570 Biowissenschaften; Biologie
Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (55)
- Habilitation Thesis (2)
- Article (1)
- Master's Thesis (1)
Language
- German (59) (remove)
Is part of the Bibliography
- yes (59) (remove)
Keywords
- Geschmack (6)
- taste (6)
- Selen (5)
- glutathione peroxidase (4)
- selenium (4)
- Bittergeschmack (3)
- Vitamin E (3)
- bitter taste (3)
- Energiestoffwechsel (2)
- Entzündung (2)
Institute
- Institut für Ernährungswissenschaft (59) (remove)
Das seit 1957 als essentiell klassifizierte Spurenelement Selen vermittelt seine Funktion hauptsächlich durch seinen Einbau in Selenoproteine in Form der 21. proteinogenen Aminosäure Selenocystein. Insgesamt wurden 25 humane Gene für Selenoproteine identifiziert, deren genaue Funktion häufig noch nicht bekannt ist. Selen ist das einzige Mitglied aus der Gruppe der Mikronährstoffe, für das nach wie vor eine antikanzerogene Funktion vor allem in Bezug auf Darmkrebs postuliert wird. Die Grundlage dafür liefert eine Interventionsstudie, bei der 1.312 Probanden für 4,5 Jahre mit 200 μg Selen/Tag supplementiert wurden. Dies resultierte in einer Senkung der Gesamtkrebsmortalität um 50 %. Die Fragen einer optimalen Selenzufuhr, die nicht nur den Bedarf deckt, sondern auch die Entfaltung der antikanzerogenen Wirkung von Selen gewährleistet und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch ungeklärt. Zudem liegt die Selenzufuhr bei einem Großteil der europäischen Bevölkerung unter den Empfehlungen. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit vier Wochen alte Mäuse für sechs Wochen marginal defizient (0,086 mg/kg Futter) bzw. selenadäquat (0,15 mg/kg Futter) gefüttert. Dieser geringe Unterschied im Selengehalt resultierte in einer Senkung des Plasmaselenspiegels der selenarmen Tiere auf 13 % und der GPx-Aktivität in der Leber auf 35 %. Zunächst wurde der Einfluss von Selen auf die globale Genexpression im murinen Colon mittels Microarray untersucht. Von den im Colon exprimierten Selenoproteinen reagierte die mRNA von SelW, SelH, GPx1 und SelM im Selenmangel besonders deutlich mit Expressionsverlust. Da diese Selenoproteine nicht nur im Colon, sondern auch in Leukozyten reguliert waren, sind sie auch als humane Biomarker für die in dieser Studie gewählte Schwankung des Selengehalts geeignet. Des Weiteren wurde auf Basis der Microarraydaten eine Signalweganalyse durchgeführt, die der Identifizierung krebsrelevanter Signalwege diente, um mögliche molekularbiologische Erklärungsansätze für die Rolle von Selen im Krebsgeschehen zu finden. Es zeigte sich, dass die mRNA von Schlüsselgenen des Wnt-Signalwegs wie β-Catenin, Gsk3β, Dvl2, Tle2, Lef1 und c-Myc auf Schwankungen des Selengehalts reagiert. Vor allem die Induktion von c-Myc, einem Zielgen des Wnt-Signalwegs, deutet darauf hin, dass dieser im Selenmangel tatsächlich aktiver ist als bei selenadäquater Versorgung. Ein weiterer möglicher Erklärungsansatz für die postulierte präventive Funktion von Selen gegenüber Darmkrebs ist die gastrointestinale Glutathionperoxidase (GPx2), die physiologisch in den proliferierenden Zellen des Kryptengrunds exprimiert wird. Die Regulation dieses Enzyms durch den Wnt-Signalweg, der ebenfalls in proliferierenden Zellen aktiv ist, konnte mittels Reportergenanalyse und endogen auf mRNA- und Proteinebene in Zellkultur gezeigt werden. Die Aktivierung verkürzter Promotorkonstrukte und die Mutation eines potentiellen Bindeelements identifizierten den für die Bindung von TCF und β-Catenin verantwortlichen Bereich. Als Zielgen des Wnt-Signalwegs scheint GPx2 zu den an Proliferationsprozessen beteiligten Genen zu gehören, was unter physiologischen Bedingungen die Aufrechterhaltung des intestinalen Epithels gewährleistet. Bei der Entstehung intestinaler Tumore, die in der Initiationsphase zu über 90 % mit einer konstitutiven Aktivierung des Wnt-Signalwegs einhergeht, wirkt GPx2 möglicherweise prokanzerogen. Die genaue Funktion von GPx2 während der Kanzerogenese bleibt weiter zu untersuchen.
Die Toxizität und Kanzerogenität von rein aromatischen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) ist seit Jahrzehnten bekannt und umfassend erforscht. Die alkylierten PAK (alkPAK) besitzen jedoch aufgrund ihrer Alkylgruppe eine weitere Möglichkeit zur Bioaktivierung und müssen daher gesondert betrachtet werden. Die Alkylgruppe wird zunächst hydroxyliert, anschließend zur Säure oxidiert oder direkt konjugiert. Entstehen hierbei instabile benzylische Sulfokonjugate, so können diese DNA-Addukte bilden und zu Mutationen führen. In Hinblick auf die Bioaktivierung von alkPAK galt es daher zu klären welchen Einfluss die Struktur auf die benzylische Hydroxylierung hat und welche humanen Formen der löslichen Sulfotransferasen besonders an der Umsetzung der alkPAK-Derivate beteiligt sind. Die Untersuchung der Albuminbindung von Schwefelsäureestern sowie ihre Aufnahme in Nierenzellen sollten Aufschluss hinsichtlich möglicher Transportvorgänge geben. Für die in-vivo-Situation wurde weiterhin die Modulation des Metabolismus ausgewählter benzylischer Alkohole durch verschiedene Nahrungsmittelbestandteile, Arzneimittel und Fremdstoffe an Ratten untersucht. Als Biomarker wurden benzylische Carbonsäuren im Urin und die entsprechenden Mercaptursäuren in Urin und Fäzes betrachtet. Zunächst wurde anhand von Inkubationen mit Rattenlebermikrosomen festgestellt, dass insbesondere größere Ringsystemen wie etwa alkylierte Benzo[a]pyrene im Gegensatz zu Methylpyrenen in wesentlich geringerem Umfang zum benzylischen Alkohol umgesetzt werden. Dies wurde auch in Untersuchungen mit humanen Lebermikrosomen bestätigt. Untersuchungen an einzelnen humanen Cytochromen P450 zeigten, dass insbesondere die durch PAK induzierbaren Formen hCYP1A1 und 1B1 hohe Umsatzraten aufwiesen. Die hepatisch exprimierten Formen hCYP1A2 und 3A4 waren jedoch auch zur Bildung der benzylischen Alkohole in der Lage. Für die anschließende Sulfonierung der benzylischen Alkohole wurden besonders hohe Aktivitäten mit den humanen Sulfotransferasen hSULT1A1, 1A2, 1C2 und 1E1 festgestellt. Aufgrund der Enzymexpression und der guten Durchblutung, die eine gute Substratversorgung ermöglicht, ist die Leber als Hauptort der benzylischen Hydroxylierung und Sulfonierung anzusehen. Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zeigen jedoch, dass nach 1-Hydroxymethylpyren-Applikation bei Ratten die Niere die höchste Zahl an DNA-Addukten aufweist. Wegen der Fokussierung der Sulfonierung auf die Leber ist die systemische Verteilung der Schwefelsäureester die einzig plausible Erklärung. So wurde im Rahmen dieser Arbeit eine hochaffine Bindungsstelle für 2-Sulfoxymethylpyren an Albumin beschrieben und die Aufnahme von benzylischen Sulfaten durch die humanen organischen Anionentransporter hOAT1, 3 und 4 in Nierenzellen in vitro gezeigt. Für die in-vivo-Situation wurde der Einfluss von Ethanol, 4-Methylpyrazol, Pentachlorphenol, Quercetin und Disulfiram untersucht. Neben der durch die Detoxifizierung mittels Alkoholdehydrogenase und Aldehyddehydrogenase entstandenen benzylischen Carbonsäure kann als Biomarker die entsprechende Mercaptursäure herangezogen werden. Sie ist ein indirekter Nachweis für die reaktiven und toxischen benzylischen Sulfate der alkPAK. Für die beiden im Tierversuch eingesetzten benzylischen Alkohole (1-Hydroxymethylpyren und 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren) konnte sie in Urin und Fäzes nachgewiesen werden. Es wurde jedoch ein deutlicher Unterschied in der gebildeten Menge sowie der Verteilung zwischen Urin und Fäzes für die beiden Mercaptursäuren festgestellt. Hierfür sind wahrscheinlich Unterschiede im Transport der benzylischen Schwefelsäureester sowie der Spezifität der an der Mercaptursäurebildung beteiligten Enzyme verantwortlich. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass der humane organische Anionentransporter hOAT1 1,8-Dimethylpyrenmercaptursäure nicht und der hOAT3 nur mit niedrigen Umsatzraten transportiert. Bei den Modulatoren zeigte die Gabe der kompetitiven Alkoholdehydrogenase-Hemmstoffe Ethanol und 4-Methylpyrazol die Bedeutung der Alkoholdehydrogenasen für die Entgiftung der benzylischen Alkohole: Die Oxidation zur entsprechenden Carbonsäure war reduziert und die Bildung der Mercaptursäure erhöht. Eine Hemmung der Toxifizierung vermittelt durch Sulfotransferase-Inhibitoren konnte nur für Pentachlorphenol beim Metabolismus des 1-Hydroxymethylpyrens beobachtet werden. Gleichzeitig erwies sich Pentachlorphenol als kompetitiver Alkoholdehydrogenase-Inhibitor, da eine signifikant geminderte Carbonsäureausscheidung zu beobachten war. Bei 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren traten diese Effekte nicht auf. Die unterschiedlichen bzw. unterschiedlich starken Effekte der Modulatoren beim Metabolismus der verschiedenen benzylischen Alkohole bestätigen die Beobachtungen aus den in-vitro-Untersuchungen, dass unterschiedliche Enzym- und Transporteraffinitäten und –aktivitäten vorliegen.
Der Fettsäurestoffwechsel unterliegt vielfältigen Kontrollmechanismen. So wird der Fettsäureabbau über die Induktion und Aktivität spezifischer Enzyme reguliert. Ein zentraler Regulator ist dabei der nukleäre Rezeptor Peroxisomenproliferator-aktivierter-Rezeptor-α (PPARα). PPARα wird durch freie Fettsäuren in der Zelle aktiviert und fördert über die Induktion von Zielgenen den Fettsäuretransport und -abbau sowie die Gluconeogenese und Ketogenese. Der Anstieg an freien Fettsäuren beim Fasten, aber auch im Diabetes aktiviert PPARα. Unabhängig davon wurde in beiden Stoffwechsellagen auch eine erhöhte Expression des nukleären Rezeptors Constitutiver-Androstan-Rezeptor (CAR) und einiger CAR-Zielgene, vorrangig Enzyme des Fremdstoffmetabolismus wie Cytochrom P450 2B (CYP2B), festgestellt. Bei der Adaption an eine Fastensituation scheinen PPARα- und CAR-Signalwege über einen bisher unbekannten Mechanismus miteinander verschaltet zu sein. In der vorliegenden Arbeit sollte der der Verschaltung zugrunde liegende Mechanismus anhand eines Modelsystems, der PPARα-Agonisten-vermittelten Verstärkung der Phenobarbital (PB)-abhängigen Induktion des CAR-Zielgens CYP2B, in vitro untersucht werden. Zudem sollte die physiologische Relevanz einer durch PPARα-Agonisten vermittelten Modulierung der CYP2B-Aktivität in einer Ganztierstudie in vivo belegt werden. Die verwendeten synthetischen PPARα-Agonisten steigerten in primären Hepatozyten der Ratte signifikant die Phenobarbital (PB)-abhängige mRNA- und Protein-Expression sowie die Aktivität von CYP2B. Ohne vorherige PB-Behandlung induzierten PPARα-Agonisten CYP2B nicht. In Gegenwart von PB war die Steigerung der CYP2B-Aktivität durch PPARα-Agonisten dosisabhängig. In einem Luciferase-Reportergenassay wurde gezeigt, dass die Induktion durch PB unter der Kontrolle des CYP2B1-Promotors von einem distalen PBREM (PB-responsive-enhancer-module), an welches CAR binden kann, abhängig war. PPARα-Agonisten steigerten diese PB- und PBREM-abhängige Reportergentranskription und induzierten die CAR-mRNA und CAR-Proteinexpression. Sie aktivierten die Transkription eines Reportergens unter der Kontrolle eines Promotorfragments von bis zu 4,4 kb oberhalb des mutmaßlichen CAR-Transkriptionsstarts. Mit Hilfe von Deletionskonstrukten konnte ein potentielles Peroxisomenproliferator-aktivierter-Rezeptor-responsives Element (PPRE) im CAR-Promotorbereich von -942 bp bis -930 bp identifiziert werden, welches essentiell für die Initiation der Transkription durch PPARα-Agonisten ist. In band shift Experimenten akkumulierte verstärkt Kernprotein mit diesem PPRE. Ein Überschuss an unmarkiertem Wildtyp-CAR-Reportergenvektor, nicht aber an CAR-Reportergenvektor mit PPRE-Deletion, konnte mit dem markierten PPRE um die Bindung von Kernprotein konkurrieren. Nach Chromatin-Immunpräzipitation mit einem PPARα-Antikörper wiederum wurde das betreffende PPRE amplifiziert. Bei in vivo Experimenten an männlichen Ratten resultierte die Behandlung mit PPARα-Agonisten in einer signifikanten Induktion der CAR-mRNA-Expression und signifikant erhöhter PB-abhängiger CYP2B-Aktivität. Die physiologisch Relevanz wurde durch weiterführenden Experimente unterstrichen, in denen gezeigt wurde, dass die Fasten-abhängige Induktion von CAR in PPARα-defizienten Mäusen unterdrückt war. Diese Experimente legen nahe, dass durch PPARα-Agonisten aktiviertes PPARα an das PPRE im CAR-Promotorbereich von -942 bp bis -930 bp bindet und dadurch die CAR-Transkription induziert. Somit kann CAR als PPARα-Zielgen betrachtet werden, was die Schlussfolgerung zulässt, dass die PPARα- und CAR-Signalwege über die direkte Bindung von PPARα an den CAR-Promotor unmittelbar miteinander verknüpft sind. Allerdings ist davon unabhängig eine Aktivierung von CAR, etwa durch PB, für die vermehrte Induktion von CAR-Zielgenen notwendig . Die physiologische Relevanz der PPARα-abhängige CAR-Expression zeigt sich in den Ganztierexperimenten, bei denen die Wirksamkeit der PPARα-Agonisten bestätigt werden konnte. CAR-abhängig induzierte Enzyme sind nicht nur in großem Umfang am Fremdstoffmetabolismus beteiligt, sondern auch am Abbau von Schilddrüsenhormonen und Glucocorticoiden. Sie können damit direkt Einfluss auf den Kohlenhydrat- und Energiestoffwechsel sowie die Regulation der Nahrungsaufnahme nehmen. Über eine PPARα-abhängige Induktion von CAR im Rahmen der Fastenadaption könnten die CAR-Zielgene UDP-Glucuronyltransferase 1A1 und Sulfotransferase N beispielsweise verstärkt Schilddrüsenhormone abbauen und in der Folge den Grundumsatz senken. Der in dieser Arbeit erstmals beschriebene Mechanismus ist dafür von zentraler Bedeutung.
Vitamin E ist der Überbegriff für 4 Tocopherole (α, β, γ und δ) sowie 4 Tocotrienole (α, β, γ und δ), die als gemeinsames Merkmal ein Chromanolringsystem sowie eine gesättigte (Tocopherole) bzw. ungesättigte (Tocotrienole) Seitenkette aufweisen. Neben ihrer antioxidativen Wirkung (Schutz von Membranen vor Lipidperoxidaton) konnten für einige Vitamin E - Formen auch eine Reihe von hochspezifischen, nicht-antioxidativen Wirkungen in vitro nachgewiesen werden. Meist bleibt jedoch unklar, ob ein solcher Effekt auch in vivo, also im Tiermodel oder direkt im Menschen, gefunden werden kann. In erster Linie müsste hierbei geklärt werden, ob die jeweilige Vitamin E - Form auch bioverfügbar, also in für eine Wirkung ausreichender Konzentration im Organismus vorhanden ist, oder aber vorher eliminiert und ausgeschieden wird. In dieser Doktorarbeit wurden deshalb wichtige Grundlagen zum Abbau der Tocopherole und Tocotrienole erarbeitet. • In HepG2-Zellen konnte der Abbau der Tocotrienole mit Hilfe flüssig- sowie gaschromatographischer Analysemethoden vollständig aufgeklärt werden. Wie sich hierbei ergab, verläuft der Abbau weitgehend in Analogie zum Abbau der Tocopherole über eine durch Cytochrom P450 katalysierte initiale ω-Hydroxylierung mit 5 nachfolgenden β-Oxidationsschritten. • In vitro konnten in HepG2 – Zellen die Abbauraten der verschiedenen Vitamin E - Formen bestimmt werden. Dies nahmen in folgender Reihenfolge zu: α-Tocopherol < γ-Tocopherol < α-Tocotrienol < γ-Tocotrienol. • Wie sich mit Hilfe eines mit Cytochrom P450 hochangereicherten Homogenats aus Rattenlebern ergab, stellt die initiale ω-Hydroxylierung einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Abbaus dar: α-Tocopherol wurde weit langsamer hydroxyliert als alle anderen Vitamin E – Formen. • Der unterschiedliche Abbau von α-Tocopherol und γ-Tocotrienol konnte auch im Mäuseversuch in vivo bestätigt werden. Nach Fütterung von Mäusen mit α-Tocopherol wurden nur geringe Mengen von α-Tocopherolmetaboliten im Urin der Mäuse gefunden, während nach Applikation von γ-Tocotrienol hohe Konzentrationen der γ-Tocotrienolmetabolite nachgewiesen wurden. In Plasma und Leber wiederum wurden (dem Futtergehalt entsprechende) hohe α-Tocopherolkonzentrationen entdeckt, während γ-Tocotrienol selbst nach hoher Gabe nicht oder nur in Spuren nachweisbar war. In HepG2 – Zellen konnte gezeigt werden, dass γ-Tocotrienol eine cytotoxische Wirkung auf die Hepatocarcinoma-Zelllinie HepG2 entfalten kann, indem durch die Aktivierung der proteolytischen Caspase 3 die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) ausgelöst wird. Abschliessend lässt sich festhalten, dass der Körper lediglich das natürliche α-Tocopherol vor dem Abbau bewahrt, die anderen Vitamin E – Formen jedoch als Fremdstoffe behandelt und rapide ausscheidet. Als doppelter Schutz vor Verlust des “wertvollen” α-Tocopherol dienen hierbei das α-Tocopherol Transfer Protein sowie die in dieser Arbeit gefundenen Unterschiede im ersten Schritt des Abbaus, der Cytochrom P450 - katalysierten ω-Hydroxylierung. Beides erklärt die bevorzugte Retention von α-Tocopherol im Organsimus und seine hohe Bioaktivität. Will man deshalb in vitro Ergebnisse anderer Vitamin E – Formen auf die in vivo Situation übertragen, muss man die geringe Bioverfügbarkeit dieser Substanzen berücksichtigen.
Alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (alk-PAK) kommen zusammen mit rein aromatischen polyzyklischen Kohlenwasserstoffen u.a. im Zigarettenrauch, Dieselabgasen sowie einigen Lebensmitteln (z.B. Freilandgemüse, planzliche Öle und Fette) vor. Benzylische Hydroxylierung und nachfolgende Sulfokonjugation ist ein wichtiger Bioaktivierungsweg für einige alk-PAK. Oxidation der benzylischen Alkohole durch Alkoholdehydrogenasen (ADH) und Aldehyddehydrogenasen (ALDH) zur Carbonsäure könnte einen wichtigen Detoxifizierungsweg in Konkurrenz zur Aktivierung durch Sulfotransferasen (SULT) darstellen, was für 1-Hydroxymethylpyren in der Ratte bereits gezeigt wurde (Ma, L., Kuhlow, A. & Glatt, H. (2002). Polycyclic Aromat Compnds 22, 933-946). Durch Hemmung der ADH und/oder ALDH ist eine verstärkte Aktivierung zu erwarten, wie in der besagten Studie ebenfalls nachgewiesen wurde. Insbesondere Ethanol kommt in diesem Zusammenhang eine Rolle als möglicher Risikofaktor für alk-PAK induzierte Kanzerogenese zu. Menschen konsumieren häufig große Mengen Ethanol und oft besteht eine Koexposition mit alk-PAK (z.B. durch Rauchen). Ähnliches gilt für 5-(Hydroxymethyl)-2-furfural (HMF), einem Pyrolyseprodukt reduzierender Zucker, dem gegenüber Menschen in recht hohen Mengen exponiert sind. Auch bei HMF steht der ADH- und ALDH-vermittelte oxidative Metabolismus in Konkurrenz zu einer Aktivierung durch Sulfokonjugation. Um die Bedeutung humaner ADH und ALDH im Metabolismus von alk-PAK und von HMF aufzuklären, wurden alle bekannten humanen ADH sowie die humanen ALDH2 und 3A1 (aus theoretischen Überlegungen heraus die vielversprechendsten Formen) für kinetische Analysen in Bakterien exprimiert. Als Enzymquelle dienten zytosolische Präparationen und durch Anionenaustauschchromatographie partiell gereinigte Enzyme. In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass primäre benzylische Alkohole von Methyl- und Dimethylpyrenen gute Substrate humaner ADH sind. Sekundäre benzylische Alkohole und benzylische Alkohole von alk-PAK mit größerem Kohlenwasserstoffgrundgerüst erwiesen sich dagegen als schlechte Substrate. Vier Formen (ADH1C, 2, 3 und 4) wurden näher analysiert. Dazu wurden sie partiell gereinigt, primär um die störende endogene Bakterien-ADH zu eliminieren. Alle untersuchten ADH waren in der Lage Pyrenylmethanole zu oxidieren. Insbesondere ADH2 katalysierte die Oxidation der Pyrenylmethanole effizient, aber auch für ADH1C und 4 waren die Pyrenylmethanole gute Substrate. ADH3 oxidierte die Pyrenylmethanole mit geringer katalytischer Effizienz. Die Reduktion der entsprechenden Pyrenaldehyde durch ADH1C, 2 und 4 wurde mit noch höherer Effizienz katalysiert als die Oxidation der Pyrenylmethanole, was die Bedeutung von ALDH für die effiziente Detoxifizierung dieser Verbindungen unterstreicht. In einer an diese Arbeit angelehnten Diplomarbeit (Rost, K. (2007). Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät) wurde auch tatsächlich gezeigt, dass humane ALDH2 aber auch ALDH3A1 in der Lage sind, die Pyrenaldehyde zu Pyrenylcarbonsäuren zu oxidieren. Die bestimmten kinetischen Parameter legen nahe, dass insbesondere ALDH2 von Bedeutung für die Detoxifizierung von Methyl- und Dimethylpyrenen ist. Schon allein auf Grund der an der Detoxifizierung beteiligten Enzyme ist Ethanolaufnahme bei Koexposition mit Pyrenderivaten als Risiokofaktor anzusehen. Es ist wahrscheinlich, dass Ethanol und, nach dessen Oxidation, Acetaldehyd als konkurrierende Substrate die ADH- und ALDH-katalysierte Oxidation von Pyrenylmethanolen bzw. Pyrenaldehyden inhibieren und somit zu einer verstärkten SULT-vermittelten Aktivierung der Pyrenylmethanole führen. In der Tat wurde eine effiziente Inhibition der ADH2-katalysierten Oxidation von 1-Hydroxymethylpyren und von 1-(Hydroxymethyl)-8-methylpyren durch physiologisch relevante Ethanolkonzentrationen nachgewiesen. Drei humane ADH (4, 2 und 3), die HMF effizient zum 2,5-Diformylfuran oxidieren können, wurden identifiziert. Durch ALDH-katalysierte Weiteroxidation dieser Substanz entsteht schließlich 2,5-Furandicarbonsäure, die nach HMF-Exposition auch tatsächlich im menschlichen Urin gefunden wurde (Jellum, E., Børresen, H. C. & Eldjarn, L. (1973). Clin Chim Acta 47, 191-201). Weiter wurde gezeigt, dass ALDH3A1, aber auch ALDH2 HMF effizient zur 5-(Hydroxymethyl)-2-furancarbonsäure (HMFA) oxidieren können, ein weiterer nachgewiesener HMF Metabolit in vivo. Dass die ADH-katalysierte Oxidation von HMFA und nachfolgende ALDH-katalysierte Oxidation zur Bildung von 2,5-Furandicarbonsäure einen nennenswerten Anteil beträgt, kann aufgrund der kinetischen Daten für HMFA als Substrat humaner ADH ausgeschlossen werden. Die beobachteten Enzymaktivitäten lassen den Schluss zu, dass Ethanolaufnahme zu einer Reduktion des oxidativen HMF Metabolismus führt und somit eine Aktivierung von HMF durch Sulfokonjugation begünstigt.
"Untersuchung kardioprotektiver Wirkungen des Olivenöles und seiner phenolischen Komponenten in einer Gruppe gesunder deutscher Männer" EINLEITUNG: Epidemiologische Daten belegen, dass die mediterrane Ernährung mit einer niedrigen Inzidenz an mit oxidativen Stress assoziierten kardiovaskulären Erkrankungen einhergeht. Dabei wird vor allem dem Olivenöl, als Hauptfettlieferant in der mediterranen Ernährung, eine kardioprotektive Wirkung zugesprochen. Olivenöl zeichnet sich neben dem hohen Gehalt an einfach ungesättigten Fettsäuren (MUFA) durch ein reichhaltiges Spektrum an phenolischen Verbindungen aus, deren antioxidative Wirkung bereits zahlreichen in in vitro Studien beschrieben wurde. Demnach könnte der Verzehr von phenolreichem Olivenöl auch in vivo vor oxidativen Schädigungen schützen und somit das Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen senken. ZIELSTELLUNG: Untersuchung der kardioprotektiven Wirkung von Olivenöl und seiner phenolischen Komponenten in einer Gruppe gesunder deutscher Männer. METHODE: Dazu wurde eine randomisierte cross-over doppelt-verblindete Interventionsstudie an 70 gesunden Männern zwischen 20 - 60 Jahren im Raum Berlin-Brandenburg durchgeführt. In jeweils drei dreiwöchigen Interventionsphasen konsumierten die Probanden täglich 25 ml natives (phenolreich), gemischtes (mittlerer Phenolgehalt) und raffiniertes (annähernd phenolfrei) Olivenöl, was sich ausschließlich im Gehalt an phenolischen Verbindungen unterschied. Das Olivenöl sollte dabei die gewöhnlich verzehrten Fette ersetzen. Die Interventionsphasen waren durch zweiwöchige Wash out-Phasen unterbrochen. Die Erhebung der Blutlipide, Biomarker der Lipidperoxidation und endogene Antioxidantien erfolgte zu Studienbeginn sowie zu Beginn und Ende jeder Verzehrsperiode.ERGEBNISSE: Bei den Blutlipiden sowie den Biomarkern der Lipidperoxidation und den endogenen Antioxidantien konnte keine signifikante Veränderung in Abhängigkeit vom Phenolgehalt der applizierten Olivenöle nachgewiesen werden. Einzig die Glutathion-Reduktase-Aktivität stieg mit zunehmendem Gehalt an phenolischen Verbindungen (pTrend = 0,041). Unabhängig von der Konzentration der Phenole im Olivenöl wurde bei den Probanden durch den Olivenölverzehr eine Senkung von Gesamtcholesterol (p = 0,007) und Triglyzeride (p = 0,013) im Serum erzielt. Diese Wirkung geht einher mit einem gestiegenen MUFA-Anteil in der Ernährung aufgrund des Olivenölkonsums (p < 0,001). SCHLUSSFOLGERUNG: Die Hypothese, dass die Phenole im Olivenöl aufgrund ihrer in in vitro und Tierstudien beschriebenen antioxidativen Wirkung dem Olivenöl neben dem einzigartigen Fettsäureprofil eine zusätzliche kardioprotektive Wirkung bescheren, konnte in der vorliegenden Studie nicht gezeigt werden. Dennoch konnte durch den Olivenölverzehr und der damit einhergehenden Erhöhung des MUFA-Anteils in der Ernährung eine vorteilhafte Beeinflussung der Blutlipide erzielt werden. Obgleich Olivenöl nicht das vorwiegend verzehrte Fett in Deutschland darstellt, zeigten die befragten Probanden eine hohe Akzeptanz. Folglich könnte die Integration von Olivenöl in die habituelle Ernährung einen Beitrag zur Senkung des kardiovaskulären Erkrankungsrisikos leisten.
Nahrungsinhaltsstoffe sind im Organismus an Steuerungsprozessen und Stoffwechselvorgängen beteiligt, wobei die Mechanismen ihrer Wirkung noch nicht völlig aufgeklärt sind. Wie Vitamin E zeigen auch sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe in Zellsystemen sowie in vivo eine Reihe biologischer Wirkungen, deren Erklärung jedoch häufig auf ihre antioxidative Eigenschaft reduziert wird. Ziel der Dissertation war es, den Einfluss von Vitamin E und anderen Pflanzeninhaltsstoffen (in Form von Pflanzenextrakten oder isolierten sekundären Pflanzeninhaltsstoffen, z.B. Polyphenole), die bisher alle hauptsächlich als Antioxidanz klassifiziert wurden, auf die transkriptionelle Regulation von Phase I- und Phase II-Enzymen zu untersuchen. Dazu wurde die Aktivierung des PXR (pregnane X receptor) und des Nrf2 (NF-E2-related factor-2) als zentrale Transkriptionsfaktoren der Phase I- bzw. Phase II-Enzyme getestet. Der Einfluss von verschiedenen Vitamin E-Formen und antioxidativen Pflanzeninhaltsstoffen in Form von Reinsubstanzen (Curcumin, EGCG, Medox, Quercetin, Resveratrol und Sulforaphan) oder Pflanzenextrakten (aus Blaubeeren, Gewürznelken, Himbeeren, Nelkenpfeffer, Thymian oder Walnüssen) auf die Aktivierung von PXR und Nrf2 sowie des Promotors eines jeweiligen Zielgens (CYP3A4 bzw. GI-GPx) wurde in vitro mit Reportergenplasmiden untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl Vitamin E-Formen als auch verschiedene sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe PXR und/oder Nrf2 sowie die Promotoren der jeweiligen Zielgene CYP3A4 bzw. GI-GPx aktivieren. In einem Tierexperiment konnte diese genregulatorische Wirkung von Vitamin E auf die in vivo-Situation übertragen werden. In Lebern von Mäusen, deren Futter unterschiedliche Mengen von Vitamin E enthielt (Mangel-, Normal- und Überflussdiät), wurde eine direkte Korrelation zwischen der alpha-Tocopherol-Konzentration und der Cyp3a11 mRNA-Expression nachgewiesen (Cyp3a11 ist das murine Homolog zum humanen CYP3A4). Entgegen der in vitro-Situation hatte gamma-Tocotrienol in vivo einen nur kaum nachweisbaren Effekt auf die Expression der Cyp3a11 mRNA, induzierte aber die Expression der alpha-TTP mRNA. Es konnte gezeigt werden, dass Vitamin E und sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe Phase I- und Phase II-Enzyme transkriptionell regulieren können. Die Wirkungen des Vitamin E können sich allerdings nur entfalten, wenn die Vitamin E-Formen ausreichend vom Körper aufgenommen werden. Gegenstand der Dissertation waren daher auch Untersuchungen zur Bioverfügbarkeit (zelluläre Akkumulation und Metabolismus) verschiedener Vitamin E-Formen. Es konnte gezeigt werden, dass Unterschiede in der chemischen Struktur der Vitamin E-Formen deren zelluläre Akkumulation und Metabolisierung beeinflussen. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der Dissertation lassen sich protektive Wirkungen von antioxidativen Nahrungsinhaltsstoffen auch unabhängig von ihren antioxidativen Eigenschaften über die Induktion zelleigener Schutzsysteme, einschließlich der Phase I- und Phase II-Enzyme, erklären. Die Induktion der zelleigenen Abwehr lässt sich auch als adaptive Antwort (sog. "adaptive response") des Organismus gegenüber zellschädigenden Ereignissen betrachten.
Das proinflammatorische Zytokin Interleukin-1 (IL-1) spielt eine zentrale Rolle bei Entzündungen und Infektionen. Die zellulären Antworten von IL-1 werden über den IL-1-Rezeptor Typ I (IL-1RI) vermittelt. Adapterproteine und die IL-1RI-assoziierte Kinase IRAK werden nach Ligandenbindung an den Rezeptor rekrutiert. Nach ihrer Phosphorylierung dissoziiert die IRAK vom IL-1RI-Komplex und aktiviert weitere Kinasen, was letztendlich zur Aktivierung von NF-κB und zur Induktion der Transkription von Genen führt. Für eine adäquate Immunantwort ist ein intrazellulärer reduzierter Status von Proteinthiolen essentiell. Vorausgegangene Untersuchungen an der murinen Thymomzelllinie EL-4 zeigten, dass die IL-1-Signalkaskade durch thiolmodifizierende Substanzen wie Menadion (MD) oder Phenylarsinoxid (PAO) gehemmt wird. Eine IL-1-abhängige Aktivierung von IL-1RI-assoziierte Kinasen oder NF-κB fand nicht mehr statt. Ziele dieser Arbeit waren: (i) mögliche Proteine, die für den Angriff von thiolmodifizierenden Agenzien ein Ziel sein könnten, zu identifizieren und (ii) den Einfluss nahrungsrelevanter und redoxaktiver Substanzen auf frühe Ereignisse der IL-1-Signaltransduktion wie der Bildung des IL-1RI-Komplexes zu untersuchen. Als Zellmodell wurden EL-4-Zellen mit stabil überexprimierter IRAK (EL-4<sup>IRAK) verwendet. Um die Bildung des IL-1RI-Komplexes, anschließende Phosphorylierungsereignisse und somit Kinase-Aktivitäten nachzuweisen, wurden Co-Präzipitations-Experimente und in vitro Kinase Tests durchgeführt. Die Markierung von Proteinthiolen erfolgte mit dem thiolspezifischen Reagenz Iodoacetyl-[<sup>125I]-Iodotyrosin ([<sup>125I]-IAIT). Die Vorbehandlung von EL-4<sup>IRAK-Zellen mit MD oder PAO führte zu einer Hemmung der Rekrutierung der IRAK an den IL-1RI und der anschließenden Phosphorylierungen. Zur Identifikation weiterer IL-1RI-assoziierter Proteine wurden IL-1RI-Immunpräzipitate zweidimensional aufgetrennt, Colloidal-Coomassie gefärbte Proteinspots ausgeschnitten und anschließend massenspektrometrisch mittels ESI-Q-TOF analysiert. Bei der Analyse wurden Proteine des Cytoskeletts wie z. B. Actin identifiziert. In Analogie zu den synthetischen Substanzen MD und PAO wurden nahrungsrelevante und redoxaktive Substanzen wie Curcumin (Gelbwurz) und Sulforaphan (Broccoli) eingesetzt, um zu untersuchen, ob sie bereits früh die IL-1-Signaltransduktion beeinflussen. Bislang sind antiinflammatorische Effekte dieser beiden Nahrungsinhaltsstoffe nur auf der Ebene der Zytokin-vermittelten Aktivierung von NF-κB beschrieben. Sowohl Curcumin als auch Sulforaphan blockierten konzentrationsabhängig die Assoziation der IRAK an den IL-1RI in EL-4<sup>IRAK-Zellen, wobei beide Substanzen unterschiedlich wirkten. Curcumin beeinflusste die IRAK-Aktivierung durch direkte Modifikation von Thiolen der IRAK ohne die Bindung von IL-1 mit dem IL-1RI zu beeinträchtigen. Sulforaphan hingegen induzierte auf mRNA- und Proteinebene die Expression von Tollip, welches durch PCR bzw. Western Blot nachgewiesen wurde. Tollip, ein negativer Regulator in TLR/IL-1RI-Signalkaskaden, könnte somit nach Induktion die IRAK-Aktivierung unterdrücken. Die Sulforaphan-abhängige Induktion der Tollip-Expression erfolgte jedoch nicht über Nrf2 und "antioxidant response element" (ARE)-regulierte Transkription, obwohl Sulforaphan ein bekannter Nrf2-Aktivator ist. Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass die IRAK ein redoxsensitives Protein ist und für die Bildung des IL-1RI-Komplexes reduzierte Proteinthiole eine Voraussetzung sind. Der Angriffspunkt für die antiinflammatorische Wirkung der beiden Nahrungsbestandteile Curcumin und Sulforaphan ist die Bildung des IL-1RI-Komplexes als ein frühes Ereignis in der IL-1-Signalkaskade. Die Hemmung dieses Prozesses würde die in der Literatur beobachteten Inhibitionen der abwärts liegenden Signale wie die Aktivierung von NF-κB und die Induktion proinflammatorischer Proteine erklären.
Die Entwicklung von Dickdarmkrebs wird durch eine Reihe von Lebens- und Essgewohnheiten sowie Umweltfaktoren begünstigt. Den letzteren beiden sind Substanzen zuzurechnen, die bei der Zubereitung der Nahrung entstehen und mit ihr aufgenommen werden. Zu diesen Verbindungen gehört das 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin (PhIP) aus der Substanzklasse der heterozyklischen aromatischen Amine. Es entsteht bei der Erhitzung zahlreicher proteinhaltiger Nahrungsmittel und die Zielorgane in Nagerstudien stimmen mit der Häufung von Krebsinzidenzen in westlichen Industrienationen überein. Dieser Zusammenhang konnte jedoch bis heute nicht endgültig bewiesen werden. Fütterungsversuche mit Ratten wurden mit Konzentrationen der Substanz durchgeführt, die weit über der menschlichen Exposition liegen. Durch das Verfüttern einer humanrelevanten Dosis PhIP sollte geklärt werden, ob auch geringe Konzentrationen dickdarmkrebstypische Mutationen, präneoplastische Läsionen oder Tumore induzierten. Die mit humanrelevanten Dosen gefütterten Tiere wiesen weniger Läsionen als die Hoch-Dosis-PhIP-Gruppe auf, in der allerdings keinerlei maligne Tumoren des Dickdarms auftraten. Hinweise auf dickdarmkrebstypische Mutationen fanden sich ebenfalls in beiden Gruppen, wobei hier keine Dosisabhängigkeit beobachtet werden konnte. Die Sequenzierung ergab ein deutlich von Literaturdaten abweichendes Spektrum. In Bezug auf das verwendete Tiermodell wurden erhebliche Abweichungen in der Empfindlichkeit der Tiere gegenüber der Substanz im Vergleich zu ähnlichen Studien festgestellt. Beide Fütterungsgruppen zeigten deutlich weniger Läsionen; als mögliche Gründe wurden Unterschiede in der Futterzusammensetzung und –zubereitung sowie in der Tierhaltung und –herkunft ausgemacht. Es konnte erstmalig ein Zusammenhang zwischen PhIP in niedrigen Dosen in der Nahrung und der Induktion von Entzündungen gezeigt werden. Diese waren sowohl makroskopisch als auch histologisch sichtbar, der genaue Mechanismus ihrer Entstehung ist jedoch unbekannt. Die zusammenfassende Betrachtung aller Ergebnisse lässt vermuten, dass PhIP allein über lange Zeiträume aber in geringen Dosen verabreicht nicht für die hohe Zahl an Krebserkrankungen in westlichen Industrienationen ursächlich ist.
Homocystein (tHcy) gilt als unabhängiger kardiovaskulärer Risikofaktor und korreliert eng mit einer endothelialen Dysfunktion, welche nichtinvasiv mittels der flussinduzierten Vasodilatation (FMD) messbar ist. Experimentelle Hyperhomocysteinämie ist mit einer reduzierten Bioverfügbarkeit von endothelialen Stickstoffmonoxid (NO) bei gleichzeitig erhöhten Spiegeln des kompetetiven Inhibitors der NO-Biosynthese asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) assoziiert. In-vivo senkt eine Östrogenbehandlung neben tHcy auch die ADMA-Spiegel und verbessert signifikant die Endothelfunktion. Hinsichtlich ihrer Wirkung als selektive Östrogenrezeptormodulatoren wird angenommen, dass Phytoöstrogene, speziell Sojaisoflavone, ähnliche Effekte hervorrufen. Innerhalb einer europäischen, multizentrischen, doppelblinden Interventionsstudie an 89 gesunden, postmenopausalen Frauen wurde der Einfluss von Sojaisoflavonen auf den Homocysteinmetabolismus, den Blutdruck und die in-vivo Endothelfunktion untersucht. Die cross-over Studie umfasste zwei achtwöchige Interventionsperioden, die von einer gleichlangen Wash-out-Phase unterbrochen waren. Die Zuteilung zum Isoflavon- (50 mg/d) oder Plazeboregime für die erste Interventionsphase erfolgte randomisiert. Endpunkterhebungen fanden jeweils in den Wochen 0 und 8 der Interventionsperioden statt. Die renale Ausscheidung von Genistein, Daidzein und Equol war während der Isoflavonintervention signifikant erhöht (P>0,001). Die Phyoöstrogene hatten weder einen Effekt auf die tHcy-Konzentration (P=0,286), noch auf ADMA, Erythrozytenfolat und Vitamin B-12 (P>0,05) im Plasma. Während die Summe aus Nitrat und Nitrit (NOx), welche die NO-Bioverfügbarkeit reflektiert, im Verlaufe der Plazebobehandlung abfiel, wurde ein leichter Anstieg bei der Isoflavonsupplementation beobachtet (Delta Wo8-Wo0: -2,60 [-8,75; 2,25] vs. 1,00 [-6,65; 7,85] µmol/L P<0,001), was zu einem signifikanten Behandlungseffekt führte. Weiterhin wurde eine positive Korrelation zwischen ADMA und Vitamin B-12 gefunden (R=0,252; P=0,018). Die flussinduzierte Vasodilatation (P=0,716), ein Maß für die Endothelfunktion, blieb durch die Isoflavonbehandlung unbeeinflusst, obwohl sich diese über die Zeit insgesamt verbesserte (P>0,001). Bis auf einen marginalen Anstieg des systolischen Wertes (P=0,032) im Vergleich zur Plazebobehandlung blieb der Blutdruck während der Isoflavonintervention unverändert. Im Gegensatz zu Östrogen übten Sojaisoflavone weder einen Einfluss auf die in-vivo Endothelfunktion noch auf die traditionellen und neuen kardiovaskulären Risikofaktoren den Blutdruck, tHcy und ADMA aus. Demzufolge ist der gesundheitliche Nutzen isolierter Isoflavone hinsichtlich einer Prävention hormonmangelbedingter Erkrankungen in gesunden postmenopausalen Frauen fraglich.