern auch Stress- und Metabolismus-relevante Gene hochreguliert werden. Durch die Konstruktion dieser spezifischen cDNA-Bibliotheken ist die Erkennung von charakteristischen molekularen Markern gegeben.
Weiterhin wurden anhand der Transkriptomanalyse spezifisch hochregulierte Gene identifiziert, die relevant für das intrazelluläre Überleben von S. Enteritidis in humanen Epithelzellen sind. Hiervon wurden drei Gene näher untersucht, indem ihr Einfluss im infektionsähnlichen Modell mittels entsprechender Gen-Knockout-Stämme analysiert wurde. Dabei wurde für eine dieser Mutanten ein reduziertes Wachstum in der späten intrazellulären Phase nachgewiesen. Weiterführende in vitro Analysen sind für die Charakterisierung des Knockout-Stamms notwendig, um den Einsatz als potenzielles Therapeutikum zu verifizieren.
Zusammenfassend wurde ein in vitro Infektionsmodell für S. Enteritidis etabliert, wodurch neue Zielstrukturen des Erregers identifiziert wurden. Diese sind für diagnostische oder therapeutische Anwendungen interessant. Das Modell lässt sich ebenso für andere intrazelluläre Pathogene übertragen und gewährleistet eine zuverlässige Identifizierung von potentiellen Antigenen.
Homogene Immunoassays sind immunologische Testverfahren, bei deren Durchführung vollständig auf Separations- und Waschschritte verzichtet werden kann. Der Substrate Channeling Immunoassay beruht auf der Weitergabe eines Substrates in einem immunologischen Komplex aus zwei Enzymen. Das Produkt des ersten Enzyms dient dem zweiten Enzym als Substrat zur Generierung eines photometrisch nachweisbaren Produktes. Voraussetzung für diese Weitergabe ist die enge räumliche Nähe beider Enzyme. Diese Nähe wird durch eine Bindung zwischen Analyt und anti-Analyt Antikörper vermittelt. Ein solcher Substrate Channeling Immunoassay wurde unter Verwendung der Enzyme Glucoseoxidase und Peroxidase aufgebaut. Das so etablierte System war funktionstüchtig, jedoch blieb seine Sensitivität hinter der normaler, heterogener Immunoassays zurück. Die Grundlage eines Fluorescence Quenching Immunoassays ist der gegenseitige Ausschluß zweier Antikörper bei der Bindung eines Dihapten-Konjugates. Das Konjugat besteht dabei aus dem Analyten und einem Fluorophor. Die beiden um die Konjugatbindung konkurrierenden Antikörper sind ein anti-Analyt Antikörper und ein anti-Fluorophor Antikörper, der zudem über die Eigenschaft verfügt, bei Bindung des Fluorophors dessen Fluoreszenz zu löschen. Externe Gaben des freien Analyten verschieben das eingestellte Gleichgewicht in Richtung Fluorophor-Bindung und damit Fluoreszenz-Löschung. Die Änderung der Fluoreszenz ist direkt an die Konzentration des freien Analyten gekoppelt und dient zu deren Bestimmung. Ein solcher Fluorescence Quenching Immunoassays wurde für die Konzentrationsbestimmung des Herbizides Diuron etabliert. Die erreichten Sensitivitäten erlauben die praktische, immundiagnostische Anwendung des Systems. Ein Dihapten-Konjugat wurde ebenfalls zum Aufbau eines Verfahrens zur Selektion Antikörper produzierender Zellen eingesetzt. Die Selektion der Antikörper produzierenden Zellen erfolgt unter Verwendung eines Toxinkonjugates. Dieses Konjugat besteht aus einem Liganden und einem Toxin. Die Antikörperbindung des Liganden behindert sterisch die Wechselwirkung der Toxinkomponente im Konjugat mit deren Zielstruktur in oder auf der Zelle. Nur Zellen die einen geeigneten Antikörper sezernieren, überleben die Selektion und reichern sich in der Kultur an. Das Selektionsverfahren wurde erfolgreich für die Selektion von E.coli Zellen eingesetzt, die einen rekombinanten, Fluorescein bindenden Antikörper produzierten. Das hierfür synthetisierte Toxinkonjugat bestand aus Fluorescein (Ligand) und Ampicillin (Toxinkomponente). Eine Ablösung der bisher für diese Aufgabe gebräuchlichen, außerordentlich kostenintensiven, Screening Methoden wird damit möglich.
Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleinsäure-basierte Methoden für den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchführbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleinsäure-basierten Diagnostik kann durch die Einführung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kostengünstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielfältige Detektionsmöglichkeiten, die sowohl für Schnelltest- als auch für Monitoring-Anwendungen geeignet sind.
Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode für den einfachen, schnellen und günstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abhängiger Detektionsverfahren. Hier wurden zunächst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe für die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden können. Als Alternative für die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe für den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus für die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt.
Ergebnisse: Für den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivität zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegenüber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zusätzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen für die Endpunktdetektion verwendet werden. Darüber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das für den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch für die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zusätzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abhängige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP über das Pyrophosphat identifiziert werden. Dafür wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilität und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden können. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabhängigkeit zwischen den einzelnen Komponenten für einen fluorimetrischen Verdrängungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verhältnis’ als Intensitätsmatrix (heatmap) konnten zunächst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als günstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abhängige Zunahme der Fluoreszenzintensität. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich für die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilität und Homogenität der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tröpfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S möglich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abhängige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gewährleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die Rückfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivität am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur möglich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification“ (HIP) konnte abschließend durch die Verkürzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-ähnlichen Primer verbessert werden.
Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsfähigen Alternative für die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsfähigkeit der qualitativen und quantitativen LAMP für die Feldanwendungen und für die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden können und so eine einfache Pathogendiagnostik ermöglichen. Die gezeigten Methoden können darüber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegenüber den herkömmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP für den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei können die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abhängigen Reaktionen ermöglicht darüber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zukünftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik möglich.
Die Bittergeschmacksrezeptoren stellen in der Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine besondere Gruppe dar. Im Menschen können die 25 Rezeptoren eine große Anzahl unterschiedlichster Bittergeschmacksstoffe detektieren. Diese Substanzen können sowohl schädlich, wie etwa Strychnin, als auch der Gesundheit förderliche Arzneistoffe, wie etwa Chloramphenicol sein. Unter den Bittergeschmacksrezeptoren des Menschen gibt es eine Gruppe von drei Rezeptoren, die besonders viele Bitterstoffe detektieren können. Einer von ihnen ist der Rezeptor hTAS2R10. In dieser Arbeit konnte sowohl experimentell als auch durch computergestützte Modellierung gezeigt werden, dass der hTAS2R10 nur eine Bindungstasche besitzt. Das stimmt mit den bisher ausführlich experimentell und in silico untersuchten Rezeptoren hTAS2R1, -R16, -R38 und -R46 überein. Die für die Agonisteninteraktionen nachweislich wichtigen Transmembrandomänen sind in den bisher untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren, wie auch im hTAS2R10, die Transmembrandomänen 3, 5, 6 und 7. Die Untersuchungen zeigten, dass die Bindungstasche des hTAS2R10 in der oberen Hälfte des zum extrazellulären Raum gerichteten Bereichs lokalisiert ist. Insbesondere konnte für die untersuchten Agonisten Strychnin, Parthenolid und Denatoniumbenzoat gezeigt werden, dass die Seitenketten der Aminosäuren in Position 3.29 und 5.40 ausgeprägte agonistenselektive Wechselwirkungen eingehen. Weitere Untersuchungen haben ergeben, dass das weitgefächerte Agonistenspektrum des hTAS2R10 zu Lasten der Sensitivität für einzelne Bitterstoffe geht. Der Vergleich wichtiger Positionen im hTAS2R10, hTAS2R46 und mTas2r105 hat deutlich gemacht, dass sich die Bindungsmodi zwischen diesen Rezeptoren unterscheiden. Dies deutet auf eine getrennte evolutionäre Entwicklung der Bindungseigenschaften dieser Rezeptoren hin. Gleichfalls zeigten die Untersuchungen, dass einige Positionen wie z.B. 7.39 die Funktion aller untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren prägen, sich jedoch die genaue Bedeutung im jeweiligen Rezeptor unterscheiden kann. Einzelne dieser Positionen konnten auch bei der Agonisteninteraktion des Rhodopsins und des β2-adrenergen Rezeptors beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit helfen dabei die Wechselwirkungen zwischen Bitterstoffen und den Bittergeschmacksrezeptoren zu verstehen und geben erste Einblicke in die Entwicklung der Rezeptoren in Hinblick auf ihren Funktionsmechanismus. Diese Erkenntnisse können genutzt werden, um Inhibitoren zu entwickeln, die sowohl ein wichtiges Werkzeug in der Rezeptoranalytik wären, als auch dazu genutzt werden könnten, den unerwünschten bitteren Geschmack von Medikamenten oder gesundheitsfördernden sekundären Pflanzenstoffen zu mindern. Damit könnte ein Beitrag zur Gesundheit der Menschen geleistet werden.
Biomakromoleküle sind in der Natur für viele Abläufe in lebenden Organismen verantwortlich. Dies reicht vom Aufbau der extrazellulären Matrix und dem Cytoskelett über die Erkennung von Botenstoffen durch Rezeptoren bis hin zur Katalyse der verschiedensten Reaktionen in den Zellen selbst. Diese Aufgaben werden zum größten Teil von Proteinen übernommen, und besonders das spezifische Erkennen der Interaktionspartner ist für alle diese Moleküle äußerst wichtig, um eine fehlerfreie Funktion zu gewährleisten. Als Alternative zur evolutiven Erzeugung von optimalen Bindern und Katalysatoren auf der Basis von Aminosäuren und Nukleotiden wurden von Wulff, Shea und Mosbach synthetische molekular geprägte Polymere (molecularly imprinted polymers, MIPs) konzipiert. Das Prinzip dieser künstlichen Erkennungselemente beruht auf der Tatsache, dass sich funktionelle Monomere spezifisch um eine Schablone (Templat) anordnen. Werden diese Monomere dann vernetzend polymerisiert, entsteht ein Polymer mit molekularen Kavitäten, in denen die Funktionalitäten komplementär zum Templat fixiert sind. Dadurch ist die selektive Bindung des Templats in diese Kavitäten möglich. Aufgrund ihrer hohen chemischen und thermischen Stabilität und ihrer geringen Kosten haben “bio-inspirierte” molekular geprägte Polymere das Potential, biologische Erkennungselemente in der Affinitätschromatographie sowie in Biosensoren und Biochips zu ersetzen. Trotz einiger publizierter Sensorkonfigurationen steht der große Durchbruch noch aus. Ein Hindernis für Routineanwendungen ist die Signalgenerierung bei Bindung des Analyten an das Polymer. Eine Möglichkeit für die markerfreie Detektion ist die Benutzung von Kalorimetern, die Bindungs- oder Reaktionswärmen direkt messen können. In der Enzymtechnologie wird der Enzym-Thermistor für diesen Zweck eingesetzt, da enzymatische Reaktionen eine Enthalpie in einer Größenordnung von 5 – 100 kJ/mol besitzen. In dieser Arbeit wird die Herstellung von katalytisch geprägten Polymeren nach dem Verfahren des Oberflächenprägens erstmalig beschrieben. Die Methode zur Immobilisierung des Templats auf der Oberfläche von porösem Kieselgel sowie die Polymerzusammensetzung wurden optimiert. Weiter wird die Evaluation der katalytischen Eigenschaften über einen optischen Test, sowie das erste Mal die Kombination eines kalorimetrischen Transduktors – des Thermistors – mit der Analyterkennung durch ein katalytisch aktives MIP gezeigt. Bei diesen Messungen konnte zum ersten Mal gleichzeitig die Bindung/Desorption, sowie die katalytische Umwandlung des Substrats durch konzentrationsabhängige Wärmesignale nachgewiesen werden.
Biogene Amine sind kleine organische Verbindungen, die sowohl bei Vertebraten als auch bei Invertebraten als Neurotransmitter, Neuromodulatoren und/oder Neurohormone wirken. Sie bilden eine bedeutende Gruppe von Botenstoffen und entfalten ihre Wirkungen vornehmlich über die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Bei Insekten wurde eine Vielzahl von Wirkungen biogener Amine beschrieben. Das führte schon frühzeitig zur Vermutung, dass Insekten (u. a. Invertebraten) wie die Wirbeltiere ein diverses Repertoire an aminergen Rezeptoren besitzen. Für ein umfassendes Verständnis der komplexen physiologischen Wirkungen biogener Amine fehlten jedoch wichtige Informationen über die molekulare Identität der entsprechenden Rezeptorproteine und ihrer pharmakologischen Eigenschaften, ihre Lokalisation und ihre intrazellulären Reaktionspartner. Viele bei Schaben gut untersuchte (neuro)physiologische Prozesse sowie Verhaltensweisen werden durch Serotonin und Dopamin gesteuert bzw. moduliert. Über die beteiligten Rezeptoren ist jedoch bisher vergleichsweise wenig bekannt. Die Klonierung und Charakterisierung von Serotonin- und Dopaminrezeptoren der Amerikanischen Schabe P. americana ist damit ein längst überfälliger Schritt auf dem Weg zu einem umfassenden Verständnis der vielfältigen Wirkungen biogener Amine bei Insekten. Durch die Anwendung verschiedener Klonierungsstrategien konnten cDNAs isoliert werden, die für potentielle Serotoninrezeptoren und einen Dopaminrezeptor kodieren. Die Sequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu Mitgliedern der 5-HT1- und 5-HT7-Rezeptorklassen bzw. den Invertebratentyp-Dopaminrezeptoren auf. Die isolierten Rezeptoren der Amerikanischen Schabe wurden dementsprechend Pea(Periplaneta americana)5-HT1, Pea5-HT7 und PeaDop2 benannt. Das Hydropathieprofil dieser Rezeptoren postuliert das Vorhandensein der charakteristischen heptahelikalen Architektur G-Protein-gekoppelter Rezeptoren. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen typische Merkmale aminerger Rezeptoren. So sind Aminosäuren, die bedeutend für die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an GProteine sind, in den Rezeptoren konserviert. Expressionsstudien zeigten eine auffallend hohe Expression aller drei Rezeptor-mRNAs im Gehirn sowie in den Speicheldrüsen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden polyklonale Antikörper gegen den Pea5-HT1-Rezeptor sowie den PeaDop2-Rezeptor hergestellt. Der anti-Pea5-HT1-Antikörper detektiert im Homogenat von Schabengehirnen, Speicheldrüsen und Pea5-HT1-exprimierenden HEK 293-Zellen die glykosylierte Form des Rezeptors. In Gehirnschnitten markiert der anti-Pea5-HT1-Antikörper spezifisch einige Zellkörper in der Pars intercerebralis und deren Axone, welche in den Corpora cardiaca Nerv I projizieren. Der PeaDop2-Rezeptor wurde durch den spezifischen anti-PeaDop2-Antikörper in Neuronen mit Somata im anterioren Randbereich der Medulla nachgewiesen. Diese Neurone innervieren die optischen Loben und projizieren in das ventrolaterale Protocerebrum. Die intrazellulären Signalwege der heterolog exprimierten Pea5-HT1- und PeaDop2-Rezeptoren wurden in HEK 293-Zellen untersucht. Die Aktivierung des Pea5-HT1-Rezeptors durch Serotonin führt zur Hemmung der cAMP-Synthese. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der Rezeptor konstitutive Aktivität besitzt. WAY 100635, ein hoch selektiver 5-HT1A-Rezeptorantagonist, wurde als wirksamer inverser Agonist am Pea5-HT1-Rezeptor identifiziert. Der stabil exprimierte PeaDop2-Rezeptor antwortet auf eine Aktivierung durch Dopamin mit einer Erhöhung der cAMP-Konzentration. Eine C-terminal trunkierte Variante dieses Rezeptors ist eigenständig nicht funktional. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit indizieren, dass die untersuchten aminergen Rezeptoren im zentralen Nervensystems der Schabe an der Informationsverarbeitung beteiligt sind und verschiedene physiologische Prozesse in peripheren Organen regulieren. Mit der Klonierung und funktionellen Charakterisierung der ersten Serotoninrezeptoren und eines Dopaminrezeptors ist damit eine wichtige Grundlage für die Untersuchung ihrer Funktionen geschaffen worden.
Die Tailspike Proteine (TSP) der Bakteriophagen P22, Sf6 und HK620 dienen der Erkennung von Kohlenhydratstrukturen auf ihren gram-negativen Wirtsbakterien und zeigen, von den ersten 110 Aminosäuren des N-Terminus abgesehen, keine Sequenzübereinstimmung. Mit Röntgenkristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, dass HK620TSP und Sf6TSP ebenfalls zu einer parallelen, rechtsgängigen beta-Helix falten, wie dies schon für P22TSP bekannt war. Die Kohlenhydratbindestelle ist bei Sf6TSP im Vergleich zu P22TSP zwischen die Untereinheiten verschoben.
Die Enzyme der Sulfotransferase-Gensuperfamilie (SULT) konjugieren nukleophile Gruppen von kleinen endogenen Verbindungen und Fremdstoffen mit der negativ geladenen Sulfo-Gruppe. Dadurch wird die Polarität dieser Verbindungen erhöht, ihre passive Permeation von Zellmembranen verhindert und somit ihre Ausscheidung erleichtert. Jedoch stellt die Sulfo-Gruppe in bestimmten chemischen Verbindungen eine gute Abgangsgruppen dar. Aus der Spaltung resultierende Carbenium- oder Nitreniumionen können mit DNA oder anderen zellulären Nukleophilen reagieren. In Testsystemen für Mutagenität wurden zahlreiche Verbindungen, darunter Nahrungsinhaltsstoffe und Umweltkontaminanten, durch SULT zu Mutagenen aktiviert. Dabei zeigten sich zum einen eine ausgeprägte Substratspezifität selbst orthologer SULT-Formen unterschiedlicher Spezies und zum anderen Interspezies-Unterschiede in der SULT-Gewebeverteilung. Daher könnten sich die Zielgewebe einer SULT-induzierten Krebsentstehung bei Mensch und Nager unterscheiden. Um die Beteiligung von humanen SULT an der Bioaktivierung von Fremdstoffen im Tiermodell untersuchen zu können, wurden transgene Mauslinien für den Cluster der humanen SULT1A1- und -1A2-Gene sowie für die humane SULT1B1 generiert. Zur Herstellung der transgenen Linien wurden große genomische Konstrukte verwendet, die die SULT-Gene sowie – zum Erreichen einer der Humansituation entsprechenden Gewebeverteilung der Proteinexpression – deren potentielle regulatorische Sequenzen enthielten. Es wurden je drei transgene Linien für hSULT1A1/hSULT1A2 und drei transgene Linien für hSULT1B1 etabliert. Die Expression der humanen Proteine konnte in allen Linien gezeigt werden und fünf der sechs Linien konnten zur Homozygotie bezüglich der Transgene gezüchtet werden. In der molekularbiologischen Charakterisierung der transgenen Linien wurde der chromosomale Integrationsort der Konstrukte bestimmt und die Kopienzahl pro Genom untersucht. Mit Ausnahme einer hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linie, bei der Kopien des Konstrukts in zwei unterschiedliche Chromosomen integriert vorliegen, wiesen alle Linien nur einen Transgen-Integrationsort auf. Die Untersuchung der Transgen-Kopienzahl ergab, dass die Mauslinien zwischen einer und etwa 20 Kopien des Transgen-Konstrukts pro Genom trugen. In der proteinbiochemischen Charakterisierung wurde gezeigt, dass die transgenen Linien die humanen Proteine mit einer weitgehend der des Menschen entsprechenden Gewebeverteilung exprimieren. Die Intensität der im Immunblot nachgewiesenen Expression korrelierte mit der Kopienzahl der Transgene. Die zelluläre und subzelluläre Verteilung der Transgen-Expression wurden bei einer der hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linien in Leber, Niere, Lunge, Pankreas, Dünndarm und Kolon und bei einer der hSULT1B1-transgenen Linien im Kolon untersucht. Sie stimmte ebenfalls mit der Verteilung der entsprechenden SULT-Formen im Menschen überein. Da sich die erzeugten transgenen Linien aufgrund ihrer mit dem Menschen vergleichbaren Gewebeverteilung der SULT-Expression als Modellsystem zur Untersuchung der menschlichen SULT-vermittelten metabolischen Aktivierung eigneten, wurde eine der hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linien für zwei erste toxikologische Untersuchungen eingesetzt. Den Mäusen wurden chemische Verbindungen verabreicht, für die in in-vitro-Versuchen eine hSULT1A1/hSULT1A2-vermittelte Bioaktivierung zu Mutagenen gezeigt worden war. In beiden Untersuchungen wurde die Gewebeverteilung der entstandenen DNA-Addukte als Endpunkt einer gewebespezifischen genotoxischen Wirkung ermittelt. In der ersten Untersuchung wurden 90 mg/kg Körpergewicht 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin – ein in gebratenem Fleisch gebildetes heterozyklisches aromatisches Amin – transgenen sowie Wildtyp-Mäusen oral verabreicht. Acht Stunden nach Applikation wiesen die transgenen Mäuse signifikant höhere Adduktniveaus als die Wildtyp-Mäuse in Leber, Lunge, Niere, Milz und Kolon auf. In der Leber der transgen Mäuse war das Adduktniveau 17fach höher als in der Leber der Wildtyp-Mäuse. Die Leber war bei den transgenen Tieren das Organ mit dem höchsten, bei den Wildtyp-Tieren hingegen mit dem niedrigsten DNA-Adduktniveau. In der zweiten Untersuchung (Pilotstudie mit geringer Tierzahl) wurde transgenen und Wildtyp-Mäusen 19 mg/kg Körpergewicht des polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffs 1-Hydroxymethylpyren – ein Metabolit der Nahrungs- und Umweltkontaminante 1-Methylpyren – intraperitoneal verabreicht. Nach 30 Minuten wurden, verglichen mit den Wildtyp-Mäusen, bis zu 25fach erhöhte Adduktniveaus bei den transgenen Mäusen in Leber, Niere, Lunge und Jejunum nachgewiesen. Somit konnte anhand einer in dieser Arbeit generierten transgenen Mauslinie erstmals gezeigt werden, dass die Expression der humanen SULT1A1/hSULT1A2 tatsächlich sowohl auf die Stärke als auch die Zielgewebe der DNA-Adduktbildung in vivo eine Auswirkung hat.
Eine besondere Rolle im Fremdstoffmetabolismus hat die SULT1A1 beim Menschen aufgrund der hohen Expression und breiten Gewebeverteilung. Während die humane SULT1A1 in sehr vielen Geweben exprimiert wird, wurde die murine SULT1A1 vor allem in der Leber, Lunge und Colon gefunden. Neben der Gewebeverteilung spielt auch der Polymorphismus im humanen SULT1A1-Gen eine bedeutende Rolle. Der häufigste Polymorphismus in diesem Gen führt zu einer Aminosäuresubstitution von Arginin zu Histidin an Position 213. Die Genvariante mit Histidin (auch als SULT1A1*2 bezeichnet) codiert für ein Protein mit einer geringen Enzymaktivität und einer reduzierten Enzymmenge in Thrombocyten. Über den Einfluss dieser allelischen Varianten in anderen Geweben ist bislang wenig bekannt. In vorausgegangenen epidemiologischen Studien wurden mögliche Korrelationen zwischen den Genvarianten und der Krebsentstehung in verschiedenen Geweben untersucht. Diese Daten liefern jedoch widersprüchliche Ergebnisse zum Krebsrisiko. Aufgrund der strittigen epidemiologischen Daten sollten Tiermodelle generiert werden, um die häufigsten SULT1A1-Allele hinsichtlich der Empfindlichkeit gegenüber Nahrungs- und Umweltkanzerogenen zu untersuchen. Zur Erzeugung transgener (tg) Mauslinien wurde mittels Mikroinjektion der codierenden Genbereich und große flankierende Humansequenzen stromaufwärts und stromabwärts in das Mausgenom integriert. Es wurden mehrere Mauslinien hergestellt. Zwei davon, die Mauslinie 31 mit dem SULT1A1*1-Allel und die Mauslinie 28 mit dem SULT1A1*2-Allel, wurden eingehend analysiert. In beiden Linien wurde eine identische Kopienzahl des Transgens ermittelt. Proteinbiochemische Charakterisierungen zeigten eine weitgehend dem Menschen entsprechende Gewebeverteilung und zelluläre und subzelluläre Lokalisation der humanen SULT1A1 in der Linie (Li) 28. In Li 31 wurden Unterschiede zu Li 28 sowohl in der Gewebeverteilung als auch in der zellulären Lokalisation des exprimierten humanen Proteins ermittelt. Dabei war die Expression auf Proteinebene in der SULT1A1*2-tg Linie generell stärker als in der SULT1A1*1-Linie. Dieses Ergebnis war überraschend, denn in humanen Thrombocyten führt das SULT1A1*1-Allel zu einem höheren Gehalt an SULT1A1-Protein als das SULT1A1*2-Allel. Zur Analyse der unterschiedlichen Proteinexpressionen in den tg Mauslinien wurde die cDNA und der 5´-flankierende Bereich des SULT1A1-Gens sequenziert. In beiden tg Linien entsprach die Sequenz der cDNA der Referenzsequenz aus der Gendatenbank (Pubmed). In der 5´-flankierenden Region wurden bekannte Polymorphismen analysiert und unterschiedliche Haplotypen in den tg Linien an den Positionen -624 und -396 ermittelt. Dabei wurde in der Li 31 der Haplotyp detektiert, der in der Literatur mit einer höheren SULT1A1-Enzymaktivität beschrieben wird. Der mögliche Zusammenhang zwischen Transkriptionsrate und Proteinexpression wurde in RNA-Expressionsanalysen im codierenden und 5´-nicht codierenden Bereich (mit den alternativen Exons 1B und 1A) untersucht. Im codierenden Bereich und im Exon 1B konnte in den untersuchten Organen eine höhere RNA-Expression in der Li 28 im Vergleich zur Li 31 ermittelt werden. Außer in der Lunge wurde für Exon 1B eine identische RNA-Expression detektiert. RNA, die Exon 1A enthielt, wurde in allen untersuchten Organen der Li 28, aber nur in der Lunge bei der Li 31 gefunden. In beiden tg Linien konnten mit den Exon 1A-Primern jedoch auch größere PCR-Produkte ermittelt werden. Dieser Unterschied im Exon 1A und mögliche Spleißvarianten könnten damit für die unterschiedliche Proteinexpression des humanen SULT1A1-Proteins in den beiden tg Mauslinien sein. Die in dieser Arbeit generierten und charakterisierten tg Mausmodelle wurden in einer toxikologischen Studie eingesetzt. Es wurde das heterozyklische aromatische Amin 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo-[4,5-b]pyridin (PhIP) verwendet. PhIP wird beim Erhitzen und Braten von Fleisch und Fisch gebildet und könnte mit der erhöhten Krebsentstehung im Colon in der westlichen Welt im Zusammenhang stehen. Mittels 32P-Postlabelling sollte der Einfluss der zusätzlichen Expression der humanen SULT-Proteine auf die PhIP-DNA-Adduktbildung analysiert werden. Dabei wurden mehr DNA-Addukte in den tg Tieren als in den Wildtyp-Mäusen ermittelt. Die Konzentration der gebildeten DNA-Addukte korrelierte mit der Expressionsstärke des humanen SULT1A1-Proteins in den tg Mäusen. An den in dieser Arbeit generierten tg Mauslinien mit den häufigsten allelischen Varianten des SULT1A1-Gens konnten Unterschiede auf RNA- und Protein-Ebene ermittelt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Expression der humanen SULT1A1 eine Auswirkung sowohl auf die Stärke als auch das Zielgewebe der DNA-Adduktbildung in vivo hat.
Korrelation zwischen der genetischen und der funktionellen Diversität humaner Bitterrezeptoren
(2013)
Der Mensch besitzt ~25 funktionelle Bitterrezeptoren (TAS2R), die für die Wahrnehmung potenziell toxischer Substanzen in der Nahrung verantwortlich sind. Aufgrund der großen genetischen Variabilität der TAS2R-Gene könnte es eine Vielzahl funktionell unterschiedlicher TAS2R-Haplotypen geben, die zu Unterschieden der Bitterwahrnehmung führen. Dies konnte bereits in funktionellen Analysen und sensorischen Studien für einzelne Bitterrezeptoren gezeigt werden. In dieser Arbeit wurden die häufigsten Haplotypen aller 25 Bitterrezeptoren verschiedener Ethnien funktionell charakterisiert. Das Ziel war eine umfassende Aussage über die funktionelle Diversität der TAS2Rs, die die molekulare Grundlage für individuelle Bitterwahrnehmung bildet, treffen zu können. Fehlende Varianten wurden aus genomischer DNA kloniert oder durch gezielte Mutagenese bereits vorhandener TAS2R-Konstrukte generiert. Die funktionelle Analyse erfolgte mittels Expression der TAS2R-Haplotypen in HEK293TG16gust44 Zellen und anschließenden Calcium-Imaging-Experimenten mit zwei bekannten Agonisten. Die Haplotypen der fünf orphanen TAS2Rs wurden mit über hundert Bitterstoffen stimuliert. Durch die gelungene Deorphanisierung des TAS2R41 in dieser Arbeit, wurden für die 21 aktivierbaren TAS2Rs 36 funktionell-unterschiedliche Haplotypen identifiziert. Die tatsächliche funktionelle Vielfalt blieb jedoch deutlich hinter der genetischen Variabilität der TAS2Rs zurück. Neun Bitterrezeptoren wiesen funktionell homogene Haplotypen auf oder besaßen nur eine weltweit vorherrschende Variante. Funktionell heterogene Haplotypen wurden für zwölf TAS2Rs identifiziert. Inaktive Varianten der Rezeptoren TAS2R9, TAS2R38 und TAS2R46 sollten die Wahrnehmung von Bitterstoffen wie Ofloxacin, Cnicin, Hydrocortison, Limonin, Parthenolid oder Strychnin beeinflussen. Unterschiedlich sensitive Varianten, besonders der Rezeptoren TAS2R47 und TAS2R49, sollten für Agonisten wie Absinthin, Amarogentin oder Cromolyn ebenfalls zu phänotypischen Unterschieden führen. Wie für den TAS2R16 bereits gezeigt, traten Haplotypen des funktionell heterogenen TAS2R7 und TAS2R41 ethnien-spezifisch auf, was auf lokale Anpassung und verschiedene Phänotypen hinweisen könnte. Weiterführend muss nun eine Analyse der funktionell-variablen TAS2Rs in sensorischen Tests erfolgen, um ihre phänotypische Relevanz zu prüfen. Die Analyse der funktionsmodulierenden Aminosäurepositionen, z.Bsp. des TAS2R44, TAS2R47 oder TAS2R49, könnte weiterführend zum besseren Verständnis der Rezeptor-Ligand- und Rezeptor-G-Protein-Interaktion beitragen.
Die ergonomische Anpassung von Produkten der körpernahen Umwelt an den menschlichen Körper in seiner gesamten Variabilität erfordert anthropometrische Grundlagen. Die vorliegende Arbeit beschreibt und analysiert die Körpermasse, 17 Längenmaße, 5 Skelettrobustizitätsmaße, 6 Korpulenzmaße, 3 Kopfmaße, 5 Handmaße, 3 Fußmaße, sowie 10 Beweglichkeitsmaße der Wirbelsäule, 8 Beweglichkeitsmaße der Hand, 2 Beweglichkeitsmaße des Beines und 7 Handkräfte von 295 Probanden der drei Altersgruppen 20 bis 29 Jahre, 50 bis 59 Jahre und 60 bis 69 Jahre. Die Untersuchungen wurden im Zeitraum von September 2006 bis April 2007 durchgeführt. Ziel der Arbeit ist es, für den überwiegenden Teil der untersuchten körperlichen Merkmale erstmals für die deutsche Bevölkerung geschlechts- und altersspezifische Mittelwerte und Variabilitätsbereiche bis zum vollendeten 70. Lebensjahr zur Verfügung zu stellen. Das gilt insbesondere für die untersuchten Beweglichkeitsmaße und Handkräfte. Erstmals werden Korrelationen zwischen der Körperform, wie sie sich im Maßzusammenhang der unterschiedlichen Körperbautypen darstellt, der Gelenkbeweglichkeit und den Handkräften vorgestellt. Darüber hinaus wird durch den Vergleich der Ergebnisse der jungen und der beiden älteren Erwachsenengruppen untersucht, welche Unterschiede zwischen den verschiedenen Altersgruppen bestehen. Im Hinblick auf die zeitliche Gültigkeit der aktuellen Untersuchungsergebnisse werden der Einfluss des säkularen Trends und der Einfluss der ontogenetischen Alternsprozesse auf Längenmaße und Korpulenzmaße diskutiert. Die Arbeit zeigt auf, dass innerhalb der untersuchten Probanden eine große Variationsbreite in den Körpermaßen auftritt. Es lassen sich typische Altersunterschiede erkennen. Die Älteren sind im Mittel kleiner, weisen jedoch größere Skelettrobustizitäts- und Korpulenzmaße auf. Die dynamischen Maße weisen auf eine geringere Beweglichkeit der Wirbelsäule, teilweise auch der Hand hin. Die Handkräfte der Frauen werden mit zunehmendem Alter geringer, bei den Männern sind die Älteren kräftiger als die jungen Erwachsenen. Die Ergebnisse deuten auf einen gegenüber früheren Generationen verzögerten Beginn von körperlichen Alterserscheinungen hin, der im Hinblick auf die steigende Lebenserwartung der Bevölkerung eingehender untersucht werden sollte.
Die vorliegende Arbeit ist eine aktuelle Dokumentation von Körperbau, Körperzusammensetzung und Ernährungsgewohnheiten an 708 jüngeren und älteren Männern und Frauen aus dem Bundesland Brandenburg. Der Körperbau wurde über ein 42 Längen-, Breiten-, Tiefen- und Umfangsmaße umfassendes anthropometrisches Untersuchungsprogramm bestimmt. Die Einschätzung von Gesamtkörperfettanteil und Magermasse erfolgte mit zwei Feldmethoden, der Hautfaltendickenmessung und der bioelektrischen Impedanzanalyse. Mit Hilfe eines semiquantitativen Fragebogens zu den Ernährungsgewohnheiten wurde der Lebensmittelverzehr erfasst und daraus die Energie- und Nährstoffaufnahme berechnet. Die Ergebnisse zum Körperbau zeigen im Mittel eine Abnahme der Längenmaße, jedoch eine Zunahme der Breiten-, Tiefen- und Umfangsmaße mit steigendem Erwachsenenalter. Einfache Parameter zur Beurteilung des Ernährungszustandes, wie Körpermasse und Body-Mass-Index (BMI) nehmen im Alter geschlechtsspezifisch zu. Nach den Richtlinien der WHO für den BMI gelten 55,3% der untersuchten Männern als übergewichtig, davon 10% als adipös. Von allen untersuchten Frauen sind 41,6% übergewichtig, davon sind 14,3% adipös. Der Anteil der Übergewichtigen ist zwar beim weiblichen Geschlecht geringer, aber dafür haben mehr Frauen die Grenze zur Adipositas überschritten. Für eine wissenschaftlich exakte Beurteilung des Ernährungszustandes reichen Körpermasse und BMI nicht aus, da sie die Körperzusammensetzung nicht bzw. nicht genügend berücksichtigen. Die subkutane Fettschichtdicke nimmt insbesondere am Rumpf zu, was als zusätzliches Gesundheitsrisiko gilt. Der Gesamtkörperfettanteil steigt im Erwachsenenalter abhängig von der Berechnungsmethode an. Die untersuchten Frauen sind gegenüber den Männern in allen Altersgruppen durch einen etwa ein Drittel höheren Körperfettanteil gekennzeichnet. Die tägliche Nahrungsenergieaufnahme der untersuchten Personen lässt eine abnehmende Tendenz bis zum 65. Lebensjahr erkennen. Trotz einer sinkenden Nahrungsenergieaufnahme im Alter, nimmt der BMI zu. Mögliche Ursachen hierfür werden in der Arbeit diskutiert. Der Anteil der Grundnährstoffe an der Energiebereitstellung entspricht in keiner der untersuchten Gruppen den Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Ernährung. Allgemein ist der Fettkonsum zu hoch und der Kohlenhydratanteil zu gering. Das zeigt sich besonders in den beiden mittleren untersuchten Altersgruppen und bei den Männern stärker als bei den Frauen.
Die vorliegende Dissertation behandelt die Ökologie von Cnidium dubium (Schkuhr) Thell. (Sumpf-Brenndolde), Gratiola officinalis L. (Gottes-Gnadenkraut) und Juncus atratus Krocker (Schwarze Binse), drei gefährdeten Arten, die als sogenannte Stromtalpflanzen in Mitteleuropa in ihrem Vorkommen eng an die Flussauen gebunden sind. Die Arbeit basiert auf verschiedenen Simulationsexperimenten und Feldstudien in der Unteren Havelniederung, einem „Feuchtgebiet von internationaler Bedeutung“. Sie behandelt Themenkomplexe wie das Samenbankverhalten, die Samenkeimung, die Stickstofflimitierung, die Konkurrenzkraft, das Verhalten der Pflanzen nach einer Sommertrockenheit und nach einer Winter/Frühjahrsüberflutung. Ferner widmet sie sich der Populationsbiologie der Arten und dem Verhalten der Pflanzen nach besonderen Störungsereignissen wie Mahd, Herbivorie und der Sommerflut 2002. Der Leser erfährt, wie die Pflanzen in verschiedenen Lebensphasen auf die auentypische Umwelt reagieren und erhält umfassende Einblicke in physiologische Mechanismen, die der Anpassung an die typischen Bedingungen einer mitteleuropäischen Flussaue dienen. Eine Interpretation der Ergebnisse zeigt auf, welche der spezifischen Eigenschaften zur Gefährdung der drei Stromtalarten beitragen. Die Arbeit ist für den Arten-, Biotop- und Landschaftsschutz interessant. Darüber hinaus bietet sie zahlreiche Anknüpfungspunkte zur ökophysiologischen Grundlagenforschung. Die verstärkte Nutzung physiologischer Methoden bei der Klärung ökologischer Fragestellungen wird angeregt.
Darmkrebs ist die zweithäufigste malignombedingte Todesursache in den westlichen Industrieländern. Durch eine frühzeitige Diagnose besteht jedoch eine hohe Chance auf Heilung. Der Goldstandard zur Darmkrebsfrüherkennung ist gegenwärtig die Koloskopie. Eine Darmspiegelung ist jedoch invasiv und mit Unannehmlichkeiten für den Patienten verbunden. Die Akzeptanz in der Bevölkerung ist daher gering. Ziel des BMBF- Projektes „Entwicklung eines nichtinvasiven Nachweissystems zur Früherkennung von humanem Darmkrebs“, in dessen Rahmen diese Arbeit entstand, ist die Bereitstellung eines nichtinvasiven Nachweisverfahrens zur Darmkrebsfrüherkennung. Der Nachweis soll über die Detektion von aus neoplastischen Zellen stammender DNA in Stuhl erfolgen. Die Entartung dieser Zellen beruht auf Veränderungen im Erbgut, welches unter anderem Mutationen sind. Im ersten Teil des BMBF-Projektes wurde ein Set von Mutationen zusammengestellt, welches eine hohe Sensitivität für Vorstufen von Darmkrebs aufweist. Ziel dieser Arbeit war es, eine Nachweismethode für die zuvor identifizierten Punktmutationen zu entwickeln. Das Nachweisverfahren musste dabei unempfindlich gegen einen hohen Hintergrund nichtmutierter DNA sein, da im Stuhl geringe Mengen DNA aus neoplastischen Zellen bei einem hohen Hintergrund von DNA aus gesunden Zellen vorliegen. Hierzu wurden Plasmidmodellsysteme für die aus dem Marker-Set stammenden Genfragmente BRAF und dessen Mutante V600E, CTNNB1 und T41I, T41A, S45P und K-ras G12C hergestellt. Mit Hilfe dieser Plasmidmodellsysteme wurde dann das Nachweissystem entwickelt. Der entscheidende Schritt für die Detektion von Punktmutationen bei hohem Wildtypüberschuss ist eine vorhergehende Anreicherung. In der vorliegenden Arbeit wurde dazu die Methode der LNA-clamp-PCR (locked nucleic acid) etabliert. Die Bewertung der erzielten Anreicherung erfolgte über das relative Detektionslimit. Zur Bestimmung des Detektionslimits wurde die Schmelzkurvenanalyse von Hybridisierungssonden eingesetzt; diese wurde im Rahmen dieser Arbeit für die drei oben genannten Genfragmente und ihre Mutanten entwickelt. Die LNA-clamp-PCR wird in Anwesenheit eines LNA-Blockers durchgeführt. Das Nukleotidanalogon LNA weist im Vergleich zu DNA eine erhöhte Affinität zu komplementären DNA-Strängen auf. Gleichzeitig kommt es bei Anwesenheit einer Basenfehlpaarung zu einer größeren Destabilisierung der Bindung. Als Blocker werden kurze LNA-DNA-Hybridoligonukleotide eingesetzt, die den mutierten Sequenzbereich überspannen und selbst der Wildtypsequenz entsprechen. Durch Bindung an die Wildtypsequenz wird deren Amplifikation während der PCR verhindert (clamp = arretieren, festklemmen). Der Blocker selbst wird dabei nicht verlängert. Der Blocker bindet unter optimalen Bedingungen jedoch nicht an die mutierte Sequenz. Die Mutante wird daher ungehindert amplifiziert und somit gegenüber dem Wildtyp-Fragment angereichert. Die Position des Blockers kann im Bindungsbereich eines der Primer sein und hier dessen Hybridisierung an dem Wildtyp-Fragment verhindern oder zwischen den beiden Primern liegen und so die Synthese durch die Polymerase inhibieren. Die Anwendbarkeit beider Systeme wurde in dieser Arbeit gezeigt. Die LNA-clamp-PCR mit Primerblocker wurde für BRAF etabliert. Es wurde ein Detektionslimit von mindestens 1:100 erzielt. Die LNA-clamp-PCR mit Amplifikationsblocker wurde erfolgreich für BRAF, K-ras und CTNNB1: T41I, T41A mit einem Detektionslimit von 1:1000 bis 1:10 000 entwickelt. In Stuhlproben liegt DNA aus neoplastischen Zellen nach Literaturangaben zu einem Anteil von 1% bis 0,1% vor. Die LNA-clamp-PCR weist also mit Amplifikationsblockern ein ausreichend hohes Detektionslimit für die Analyse von Stuhlproben auf. Durch die erfolgreiche Etablierung der Methode auf drei verschiedenen Genfragmenten und vier unterschiedlichen Punktmutationen konnte deren universelle Einsetzbarkeit gezeigt werden. Für die Ausweitung der LNA-clamp-PCR auf die übrigen Mutationen des Marker-Sets wurden Richtlinien ausgearbeitet und die Blockereffizienz als Kennzahl eingeführt. Die LNA-clamp-PCR ist ein schnelles, kostengünstiges Verfahren, welches einen geringen Arbeitsaufwand erfordert und wenig fehleranfällig ist. Sie ist somit ein geeignetes Anreicherungsverfahren für Punktmutationen in einem diagnostischen System zur Darmkrebsfrüherkennung. Darüber hinaus kann die LNA-clamp-PCR auch in anderen Bereichen, in denen die Detektion von Punktmutationen in einem hohen Wildtyphintergrund erforderlich ist, eingesetzt werden.
Apoptose, der programmierte Zelltod, spielt eine wichtige Rolle für das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Sterben von Zellen und ist außerdem an der Beseitigung von infizierten und geschädigten Zellen beteiligt. Apoptose kann durch Stimulation von Rezeptoren aus der Familie der TNF-Rezeptoren wie CD95, ausgelöst werden. Nach Liganden-induzierter Trimerisierung der Rezeptoren bindet FADD an den zytoplasmatischen Teil des Rezeptors und rekrutiert Caspase-8 und/oder -10. Die räumliche Nähe der Caspasen in diesem als DISC bezeichneten Komplex führt zu ihrer auto- und transkatalytischen Spaltung und damit Aktivierung. Dadurch wird das apoptotische Programm gestartet, welches zum Tod der Zelle führt. Kontrolliert wird dieser Vorgang von einer Vielzahl anti-apoptotischer Proteine. Störungen in diesem System sind an der Entstehung einer Reihe von Krankheiten beteiligt. Die Blockade der Apoptoseinduktion kann zur Entstehung von Tumoren beitragen. Das klassische Hodgkin Lymphom ist eine maligne Erkrankung des lymphatischen Systems. Die Tumorzellen sind große, einkernige Hodgkin- oder mehrkernige Reed/Sternbergzellen (HRS-Zellen). Sie leiten sich von Keimzentrum-B-Zellen ab. In HRS-Zellen fehlt die Expression einer Vielzahl von typischen B-Zellmarkern, darunter die des B-Zellrezeptors. Solche B-Zellen sterben normalerweise während der Keimzentrumsreaktion durch Apoptose. An diesem Prozess ist CD95 beteiligt. In einer Reihe von malignen Erkrankungen wurden eine Herunterregulation der CD95-Expression oder Mutationen im CD95-Gen beobachtet. Es wird daher vermutet, dass CD95-induzierte Apoptose zur Entfernung von Tumorzellen beiträgt. Im Gegensatz dazu exprimieren sowohl primäre HRS-Zellen als auch etablierte HRS-Zelllinien in der Regel Wildtyp-CD95, sind aber trotzdem CD95-resistent. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Komponenten des CD95-Systems, im Gegensatz zu anderen malignen Erkrankungen, in den HRS-Zellen hochreguliert sind, darunter CD95 selbst. In immunpräzipitierten DISCs von CD95-stimulierten HRS-Zellen wurde neben FADD und Caspase-8/-10 auch c-FLIP nachgewiesen. c-FLIP ist ein Caspase-8/-10-Homolog, das ebenfalls an FADD bindet, aber aufgrund fehlender katalytischer Aktivität die Aktivierung der Caspasen im DISC und damit die Apoptoseinduktion verhindert. Eine starke c-FLIP-Expression konnte in allen HRS-Zelllinien und in den HRS-Zellen nahezu aller untersuchter primärer Hodgkinfälle (55/59) gezeigt werden. Durch siRNA-vermittelte Herunterregulation von c-FLIP war es möglich, HRS-Zelllinien gegenüber CD95-induzierter Apoptose zu sensitivieren. Dies zeigt, dass die CD95-Rezeptor-induzierte Apoptose in den HRS-Zellen nicht strukturell, sondern funktionell inhibiert ist und c-FLIP stark zu dieser Inhibition beiträgt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die c-FLIP-Expression in den HRS-Zellen von der konstitutiven Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB abhängt, die charakteristisch für diese Zellen ist. Normalerweise wird NF-κB von Inhibitorproteinen, den IκBs, im Zytoplasma zurückgehalten. Diverse Stimuli können den IKK-Komplex aktivieren, der die IκBs an bestimmten Serinresten phosphoryliert. Dies hat die Ubiquitinylierung und den Abbau der IκBs zur Folge, wodurch NF-κB frei wird, in den Kern wandert und dort seine Zielgene aktiviert. Es wird angenommen, dass in HRS-Zellen ein konstitutiv aktiver IKK-Komplex und teilweise Mutationen der IκB-Proteine zur konstitutiven NF-κB-Aktivität beitragen. Zu den NF-κB-abhängigen Genen in den HRS-Zellen gehören solche mit anti-apoptotischer und Zellzyklus-treibender Wirkung. Die Inhibition der NF-κB-Aktivität in den HRS-Zellen führt zu Apoptose und eingeschränkter Proliferation. Von dreiwertigem Arsen ist bekannt, dass es die Induzierbarkeit des IKK-Komplexes inhibieren kann und damit letztendlich die Aktivierung von NF-κB. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Arsen in HRS-Zellen den konstitutiv aktiven IKK-Komplex inhibiert. In Zelllinien mit intakten IκB-Proteinen führte dies zur NF-κB-Inhibition und Apoptoseinduktion. Die Reduktion der NF-κB-Aktivität ging mit der Herunterregulation von anti-apoptotischen und Proliferations-fördernden Zielgenen einher. Die ektope Überexpression von NF-κB hob die Apoptose-induzierende Wirkung von Arsen teilweise auf. Durch Arsen-Behandlung von Mäusen konnte das Tumorwachstum xenotransplantierter HRS-Zellen stark verlangsamt werden. In explantierten Tumorzellen konnte ebenfalls eine NF-κB-Inhibition nachgewiesen werden. Die NF-κB-Inhibition durch Arsen trägt also stark zur Apoptoseinduktion in den HRS-Zellen bei. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Modulation der Apoptoseresistenz neue therapeutische Ansätze für die Behandlung des Hodgkin Lymphoms bieten könnte. Der Einsatz von Arsen ist dabei besonders interessant, da Arsen schon für die Behandlung anderer maligner Erkrankungen eingesetzt wird.
Biosensoren werden oft für die Messung einzelner Substanzen in komplexen Medien verwendet, wie z.B. bei der Blutzuckerbestimmung. Sie bestehen aus einem physikochemischen Sensor, dem Transduktionselement, und einer darauf immobilisierten biologischen Komponente, dem Erkennungselement. In dieser Arbeit wurde als Transduktionselement eine Elektrode und als Biokomponente das Enzym „Meerrettich Peroxidase“ (engl. horseradish peroxidase, HRP) verwendet. Solche HRP-Elektroden werden für die Messung von Wasserstoffperoxid (H2O2) eingesetzt. H2O2 wird im Körper von weißen Blutkörperchen produziert, um Bakterien abzutöten, wird teilweise ausgeatmet und kann in kondensierter Atemluft nachgewiesen werden. Da viele weiße Blutkörperchen bei einer Chemotherapie abgetötet und dadurch die Patienten anfälliger für Infektionen werden, muss ihre Anzahl regelmäßig überwacht werden. Dazu wird zurzeit Blut abgenommen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine Überwachung der Anzahl an weißen Blutkörperchen ohne Blutabnahme durch eine H2O2-Messung erfolgen kann. Ein direkter Zusammenhang zwischen der ausgeatmeten H2O2-Menge und der Zahl der weißen Blutkörperchen konnte dabei nicht festgestellt werden. Für empfindliche H2O2-Messungen mit einer HRP-Elektrode ist ein schneller Austausch von Elektronen zwischen der Elektrode und dem Enzym notwendig. Eine Vorraussetzung dafür ist eine kurze Distanz zwischen dem aktiven Zentrum des Enzyms und der Elektrodenoberfläche. Um einen kurzen Abstand zu erreichen wurden im zweiten Teil dieser Arbeit verschiedene poröse graphitähnliche Materialien aus pyrolysierten Kobalt-Porphyrinen für die Elektrodenherstellung verwendet. Dabei stellte sich heraus, dass eines der untersuchten Materialien, welches Poren von etwa der Größe eines Enzyms hat, Elektronen etwa 200mal schneller mit dem Enzym austauscht als festes Graphit. Die HRP selbst enthält in seinem aktiven Zentrum ein Eisen-Protoporphyrin, also ein aus vier Ringen bestehendes flaches Molekül mit einem Eisenatom im Zentrum. Reagiert die HRP mit H2O2, so entzieht es dem Peroxid zwei Elektronen. Eines dieser Elektronen wird am Eisen, das andere im Ringsystem zwischengespeichert, bevor sie an ein anderes Molekül oder an die Elektrode weitergegeben werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Eisen durch Osmium ausgetauscht. Das so veränderte Enzym entzieht Peroxiden nur noch ein Elektron. Dadurch reagiert es zwar langsamer mit Wasserstoffperoxid, dafür aber schneller mit tert-Butylhydroperoxid, einem organischen Vertreter der Peroxid-Familie.