570 Biowissenschaften; Biologie
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Der Einfluss unterschiedlich aggressiver Fusarium culmorum- und F. graminearum-Isolate auf die Schadbildausprägung bei Winterweizen sowie die Möglichkeit der Befallskontrolle mit Mykorrhiza Die durch Pilzarten der Gattung Fusarium spp. hervorgerufene partielle Taubährigkeit ist ein ernstes Problem im weltweiten Weizenanbau. Eine für die Schaderreger günstige feuchte Witterung zum Zeitpunkt der Weizenblüte in Kombination mit befallsfördernden agrotechnischen Maßnahmen löst immer wieder Epidemien aus. Hauptsächlich verursacht durch F. culmorum und F. graminearum führt eine Erkrankung zu Ertrags- und Qualitätseinbußen sowie zu einer Belastung des Ernteguts mit Mykotoxinen, die bereits in niedrigen Konzentrationen toxisch auf den tierischen und menschlichen Organismus wirken. Die am häufigsten vorkommenden Fusarium-Toxine in Weizen sind Deoxynivalenol (DON) und Zearalenon (ZEA). Isolate von F. graminearum- und F. culmorum können in ihrem DON- und ZEA-Bildungsvermögen und ihrem Potential, Nekrosen zu verursachen, stark variieren. In Laborversuchen (in vitro) wurden F. graminearum- und F. culmorum-Isolate hinsichtlich dieser Eigenschaften (hier als Aggressivität bezeichnet) charakterisiert und anschließend wurde im Feldversuch überprüft, ob die in vitro-ermittelte Aggressivität die Schadbildausprägung bei Weizenpflanzen beeinflusst. Nur im ersten Versuchsjahr, das durch hohe Niederschläge gekennzeichnet war, konnte ein Einfluss der Aggressivität und einer zusätzlichen Beregnung im Feldversuch nachgewiesen werden. Die als hoch-aggressiv eingestuften Fusarium-Isolate reduzierten unter dem Einfluss der Beregnung den Ertrag und das Tausendkorngewicht. Die Beregnung führte zu einer Erhöhung des Pilzwachstums und der DON- und ZEA-Produktion. Ein extrem trockener Sommer verhinderte die Infektion der Weizenpflanzen durch die beimpften Fusarium-Isolate und ein anschließendes Pilzwachstum in den Ähren im zweiten Versuchsjahr. Um den Befall von Weizenpflanzen mit Fusarium spp. vorzubeugen, stehen verschiedene pflanzenbauliche Maßnahmen zur Verfügung. Eine Möglichkeit stellen in diesem Zusammenhang die symbiotischen Mykorrhizapilze (MP) dar. Die Pilze sind in der Lage, Pflanzen zu stärken und antagonistisch auf pilzliche Schaderreger zu wirken. Um zu überprüfen, ob MP dazu beitragen könnten, den Befall von Weizenpflanzen mit Fusarium spp. niedrig zu halten, wurden Weizenpflanzen mit MP und Fusarium spp. beimpft und die Auswirkungen der Interaktionen auf die Weizenpflanzen in einem Klimakammer- und einem Feldversuch getestet. In der Klimakammer wurde eine Reduzierung des Fusarium-Befalls nachgewiesen. Die mykorrhizierten Weizenpflanzen wiesen außerdem höhere Photosyntheseraten, höhere Sprosstrockenmassen und mehr Ähren im Vergleich zu den nicht-mykorrhizierten und mit Fusarium-beimpften Weizenpflanzen auf. Insgesamt wurde durch die Mykorrhizierung der negative Einfluss von Fusarium spp. kompensiert. Im Freiland konnte kein Einfluss der MP auf Fusarium spp. beobachtet werden. Im ersten Versuchsjahr führte das Beimpfen der Weizenpflanzen mit MP zu höheren Wurzel- und Sprosstrockenmassen sowie zu höheren Tausendkorngewichten im Vergleich zu den mit Fusarium spp.-beimpften Weizenpflanzen. Im zweiten Versuchsjahr konnte dieses Ergebnis nicht wiederholt werden.
Es ist bekannt, dass Änderungen im Kohlenstoff- bzw. Stickstoffstaus der Pflanzen zu einer parallelen statt reziproken Änderung der kohlenstoff- und stickstoffhaltigen Primärmetabolite führen. Unter diesem Gesichtspunkt wurden in der vorliegenden Arbeit der Aminosäurestoffwechsel und der Sekundärstoffwechsel unter reduzierten Stickstoffbedingungen untersucht. Zur Beeinflussung des Stickstoffstoffwechsels wurden nitratmangelernährte Tabakwildtyppflanzen und Genotypen mit unterschiedlich stark reduzierter Nitratreduktase-Aktivität verwendet. Dieses experimentelle System erlaubt zusätzlich durch den Vergleich Nitrat defizienter Wildtyppflanzen mit Nitrat akkumulierenden NIA-Transformanten Prozesse zu identifizieren, die durch Nitrat gesteuert werden. Die Analysen der Primär- und Sekundärmetabolite wurde in allen Genotypen diurnal durchgeführt, um auch tageszeitlich abhängige Prozesse zu identifizieren. Die Analyse der absoluten Gehalte aller individuellen Aminosäuren enthüllte bei den meisten erstaunlich stabile diurnale Muster mit einem Anstieg während des Tages und einem Abfall in der Nacht in Wildtyppflanzen gewachsen mit ausreichend Nitrat. Dieses Ergebnis legt die Schlussfolgerung nahe, dass die Biosynthese der Aminosäuren koordiniert abläuft. In Pflanzen mit reduziertem Stickstoffstatus haben diese diurnalen Muster jedoch keinen Bestand. Die Kombination des erzeugten stickstoffbasierten Aminosäuredatensatz in Kombination mit einem bereits erzeugten Aminosäuredatensatz unter kohlenstofflimitierten Bedingungen von Matt et al. (2002) führte durch Hauptkomponentenanalyse (PCA) und Korrelationsanalyse zu dem Ergebnis, dass die Hypothese nach einer koordinierten Aminosäurebiosynthese nicht allgemeine Gültigkeit hat. Die PCA identifizierte Glutamin, Glutamat, Aspartat, Glycin, Pheny-lalanin und Threonin als Faktoren, die den Datensätzen ihre charakteristische Eigenschaft und deren Varianz verleihen. Die Korrelationsanalyse zeigte, dass die sehr guten Korrelationen der individuellen Aminosäuren untereinander in reduzierten Stickstoff- und Kohlenstoffbedingungen sich verschlechtern. Das Verhältnis einer einzelnen Aminosäure relativ zu den anderen führte zur Identifizierung einiger Aminosäuren, die individuelle Antworten auf Stickstoff- und/oder Kohlenstoffstatus zeigen, und/oder speziell auf Nitrat, Licht und/oder den E-nergiestatus der Thylakoidmembran. Glutamat beispielsweise verhält sich in den meisten Situationen stabil, Phenylalanin dagegen zeigt in jeder physiologischen Situation eine individuelle Antwort. Die Ergebnisse dieser Arbeit führen zu einer Erweiterung der Hypothese einer koordinierten Synthese der Aminosäuren dahingehend, dass diese nicht generell für alle Aminosäuren angenommen werden kann. Es gibt einige Aminosäuren deren, Anteile sich situationsbedingt anpassen. Die Reduktion des Stickstoffstatus in nitratmangelernährten Tabakwildtyppflanzen führte zu der, nach der „Carbon-Nutrient-Balance“ Hypothese erwarteten Verlagerung der kohlenstoffreichen Phenylpropanoide und des stickstoffreichen Nikotins. Die Erhöhung der Phenylpropanoidgehalte war nicht in der Nitrat akkumulierenden NIA-Transformante zu beobachten und somit konnte Nitrat als regulatorisches Element identifiziert werden. Ein Einfluss der Vorläufermetabolite konnte ausgeschlossen werden, da sowohl nitratmangelernährter Wildtyp als auch die Nitrat akkumulierende NIA-Transformante ähnliche Gehalte dieser aufwiesen. Genexpressionsanalysen über Mikroarray-Hybridisierung und quantitative RT-PCR zeigten, dass Nitrat durch noch nicht geklärte Mechanismen Einfluss auf die Expression einiger Gene nimmt, die dem Phenylpropanoidstoffwechsels zugeordnet sind. Aus der Arbeit hervorgegangene Veröffentlichungen: Christina Fritz, Natalia Palacios-Rojas, Regina Feil und Mark Stitt (2006) Regulation of Secondary Metabolism by the Carbon-Nitrogen Status in Tobacco: Nitrate Inhibits Large Sectors of Phenylpropanoid Metabolism. Plant Journal 46, 533 - 548 Christina Fritz, Petra Matt, Cathrin Müller, Regina Feil und Mark Stitt (2006) Impact of the Carbon-Nitrogen Status on the Amino Acid Profile in Tobacco Source Leaves. Plant, Cell and Environment 29 (11), 2009 - 2111
Es ist schon seit längerer Zeit bekannt, dass nach Kontakt des Biomaterials mit der biologischen Umgebung bei Implantation oder extrakorporaler Wechselwirkung zunächst Proteine aus dem umgebenden Milieu adsorbiert werden, wobei die Oberflächeneigenschaften des Materials die Zusammensetzung der Proteinschicht und die Konformation der darin enthaltenden Proteine determinieren. Die nachfolgende Wechselwirkung von Zellen mit dem Material wird deshalb i.d.R. von der Adsorbatschicht vermittelt. Der Einfluss der Oberflächen auf die Zusammensetzung und Konformation der Proteine und die nachfolgende Wechselwirkung mit Zellen ist von besonderem Interesse, da einerseits eine Aussage über die Anwendbarkeit ermöglicht wird, andererseits Erkenntnisse über diese Zusammenhänge für die Entwicklung neuer Materialien mit verbesserter Biokompatibilität genutzt werden können. In der vorliegenden Habilitationsschrift wurde deshalb der Einfluss der Zusammensetzung von Polymeren bzw. von deren Oberflächeneigenschaften auf die Adsorption von Proteinen, den Aktivitätszustand der plasmatischen Gerinnung und die Adhäsion von Zellen untersucht. Dabei wurden auch Möglichkeiten zur Beeinflussung dieser Vorgänge über eine Veränderung der Volumenzusammensetzung oder durch Oberflächenmodifikationen von Biomaterialien vorgestellt. Erkenntnisse aus diesen Arbeiten konnten für die Entwicklung von Membranen für Biohybrid-Organe genutzt werden.
Die Erkennung komplexer Kohlenhydrate durch das Tailspike Protein aus dem Bakteriophagen HK620
(2012)
Kohlenhydrate stellen aufgrund der strukturellen Vielfalt und ihrer oft exponierten Lage auf Zelloberflächen wichtige Erkennungsstrukturen dar. Die Wechselwirkungen von Proteinen mit diesen Kohlenhydraten vermitteln einen spezifischen Informationsaustausch. Protein-Kohlenhydrat-Interaktionen und ihre Triebkräfte sind bislang nur teilweise verstanden, da nur wenig strukturelle Daten von Proteinen im Komplex mit vorwiegend kleinen Kohlenhydraten erhältlich sind. Mit der vorliegenden Promotionsarbeit soll ein Beitrag zum Verständnis von Protein-Kohlenhydrat-Wechselwirkungen durch Analysen struktureller Thermodynamik geleistet werden, um zukünftig Vorhersagen mit zuverlässigen Algorithmen zu erlauben. Als Modellsystem zur Erkennung komplexer Kohlenhydrate diente dabei das Tailspike Protein (TSP) aus dem Bakteriophagen HK620. Dieser Phage erkennt spezifisch seinen E. coli-Wirt anhand der Oberflächenzucker, der sogenannten O-Antigene. Dabei binden die TSP des Phagen das O-Antigen des Lipopolysaccharids (LPS) und weisen zudem eine hydrolytische Aktivität gegenüber dem Polysaccharid (PS) auf. Anhand von isolierten Oligosacchariden des Antigens (Typ O18A1) wurde die Bindung an HK620TSP und verschiedener Varianten davon systematisch analysiert. Die Bindung der komplexen Kohlenhydrate durch HK620TSP zeichnet sich durch große Interaktionsflächen aus. Durch einzelne Aminosäureaustausche im aktiven Zentrum wurden Varianten generiert, die eine tausendfach erhöhte Affinität (KD ~ 100 nM) im Vergleich zum Wildtyp-Protein (KD ~ 130 μM) aufweisen. Dabei zeichnet sich das System dadurch aus, dass die Bindung bei Raumtemperatur nicht nur enthalpisch, sondern auch entropisch getrieben wird. Ursache für den günstigen Entropiebeitrag ist die große Anzahl an Wassermolekülen, die bei der Bindung des Hexasaccharids verdrängt werden. Röntgenstrukturanalysen zeigten für alle TSP-Komplexe außer für Variante D339N unabhängig von der Hexasaccharid-Affinität analoge Protein- und Kohlenhydrat-Konformationen. Dabei kann die Bindestelle in zwei Regionen unterteilt werden: Zum einen befindet sich am reduzierenden Ende eine hydrophobe Tasche mit geringen Beiträgen zur Affinitätsgenerierung. Der Zugang zu dieser Tasche kann ohne große Affinitätseinbuße durch einen einzelnen Aminosäureaustausch (D339N) blockiert werden. In der zweiten Region kann durch den Austausch eines Glutamats durch ein Glutamin (E372Q) eine Bindestelle für ein zusätzliches Wassermolekül generiert werden. Die Rotation einiger Aminosäuren bei Kohlenhydratbindung führt zur Desolvatisierung und zur Ausbildung von zusätzlichen Wasserstoffbrücken, wodurch ein starker Affinitätsgewinn erzielt wird. HK620TSP ist nicht nur spezifisch für das O18A1-Antigen, sondern erkennt zudem das um eine Glucose verkürzte Oligosaccharid des Typs O18A und hydrolysiert polymere Strukturen davon. Studien zur Bindung von O18A-Pentasaccharid zeigten, dass sich die Triebkräfte der Bindung im Vergleich zu dem zuvor beschriebenen O18A1-Hexasaccharid verschoben haben. Durch Fehlen der Seitenkettenglucose ist die Bindung im Vergleich zu dem O18A1-Hexasaccharid weniger stark entropisch getrieben (Δ(-TΔS) ~ 10 kJ/mol), während der Enthalpiebeitrag zu der Bindung günstiger ist (ΔΔH ~ -10 kJ/mol). Insgesamt gleichen sich diese Effekte aus, wodurch sehr ähnliche Affinitäten der TSP-Varianten zu O18A1-Hexasaccharid und O18A-Pentasaccharid gemessen wurden. Durch die Bindung der Glucose werden aus einer hydrophoben Tasche vier Wassermoleküle verdrängt, was entropisch stark begünstigt ist. Unter enthalpischen Aspekten ist dies ebenso wie einige Kontakte zwischen der Glucose und einigen Resten in der Tasche eher ungünstig. Die Bindung der Glucose in die hydrophobe Tasche an HK620TSP trägt somit nicht zur Affinitätsgenerierung bei und es bleibt zu vermuten, dass sich das O18A1-Antigen-bindende HK620TSP aus einem O18A-Antigen-bindenden TSP evolutionär herleitet. In dem dritten Teilprojekt der Dissertation wurde der Infektionsmechanismus des Phagen HK620 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass analog zu dem verwandten Phagen P22 die Ejektion der DNA aus HK620 allein durch das Lipopolysaccharid (LPS) des Wirts in vitro induziert werden kann. Die Morphologie und Kettenlänge des LPS sowie die Aktivität von HK620TSP gegenüber dem LPS erwiesen sich dabei als essentiell. So konnte die DNA-Ejektion in vitro auch durch LPS aus Bakterien der Serogruppe O18A induziert werden, welches ebenfalls von dem TSP des Phagen gebunden und hydrolysiert wird. Diese Ergebnisse betonen die Rolle von TSP für die Erkennung der LPS-Rezeptoren als wichtigen Schritt für die Infektion durch die Podoviren HK620 und P22.
Natürliche Standorte der Waldkiefer gibt es in Deutschland nur kleinflächig. Während Kiefernforste anstelle natürlicher Laubwälder heute oft landschaftsprägend sind, bildet die konkurrenzschwache und lichtbedürftige Kiefer ausschließlich auf extrem trockenen oder nassen, nährstoffarmen Standorten naturnahe Schlusswaldgesellschaften. Regionale Schwerpunkte liegen in subkontinentalen Regionen wie dem nordostdeutschen Tiefland und Bayern, ein „natürliches Kiefernareal" lässt sich aber kaum abgrenzen. An der Trockengrenze des Waldes finden sich auf Kalk- und Dolomitgesteinen artenreiche Karbonat-Trockenkiefernwälder mit Elementen der alpinen Rasen und Kalkmagerrasen in der Bodenvegetation. Diese Wälder besiedeln steile, südexponierte Felsen und morphodynamisch aktive Bereiche wie Rutschhänge und FlussSchotterböden im Umkreis der Alpen, kommen aber auch in den Mittelgebirgen vor. Ihr Gegenstück auf sauren Standorten sind die Sand- und Silikat-Kiefernwälder der Quarzsande und Sandstein-Verwitterungsböden, deren Bodenvegetation durch Zwergsträucher, Moose und Strauchflechten geprägt ist. Hier siedelt die Kiefer in den Tieflagen besonders auf Binnendünen und Sandern, aber auch auf Küstendünen der Ostsee, in den Mittelgebirgen z. B. auf den Sandsteinriffen der Sächsischen Schweiz. Der dritte Wuchsbereich natürlicher Kiefernwälder sind saure, nährstoffarme Moore, die ganz überwiegend von Regenwasser gespeist werden. Auch die Kiefern-Moorwälder sind in Nordostdeutschland und Bayern am häufigsten. Von diesen Standorten ausgehend, wo ihr Platz kaum von anderen Baumarten streitig gemacht wird, tritt die Waldkiefer immer wieder als Pionier auf weniger extremen Standorten auf. In der Naturlandschaft kam dies etwa nach Waldbränden oder Stürmen vor, doch der Mensch förderte die Kiefer durch Auflichtung der Wälder, Waldweide und Streunutzung stark. Auch die damit verbundene Nährstoffverarmung macht eine exakte Abgrenzung natürlicher Kiefernstandorte unmöglich. Die schlechtwüchsigen und forstwirtschaftlich nicht interessanten, ästhetisch aber sehr ansprechenden natürlichen Kiefernbestände sind heute vor allem durch Stickstoff-Immissionen gefährdet. Trotz ihrer oft kargen Erscheinung besitzen sie einen hohen Wert für die Biodiversität und den Artenschutz. Neben bodenbewohnenden Flechten und regionalen Relikt-Endemiten ist vor allem die in den letzten Jahrzehnten zunehmend gefährdete Vielfalt an Mykorrhiza-Pilzen hervorzuheben, die der Kiefer das Leben auf extrem nährstoffarmen Standorten überhaupt ermöglichen. Abschließend werden mögliche Schutz- bzw. Regenerationsmaßnahmen wie das Abplaggen flechtenreicher Kiefernstandorte vorgestellt.
Die acinösen Speicheldrüsen der Schabe Periplaneta americana sind reich durch serotonerge, dopaminerge und GABAerge Fasern innerviert. Die biogenen Amine Serotonin (5-HT) und Dopamin (DA) induzieren die Sekretion eines NaCl-haltigen Primärspeichels. Die physiologische Rolle der GABAergen Innervation des Drüsenkomplexes war bislang unbekannt. Weiterhin wurde vermutet, dass Tyramin (TA) und Octopamin (OA) an der Speichelbildung beteiligt sind. Mittels intrazellulärer Ableitungen von sekretorischen Acinuszellen mit und ohne Stimulierung des Speicheldrüsennervs (SDN) sollte daher die Wirkung von GABA, TA und OA im Speicheldrüsenkomplex untersucht werden. Intrazelluläre Ableitungen aus Acinuszellen zeigten, dass sowohl DA als auch 5 HT biphasische Änderungen des Membranpotentials induzierten. Diese bestanden aus einer initialen Hyperpolarisation und einer darauf folgenden transienten Depolarisation. Stimulierung des SDN mittels einer Saugelektrode verursachte ebenfalls biphasische Änderungen des Membranpotentials der Acinuszellen, die mit den DA- bzw. 5-HT-induzierten Änderungen kinetisch identisch waren. Dieses Ergebnis zeigte, dass die elektrische Stimulierung des SDN im Nerv-Speicheldrüsenpräparat eine verlässliche Methode zur Untersuchung der Wirkungen von Neuromodulatoren auf die dopaminerge und/oder sertotonerge Neurotransmission ist. Die Hyperpolarisation der DA-induzierten Potentialänderungen wurde durch eine intrazelluläre Ca2+-Freisetzung und die Öffnung basolateral lokalisierter Ca2+-gesteuerter K+-Kanäle verur-sacht. Die DA- und 5-HT-induzierte Depolarisation hing kritisch von der Aktivität eines basolateral lokalisierten Na+-K+-2Cl--Symporters ab. GABA, TA und OA potenzierten die elektrischen Antworten der Acinuszellen, wenn diese durch SDN-Stimulierung hervorgerufen wurden. Dabei war OA wirksamer als TA. Dieses Ergebnis zeigte, dass diese Substanzen als im Drüsenkomplex präsynaptisch und erregend als Neuromodulatoren wirken. Pharmakologische Untersuchungen ergaben, dass die erregende Wirkung von GABA durch einen G-Protein-gekoppelten GABAB-Rezeptor vermittelt wurde. Messungen der durch SDN-Stimulierung induzierten Flüssigkeits- und Proteinsekretionsraten zeigten, dass beide Parameter in Anwesenheit von GABA verstärkt waren. Dies ließ auf eine verstärkte serotonerge Neurotransmission schließen, da nur 5-HT die Bildung eines Protein-haltigen Speichels verursacht. Immuncytochemische Untersuchungen zeigten, dass die Drüsen tyraminerge und octopaminerge Innervation empfangen. Weiterhin wurde der erste charakterisierte TA-Rezeptor (PeaTYR1) der Schabe auf einem paarigen, lateral zur Drüse ziehenden Nerv markiert, der auch tyraminerge Fasern enthielt. Die vorliegende Arbeit trug zum Verständnis der komplexen Funktionsweise der Speicheldrüse der Schabe bei und erweiterte das lückenhafte Wissen über die neuronale Kontrolle exokriner Drüsen in Insekten.
Die Pektat-Lyasen gehören zu einer Proteinfamilie, die meistens von pflanzenpathogenen Mikroorganismen sekretiert werden. Die Enzyme katalysieren den Abbau von Polygalakturonsäure, einem Hauptbestandteil in pflanzlichen Mittellamellen und Primärzellwänden. Der Abbau der alpha-1,4-verbrückten Galakturonsäurereste erfogt durch eine beta-Eliminierungsreaktion, dabei entsteht ein Produkt mit einer ungesättigten C4-C5 Bindung am nicht reduzierenden Ende, das durch spektroskopische Messungen beobachtet werden kann. Für die enzymatische Reaktion der Pektat-Lyasen ist Calcium nötig und das pH-Optimum der Reaktion liegt bei pH 8.5. Alle bis jetzt bekannten Strukturen der Pektat- und Pektin-Lyasen haben das gleiche Strukturmotiv - eine rechtsgängige parallele beta-Helix. Die Struktur der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis (BsPel) ist im Komplex mit Calcium gelöst worden. BsPel ist ein monomeres Protein mit einer ungefähren Molekularmasse von 43 kDa, das keine Disulfidbrücken enthält. Dies erlaubte sowohl eine effiziente rekombinante Expression des Wildtypproteins, als auch von destabilisierten Mutanten im Cytoplasma von E. coli. Parallele beta-Helices sind relativ große, jedoch verhältnismäßig einfach aufgebaute Proteine. Um detailliertere Informationen über die kritischen Schritte bei der in vitro-Faltung von parallelen beta-Helices zu erhalten, sollte in der vorliegenden Arbeit versucht werden, den Faltungsmechanismus dieses Proteins näher zu charakterisieren. Dabei sollte vor allem die Frage geklärt werden, welche Wechselwirkungen für die Stabilität dieses Proteins einerseits und für die Stabilität von essentiellen Faltungsintermediaten andererseits besonders wichtig sind.<BR>Rückfaltung von BsPel, ausgehend vom guanidiniumchlorid-denaturierten Zustand, war bei kleinen Proteinkonzentrationen und niedrigen Temperaturen vollständig möglich. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge waren aber nicht reversibel und zeigten eine apparente Hysterese. Kinetische Messungen des Fluoreszenz- und CD-Signals im fernen UV ergaben eine extreme Denaturierungsmittelabhängigkeit der Rückfaltungsrate im Bereich des Übergangmittelpunktes. Der extreme Abfall der Rückfaltungsraten mit steigender Denaturierungsmittelkonzentration kann als kooperative Entfaltung eines essentiellen Faltungsintermediats verstanden werden. Dieses Faltungsintermediat ist temperaturlabil und kann durch den Zusatz Glycerin im Renaturierungspuffer stabilisiert werden, wobei sich die Hysterese verringert, jedoch nicht vollständig aufgehoben wird. Durch reverse Doppelsprungexperimente konnten zwei transiente Faltungsintermediate nachgewiesen werden, die auf zwei parallelen Faltungswegen liegen und beide zum nativen Zustand weiterreagieren können. Fluoreszenzemissionsspektren der beiden Intermediate zeigten, daß beide schon nativähnliche Struktur aufweisen. Kinetische Daten von Prolin-Doppelsprungexperimenten zeigten, daß Prolinisomerisierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Reaktivierung des denaturierten Enzyms darstellt. Desweiteren konnte durch Prolin-Doppelsprungexperimenten an Mutanten mit Substitutionen im Prolinrest 281 gezeigt werden, daß die langsame Renaturierung von BsPel nicht durch die Isomerisierung der einzigen cis-Peptidbindung an Prolin 281 verursacht wird, sondern durch die Isomerisierung mehrerer trans-Proline. Die beiden beobachteten transienten Faltungsintermediate sind somit wahrscheinlich zwei Populationen von Faltungsintermediaten mit nicht-nativen X-Pro-Peptidbindungen, wobei sich die Populationen durch mindestens eine nicht-native X-Pro-Peptidbindung unterscheiden.<BR>Der Austausch des Prolinrestes 281 gegen verschiedene Aminosäuren (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) führte zu einer starken Destabilisierung des nativen Proteins und daneben auch zu einer Reduktion in der Aktivität, da die Mutationsstelle in der Nähe der putativen Substratbindetasche liegt. Die Rückfaltungskinetiken der Prolinmutanten war bei 10°C annähernd gleich zum Wildtyp und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Faltung waren durch die Mutation nicht verändert. Die durch die Mutation verursachte drastische Destabilisierung des nativen Zustands führte zu einem reversiblen Entfaltungsgleichgewicht bei pH 7 und 10°C. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge der Mutante P281A zeigten bei Messungen der Tryptophanfluoreszenzemission und der Aktivität einen kooperativen Phasenübergang mit einem Übergangsmittelpunkt bei 1.1 M GdmCl. Durch die Übereinstimmung der Faltungsübergänge bei beiden Messparametern konnten die Faltungsübergänge nach dem Zwei-Zustandsmodell ausgewertet werden. Dabei wurde eine freie Sabilisierungsenthalpie der Faltung für die Mutante von <nobr>- 64.2 ± 0.4 kJ/mol</nobr> und eine Kooperativität des Übergangs von <nobr>- 58.2 ± 0.3 kJ/(mol·M)</nobr> bestimmt.<BR> BsPel enthält, wie die meisten monomeren rechtsgängigen parallelen beta-Helix-Proteine, einen internen Stapel wasserstoffverbrückter Asparagin-Seitenketten. Die Mehrheit der erzeugten Mutanten mit Substitutionen im Zentrum der Asn-Leiter (N271X) waren als enzymatisch aktives Protein zugänglich. Die Auswirkung der Mutation auf die Stabilität und Rückfaltung wurde an den Proteinen BsPel-N271T und BsPel-N271A näher analysiert. Dabei führte die Unterbrechung des Asparaginstapels im Inneren der beta-Helix zu keiner drastischen Destabilisierung des nativen Proteins. Allerdings führten diese Mutationen zu einem temperatur-sensitiven Faltungsphänotyp und die Hysterese im Denaturierungsübergang wurde verstärkt. Offenbar wird durch die Unterbrechung des Asparaginstapel ein essentielles, thermolabiles Faltungsintermediat destabilisiert. Der Asparaginstapel wird somit bei der Faltung sehr früh ausgebildet und ist wahrscheinlich schon im Übergangszustand vorhanden.
In den Chloroplasten von höheren Pflanzen sind die Galaktolipide Monogalaktosyldiacylglycerol (MGDG) und Digalaktosyldiacylglycerol (DGDG) die am weitesten verbreiteten Lipide. In dieser Forschungsarbeit wurde die Funktion der DGDG Synthase DGD1, und insbesondere die Funktion des N-terminalen Bereichs dieses Enzyms in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana untersucht. Die Überexpression des N-terminalen Bereichs von DGD1 in WT-Col2 resultierte in einem reduzierten Wachstum, welches sich jedoch von der dgd1-1 Mutante unterschied. Dies legte bereits nahe, dass die Expression von N-DGD1 einen negativen Einfluss auf das Wachstum hat. Durch Studien in einem heterologen E.coli Expressionssystem konnte diese These bestätigt werden. Zellen, die ausschließlich N-DGD1 zusammen mit einer MGD Synthase aus Gurke exprimierten, waren im Wachstum stark beeinträchtigt. Nicht nur der N-terminale Bereich von DGD1, auch der N-terminale Bereich von MGD1 besitzt eine Funktion als Transitpeptid und ist somit ein wichtiger Faktor zur korrekten Lokalisierung des MGD1 Proteins. In dieser Arbeit ist es gelungen, ein Fusionskonstrukt aus N-MGD1 und DGD2 in die dgd1-1 Mutante zu transferieren und damit das reduzierte Wachstum zu komplementieren. Frühere Versuche, ein reduziertes dgd1-1 Wachstum mit DGD2 allein zu komplementieren, scheiterten. Somit gibt dies einen Hinweis darauf, dass N-MGD1 als Transitpeptid fungieren kann. Bindungsstudien zur Interaktion von DGD1 und N-DGD1 Protein zeigten, dass die polaren Lipide MGDG und DGDG in Wechselwirkung mit dem N-terminalen Bereich von DGD1 treten. Bis zum heutigen Zeitpunkt ist nicht erforscht, wie der Transport von DGDG und MGDG zwischen den Hüllmembranen des Chloroplasten erfolgt. Die in dieser Arbeit angefertigen Bindungsstudien konnten Hinweise darauf geben, dass N-DGD1 als eine Art „Antiporter“ fungiert, um MGDG und DGDG zwischen den Hüllmembranen zu transportieren. Weiterhin wurden Bindungsstudien zur Erforschung von Interaktionen der Glykosyltransferasen DGD1, DGD2, MGD1, MGD2 und MGD3 angefertigt. Dabei wurden Wechselwirkungen zwischen den Glykosyltransferasen DGD1, DGD2 und MGD2 detektiert. Interessant ist, dass Hinweise auf eine Dimerbildung bestimmter Enzyme gefunden wurden, so für DGD1 und MGD2. Ein weiterer Ansatz zur Erforschung von Wechselwirkungen von DGD1 Protein mit bis jetzt unbekannten Proteinen war die Expression von DGD1-StrepIITag und DGD1-CTAPTag Fusionsproteinen in dgd1-1 Mutanten. Es wurden für beide Tags transgene Linien generiert, die im Wachstum komplementiert waren und wildtypähnliche Mengen an DGDG akkumulierten. Die Expression der verschiedenen Tags in den Pflanzen war sehr unterschiedlich, wobei der DGD1-CTAP-Tag am stärksten exprimiert war. Mit Pflanzenmaterial dieser Linien kann nun eine Aufreinigung des getaggten Proteins und eventueller Interaktionspartner erfolgen.
Pektatlyase (Pel-15) aus dem alkalophilen Bodenbakterium Bacillus spec. KSM-P15 ist mit 197 Aminosäuren eines der kleinsten, bekannten β-3-Solenoidproteine. Sie spaltet Polygalakturonsäurederivate in einem Ca2+-abhängigen β-Eliminierungsprozess. Wie bei allen Proteinen dieser Enzymfamilie ist auch die Polypeptidkette von Pel-15 zu einer einsträngigen, rechtsgängigen, parallelen β-Helix aufgewunden. In diesem Strukturmotiv enthält jede Windung drei β-Stränge, die jeweils durch flexible Schleifenbereiche miteinander verbunden sind. Insgesamt acht Windungen stapeln sich in Pel-15 übereinander und bilden entlang der Helixachse flächige, parallele β-Faltblätter aus. Im Bereich dieser β-Faltblätter existiert ein ausgedehntes Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen, durch das der hydrophobe Kern, der sich im Inneren der β-Helix befindet, vom umgebenden Lösungsmittel abgeschirmt wird. Besondere Abschlussstrukturen an beiden Enden der β-Helix, wie sie typischerweise bei anderen Ver-tretern dieser Strukturklasse ausgeprägt werden, sind in Pel-15 nicht zu beobachten. Stattdessen sind die terminalen Bereiche der β-Helix über Salzbrücken und hydrophobe Seitenkettenkontakte stabilisiert. In der vorliegenden Dissertation wurde die Pektatlyase Pel-15 hinsichtlich ihres Faltungsgleichgewichtes, ihrer enzymatischen Aktivität und der Kinetik ihrer Strukturbildung charakterisiert. In eine evolutionär konservierte Helixwindung wurden destabilisierende Mutationen eingeführt, und deren Auswirkungen mittels spektroskopischer Methoden analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Pel-15 in Gegenwart des Denaturierungsmittels Guanidiniumhydrochlorid einen hyperfluoreszenten Gleichgewichtsustand (HF) populiert, der nach Messungen von Faltungs- und Entfaltungskinetiken ein konformationelles Ensemble aus den Zuständen HFslow und HFfast darstellt. Diese HF-Zustände sind durch eine hohe Aktivierungsbarriere voneinander getrennt. In Rückfaltungsexperimenten populieren nur etwa 80 % der faltenden Moleküle den Zwischenzustand HFslow, der mit einer Zeitkonstante von ca. 100 s zu HFfast weiterreagiert. Die Denaturierungsmittelabhängigkeit dieser Reaktion ist sehr gering, was eine trans-/cis-Prolylisomerisierung als geschwindigkeitslimitierenden Schritt nahelegt. Die Existenz eines cis-Peptides in der nativen Struktur macht es erforderlich, den denaturierten Zustand als ein Ensemble kinetisch separierter Konformationen, kurz: DSE, zu betrachten, das durch die Spezies Ufast und Uslow populiert wird. Nach dem in dieser Arbeit aufgestellten „Minimalmodell der Pel-15 Faltung“ stehen die HF-Spezies (HFslow, HFfast) mit den Konformationen des DSE in einem thermodynamischen Kreisprozess. Das Modell positioniert HFfast und die native Konformation N auf die „native Seite“ der Aktivierungsbarriere und trägt damit der Tatsache Rechnung, dass die Gleichgewichtseinstellung zwischen diesen Spezies zu schnell ist, um mit manuellen Techniken erfasst zu werden. Die hochaffine Bindung von Ca2+ (Kd = 10 μM) verschiebt sich das Faltungsgleichgewicht bereits in Gegenwart von 1 mM CaCl2 soweit auf die Seite des nativen Zustandes, das HFfast nicht länger nachweisbar ist. Entgegen anfänglicher Vermutungen kommt einer lokalen, evolutionär konservierten Disulfidbrücke im Zentrum der β-Helix eine wichtige Stabilisierungsfunktion zu. Die Disulfidbrücke befindet sich in einem kurzen Schleifenbereich der β-Helix nahe dem aktiven Zentrum. Obwohl ihr Austausch gegen die Reste Val und Ala die freie Stabilisierungsenthalpie des Proteins um ca. 10 kJ/mol reduziert, lässt die Struktur im Bereich der Mutationsstelle keine gravierende Veränderung erkennen. Auch die katalytisch relevante Ca2+-Bindungsaffinität bleibt unbeeinflusst; dennoch zeigen Enzymaktivitätstests für VA-Mutanten eine Reduktion der enzymatischen Aktivität um fast 50 % an. Die evolutionär konservierte Helixwindung im Allgemeinen und die in ihr enthaltene Disulfidbrücke im Besonderen müssen nach den vorliegenden Ergebnissen also eine zentrale Funktion sowohl für die Struktur des katalytischen Zentrums als auch für die Strukturbildung der β-Helix während der Faltungsreaktion besitzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit finden in mehreren Punkten Anklang an Faltungseigenschaften, die für andere β -Helixproteine beschrieben wurden. Vor allem aber prädestinieren sie Pel-15 als ein neues, β-helikales Modellprotein. Aufgrund seiner einfachen Topologie, seiner niedrigen Windungszahl und seiner hohen thermodynamischen Stabilität ist Pel-15 sehr gut geeignet, die Determinanten von Stabilität und Strukturbildung des parallelen β-Helix-Motivs in einer Auflösung zu studieren, die aufgrund der Komplexität bestehender β-helikaler Modellsysteme bislang nicht zur Verfügung stand.
Die Hybridomtechnik zur Produktion von monoklonalen Antikörpern ermöglichte einen großen Schritt in der Entwicklung von Immunoassays für die biochemische Forschung und klinische Diagnostik. Auch die Produktion von Antikörpern gegen niedermolekulare Analyten, Haptene, typische Targets in der Lebensmittel- und Umweltanalytik, erlangte in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung. Im Zuge der Durchführung der Hybridomtechnik werden tausende Antikörper-sezernierende und nicht-sezernierende Zellen generiert. Die Selektion der wenigen antigenselektiven Hybridomzellen zählt dabei zu den herausforderndsten Schritten für die Antikörpergewinnung. Bisherige Selektionsverfahren, wie die Limiting-Dilution-Klonierung in Verbindung mit Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs), garantieren keine Monoklonalität und erlauben nur das Screening von einigen wenigen Zellklonen. Hingegen ermöglichen Hochdurchsatz-Selektionsmethoden, wie die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), einen sehr hohen Probendurchsatz. Eine Einzelzellablage garantiert hierbei Monoklonalität. Jedoch sind die dafür erforderlichen Zellmarkierungen oftmals zellschädigend oder aufwendig zu generieren. Auch ist bisher noch keine Markierungsmethode bekannt, die es ermöglicht, Hapten-selektive Hybridomzellen durchflusszytometrisch zu analysieren und eine FACS-Selektion durchzuführen.
Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zwei Zellmarkierungsmethoden entwickelt, die dies ermöglichen sollten. Die membranständigen Antikörper von Hybridomzellen sollten entweder direkt oder indirekt immunfluoreszenz-markiert und dadurch für die Durchflusszytometrie und FACS-Selektion zugänglich gemacht werden. Die direkte Markierung wurde mittels eines Hapten-Fluorophor-Konjugats durchgeführt. Sie ermöglichte erstmalig den Anteil an Haptenselektiven Hybridomzellen in einer Hybridomzelllinie zu überprüfen. Dies konnte für zwei Hapten-selektive Hybridomzelllinien, die Antikörper gegen das Hormon 17β-Estradiol und das Cardenolid Digoxigenin bilden, gezeigt werden. Durchflusszytometrie und ELISAs lieferten vergleichbare Ergebnisse. Zellen, die Hapten-selektiv markiert werden konnten, sezernierten ebenfalls Hapten-selektive Antikörper. Des Weiteren konnte die direkte Markierung dazu genutzt werden, zwei Mykotoxin-selektive Hybridomzelllinien, welche Antikörper gegen Aflatoxin und Zearalenon bilden, auf Monoklonalität zu testen. Dies ist mittels ELISA nicht möglich. Die Markierungsmethode eignete sich jedoch nur für fixierte Hybridomzellen. Eine Markierung von lebenden Zellen konnte weder durchflusszytometrisch noch mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie gezeigt werden.
Dies gelang erst mit einer neu entwickelten indirekten Immunfluoreszenzmarkierung. Dabei wurden die Zellen zunächst mit einem Hapten-Peroxidase-Konjugat inkubiert, gefolgt von einem Fluorophor-markierten anti-HRP-Antikörper-Konjugat. Dies wurde für zwei Analyten, das Hormon Estron und das Antiepileptikum Carbamazepin, gezeigt. Die indirekte Markierung wurde erfolgreich dazu verwendet, Carbamazepin-selektive Hybridomzellen aus einem Fusionsansatz für die monoklonale Antikörperproduktion auszusortieren. Damit wurde erstmalig eine Zellmarkierungsmethode entwickelt, die eine Hochdurchsatz-Selektion lebender Hybridomzellen aus einem Fusionsansatz ermöglicht. Sie ist nicht zellschädigend und kann zusätzlich zur Selektion Hapten-selektiver Plasmazellen verwendet werden.
Die Natur unterliegt ständigen Veränderungen und befindet sich nur vermeintlich in einem Gleichgewicht. Umweltparameter wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit oder Sonneneinstrahlung schwanken auf einer Zeitskala von Sekunden bis Jahrmillionen und beinhalten teils beträchtliche Unterschiede. Mit diesen Umweltveränderungen müssen sich Arten als Teil eines Ökosystems auseinandersetzen. Für Ökologen ist interessant, wie sich individuelle Reaktionen auf die Umweltveränderungen im dynamischen Verhalten einer ganzen Population bemerkbar machen und ob deren Verhalten vorhersagbar ist. Der Demografie einer Population kommt hierbei eine entscheidende Rolle zu, da sie das Resultat von Wachstums- und Sterbeprozessen darstellt. Eben jene Prozesse werden von der Umwelt maßgeblich beeinflusst. Doch wie genau beeinflussen Umweltveränderungen das Verhalten ganzer Populationen? Wie sieht das vorübergehende, transiente Verhalten aus? Als Resultat von Umwelteinflüssen bilden sich in Populationen sogenannte Kohorten, hinsichtlich der Zahl an Individuen überproportional stark vertretene Alters- oder Größenklassen. Sterben z.B. aufgrund eines außergewöhnlich harten Winters, die alten und jungen Individuen einer Population, so besteht diese anschließend hauptsächlich aus Individuen mittleren Alters. Sie wurde sozusagen synchronisiert. Eine solche Populationen neigt zu regelmäßigen Schwankungen (Oszillationen) in ihrer Dichte, da die sich abwechselnden Phasen der individuellen Entwicklung und der Reproduktion nun von einem Großteil der Individuen synchron durchschritten werden. D.h., mal wächst die Population und mal nimmt sie entsprechend der Sterblichkeit ab. In Experimenten mit Phytoplankton-Populationen konnte ich zeigen, dass dieses oszillierende Verhalten mit dem in der Physik gebräuchlichen Konzept der Synchronisation beschrieben werden kann. Synchrones Verhalten ist eines der verbreitetsten Phänomene in der Natur und kann z.B. in synchron schwingenden Brücken, als auch bei der Erzeugung von Lasern oder in Form von rhythmischem Applaus auf einem Konzert beobachtet werden. Wie stark die Schwankungen sind, hängt dabei sowohl von der Stärke der Umweltveränderung als auch vom demografischen Zustand der Population vor der Veränderung ab. Zwei Populationen, die sich in verschiedenen Habitaten aufhalten, können zwar gleich stark von einer Umweltveränderung beeinflusst werden. Die Reaktionen im anschließenden Verhalten können jedoch äußerst unterschiedlich ausfallen, wenn sich die Populationen zuvor in stark unterschiedlichen demografischen Zuständen befanden. Darüber hinaus treten bestimmte, für das Verhalten einer Population relevante Mechanismen überhaupt erst in Erscheinung, wenn sich die Umweltbedingungen ändern. So fiel in Experimenten beispielsweise die Populationsdichte um rund 50 Prozent ab nachdem sich die Ressourcenverfügbarkeit verdoppelte. Der Grund für dieses gegenintuitive Verhalten konnte mit der erhöhten Aufnahme von Ressourcen erklärt werden. Damit verbessert eine Algenzelle zwar die eigene Konstitution, jedoch verzögert sich dadurch die auch die Reproduktion und die Populationsdichte nimmt gemäß ihrer Verluste bzw. Sterblichkeit ab. Zwei oder mehr räumlich getrennte Populationen können darüber hinaus durch Umwelteinflüsse synchronisiert werden. Dies wird als Moran-Effekt bezeichnet. Angenommen auf zwei weit voneinander entfernten Inseln lebt jeweils eine Population. Zwischen beiden findet kein Austausch statt – und doch zeigt sich beim Vergleich ihrer Zeitreihen eine große Ähnlichkeit. Das überregionale Klima synchronisiert hierbei die lokalen Umwelteinflüsse. Diese wiederum bestimmen das Verhalten der jeweiligen Population. Der Moran-Effekt besagt nun, dass die Ähnlichkeit zwischen den Populationen jener zwischen den Umwelteinflüssen entspricht, oder geringer ist. Meine Ergebnisse bestätigen dies und zeigen darüber hinaus, dass sich die Populationen sogar ähnlicher sein können als die Umwelteinflüsse, wenn man von unterschiedlich stark schwankenden Einflüssen ausgeht.
Effekte einer reduzierten Dosis von Pflanzenschutzmitteln auf tritrophische Systeme im Ackerbau
(2007)
Chemische Pflanzenschutzmittel (PSM) bekämpfen nicht nur Schadorganismen, sondern haben aufgrund ihrer hohen Toxizität auch negative Auswirkungen auf Nicht-Ziel-Organismen. Die Fragestellung der Arbeit war es, ob mit reduzierten Anwendungen von PSM ihr Gefährdungspotenzial für Prädatoren von Schädlingen verringert und dadurch das Potenzial der natürlichen Schädlingsregulation erhöht wird. In dreijährigen Freilanduntersuchungen wurden die Effekte einer dauerhaft reduzierten Dosis von chemischen PSM auf die ökologische Situation im Ackerbau anhand von drei Fallbeispielen in einem konventionell bewirtschafteten Betrieb in der Magdeburger Börde untersucht. Drei über 15 ha große Felder wurden dauerhaft in zwei Teilflächen geteilt, wobei eine Teilfläche mit der vom Landwirt gewünschten Dosis (100 %-Variante) und die andere mit jeweils genau der halben Dosis (50 %-Variante) behandelt wurde. Mittels dieser Halbfelder-Vergleiche wurden die ökologischen Situationen bezüglich des Auftretens von Blattläusen und ihren Prädatoren sowie Unkräutern vor und nach der jeweiligen PSM-Behandlung aufgenommen und ökonomische Parameter ermittelt. Ergänzend wurden im Labor Modellgefäßversuche mit abgestuften Dosierungen von Insektiziden und Herbiziden durchgeführt. Die Insektizidbehandlung übte einen großen Einfluss auf die Blattläuse und ihre Prädatoren aus, während alle vorherigen Herbizid- und Fungizidbehandlungen zu keinen Unterschieden in der Abundanz der Blattläuse und ihrer Prädatoren zwischen beiden Varianten hervorriefen. Die reduzierte Insektiziddosis führte zu keiner guten Blattlauskontrolle, während die Abundanz der blattlausspezifischen Prädatoren positiv beeinflusst wurde. Die Araneae reagierten auf die reduzierte Dosis mit einer teilweise erhöhten Aktivitätsdichte und Artendiversität. Dagegen waren diesbezüglich keine eindeutigen Effekte auf die Carabidae festzustellen. Es traten keine strukturellen Veränderungen in Form einer erhöhten Unkrautdichte durch die reduzierte Herbiziddosis auf. Erste Hinweise auf mögliche langfristige Auswirkungen einer dauerhaft reduzierten PSM-Anwendung konnten nur bei der Verunkrautung und der Aktivitätsdichte der Araneae beobachtet werden. Blattläuse profitierten demnach mehr von der reduzierten Anwendung der PSM als ihre Prädatoren, so dass zwar das Potenzial der natürlichen Blattlausregulation erhöht, die Selbstregulation aber nicht verbessert wurde. Die geschonten Prädatoren schafften es nicht, die vorhandene Restpopulation der Blattläuse zu reduzieren. Dagegen konnte in den Laborversuchen gezeigt werden, das schon bei deutlich reduzierten Insektiziddosen eine ausreichende Blattlausbekämpfung möglich ist und eine weitere Einsparung durch Ausnutzung der natürlichen Regulation durch Prädatoren erreicht werden kann. Allerdings ist eine Übertragung der Ergebnisse von Laboruntersuchungen auf Freilandbedingungen schwierig. Es kann zu einer Überschätzung der Prädatorleistung führen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Auswirkungen von Glucose- und Lipidtoxizität auf die Funktion der β-Zellen von Langerhans-Inseln in einem diabetesresistenten (B6.V-Lepob/ob, ob/ob) sowie diabetessuszeptiblen (New Zealand Obese, NZO) Mausmodell zu untersuchen. Es sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zum Untergang der β-Zellen in der NZO-Maus führen bzw. zum Schutz der β-Zellen der ob/ob-Maus beitragen. Zunächst wurde durch ein geeignetes diätetisches Regime in beiden Modellen durch kohlenhydratrestriktive Ernährung eine Adipositas(Lipidtoxizität) induziert und anschließend durch Fütterung einer kohlenhydrathaltigen Diät ein Zustand von Glucolipotoxizität erzeugt. Dieses Vorgehen erlaubte es, in der NZO-Maus in einem kurzen Zeitfenster eine Hyperglykämie sowie einen β-Zelluntergang durch Apoptose auszulösen. Im Vergleich dazu blieben ob/ob-Mäuse längerfristig normoglykämisch und wiesen keinen β-Zelluntergang auf. Die Ursache für den β-Zellverlust war die Inaktivierung des Insulin/IGF-1-Rezeptor-Signalwegs, wie durch Abnahme von phospho-AKT, phospho-FoxO1 sowie des β-zellspezifischen Transkriptionsfaktors PDX1 gezeigt wurde. Mit Ausnahme des Effekts einer Dephosphorylierung von FoxO1, konnten ob/ob-Mäuse diesen Signalweg aufrechterhalten und dadurch einen Verlust von β-Zellen abwenden. Die glucolipotoxischen Effekte wurden in vitro an isolierten Inseln beider Stämme und der β-Zelllinie MIN6 bestätigt und zeigten, dass ausschließlich die Kombination hoher Glucose und Palmitatkonzentrationen (Glucolipotoxizität) negative Auswirkungen auf die NZO-Inseln und MIN6-Zellen hatte, während ob/ob-Inseln davor geschützt blieben. Die Untersuchung isolierter Inseln ergab, dass beide Stämme unter glucolipotoxischen Bedingungen keine Steigerung der Insulinexpression aufweisen und sich bezüglich ihrer Glucose-stimulierten Insulinsekretion nicht unterscheiden. Mit Hilfe von Microarray- sowie immunhistologischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass ausschließlich ob/ob-Mäuse nach Kohlenhydratfütterung eine kompensatorische transiente Induktion der β-Zellproliferation aufwiesen, die in einer nahezu Verdreifachung der Inselmasse nach 32 Tagen mündete. Die hier erzielten Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass der β-Zelluntergang der NZO-Maus auf eine Beeinträchtigung des Insulin/IGF-1-Rezeptor-Signalwegs sowie auf die Unfähigkeit zur β- Zellproliferation zurückgeführt werden kann. Umgekehrt ermöglichen der Erhalt des Insulin/IGF-1-Rezeptor-Signalwegs und die Induktion der β-Zellproliferation in der ob/ob-Maus den Schutz vor einer Hyperglykämie und einem Diabetes.
Im Hinblick auf die Problematik der Umweltverschmutzung durch die Nutzung fossiler Brennstoffe ist es nötig, eine langfristig stabile und umweltfreundliche Energieversorgung zu gewährleisten. Eine Möglichkeit, den Energiebedarf CO2-neutral zu decken, ist die Nutzung von Biogas. Hierbei spielt der Einsatz von biogenen Reststoffen, die durch einen hohen Anteil an Kohlenhydraten, Fetten und Proteinen gekennzeichnet sind und daher ein hohes Biogaspotential besitzen, eine wichtige Rolle. Voraussetzung für die Effizienz und Rentabilität solcher Anlagen ist u. a. ein stabiler Gasbildungsprozess. Da bisher noch nicht alle Aspekte der Biogasbildung vollständig verstanden sind, werden die Anlagen oft nicht optimal ausgelastet, um Prozessstörungen wie z. B. Übersäuerung zu vermeiden.
Um dennoch auftretende Prozessstörungen zu beheben, können unterschiedliche Maßnahmen durchgeführt werden. Neben der Senkung der Raumbelastung, ist es möglich, den pH-Wert durch die Zugabe von Natronlauge oder Calciumoxid anzuheben.
In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl Prozessstörungen als auch Prozessregenerierungen an einer großtechnischen Biogasanlage und in Laborversuchen untersucht. Dabei galt es, neben den physikalischen und chemischen Parametern, die mikrobielle Biozönose mit Hilfe des genetischen Fingerprintings zu charakterisieren und Änderungen zu detektieren.
Während der Prozessregenerierungen wurden nach der Zugabe von CaO Veränderungen des Gärrestes beobachtet. Es bildeten sich Pellets, die im Hinblick auf ihre Funktion für die Prozessregenerierung und die Prozessstabilität molekularbiologisch und mikroskopisch untersucht wurden. Es wurde weiterhin der Frage nachgegangen, welche Rolle die Mikroorganismen bei der Entstehung der Pellets spielen.
Die vor allem aus Calcium und Fettsäuren bestehenden Pellets dienten als Aufwuchsflächen für verschiedene Mikroorganismen. Die Bildung von Biofilmen, wie sie auf und in den Pellets nachgewiesen wurde, bot für Mikroorganismen einen Schutz vor negativen Umwelteinflüssen wie z. B. hohe Propionsäurekonzentrationen. Unter diesen günstigen Bedingungen war die Bildung von Biogas auch unter hohen Wasserstoffpartialdrücken, die den Abbau von Propionsäure hemmten, möglich. Als Indikator für bessere Lebensbedingungen wurde im Laborversuch ein Methanoculleus receptaculi-verwandter Organismus identifiziert. Dieses methanogene Archaeon wurde im Pellet nachgewiesen, während es im Gärrest erst nach der Prozessregenerierung detektiert wurde. Der Nachweis eines im Vergleich zum umgebenden Gärrest höheren Anteils an Archaeen im Kern der Pellets sowie von Biofilmen/EPS, verschiedenen Phosphatsalzen und schwerlöslichen Calciumsalzen zeigte, dass sowohl Präzipitation und Adsorption als auch Degradation von LCFA dazu führen, dass deren Konzentration im flüssigen Gärrest gesenkt wird. Dadurch nimmt die Hemmung auf die Biozönose ab und die Biogasbildungsrate steigt. Daher ist der Abbau der Fettsäuren auch bei einem niedrigen pH-Wert und unter hohen Wasserstoffpartialdrücken möglich und der Biogasbildungsprozess ist langfristig stabil. Die Bildung von Pellets unterstützt die Prozessstabilität, sofern diese nicht zu groß werden und dann u. a. die Durchmischung behindern und den Ablauf verstopfen.
Nach erfolgreicher Prozessstabilisierung wurden keine Pellets im Gärrest beobachtet. Der Abbau des organischen Materials wurde sowohl durch die steigende Calciumkonzentration als auch die steigende Gasproduktion angezeigt.
In dieser Arbeit wird die Entwicklung und Charakterisierung neuer „smarter“ Redoxhydrogele mit drei verschiedenen funktionellen Eigenschaften und deren erfolgreicher Einsatz zur elektrochemischen Kontaktierung von Oxidoreduktasen beschrieben. Diese neuen Redoxpolymere 1. tragen kovalent integrierte Redoxzentren umgeben von einer hydrophilen Polymermatrix, 2. reaktive Kopplungsgruppen für den Aufbau selbstassemblierter Polymerschichten auf Elektrodenoberflächen und 3. lassen sich in ihrer Redoxaktivität durch Verwendung „intelligenter“ Polymere über externe Stimuli kontrollieren. Die Redoxhydrogele wurden nach dem Vorbild eines Baukastensystems in einfachen Ein-Stufen-Synthesen synthetisiert. Dazu wurden verschiedene Redoxzentren (Ferrocen, 1,10-Phenanthrolin-5,6-dion und 4-Carboxy-2,5,7-Trinitro-9-fluorenon), reaktive Kopplungsgruppen (Epoxy-, Amino-, Thiol- oder Disulfidfunktionen) und Polymermatrices (Poly-(N-Isopropylacrylamid) (PNIPAM) und Poly(ethylenglykolmethacrylat) (PEGMA)) in unterschiedlichen Zusammensetzungen miteinander copolymerisiert. Die Polymere wurden in Form von dünnen Polymerfilmen über die wiederholenden Funktionalitäten auf Elektrodenoberflächen aufgebracht und physiko- und elektrochemisch charakterisiert. Durch die erstmals gezeigte, derartige Ankopplung der Polymere, entstehen dreidimensionale, hydrophile selbstassemblierte Polymerschichten. Die Elektronentransferwege sind kurz und der Elektronentransfer effizient. Diese Polymer-modifizierten Elektroden wurden für die Kontaktierung von zwei exemplarisch ausgewählten Oxidoreduktasen eingesetzt, die Nicotinsäureamid-adenin-dinucleotid-abhängige Glucosedehydrogenase (NAD-GDH), welche ein freibewegliches Coenzym und die Pyrrolochinolinchinon-abhängige Glucosedehydrogenase (PQQ-GDH), welche ein prosthetisches Coenzym verwenden. Die Redoxaktivitäten des PNIPAMFoxy- und PEGMA-Fc-Polymers ließen sich durch externe Stimuli in Form von Temperatur und Calciumkonzentrationen kontrollieren. Ein Modell für die Komplexierung der Calciumionen durch die PEG-Seitenketten unter Ausbildung Kronenether-ähnlicher Strukturen und der daraus resultierenden Steigerung des Elektronentransfers wurde gezeigt.
Im Rahmen der Untersuchung zur Entwicklung der pelagischen Gemeinschaft des ehemals sauren Tagebauseenkomplexes Goitsche (pH~3) während dessen Flutung und Neutralisierung wurden Wechselwirkungen zwischen der Zusammensetzung von Organismengemeinschaften und der Variabilität des abiotischen Umfeldes untersucht.Im Mittelpunkt standen zwei von ihrer Kausalität her unterschiedliche Aspekte: • Der erste Aspekt betraf die Reifung von Ökosystemen: War der Reifungsprozess von pelagischen Gemeinschaften anhand der von Odum (1969) formulierten Kriterien zur Energetik der Gemeinschaft, zu den Nährstoffkreisläufen sowie zu strukturellen Merkmalen auf Ökosystem- und Individuenebene zu erfassen? Führten der physiologische Stress durch den niedrigen pH und physikalische Störungen der Schichtung durch das einströmende Flutungswasser zu einer Umkehr des Reifungsprozesses? Auf welchen Organisationsebenen der Lebensgemeinschaften waren die Auswirkungen dieser Stressoren erkennbar? • Der zweite Aspekt behandelte die Entwicklung der Artenzahl, die Gleichverteilung der Dominanz von Arten (Eveness) und die Diversität von Planktongemeinschaften entlang des Produktivitätsgradienten. Speziell wurde untersucht, ob die Artenzahl und die Diversität eine monoton positive oder eine unimodale Funktion der Produktivität waren und ob die Eveness eine monoton abnehmende Funktion der Produktivität war. Zur besseren Vorhersagbarkeit der Entwicklung dieser Indizes wurden in einem nächsten Schritt zusätzliche biotische und abiotische Faktoren (z.B. Konsumenteneffekte, physikalische Störung, Immigration) berücksichtigt. Zuletzt wurde die Hypothese getestet, dass unter dem Einfluss von extremem physiologischem Stress keine Abhängigkeit zwischen den betrachteten Indizes und der Produktivität von Ökosystemen besteht. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit führten zu folgenden Ergebnissen und Schlussfolgerungen: 1) Der Reifungsprozess der Planktongemeinschaft war unter neutralen Bedingungen nicht eindeutig an einzelnen Kriterien festzumachen. Vielmehr schienen idiosynkratische Effekte einzelner Arten auf die Zusammensetzung und Funktion der Organismengemeinschaft von Bedeutung. Coenobiumbildende Kieselalgen sowie größere Cladoceren und Copepoden dominierten sehr rasch die Planktongemeinschaft und vermittelten den Eindruck eines reifen Ökosystems fast unmittelbar nach der Neutralisierung des Tagebausees. 2) Der Einfluss von physiologischem Säurestress und physikalischer Störung der Schichtung durch das eintretende Flutungswasser war gegenüber einem neutralen, ungestörten Teilbecken des Tagebausees (Referenzzustand) eindeutig zu erkennen. Die isolierte Betrachtung der Wirkung der Stressoren lieferte hinsichtlich fast aller Kriterien Anzeichen einer Verjüngung des Systems sensu Odum (1969, 1985). 3) Im betrachteten Ökosystem existierte eine Hierarchie innerhalb der Stressoren. Der Einfluss des Säurestresses dominierte gegenüber dem Einfluss der physikalischen Störung, wahrscheinlich indem er die Reaktionsmöglichkeiten der Planktongemeinschaft einschränkte. 4) Für Primärproduzenten war die Artenzahl eine monoton positive Funktion der realisierten Biomasse (einem Surrogatparameter für die Produktivität des Systems). Die Eveness war eine monoton negative Funktion der Produktivität. Die beobachtete unimodale Beziehung zwischen der Diversität und der Produktivität der Primärproduzenten muss als eine Folge der mathematischen Formulierung dieser Indizes betrachtet werden. 5) Die Ergebnisse multivariater Modelle zur Vorhersage der Artenzahl und der Eveness der Primärproduzenten in Abhängigkeit zusätzlicher erfassbarer biotischer und abiotischer Faktoren ermöglichten eine differenziertere Betrachtung der Ergebnisse: • Im Tagebausee Goitsche war die Eveness hauptsächlich von dichteabhängigen Prozessen gesteuert (negative Abhängigkeit zum Quadrat der Biomassen und zu den Lichtverhältnissen). • Die Entwicklung der Artenzahl war neben dem primären Einfluss der zunehmenden Biomasse auch durch qualitative und quantitative Aspekte der Konsumentengemeinschaft (Diversität und Biomasse des Zooplanktons) beeinflusst. Der Einfluss einer erhöhten Immigration auf die Artenzahl wurde nur zu Beginn der Flutung des Tagebausees beobachtet. 6) Auf Ebene der Konsumenten war die einzige eindeutig feststellbare Abhängigkeit ein Anstieg der Artenzahl mit steigender Biomasse. Das Fehlen von weiteren Beziehungen zwischen Diversitätsindizes und dem Produktivitätsgradienten wird darauf zurückgeführt, dass auf den unteren trophischen Ebenen der Primärproduzenten Ressourceneffekte (Bottom-Up) stärker ausgeprägt sind, wohingegen auf höheren trophischen Ebenen Konsumenteneffekte (Top-Down) dominieren. 7) In durch physiologischen Stress beeinflussten Systemen bestand keine Abhängigkeit zwischen den Diversitätsindizes (Artenzahl, Eveness und Diversität) und der Produktivität.
Die aktuelle COVID-19-Pandemie zeigt deutlich, wie sich Infektionskrankheiten weltweit verbreiten können. Neben Viruserkrankungen breiten sich auch multiresistente bakterielle Erreger weltweit aus. Dementsprechend besteht ein hoher Bedarf, durch frühzeitige Erkennung Erkrankte zu finden und Infektionswege zu unterbrechen.
Herkömmliche kulturelle Verfahren benötigen minimalinvasive bzw. invasive Proben und dauern für Screeningmaßnahmen zu lange. Deshalb werden schnelle, nichtinvasive Verfahren benötigt.
Im klassischen Griechenland verließen sich die Ärzte unter anderem auf ihren Geruchssinn, um Infektionen und andere Krankheiten zu differenzieren. Diese charakteristischen Gerüche sind flüchtige organische Substanzen (VOC), die im Rahmen des Metabolismus eines Organismus entstehen. Tiere, die einen besseren Geruchssinn haben, werden trainiert, bestimmte Krankheitserreger am Geruch zu unterscheiden. Allerdings ist der Einsatz von Tieren im klinischen Alltag nicht praktikabel. Es bietet sich an, auf technischem Weg diese VOCs zu analysieren.
Ein technisches Verfahren, diese VOCs zu unterscheiden, ist die Ionenmobilitätsspektrometrie gekoppelt mit einer multikapillaren Gaschromatographiesäule (MCC-IMS). Hier zeigte sich, dass es sich bei dem Verfahren um eine schnelle, sensitive und verlässliche Methode handelt.
Es ist bekannt, dass verschiedene Bakterien aufgrund des Metabolismus unterschiedliche VOCs und damit eigene spezifische Gerüche produzieren. Im ersten Schritt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die verschiedenen Bakterien in-vitro nach einer kurzen Inkubationszeitzeit von 90 Minuten anhand der VOCs differenziert werden können. Hier konnte analog zur Diagnose in biochemischen Testreihen eine hierarchische Klassifikation der Bakterien erfolgen.
Im Gegensatz zu Bakterien haben Viren keinen eigenen Stoffwechsel. Ob virusinfizierte Zellen andere VOCs als nicht-infizierte Zellen freisetzen, wurde an Zellkulturen überprüft. Hier konnte gezeigt werden, dass sich die Fingerprints der VOCs in Zellkulturen infizierter Zellen mit Respiratorischen Synzytial-Viren (RSV) von nicht-infizierten Zellen unterscheiden.
Virusinfektionen im intakten Organismus unterscheiden sich von den Zellkulturen dadurch, dass hier neben Veränderungen im Zellstoffwechsel auch durch Abwehrmechanismen VOCs freigesetzt werden können.
Zur Überprüfung, inwiefern sich Infektionen im intakten Organismus ebenfalls anhand VOCs unterscheiden lassen, wurde bei Patienten mit und ohne Nachweis einer Influenza A Infektion als auch bei Patienten mit Verdacht auf SARS-CoV-2 (Schweres-akutes-Atemwegssyndrom-Coronavirus Typ 2) Infektion die Atemluft untersucht. Sowohl Influenza-infizierte als auch SARS-CoV-2 infizierte Patienten konnten untereinander und von nicht-infizierten Patienten mittels MCC-IMS Analyse der Atemluft unterschieden werden.
Zusammenfassend erbringt die MCC-IMS ermutigende Resultate in der schnellen nichtinvasiven Erkennung von Infektionen sowohl in vitro als auch in vivo.
Weltweit streben Anti-Doping Institute danach jene Sportler zu überführen, welche sich unerlaubter Mittel oder Methoden bedienen. Die hierfür notwendigen Testsysteme werden kontinuierlich weiterentwickelt und neue Methoden aufgrund neuer Wirkstoffe der Pharmaindustrie etabliert. Gegenstand dieser Arbeit war es, eine parallele Mehrkomponentenanalyse auf Basis von Antigen-Antikörper Reaktionen zu entwickeln, bei dem es primär um Verringerung des benötigten Probevolumens und der Versuchszeit im Vergleich zu einem Standard Nachweis-Verfahren ging. Neben der Verwendung eines Multiplex Ansatzes und der Mikroarraytechnologie stellten ebenfalls die Genauigkeit aller Messparameter, die Stabilität des Versuchsaufbaus sowie die Performance über einen Einfach-Blind-Ansatz Herausforderungen dar. Die Anforderung an den Multiplex Ansatz, keine falschen Signale trotz ähnlicher Strukturen zu messen, konnte durch die gezielte Kombination von spezifischen Antikörpern realisiert werden. Hierfür wurden neben Kreuzreaktivitätstests auf dem Mikroarray parallel erfolgreich Western Blot Versuche durchgeführt. Jene Antikörper, welche in diesen Versuchen die gesetzten Anforderungen erfüllten, wurden für das Ermitteln der kleinsten nachweisbaren Konzentration verwendet. Über das Optimieren der Versuchsbedingungen konnte unter Verwendung von Tween in der Waschlösung sowohl auf Glas als auch auf Kunststoff die Hintergrundfluoreszenz reduziert und somit eine Steigerung des Signal/Hintergrundverhältnisses erreicht werden. In den Versuchen zu Ermittlung der Bestimmungsgrenze wurde für das humane Choriongonadotropin (hCG-i) eine Konzentration von 10 mU/ml, für dessen beta-Untereinheit (hCG-beta) eine Konzentration von 3,6 mU/ml und für das luteinisierende Hormon (LH) eine Konzentration von 10 mU/ml bestimmt. Den ermittelten Wert im Serum für das hCG-i entspricht dem von der Welt-Anti-Dopin-Agentur (WADA) geforderten Wert in Urin von 5 mU/ml. Neben der Ermittlung von Bestimmungsgrenzen wurden diese hinsichtlich auftretender Matrixeffekte in Serum und Blut gemessen. Wie aus den Versuchen zur Ermittlung von Kreuzreaktivitäten auf dem Mikroarray zu entnehmen ist, lassen sich das LH, das hCG-i und hCG-β ebenfalls in Serum und Blut messen. Die Durchführung einer Performance-Analyse über einem Einfach-Blind-Ansatz mit 130 Serum Proben, wurde ebenfalls über dieses System realisiert. Die ausgewerteten Proben wurden anschließend über eine Grenzwertoptimierungskurve analysiert und die diagnostische Spezifität ermittelt. Für die Messungen des LH konnte eine Sensitivität und Spezifität von 100% erreicht werden. Demnach wurden alle negativen und positiven Proben eindeutig interpretiert. Für das hCG-β konnte ebenfalls eine Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 97% erreicht werden. Die hCG-i Proben wurden mit einer Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 97,5% gemessen. Um den Nachweis zu erbringen, dass dieser Versuchsaufbau über mehrere Wochen stabile Signale bei Vermessen von identischen Proben liefert, wurde ein über zwölf Wochen angesetzter Stabilitätstest für alle Parameter erfolgreich in Serum und Blut durchgeführt. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erfolgreich eine Mehrkomponentenanalyse als Multiplex Ansatz auf einem Mikroarray entwickelt werden. Die Durchführung der Performance-Analyse und des Stabilitätstests zeigen bereits die mögliche Einsatzfähigkeit dieses Tests im Kontext einer Dopinganalyse.
In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines bifunktionellen Biosensors nach dem Vorbild eines Baukastensystems beschrieben. Das Ziel wird durch die Kombination verschiedenster molekularer Erkennungselemente erreicht. Solche molekularen Erkennungselemente im verwendeten System sind: • Propidium und die periphere anionische Bindungsstelle der Acetylcholinesterase (AChE) • Organophosphate und das aktive Zentrum der AChE • ein an die AChE gekoppeltes Hapten und das Epitop eines Antikörpers • ein an die AChE gekoppeltes Hapten, das als Ligand ein weiteres Enzym bindet Neben dem molekularen Erkennungselement wird ein Biosensor ebenso durch die Art des Transducers charakterisiert. Hier werden Quarzplättchen mit Goldelektroden zur Signalumwandlung eingesetzt. Die Verwendung solcher Sensoren mit einem EQCM-Gerät (electrochemical quartz crystal microbalance) ermöglicht es zwei Messsignale gleichzeitig aufzunehmen: die piezoelektrische Bestimmung einer Massebeladung und die amperometrische Detektion von Enzymaktivität auf der Sensoroberfläche. Für die Analytik stehen somit zwei verschiedene Assay-Varianten zur Verfügung: die Bestimmung der Inhibition der ACHE-Aktivität und ein Bindungstest über das Hapten. Die Basis beider Tests ist die Modifizierung der piezoelektrischen Kristalle mit Propidium – einem reversiblen Inhibitor der Acetylcholinesterase. Dies ermöglicht die Beladung des Sensors mit AChE über die Wechselwirkung mit der peripheren anionischen Bindungsstelle des Enzyms. Die Aktivität der so immobilisierten AChE und die Inhibition durch Organophosphate (Pestizide) werden amperometrisch bestimmt. Durch die chemische Kopplung eines Hapten an die Cholinesterase wird ein weiteres Erkennungselement eingeführt. Das eröffnet die Möglichkeit, an die auf dem Propidium-modifizierten Sensor immobilisierte, haptenisierte Cholinesterase einen Antikörper zu binden. Als Voraussetzung für elektrochemische Bestimmung der AChE-Aktivität wurde zunächst die Optimierung der amperometrischen Messmethode vorgenommen. Die Oxidatationspotentiale für die Detektion von Thiocholin wurden im Bereich von 150 mV bis 300 mV variiert. Dabei wurde für die nachfolgenden Untersuchungen eine Arbeitspotential von 200 mV (vs. Ag/AgCl) festgelegt, da hier das beste Verhältnis von gemessenem Oxidationsstrom und Langzeitstabilität der Propidium-modifizierten Sensoren erzielt wurde. Dieses Potential war deutlich geringer als die bisher publizierten Mediator-freien AChE-Biosensoren. Es wurde ein Vergleich verschiedener Organophosphate über ihre Inhibitionskonstanten durchgeführt, um diejenigen herauszufinden, die möglichst schnell mit dem aktiven Zentrum der Acetylcholinesterase reagieren. Das verwendete Messsystem beruht nicht auf der Vorinkubation der AChE und damit einer Einstellung des Inhibitionsgleichgewichts. Stattdessen wurde die Inhibition der AChE direkt im Fließsystem verfolgt. Daher war eine schnelle Inhibitionskinetik für einen empfindlichen Organophosphat-Nachweis erforderlich. Da einige Inhibitoren nur als Phosphothionat vorlagen, wurde die Überführung dieser Substanzen in die entsprechenden Oxo-Formen mittels N-Bromsuccinimid untersucht. Die NBS-Aktivierung wurde erfolgreich durchgeführt, die erwartete Inhibitionsstärke konnte jedoch aufgrund hydrolytischer Vorgänge nicht erreicht werden. Untersuchungen mit Diisopropylfluorophosphat (DFP) und Chlorpyriphos-oxon (CPO) konnten die Voruntersuchungen über die Inhibitionskinetik in Bezug auf die erreichten Nachweisgrenzen von 2E-06 M für DFP und 5E-08 M für CPO bestätigen. Für die chemische Modifizierung der Acetylcholinesterase wurde zunächst 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) als Hapten ausgewählt. 2,4-D wird als Herbizid eingesetzt und in der EU über die Gewässerschutzrichtlinie reguliert. 2,4-D konnte in unterschiedlichen molaren Verhältnissen von 2,6 : 1 bis 260 : 1 (2,4-D : AChE) nach Aktivierung mit einem Norbornendicarboximido-Derivat an die AChE gekoppelt werden. Dabei konnte die spezifische Aktivität der Acetylcholinesterase erhalten und die Bindung eines anti-2,4-D-Antikörpers ermöglicht werden. Zur Verstärkung des piezolelektrischen Signals der Antikörperbindung wurden die Immunoglobuline zunächst an Goldnanopartikel gekoppelt. Damit konnte eine Verstärkung um den Faktor 10 erreicht werden. Allerdings waren die Antikörper-modifizierten Goldnanopartikel nicht langzeitstabil. Daher wurden auch Silica-Nanopartikel als Matrix für die Antikörperkopplung getestet. Mit diesem System konnte eine Verstärkung um den Faktor von 5 bis 13 je nach Grad der Beladung den Nanopartikel mit Antikörper bestimmt werden. Die hohe unspezifische Bindung der Antikörper-Nanopartikel-Konjugate an den Propidium-modifizierten QCM-Sensor konnte keinen empfindlichen 2,4-D-Nachweis ermöglichen. Als Alternative wurde Kokain (Benzoylecgonin, BZE) als Hapten an die Aceytlcholinesterase gekoppelt. Da Kokain selbst auch als Inhibitor im aktiven Zentrum der AChE binden kann, wurden zwei verschiedene Strategien zur Konjugatsynthese verfolgt. Durch Zugabe von Kokain während der Kopplung sollte die kovalente Fixierung des Kokain-Derivats BZE-DADOO im aktiven Zentrum verhindert werden (Konjugat B). In der Tat konnten mit dieser Synthesestrategie 67% der spezifischen Cholinesterase-Aktivität erhalten werden, während im Kokain-freien Ansatz (Konjugat A) nur 2% der Ausgangsaktivität wiedergefunden wurden. Das BZE-AChE-Konjugat ermöglichte auch die Untersuchung der Bindungskinetik der anti-BZE-Antikörper. Dabei konnte eine Assoziationsgeschwindigkeitskonstante ka von 12911 l/(mol•s) berechnet werden. Dieser Wert ist trotz der vergleichsweise geringen Oberflächenbeladung vergleichbar mit den in der Literatur angegebenen Werten. Die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante ist mit 2,89E−3 1/s um den Faktor 30 höher als der Literaturwert. Diese Abweichung ist auf Unterschiede im Bindungsmodell zurückzuführen. Mit beiden BZE-AChE-Konjugaten konnte ein kompetetiver Immunoassay mit Kokain im Fließsystem durchgeführt werden. Dabei zeigte sich für beide Konjugate ein ähnlicher Testmittelpunkt: IC50 = 4,40E−8 mol/l für Konjugat A bzw. IC50 = 1,77E−8 mol/l für Konjugat B. Diese Werte sind vergleichbar zu bereits publizierten Kokainassays im Fließsystem. Wie vorstehend beschrieben, bindet Kokain als Inhibitor auch im aktiven Zentrum von Cholinesterasen. Diese Eigenschaft wurde genutzt, um ein zweites Enzym – Butyrylcholinesterase (BChE) – an die BZE-AChE zu binden. Die Spezifität dieser Bindung konnte durch die Abwesenheit einer Affinität der BChE zum Propidium und durch die Blockierbarkeit der Bindung von BChE und BZE-AChE durch Kokain nachgewiesen werden. Damit konnte erfolgreich die Kombination mehrere molekularer Erkennungselemente demonstriert werden. Die Propidium-Plattform ermöglicht den Aufbau einer Architektur aus verschiedenen Cholinesterasen, die über unterschiedliche Bindungsstellen wechselwirken. Sowohl freie als auch BZE-modifizierte AChE können über die Affinität zum Propidium auf dem EQCM-Sensor immobilisiert werden. Mit Kokain als Substrat der Butyrylcholinesterase kann Benzoylecgonin nicht nur als Epitop für die Bindung eines Antikörpers, sondern auch als Erkennungselement für die BChE genutzt werden. Auf der anderen Seite erschwert die geringe Affinität der BChE im Gegensatz zum anti-BZE-Antikörper den Einsatz dieses Systems für analytische Zwecke. Durch die Verwendung anderer Ligand-Enzym-Kombinationen läßt sich das in dieser Arbeit vorgestellte Konzept noch weiter ausbauen und ermöglicht damit eine Entwicklung ausgehend von „einfachen“ molekularen Erkennungselementen (MRE) hin zu „multifunktionellen“ Erkennungselementsystemen. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass der Aufbau solch komplexe Systeme möglich ist, ohne Abstriche in Bezug auf die Empfindlichkeit der einzelnen Assays hinzunehmen.
In der molekularen Diagnostik besteht ein Bedarf an schnellen und spezifischen Testsystemen, die entweder für die Labordiagnostik oder in Point of Care-Umgebungen eingesetzt werden können. Um dieses Ziel zu erreichen, stehen die Miniaturisierung und Parallelisierung im Mittelpunkt des Forschungsinteresses. Die führende Methode im Bereich der DNA-Analytik ist derzeit die Realtime-PCR. Dieser Technologie sind hinsichtlich der Multiplexfähigkeit technologischen Hürden gesetzt, da derzeit nur eine Analyse von maximal vier Parametern parallel in einem Versuchsansatz erfolgen kann. Microarrays stellen hingegen die benötigten Voraussetzungen zur Verfügung, um als Werkzeuge für die Multiparameteranalyse in verschiedensten Anwendungsbereichen zu dienen. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war es, Multiplex-PCRs und diagnostische Microarrays zu entwickeln, die für analytische Fragestellungen eine schnelle und zuverlässige Multiparameteranalytik ermöglichen, um die bisherigen Einschränkungen aktueller Nachweisverfahren zu vermeiden. Als Anwendungen wurden zum einen ein Nachweissystem für acht relevante Geflügelpathogene zur Überwachung in der Geflügelzucht, zum anderen ein Nachweissystem zur Identifikation potentiell allergener Lebensmittelinhaltstoffe entwickelt. Neben der Entwicklung geeigneter PCR und Multiplex-PCR-Verfahren sowie spezifischer Microarrays für die Detektion der gesuchten Zielsequenzen stand auch die weiterführende Integration von DNA-Amplifikation und Microarray-Technologie im Fokus dieser Arbeit. Die OnChip-Amplifikation stellt eine Möglichkeit dar, um DNA-Analytik und Detektion in einem Reaktionsschritt zu integrieren. Entsprechend wurden die in der Arbeit entwickelten PCR- und Multiplex-PCR-Verfahren zum Nachweis potentieller allergener Lebensmittelinhaltsstoffe für die OnChip-Amplifikation adaptiert und Reaktionsbedingungen getestet, die eine Multiparameteranalyse auf dem Chip ermöglichen. Die entwickelten OnChip-PCR-Verfahren zeigten eine hohe Spezifität sowohl in Single- als auch in der Multiplex-OnChip-PCR. Eine Sensitivität von 10 Kopien bzw. <10ppm konnte in Single-OnChip-PCRs für den Nachweis allergener Lebensmittelinhaltsstoffe gezeigt werden. In Multiplex-OnChip-PCRs konnten 10-100ppm allergene Verunreinigungen spezifisch in unterschiedlichen Lebensmitteln nachgewiesen werden. Ein weiterer Schritt in Richtung einer möglichen Verwendung im Point of Care-Bereich stellt der Einsatz eines isothermalen Amplifikationsverfahrens dar. Vorteil eines solchen Verfahrens ist die Möglichkeit, auf das ansonsten benötigte Thermocycling zu verzichten. Dies vereinfacht eine Integration der OnChip-Amplifikation in mobile Analysegeräte oder Lab on Chip-Systeme und qualifiziert das Verfahren für den Einsatz in Point of Care-Umgebungen. In dieser Arbeit wurde eine noch junge isothermale Amplifikationsmethode, die helikase-abhängige Amplifikation (HDA), hinsichtlich ihrer Eignung für die Integration auf einem Microarray getestet. Hierfür konnte die bislang erste OnChip-HDA für Einzel- und Duplex-Nachweise von Pathogenen entwickelt werden.
Antikörper werden in verschiedensten Bereichen, sowohl zu therapeutischen als auch zu diagnostischen und forschungsorientierten Zwecken verwendet. Vor der Verwendung des Antikörpers bedarf es der Charakterisierung seiner Eigenschaften, in Bezug auf sein Epitop und sein Bindeverhalten gegenüber dem Paratop. Gleichzeitig muss, in Abhängigkeit des Einsatzes, der Antikörper, für den gewünschten Gebrauch, validiert werden. Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit Bead-basierte, multiplexe Testsysteme entworfen, ausgetestet und etabliert mit dem Ziel, eine einfache Screeningmethode zu entwickeln, um eine hohe Anzahl an Proben beziehungsweise Analyten gleichzeitig bestimmen zu können. Dafür wurden drei verschiedene Herangehensweisen etabliert.
So wurden ein phospho-PKA-Substrat Antikörper, welcher phosphorylierte Bindemotive der PKA der Form RRxpS erkennt, gleichzeitig mit einer Reihe an Peptide getestet, welche Punktmutationen im Vergleich zur Konsensussequenz enthielten, um den Einfluss einzelner Aminosäuren auf die Bindung des Antikörpers zu untersuchen. Es konnte im Multiplex gezeigt werden, dass die Unterschiede im Antikörperbindungsverhalten in Abhängigkeit der Aminosäure an verschiedenen P-Positionen detektierbar waren. Mit dem Bead-basierten Multiplexansatz konnten, durch Messungen von Konzentrationsreihen des Antikörpers, Bindungskinetiken aufgenommen und diese mit bereits etablierten Methoden verglichen werden.
Des Weiteren wurden verschiedene Antikörper, welche essenzielle Bestandteile von Bead-basierten Testsystemen darstellten, validiert. Es wurden dabei verschiedene Antikörper, welche spezifisch THC und CBD erkennen ausgetestet und anschließend ein kompetitiver Assay zur Detektion von THC und CBD in humanem Serum etabliert, und die Nachweisgrenzen bestimmt.
Ferner sollten Pferdeseren von Tieren, welche am Sommerekzem leiden, auf ihren IgE-Gehalt hin bestimmt werden. Dafür wurden relevante Proteine rekombinant hergestellt und durch Immobilisierung an Beads im Multiplex mit Serum inkubiert. Die spezifische Bindung des IgE an die Allergen sollte damit messbar gemacht werden können. Für die Gesamtvalidierung des Testsystems wurden zuvor sämtliche Einzelschritte einzeln validiert, um im Anschluss im multiplexen Screening zu vermessen.
Die Nutzung von Bead-basierten Multiplexmessungen als eine Plattformtechnologie erleichtert die Charakterisierung von Antikörpern sowie ihre Validierung für verschiedene Testsysteme.
Ein genereller Ansatz zur Charakterisierung von biologischen Systemen bietet die Untersuchung des Metaboloms, dessen Analyse als „Metabolomics“ bezeichnet wird. “Omics”- Technologien haben das Ziel, ohne Selektionskriterien möglichst alle Bestandteile einer biologischen Probe zu detektieren (identifizieren und quantifizieren), um daraus Rückschlüsse auf nicht vorhersehbare und somit neuartige Korrelationen in biologischen Systemen zu ziehen. Ein zentrales Dogma in der Biologie besteht in der Kausalität zwischen Gen – Enzym – Metabolite. Perturbationen auf einer Ebene rufen systemische Antworten hervor, die in einem veränderten Phänotyp münden können. Metabolite sind die Endprodukte von zellulären regulatorischen Prozessen, deren Abundanz durch die Resonanz auf genetische Modifikationen oder Umwelteinflüsse zurückzuführen ist. Zudem repräsentieren Metabolite ultimativ den Phänotyp eines Organismus und haben die Fähigkeit als Biomarker zu fungieren. Die integrale Analyse verschiedenster Stoffwechselwegen wie Krebszyklus, Pentosephosphatzyklus oder Calvinzyklus offeriert die Identifikation von metabolischen Mustern. In dieser Arbeit wurden sowohl das targeted Profiling via GC-TOF-MS als auch das untargeted Profiling via GC-TOF-MS und LC-FT-MS als analytische Strategien genutzt, um biologische Systeme anhand ihrer Metabolite zu charakterisieren und um physiologische Muster als Resonanz auf endogene oder exogene Stimuli zu erkennen. Dabei standen die metabolische, phänotypische und genotypische Plastizität von Pflanzen im Fokus der Untersuchungen. Metabolische Varianzen eines Phänotyps reflektieren die genotyp-abhängige Resonanz des Organismus auf umweltbedingte Parameter (abiotischer und biotischer Stress, Entwicklung) und können mit sensitiven Metabolite Profiling Methoden determiniert werden. Diese Anwendungen haben unter anderem auch zum Begriff des „Environmental Metabolomics“ geführt. In Kapitel 2 wurde der Einfluss biotischer Interaktionen von endophytischen Bakterien auf den Metabolismus von Pappelklonen untersucht; Kapitel 3 betrachtet die metabolische Plastizität von Pflanzen im Freiland auf veränderte biotische Interaktionsmuster (Konkurrenz/Diversität/Artenzusammensetzung); Abschließend wurde in Kapitel 4 der Einfluss von spezifischen genetischen Modifikationen an Peroxisomen und den daraus resultierenden veränderten metabolischen Fluss der Photorespiration dargestellt. Aufgrund der sensitiven Analyse- Technik konnten metabolische Phänotypen, die nicht zwingend in einen morphologischen Phänotyp mündeten, in drei biologischen Systemen identifiziert und in einen stoffwechselphysiologischen Kontext gestellt werden. Die drei untersuchten biologischen Systeme – in vitro- Pappeln, Grünland- Arten (Arrhenatherion-Gesellschaft) und der Modellorganismus (Arabidopsis) – belegten anschaulich die Plastizität des Metabolismus der Arten, welche durch endogene oder exogene Faktoren erzeugt wurden.
Erucasäure ist eine einfach ungesättigte Fettsäure, die sich in großer Menge im Samen von Raps und anderen Kreuzblütlern findet. Ernährungsphysiologisch gilt sie als problematisch, da sie eine nachweislich schädliche Wirkung auf die Herzmuskulatur hat. Daher wurde sie im Laufe des 20. Jahrhunderts zum größten Teil aus dem Deutschen Winterraps durch Züchtung fast vollständig eliminiert. In einigen Zweigen der Industrie ist sie jedoch weiterhin ein bedeutender Rohstoff. In dieser Arbeit wird die Papierchromatographie als kostengünstige Methode zur Trennung von Fettsäuren vorgestellt, welche auch im Schulunterricht angewendet werden kann. Diese veraltete Methode wurde reaktiviert und für die vorliegenden Zwecke optimiert. Mit Hilfe der hier beschriebenen Papierchromatographie lassen sich sowohl Rapssamen auf ihren qualitativen Gehalt an Erucasäure untersuchen, als auch eine Vielzahl von ungesättigten Fettsäuren in Raps- und auch Leinsamen qualitativ nachweisen. Es ist so möglich erucasäurefreie und erucasäurehaltige Rapssamen auf dem Papier zu unterscheiden. Der Gehalt an Erucasäure, welcher von nur zwei additiv wirkenden Genen gesteuert wird, kann im Schulunterricht z.B. im Themenbereich „Errungenschaften der Pflanzenzüchtung“ als praktisches Beispiels herangezogen werden. Durch die hier beschriebene Methode können die Mendelschen Regeln anhand dieses phänotypischen Merkmals erarbeitet oder vertieft werden. Zudem ermöglicht die praktische Untersuchung von Erucasäure themenübergreifendes Arbeiten im Biologieunterricht, da sie klassische Genetik mit moderner Pflanzenzüchtung verbindet.
Die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode wird auch heute noch als gängige Methode verwendet, vor allem wegen der geringeren Kosten für das Wirkstoffscreening in der pharmazeutischen Forschung, wobei Ionenkanäle sowie einige der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Mehrzahl der Wirkstoffziele ansprechen. Die zellfreie Synthese eukaryotischer Proteine hat nicht die Nachteile, die bei der Überexpression dieser ionenpermeablen Proteine in Zellen auftreten können, wie z. B. Zelltoxizität, geringere Proteinexpression und die Beseitigung der exprimierten Proteine aufgrund veränderter Domänen sowie die zeitaufwändige Pflege von Zelllinien. Die Synthese von Ionenkanälen in zellfreien Proteinsyntheseplattformen für das künftige Wirkstoffscreening ist noch in der Grundlagenforschung. Obwohl die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode in zellbasierten Assays weit verbreitet ist, wurde diese Methode bisher noch nicht in zellfreien Proteinexpressionssystemen verwendet. Insgesamt ist die neue Anwendung der Calcium-Imaging-Methode in eukaryontischen zellfreien Systemen eine Voraussetzung für die schnelle pharmakologische Analyse von Wirkstoffen. Das erste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit bestand darin, die grundlegenden Prinzipien der Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung von Ionenkanälen in zellbasierten Systemen zu untersuchen. Hierfür wurden zwei Tumorzelllinien des Auges verwendet, und zwar benigne Pterygiumzellen und maligne Aderhautmelanom 92.1 Zellen. In diesen Studien wurde die Interaktion zwischen den nativ überexprimierten transient-receptor-potential-Ionenkanälen (TRPs) wie TRP Vanilliod 1 (TRPV1) (Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 (TRPM8) (Mentholrezeptor) in diesen Tumorzellen nach Zugabe von verschiedenen Medikamenten und Hormonen untersucht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Calcium-Mechanismus von GPCRs in den Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde Mas, ein GPCR und Angiotensin (1-7) -Hormonrezeptor, aus dem renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) in der Human Embryonic Kidney-293 (HEK293) Zelllinie überexprimiert. In dieser Studie wurden insbesondere die Aktivierung klassischer GPCR-Signalwege wie Phospholipase C und Proteinkinase C durch Angiotensin-(1-7) über Mas und die Beteiligung von TRP-Kanälen nachgewiesen. Die zellbasierte-Calcium-Imaging-Methode für chemische Calcium-Indikatoren ließ sich aufgrund der Anwesenheit einer großen Menge cytosolischer Carboxylesterasen gut anwenden. Carboxylesterase ist das wichtigste Enzym in der Calcium Imaging Methode, das die Verarbeitung chemischen Calcium-Farbstoffe behandelt. Dieses Enzym fehlt jedoch in Mikrosomen, die als Basismembran für die Integration synthetisierter Ionenkanäle in eukaryontischen zellfreien Systemen verwendet werden. Das dritte Ziel dieser Forschungsarbeit war die Umsetzung der zellbasierten Calcium-Imaging Methode und der Calcium-Signalwege in zellfreie Systeme. Hier wurde die zellfrei synthetisierte Carboxylesterase in Mikrosomen von Spodoptera frugiperda (Sf21) als praktikables Calcium-Imaging-Werkzeug etabliert, um sowohl native ionenpermeable Proteine als auch zellfrei-synthetisierte Ionenkanäle zu untersuchen. Die Enzymaktivität der zellfrei-synthetisierten Carboxylesterase in Mikrosomen wurde durch Esterase-Assays und den Calcium-Fluoreszenzfarbstoff Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) Belastungstests nachgewiesen. Das Calcium-Imaging der nativ vorhandenen Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und der Ryanodin-Rezeptoren (RyR) in den Mikrosomen sowie der zell-frei exprimierten TRP-Ionenkanäle wurden mit dem Fura-5N-AM- Fluoreszenzfarbstoff in mit Carboxylesterase vorsynthetisierten Mikrosomen nachgewiesen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Prinzip der zellbasierten Calcium-Imaging -Methode vielversprechend an das eukaryotische zellfreie Sf21-System angepasst werden konnte, um Ionenkanäle zu analysieren. Nach entsprechender Forschung könnte die etablierte Methode in Zukunft auch auf andere Membranproteine ausgeweitet werden. Dies umfasst die Untersuchung anderer zell-frei exprimierte GPCRs oder anderer Ionenkanäle wie Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionenkanäle.
Internalin J (InlJ) gehört zu der Klasse der bakteriellen, cysteinhaltigen (leucine-rich repeat) LRR Proteine. Bei den Internalinen handelt es sich um meist invasions-assoziierte Proteine der Listerien. Die LRR-Domäne von InlJ ist aus 15 regelmäßig wiederkehrenden, stark konservierten Sequenzeinheiten (repeats, 21 Aminosäuren) aufgebaut. Ein interessantes Detail dieses Internalins ist das stark konservierte Cystein innerhalb der repeats. Daraus ergibt sich eine ungewöhnliche Anordnung von 12 Cysteinen in einem Stapel. Die Häufigkeit von Cysteinen in InlJ ist für ein extrazelluläres Protein von L. monocytogenes außergewöhnlich, und die Frage nach ihrer Funktion daher umso brennender. Im Vergleich zum ubiquitären Vorkommen der sogenannten repeat-Proteine in der Natur sind Studien zu ihrer Stabilität und Faltung nicht äquivalent vertreten. Die zentrale Eigenschaft der repeat-Proteine ist ihr modularer Aufbau, der durch einfache Topologie gekennzeichnet ist und auf kurzreichenden Wechselwirkungen basiert. Diese Topologie macht repeat-Proteine zu idealen Modellproteinen, um die stabilitätsrelevanten Wechselwirkungen zu separieren und zuzuordnen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Faltung und Entfaltung von InlJ umfassend charakterisiert und die Relevanz der Cysteine näher beleuchtet. Die spektroskopische Charakterisierung von InlJ zeigte, dass dessen Faltungszustand durch zwei Tryptophane im N- und C-Terminus fluoreszenzspektroskopisch gut zugänglich ist. Die thermodynamische Stabilität wurde mittels fluoreszenz-detektierten, Guanidiniumchlorid-induzierten Gleichgewichtsexperimenten bestimmt. Um die kinetischen Eigenschaften von InlJ zu erfassen, wurden die Faltungs- sowie die Entfaltungsreaktion spektroskopisch untersucht. Die Identifizierung der produktiven Faltungsreaktion war lediglich durch die Anwendung des reversen Doppelsprungexperiments möglich. Die Auswertung erfolgte nach dem Zweizustandsmodell, wonach die Faltung dem „Alles-oder-Nichts“ Prinzip folgt. Die Gültigkeit dieser Annahme wurde durch die kinetische Charakterisierung bestätigt. Es wurde sowohl in den Gleichgewichtsexperimenten als auch in den kinetisch erhaltenen Daten eine hohe freie Stabilisierungsenthalpie festgestellt. Die hohe Stabilität von InlJ geht mit hoher Kooperativität einher. Die kinetischen Daten zeigen zudem, dass die hohe Kooperativität hauptsächlich der Faltungsreaktion entstammt. Der Tanford-Wert von 0.93 impliziert, dass die Oberflächenänderung während der Faltung bereits zum größten Teil erfolgt ist, bevor der Übergangszustand ausgebildet wurde. Direkte strukturelle Informationen über den Übergangszustand wurden mit Hilfe von Mutationsstudien erhalten. Zu diesem Zweck wurden 12 der 14 Cysteine gegen ein Alanin ausgetauscht. Die repeats 1 bis 11 von InlJ beinhalten jeweils ein Cystein, deren Anordnung eine Leiter ergibt. Deren Substitutionen haben einen vergleichbar destabilisierenden Effekt auf InlJ von durchschnittlich 4.8 kJ/mol. Die Verlangsamung der Faltung deutet daraufhin, dass die Interaktionen der repeats 5 bis 11 im Übergangszustand bereits voll ausgebildet sind. Demnach liegt bei InlJ ein zentraler Faltungsnukleus vor. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurde eine hohe Stabilität und ein stark-kooperatives Verhalten für das extrazelluläre Protein InlJ beobachtet. Diese Erkenntnisse könnten wichtige Beiträge zur Entwicklung artifizieller repeat-Proteine leisten, deren Verwendung sich stetig ausweitet.
Die funktionelle Charakterisierung von therapeutisch relevanten Proteinen kann bereits durch die Bereitstellung des Zielproteins in adäquaten Mengen limitierend sein. Dies trifft besonders auf Membranproteine zu, die aufgrund von zytotoxischen Effekten auf die Produktionszelllinie und der Tendenz Aggregate zu bilden, in niedrigen Ausbeuten an aktivem Protein resultieren können. Der lebende Organismus kann durch die Verwendung von translationsaktiven Zelllysaten umgangen werden- die Grundlage der zellfreien Proteinsynthese. Zu Beginn der Arbeit wurde die ATP-abhängige Translation eines Lysates auf der Basis von kultivierten Insektenzellen (Sf21) analysiert. Für diesen Zweck wurde ein ATP-bindendes Aptamer eingesetzt, durch welches die Translation der Nanoluziferase reguliert werden konnte. Durch die dargestellte Applizierung von Aptameren, könnten diese zukünftig in zellfreien Systemen für die Visualisierung der Transkription und Translation eingesetzt werden, wodurch zum Beispiel komplexe Prozesse validiert werden können.
Neben der reinen Proteinherstellung können Faktoren wie posttranslationale Modifikationen sowie eine Integration in eine lipidische Membran essentiell für die Funktionalität des Membranproteins sein. Im zweiten Abschnitt konnte, im zellfreien Sf21-System, für den G-Protein-gekoppelten Rezeptor Endothelin B sowohl eine Integration in die endogen vorhandenen Endoplasmatisch Retikulum-basierten Membranstrukturen als auch Glykosylierungen, identifiziert werden.
Auf der Grundlage der erfolgreichen Synthese des ET-B-Rezeptors wurden verschiedene Methoden zur Fluoreszenzmarkierung des Adenosin-Rezeptors A2a (Adora2a) angewandt und optimiert. Im dritten Abschnitt wurde der Adora2a mit Hilfe einer vorbeladenen tRNA, welche an eine fluoreszierende Aminosäure gekoppelt war, im zellfreien Chinesischen Zwerghamster Ovarien (CHO)-System markiert. Zusätzlich konnte durch den Einsatz eines modifizierten tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paares eine nicht-kanonische Aminosäure an Position eines integrierten Amber-Stopcodon in die Polypeptidkette eingebaut und die funktionelle Gruppe im Anschluss an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt werden. Aufgrund des offenen Charakters eignen sich zellfreie Proteinsynthesesysteme besonders für eine Integration von exogenen Komponenten in den Translationsprozess. Mit Hilfe der Fluoreszenzmarkierung wurde eine ligandvermittelte Konformationsänderung im Adora2a über einen Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer detektiert. Durch die Etablierung der Amber-Suppression wurde darüber hinaus das Hormon Erythropoetin pegyliert, wodurch Eigenschaften wie Stabilität und Halbwertszeit des Proteins verändert wurden.
Zu guter Letzt wurde ein neues tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paar auf Basis der Methanosarcina mazei Pyrrolysin-Synthetase etabliert, um das Repertoire an nicht-kanonischen Aminosäuren und den damit verbundenen Kopplungsreaktionen zu erweitern. Zusammenfassend wurden die Potenziale zellfreier Systeme in Bezug auf der Herstellung von komplexen Membranproteinen und der Charakterisierung dieser durch die Einbringung einer positionsspezifischen Fluoreszenzmarkierung verdeutlicht, wodurch neue Möglichkeiten für die Analyse und Funktionalisierung von komplexen Proteinen geschaffen wurden.
Um das Immunsystem der Pflanze zu manipulieren translozieren gram-negative pathogene Bakterien Typ-III Effektorproteine (T3E) über ein Typ-III Sekretionssystem (T3SS) in die pflanzliche Wirtszelle. Dort lokalisieren T3Es in verschiedenen subzellulären Kompartimenten, wo sie Zielproteine modifizieren und so die Infektion begünstigen. HopZ1a, ein T3E des Pflanzenpathogens Pseudomonas syringae pv. syringae, ist eine Acetyltransferase und lokalisiert über ein Myristolierungsmotiv an der Plasmamembran der Wirtszelle. Obwohl gezeigt wurde, dass HopZ1a die frühe Signalweiterleitung an der Plasmamembran stört, wurde bisher kein mit der Plasmamembran assoziiertes Zielprotein für diesen T3E identifiziert. Um bisher unbekannte HopZ1a-Zieleproteine zu identifizieren wurde im Vorfeld dieser Arbeit eine Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung mit einer cDNA-Bibliothek aus Tabak durchgeführt, wobei ein nicht näher charakterisiertes Remorin als Interaktor gefunden wurde.
Bei dem Remorin handelt es sich um einen Vertreter der Gruppe 4 der Remorin-Familie, weshalb es in NbREM4 umbenannt wurde. Durch den Einsatz verschiedener Interaktionsstudien konnte demonstriert werden, dass HopZ1a mit NbREM4 in Hefe, in vitro und in planta wechselwirkt. Es wurde ferner deutlich, dass HopZ1a auf spezifische Weise mit dem konservierten C-Terminus von NbREM4 interagiert, das Remorin jedoch in vitro nicht acetyliert. Analysen mittels BiFC haben zudem ergeben, dass NbREM4 in Homodimeren an der Plasmamembran lokalisiert, wo auch die Interaktion mit HopZ1a stattfindet.
Eine funktionelle Charakterisierung von NbREM4 ergab, dass das Remorin eine spezifische Rolle im Immunsystem der Pflanze einnimmt. Die transiente Expression in N. benthamiana induziert die Expression von Abwehrgenen sowie einen veränderten Blattphänotyp. In A. thaliana wird HopZ1a über das Decoy ZED1 und das R-Protein ZAR1 erkannt, was zur Auslösung einer starken Hypersensitiven Antwort (HR von hypersensitive response) führt. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass ZAR1 in N. benthamiana konserviert ist, NbREM4 jedoch nicht in der ETI als Decoy fungiert. Mit Hilfe einer Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung mit NbZAR1 als Köder konnten zwei Proteine, die Catalase CAT1 und der Protonenpumpeninteraktor PPI1, als Interaktoren von NbZAR1 identifiziert werden, welche möglicherweise in der Regulation der HR eine Rolle spielen.
Aus Voruntersuchungen war bekannt, dass NbREM4 mit weiteren, nicht näher charakterisierten Proteinen aus Tabak interagieren könnte. Eine phylogenetische Einordnung hat gezeigt, dass es sich um die bekannte Immun-Kinase PBS1 sowie zwei E3-Ubiquitin-Ligasen, NbSINA1 und NbSINAL3, handelt. PBS1 interagiert mit NbREM4 an der Plasmamembran und phosphoryliert das Remorin innerhalb des intrinsisch ungeordneten N-Terminus. Mittels Massenspektrometrie konnten die Serine an Position 64 und 65 innerhalb der Aminosäuresequenz von NbREM4 als PBS1-abhängige Phosphorylierungsstellen identifiziert wurden.
NbSINA1 und NbSINAL3 besitzen in vitro Ubiquitinierungsaktivität, bilden Homo- und Heterodimere und interagieren ebenfalls mit dem N-terminalen Teil von NbREM4, wobei sie das Remorin in vitro nicht ubiquitinieren.
Aus den in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass der bakterielle T3E HopZ1a gezielt mit dem Tabak-Remorin NbREM4 an der Plasmamembran interagiert und über einen noch unbekannten Mechanismus mit dem Immunsystem der Pflanze interferiert, wobei NbREM4 möglicherweise eine Rolle als Adapter- oder Ankerprotein zukommt, über welches HopZ1a mit weiteren Immunkomponenten interagiert. NbREM4 ist Teil eines größeren Immunnetzwerkes, zu welchem die bekannte Immun-Kinase PBS1 und zwei E3-Ubiquitin-Ligasen gehören. Mit NbREM4 konnte damit erstmalig ein membranständiges Protein mit einer Funktion im Immunsystem der Pflanze als Zielprotein von HopZ1a identifiziert werden.
Angepasste Pathogene besitzen eine Reihe von Virulenzmechanismen, um pflanzliche Immunantworten unterhalb eines Schwellenwerts der effektiven Resistenz zu unterdrücken. Dadurch sind sie in der Lage sich zu vermehren und Krankheiten auf einem bestimmten Wirt zu verursachen. Eine essentielle Virulenzstrategie Gram-negativer Bakterien ist die Translokation von sogenannten Typ-III Effektorproteinen (T3Es) direkt in die Wirtszelle. Dort stören diese die Immunantwort des Wirts oder fördern die Etablierung einer für das Pathogen günstigen Umgebung. Eine kritische Komponente der Pflanzenimmunität gegen eindringende Pathogene ist die schnelle transkriptionelle Umprogrammierung der angegriffenen Zelle. Viele adaptierte bakterielle Pflanzenpathogene verwenden T3Es, um die Induktion Abwehr-assoziierter Gene zu stören. Die Aufklärung von Effektor-Funktionen, sowie die Identifikation ihrer pflanzlichen Zielproteine sind für das Verständnis der bakteriellen Pathogenese essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Typ-III Effektorprotein XopS aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) funktionell charakterisiert werden. Zudem lag hier ein besonderer Fokus auf der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen XopS und seinem in Vorarbeiten identifizierten pflanzlichen Interaktionspartner WRKY40, einem transkriptionellen Regulator der Abwehr-assoziierten Genexpression. Es konnte gezeigt werden, dass XopS ein essentieller Virulenzfaktor des Phytopathogens Xcv während der präinvasiven Immunantwort ist. So zeigten xopS-defiziente Xcv Bakterien bei einer Inokulation der Blattoberfläche suszeptibler Paprika Pflanzen eine deutlich reduzierte Virulenz im Vergleich zum Xcv Wildtyp. Die Translokation von XopS durch Xcv, sowie die ektopische Expression von XopS in Arabidopsis oder N. benthamiana verhinderte das Schließen von Stomata als Reaktion auf Bakterien bzw. einem Pathogen-assoziierten Stimulus, wobei zudem gezeigt werden konnte, dass dies in einer WRKY40-abhängigen Weise geschieht. Weiter konnte gezeigt werden, dass XopS in der Lage ist, die Expression Abwehr-assoziierter Gene zu manipulieren. Dies deutet darauf hin, dass XopS sowohl in die prä-als auch in die postinvasive, apoplastische Abwehr eingreift. Phytohormon-Signalnetzwerke spielen während des Aufbaus einer effizienten pflanzlichen Immunantwort eine wichtige Rolle. Hier konnte gezeigt werden, dass XopS mit genau diesen Signalnetzwerken zu interferieren scheint. Eine ektopische Expression des Effektors in Arabidopsis führte beispielsweise zu einer signifikanten Induktion des Phytohormons Jasmonsäure (JA), während eine Infektion von suszeptiblen Paprika Pflanzen mit einem xopS-defizienten Xcv Stamm zu einer ebenfalls signifikanten Akkumulation des Salicylsäure (SA)-Gehalts führte.
So kann zu diesem Zeitpunkt vermutet werden, dass XopS die Virulenz von Xcv fördert, indem JA-abhängige Signalwege induziert werden und es gleichzeitig zur Unterdrückung SA-abhängiger Signalwege kommt. Die Virus-induzierte Genstilllegung des XopS Interaktionspartners WRKY40a in Paprika erhöhte die Toleranz der Pflanze gegenüber einer Xcv Infektion, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesem Protein um einen transkriptionellen Repressor pflanzlicher Immunantworten handelt. Die Hypothese, dass WRKY40 die Abwehr-assoziierte Genexpression reprimiert, konnte hier über verschiedene experimentelle Ansätze bekräftigt werden. So wurde beispielsweise gezeigt, dass die Expression von verschiedenen Abwehrgenen einschließlich des SA-abhängigen Gens PR1 und die des Negativregulators des JA-Signalwegs JAZ8 von WRKY40 gehemmt wird. Um bei einem Pathogenangriff die Abwehr-assoziierte Genexpression zu gewährleisten, muss WRKY40 als Negativregulator abgebaut werden. Vorarbeiten zeigten, dass WRKY40 über das 26S Proteasom abgebaut wird. In der hier vorliegenden Studie konnte weiter bestätigt, dass der T3E XopS zu einer Stabilisierung des WRKY40 Proteins führt, indem er auf bislang ungeklärte Weise dessen Abbau über das 26S Proteasom verhindert. Die Ergebnisse aus der hier vorliegenden Arbeit lassen die Vermutung zu, dass die Stabilisierung des Negativregulators der Immunantwort WRKY40 seitens XopS dazu führt, dass eine darüber vermittelte Manipulation der Abwehr-assoziierten Genexpression, sowie eine Umsteuerung phytohormoneller Wechselwirkungen die Ausbreitung von Xcv auf suszeptiblen Paprikapflanzen fördert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, weitere potentielle in planta Interaktionspartner von XopS zu identifizieren die für seine Interaktion mit WRKY40 bzw. für die Aufschlüsselung seines Wirkmechanismus relevant sein könnten. So konnte die Deubiquitinase UBP12 als weiterer pflanzlicher Interaktionspartner sowohl von XopS als auch von WRKY40 gefunden werden. Dieses Enzym ist in der Lage, die Ubiquitinierung von Substratproteinen zu modifizieren und seine Funktion könnte somit ein Bindeglied zwischen XopS und dessen Interferenz mit dem proteasomalen Abbau von WRKY40 sein. Während einer kompatiblen Xcv-Wirtsinteraktion führte die Virus-induzierte Genstilllegung von UBP12 zu einer reduzierten Resistenz der Pflanze gegenüber des Pathogens Xcv, was auf dessen positiv-regulatorische Wirkung während der Immunantwort hindeutet. Zudem zeigten Western Blot Analysen, dass das Protein WRKY40 bei einer Herunterregulierung von UBP12 akkumuliert und dass diese Akkumulation von der Anwesenheit des T3Es XopS zusätzlich verstärkt wird. Weiterführende Analysen zur biochemischen Charakterisierung der XopS/WRKY40/UBP12 Interaktion sollten in Zukunft durchgeführt werden, um den genauen Wirkmechanismus des XopS T3Es weiter aufzuschlüsseln.
Die Xanthin-Dehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus ist ein cytoplasmatisches Enzym, welches ein (αβ)₂ Heterotetramer mit einer Größe von 275 kDa bildet. Die drei Kofaktoren (Moco, 2[2Fe2S], FAD) sind auf zwei unterschiedlichen Polypeptidketten gebunden. So sind die beiden spektroskopisch unterscheidbaren Eisen-Schwefel-Zentren und das FAD in der XdhA-Untereinheit und der Moco in der XdhB-Untereinheit gebunden. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte untersucht werden, warum die R. capsulatus XDH ein Dimer bildet und ob ein intramolekularer Elektronentransfer existiert. Dafür wurde eine chimäre XDH-Variante [(α)₂(β₁wt/β₂E730A)] erzeugt, welche eine aktive und eine inaktive XdhB-Untereinheit trägt. Mit Hilfe von Reduktionsspektren sowie mit der Bestimmung der kinetischen Parameter für die Substrate Xanthin und NAD+ konnte gezeigt werden, dass die chimäre XDH-Variante katalytisch halb so aktiv war, wie der auf gleiche Weise gereinigte XDH-Wildtyp. Dies verdeutlicht, dass die noch aktive Untereinheit der Chimären selbstständig und unabhängig Substrat binden und hydroxylieren kann und ein intramolekularer Elektronentransfer zwischen den beiden XdhB-Untereinheiten nicht stattfindet. Ein weiteres Ziel war die funktionelle Charakterisierung der Mus musculus AOX1 sowie der humanen AOX1 hinsichtlich ihrer Substratspezifitäten und ihrer biophysikalischen Eigenschaften sowie der Charakterisierung der konservierten Aminosäuren im aktiven Zentrum der mAOX1. Da bislang noch kein heterologes Expressionssystem für ein aktives und stabiles rekombinantes AO-Protein existierte, wurde ein E. coli Expressionssystem mit der gleichzeitigen Expression der entsprechenden Mocosulfurase für mAOX1 und hAOX1 in dieser Arbeit etabliert. Mit Hilfe dieser Koexpression konnte die Aktivität der rekombinanten mAOX1 um 50 % gesteigert werden, wenn gleich auch der sulfurierte Moco-Anteil nur 20 % betrug. Um die konservierten Aminosäuren im aktiven Zentrum hinsichtlich ihrer Funktion der Substratbindung zu charakterisieren, wurden folgende Varianten erzeugt: V806E, M884R, V806/M884R sowie E1265Q. Mit Hilfe von kinetischen Substratuntersuchungen konnte gezeigt werden, dass die beiden Aminosäuren Val806 und Met884 für die Erkennung und die Stabilisierung von Aldehyden und N-Heterozyklen essentiell sind. Ein Austausch dieser beiden gegen Glutamat bzw. Arginin (wie bei R. capsulatus XDH) zeigte jedoch keine Xanthin- oder Hypoxanthinumsetzung. Für das Glu1265 wurde ebenfalls die Rolle als die Katalyse initiierende Aminosäure belegt.
Die Qualität von Nutzpflanzen ist von zahlreichen Einflussfaktoren wie beispielsweise Lagerbedingungen und Sorteneigenschaften abhängig. Um Qualitätsmängel zu minimieren und Absatzchancen von Nutzpflanzen zu steigern sind umfangreiche Analysen hinsichtlich ihrer stofflichen Zusammensetzung notwendig. Chromatographische Techniken gekoppelt an ein Massenspektrometer und die Kernspinresonanzspektroskopie wurden dafür bislang verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Gaschromatograph an ein Flugzeitmassenspektrometer (GC-TOF-MS) gekoppelt, um physiologische Prozesse bzw. Eigenschaften (die Schwarzfleckigkeit, die Chipsbräunung, das Physiologische Alter und die Keimhemmung) von Nutzpflanzen aufzuklären. Als Pflanzenmodell wurde dafür die Kartoffelknolle verwendet. Dazu wurden neue analytische Lösungsansätze entwickelt, die eine zielgerichtete Auswertung einer Vielzahl von Proben, die Etablierung einer umfangreichen Referenzspektrenbibliothek und die sichere Archivierung aller experimentellen Daten umfassen. Das Verfahren der Probenvorbereitung wurde soweit modifiziert, dass gering konzentrierte Substanzen mittels GC-TOF-MS analysiert werden können. Dadurch wurde das durch die Probenvorbereitung limitierte Substanzspektrum erweitert. Anhand dieser Lösungsansätze wurden physiologisch relevante Stoffwechselprodukte identifiziert, welche indikativ (klassifizierend) bzw. prädiktiv (vorhersagend) für die physiologischen Prozesse sind. Für die Schwarzfleckigkeitsneigung und die Chipseignung wurde jeweils ein biochemisches Modell zur Vorhersage dieser Prozesse aufgestellt und auf eine Züchtungspopulation übertragen. Ferner wurden für die Schwarzfleckigkeit Stoffwechselprodukte des Respirationsstoffwechsels identifiziert sowie Aminosäuren, Glycerollipide und Phenylpropanoide für das Physiologische Alter als relevant erachtet. Das physiologische Altern konnte durch die Anwendung höherer Temperaturen beschleunigt werden. Durch Anwendung von Keimhemmern (Kümmelöl, Chlorpropham) wurde eine Verzögerung des physiologischen Alterns beobachtet. Die Applikation von Kümmelöl erwies sich dabei als besonders vorteilhaft. Kümmelöl behandelte Knollen wiesen im Vergleich zu unbehandelten Knollen nur Veränderungen im Aminosäure-, Zucker- und Sekundärstoffwechsel auf. Chlorpropham behandelte Knollen wiesen einen ähnlichen Stoffwechsel wie die unbehandelten Knollen auf. Für die bislang noch nicht identifizierten Stoffwechselprodukte wurden im Rahmen dieser Arbeit das Verfahren der „gezielten An-/Abreicherung“, der „gepaarten NMR/GC-TOF-MS Analyse“ und das „Entscheidungsbaumverfahren“ entwickelt. Diese ermöglichen eine Klassifizierung von GC-MS Signalen im Hinblick auf ihre chemische Funktionalität. Das Verfahren der gekoppelten NMR/GC-TOF-MS Analyse erwies sich dabei als besonders erfolgversprechend, da es eine Aufklärung bislang unbekannter gaschromatographischer Signale ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurden neue Stoffwechselprodukte in der Kartoffelknolle identifiziert, wodurch ein wertvoller Beitrag zur Analytik der Metabolomik geleistet wurde.
Der "Leukocyte Receptor Complex" (LRC) ist ein DNA-Sequenzabschnitt auf dem Chromosom 19 des Menschen, der eine Länge von über 900.000 Basenpaaren umfaßt. In diesem Chromosomenabschnitt ist eine Vielzahl von Genen lokalisiert, die für die Funktion verschiedener weißer Blutzellen (Leukozyten) von entscheidender Bedeutung sind. Bei den aus diesen Genen synthetisierten Proteinen (Eiweißen) handelt es sich um Strukturen, die auf der Oberfläche dieser Zellen lokalisiert sind und zur Interaktion der Leukozyten mit ihrer Umgebung dienen. Diese auch als Rezeptoren bezeichneten Proteine können mit Oberflächenproteinen auf anderen Körperzellen wechselwirken und daraus resultierende Signale in das Innere der Blutzelle weiterleiten. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde der LRC im Detail untersucht. Hierzu wurde zunächst der gesamte Chromosomenabschnitt aus kleineren, einander überlappenden DNA-Fragmenten rekonstruiert. Aufgrund der in diesen DNA-Fragmenten enthaltenen DNA-Sequenzen war es möglich, den gesamten Chromosomenabschnitt ähnlich einem Puzzle zusammenzusetzen. Die anschließende Analyse des LRC zeigte, daß sich dieser in drei Bereiche, sogenannte Cluster, unterteilen läßt. Diese Cluster sind dadurch gekennzeichnet, daß in ihnen jeweils nur Gene eines Rezeptortyps vorkommen. Hierbei handelt es sich um ‚immunoglobulin-like transcript′ -Gene (ILT) und ‚killer cell Ig-like receptor′-Gene (KIR). Die KIR- und ILT-Cluster werden von weiteren stammesgeschichtlich verwandten Genen unterbrochen und flankiert. Je nach Individuum können im LRC bis zu 31 solcher verwandten Rezeptorgene lokalisiert sein. Auf der Grundlage der Kartierungsdaten und von Daten des humanen Genomprojekts war es zudem möglich, evolutionäre Untersuchungen zur Entwicklung des LRC durchzuführen. Dabei wurde eine Hypothese zur Entstehung des LRC entworfen und zu anderen Spezies in Beziehung gesetzt. Im zweiten Teil der Arbeit habe ich aufbauend auf der sogenannten HRCA-Methode eine Technik entwickelt, die es erlaubt kleinste Unterschiede zwischen DNA-Sequenzen, sogenannte Einzelbasenpaaraustausche, nachzuweisen. Die entwickelte Methode kann verwendet werden, um sehr ähnliche DNA-Sequenzen, wie z.B. verschiedene KIR-Sequenzen, zu unterscheiden und ihre Menge zu bestimmen. Sie ist außerdem geeignet Mutationen, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind, nachzuweisen und könnte somit in der Diagnostik Anwendung finden.
Durch die anthropogene Nutzung sind viele Auen in Mitteleuropa verändert worden, wobei insbesondere die Retentionsflächen stark verringert wurden. Während Auen seit längerem im Fokus der wissenschaftlichen Bearbeitung stehen, gibt es bisher große Wissensdefizite in der Frage der Auenreaktivierungen. Zum einen sind derartige Projekte bisher kaum verwirklicht und zum anderen ist ein langfristiges Monitoring notwendig, um die Anpassung von Biozönosen an die veränderten Standortbedingungen beobachten zu können. Um die Folgen derartiger Eingriffe zu analysieren, bieten sich computergestützte Modellierungen der Landschaftsentwicklung an, wie sie in der vorliegenden Arbeit verwirklicht wurden. Ziel der Arbeit war, mit Hilfe eines Geografischen Informationssystems (GIS) das Entwicklungspotenzial der Landschaft bei verschiedenen Rückdeichungsvarianten auf der Ebene der Biotoptypen darzustellen. Dabei ging es nicht um die Erstellung eines allgemein gültigen Auenmodells sondern um die Erarbeitung eines Modells für einen konkreten Anwendungsfall. Der erarbeitete Ansatz sollte zudem für die landschaftsplanerische Praxis geeignet sein. Als Beispielgebiete wurden Flächen an der Mittleren Elbe bei Rogätz und Sandau, beide im nördlichen Teil von Sachsen-Anhalt, ausgewählt. Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Im ersten Teil werden Erhebungen und Auswertungen als Grundlage der Modellentwicklung dargestellt. Dazu wurden die Biotoptypen der Beispielgebiete flächendeckend erhoben und mit punktuellen Vegetationserhebungen ergänzt. Aus dem Forschungsprojekt "Rückgewinnung von Retentionsflächen und Altauenreaktivierung an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt" des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) standen standortökologische Daten der Hydrologie und Bodenkunde zur Verfügung. Ziel der Auswertung war, Schlüsselfaktoren für Hydrologie und Bodenbedingungen innerhalb der rezenten Aue zu identifizieren, die zur Ausprägung bestimmter Biotoptypen führen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Modell für Biotoptypenpotenziale auf den geplanten Rück–deichungsflächen entwickelt. Das Modell bearbeitet die Datenbank der verwendeten GIS-Dateien, die auf Daten zum Bestand beruht und um solche der Prognose der Standortökologie (Hydrologie und Boden) im Rückdeichungsfalle aus dem BMBF-Projekt erweitert wurde. Weitere Voraussetzung für die Modellierung war die Erarbeitung von Leitbildern, in denen unterschiedliche Nutzungsszenarios für die Landschaft nach Deichrückverlegung hypothetisch festgelegt wurden. Insbesondere die Nutzungsintensität wurde variiert, von einer Variante intensiver land- und forstwirtschaftlicher Nutzung über sogenannte integrierte Entwicklungsziele aus dem BMBF-Projekt bis hin zu einer Variante der Naturschutznutzung. Zusätzlich wurde eine zukünftige Potentielle Natürliche Vegetation modelliert. Eine Überprüfung des Modell fand für den Raum der rezenten Aue in der intensiven Nutzungsvariante statt, die der gegenwärtigen Nutzung am nächsten kommt. Werden Informationen des Bestandsbiotoptyps als Korrekturgröße in das Modell einbezogen, konnte für viele Biotoptypen eine Trefferquote von über 90 % erreicht werden. Bei flächenmäßig weniger bedeutenden Bio–toptypen lag dieser Wert aufgrund der schmaleren Datenbasis zwischen 20 und 40 %. Als Ergebnis liegt für unterschiedliche Deichvarianten und Leitbilder in den Beispielgebieten die Landschaftsentwicklung als Biotoppotenzial vor. Als eine vereinfachte Regionalisierung der punktuellen Vegetationsdaten wurde im Modell geprüft, inwieweit die modellierten Biotopflächen der Charakteristik der pflanzensoziologischen Aufnahmen aus der rezenten Aue entsprechen. In dem Falle wurde die Pflanzengesellschaft der jeweiligen ökologisch im Rahmen der Untersuchung einheitlichen Flächeneinheit zugeordnet. Anteilig lässt sich damit die Biotopprognosefläche pflanzensoziologisch konkretisieren. Die vorliegende Arbeit gehört zu den bisher wenigen Arbeiten, die sich mit den Folgen von Auenreaktivierung auf die Entwicklung der Landschaft auseinandersetzen. Sie zeigt eine Möglichkeit auf, Prognosemodelle für Biotoptypen und Vegetation anhand begrenzter Felduntersuchungen zu entwerfen. Derartige Modelle können zum Verständnis von Eingriffen in den Naturhaushalt, wie sie die Deichrückverlegungen darstellen, beitragen und eine Folgenabschätzung unterstützen.
Hantaviren in Deutschland
(2018)
Hantaviren sind Kleinsäuger-assoziierte Krankheitserreger, die vor allem in Nagetieren, aber auch in Spitzmäusen, Maulwürfen und Fledermäusen vorkommen. Ziel dieser Arbeit ist es, einen aktuellen Überblick zur Epidemiologie und Ökologie der Hantaviren in Deutschland zu geben und Modelle zur Vorhersage von Virusausbrüchen zu diskutieren. In Deutschland werden die meisten humanen Erkrankungsfälle beim Menschen durch das von der Rötelmaus (Myodes glareolus) übertragene Puumalavirus (PUUV) verursacht. PUUV ist mit der westlichen evolutionären Linie der Rötelmaus assoziiert und fehlt im östlichen und nördlichen Teil Deutschlands. Ein zweites humanpathogenes Hantavirus ist das Dobrava-Belgrad-Virus (DOBV), Genotyp Kurkino, dessen Reservoir die vor allem im östlichen Teil Deutschlands vorkommende Brandmaus (Apodemus agrarius) ist. Ein PUUV-verwandtes Hantavirus ist das selten humanpathogene Tulavirus (TULV), das mit der Feldmaus (Microtus arvalis) assoziiert ist. Darüber hinaus wurden mit dem Seewis-, Asikkala- und Brugesvirus Spitzmaus- und Maulwurf-assoziierte Hantaviren mit noch unklarer Humanpathogenität gefunden.
Die humanen Erkrankungen sind jeweils mit den verschiedenen Hantaviren in deren regionaler Verteilung assoziiert und können mild bis schwer, aber auch subklinisch verlaufen. Das Auftreten von Häufungen humaner, durch PUUV verursachter Erkrankungen in den Jahren 2007, 2010, 2012, 2015 und 2017 korreliert mit dem Auftreten einer starken Fruktifikation der Buche („Buchenmast“) im jeweiligen Vorjahr. Auf der Basis von Wetterparametern sind Modelle zur Vorhersage von PUUV-Erkrankungshäufungen entwickelt worden, die zukünftig validiert und optimiert werden müssen. Neben dem Ausmaß des Virusvorkommens im Reservoir wird das Risiko humaner Infektionen durch das Expositionsverhalten des Menschen beeinflusst. Durch die Anwendung von Prognosemodellen soll der öffentliche Gesundheitsdienst in die Lage versetzt werden, räumlich und zeitlich gezielte und sachgerechte Präventionsempfehlungen für die Bevölkerung abzugeben.
Das Ziel des hier beschriebenen Masterprojekts war es, eine Methode zu etablieren, mit der Insekten in Gießharz eingeschlossen werden können, damit sie dauerhaft konserviert für mikroskopische Untersuchungen im Biologieunterricht zur Verfügung stehen. Die Masterarbeit enthält eine ausführliche Anleitung zur Herstellung von Gießharzpräparaten mit darin eingebetteten Insekten. Sie soll als Handreichung vor allem für Biologie-Lehrkräfte dienen, um selbstständig hochwertige Lehrpräparate für ihren Unterricht herstellen zu können. Aufgrund der Komplexität des Themas werden Naturschutzbestimmungen und die Beschaffung der Insekten genauso beleuchtet wie deren anschließende Präparation, die Konstruktion einer eigenen Gießform, die Einbettung der Insekten in Gießharz und die Nachbehandlung des Gießlings. Wichtige Einflussfaktoren, die die Qualität der Präparate entscheidend beeinflussen und mögliche Fehlerquellen, werden ausführlich erläutert. Mittels dieser detaillierten Eingießanleitung können mit relativ einfachen und kostengünstigen Mitteln faszinierende Studienobjekte für einen anschaulichen Biologieunterricht entstehen.
Gewässer werden traditionellerweise als abgeschlossene Ökosysteme gesehen, und insbeson¬dere das Zirkulieren von Wasser und Nährstoffen im Pelagial von Seen wird als Beispiel dafür angeführt. Allerdings wurden in der jüngeren Vergangenheit wichtige Verknüpfungen des Freiwasserkörpers von Gewässern aufgezeigt, die einerseits mit dem Benthal und andererseits mit dem Litoral, der terrestrischen Uferzone und ihrem Einzugsgebiet bestehen. Dadurch hat in den vergangen Jahren die horizontale und vertikale Konnektivität der Gewässerökosysteme erhöhtes wissenschaftliches Interesse auf sich gezogen, und damit auch die ökologischen Funktionen des Gewässergrunds (Benthal) und der Uferzonen (Litoral). Aus der neu beschriebenen Konnektivität innerhalb und zwischen diesen Lebensräumen ergeben sich weitreichende Konsequenzen für unser Bild von der Funktionalität der Gewässer. In der vorliegenden Habilitationsschrift wird am Beispiel von Fließgewässern und Seen des nordostdeutschen Flachlandes eine Reihe von internen und externen funktionalen Verknüpfungen in den horizontalen und vertikalen räumlichen Dimensionen aufgezeigt. Die zugrunde liegenden Untersuchungen umfassten zumeist sowohl abiotische als auch biologische Variablen, und umfassten thematisch, methodisch und hinsichtlich der Untersuchungsgewässer ein breites Spektrum. Dabei wurden in Labor- und Feldexperimenten sowie durch quantitative Feldmes¬sungen ökologischer Schlüsselprozesse wie Nährstoffretention, Kohlenstoffumsatz, extrazellu¬läre Enzymaktivität und Ressourcenweitergabe in Nahrungsnetzen (mittels Stabilisotopen¬methode) untersucht. In Bezug auf Fließgewässer wurden dadurch wesentliche Erkenntnisse hinsichtlich der Wirkung einer durch Konnekticität geprägten Hydromorphologie auf die die aquatische Biodiversität und die benthisch-pelagische Kopplung erbracht, die wiederum einen Schlüsselprozess darstellt für die Retention von in der fließenden Welle transportierten Stoffen, und damit letztlich für die Produktivität eines Flussabschnitts. Das Litoral von Seen wurde in Mitteleuropa jahrzehntelang kaum untersucht, so dass die durchgeführten Untersuchungen zur Gemeinschaftsstruktur, Habitatpräferenzen und Nahrungs¬netzverknüpfungen des eulitoralen Makrozoobenthos grundlegend neue Erkenntnisse erbrach¬ten, die auch unmittelbar in Ansätze zur ökologischen Bewertung von Seeufern gemäß EG-Wasserrahmenrichtlinie eingehen. Es konnte somit gezeigt werden, dass die Intensität sowohl die internen als auch der externen ökologischen Konnektivität durch die Hydrologie und Morphologie der Gewässer sowie durch die Verfügbarkeit von Nährstoffen wesentlich beeinflusst wird, die auf diese Weise vielfach die ökologische Funktionalität der Gewässer prägen. Dabei trägt die vertikale oder horizontale Konnektivität zur Stabilisierung der beteiligten Ökosysteme bei, indem sie den Austausch ermöglicht von Pflanzennährstoffen, von Biomasse sowie von migrierenden Organismen, wodurch Phasen des Ressourcenmangels überbrückt werden. Diese Ergebnisse können im Rahmen der Bewirtschaftung von Gewässern dahingehend genutzt werden, dass die Gewährleistung horizontaler und vertikaler Konnektivität in der Regel mit räumlich komplexeren, diverseren, zeitlich und strukturell resilienteren sowie leistungsfähi¬geren Ökosystemen einhergeht, die somit intensiver und sicherer nachhaltig genutzt werden können. Die Nutzung einer kleinen Auswahl von Ökosystemleistungen der Flüsse und Seen durch den Menschen hat oftmals zu einer starken Reduktion der ökologischen Konnektivität, und in der Folge zu starken Verlusten bei anderen Ökosystemleistungen geführt. Die Ergebnisse der dargestellten Forschungen zeigen auch, dass die Entwicklung und Implementierung von Strategien zum integrierten Management von komplexen sozial-ökologischen Systemen wesentlich unterstützt werden kann, wenn die horizontale und vertikale Konnektivität gezielt entwickelt wird.
Tierische und menschliche Fäkalien aus Landwirtschaft und Haushalten enthalten zahlreiche obligat und opportunistisch pathogene Mikroorganismen, deren Konzentration u. a. je nach Gesundheitszustand der betrachteten Gruppe schwankt. Neben den Krankheitserregern enthalten Fäkalien aber auch essentielle Pflanzennährstoffe (276) und dienen seit Jahrtausenden (63) als Dünger für Feldfrüchte. Mit der unbedarften Verwendung von pathogenbelastetem Fäkaldünger steigt jedoch auch das Risiko einer Infektion von Mensch und Tier. Diese Gefahr erhöht sich mit der globalen Vernetzung der Landwirtschaft, z. B. durch den Import von kontaminierten Futter- bzw. Lebensmitteln (29).
Die vorliegende Arbeit stellt die milchsaure Fermentation von Rindergülle und Klärschlamm als alternative Hygienisierungsmethode gegenüber der Pasteurisation in Biogasanlagen bzw. gebräuchlichen Kompostierung vor.
Dabei wird ein Abfall der Gram-negativen Bakterienflora sowie der Enterokokken, Schimmel- und Hefepilze unter die Nachweisgrenze von 3 log10KbE/g beobachtet, gleichzeitig steigt die Konzentration der Lactobacillaceae um das Tausendfache. Darüber hinaus wird gezeigt, dass pathogene Bakterien wie Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, EHEC O:157 und vegetative Clostridum perfringens-Zellen innerhalb von 3 Tagen inaktiviert werden. Die Inaktivierung von ECBO-Viren und Spulwurmeiern erfolgt innerhalb von 7 bzw. 56 Tagen. Zur Aufklärung der Ursache der beobachteten Hygienisierung wurde das fermentierte Material auf flüchtige Fettsäuren sowie pH-Wertänderungen untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die gemessenen Werte nicht die alleinige Ursache für das Absterben der Erreger sind, vielmehr wird eine zusätzliche bakterizide Wirkung durch eine mutmaßliche Bildung von Bakteriozinen in Betracht gezogen. Die parasitizide Wirkung wird auf die physikalischen Bedingungen der Fermentation zurückgeführt.
Die methodischen Grundlagen basieren auf Analysen mittels zahlreicher klassisch-kultureller Verfahren, wie z. B. der Lebendkeimzahlbestimmung. Darüber hinaus findet die MALDI-TOF-Massenspektrometrie und die klassische PCR in Kombination mit der Gradienten-Gelelektrophorese Anwendung, um kultivierbare Bakterienfloren zu beschreiben bzw. nicht kultivierbare Bakterienfloren stichprobenartig zu erfassen.
Neben den Aspekten der Hygienisierung wird zudem die Eignung der Methode für die landwirtschaftliche Nutzung berücksichtigt. Dies findet sich insbesondere in der Komposition des zu fermentierenden Materials wieder, welches für die verstärkte Humusakkumulation im Ackerboden optimiert wurde. Darüber hinaus wird die Masseverlustbilanz während der milchsauren Fermentation mit denen der Kompostierung sowie der Verarbeitung in der Biogasanlage verglichen und als positiv bewertet, da sie mit insgesamt 2,45 % sehr deutlich unter den bisherigen Alternativen liegt (73, 138, 458). Weniger Verluste an organischem Material während der Hygienisierung führen zu einer größeren verwendbaren Düngermenge, die auf Grund ihres organischen Ursprungs zu einer Verstärkung des Humusanteiles im Ackerboden beitragen kann (56, 132).
Die immunologische Kontrazeption mittels Zona pellucida (ZP) Proteinen gilt als vielversprechender Ansatz für die Reproduktionskontrolle verwilderter Haus- und Wildtierbestände. Da die Applikation von nativer ZP mit Nebenwirkungen verbunden ist, wird die Verwendung einzelner ZP Peptide als Bestandteil kontrazeptiver Vakzine als besonders aussichtsreich erachtet. Das Prinzip dieser nebenwirkungsfreien ZP Immunisierung ist die gezielte Trennung der Entzündungsreaktionen auslösenden T-Zell-Epitope der ZP von den kontrazeptiv wirkenden B-Zell-Epitopen. Niedermolekulare synthetische oder rekombinante Peptide allein sind gering immunogen und können somit keine ausreichende Immunantwort induzieren. Die Verwendung von Peptiden für die immunologische Kontrazeption erfordert daher ein „Vakzin-Design“, d. h. die gezielte Kombination der Peptide mit immunstimulierenden Substanzen (Liposomen, Carrierproteinen, Adjuvantien). Zielstellung der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Potentials synthetischer Peptide für die Immunokontrazeption von verwilderten Hauskatzen (Felis catus). Dazu wurden zunächst relevante B-Zell-Epitope des felinen Zona pellucida Proteins, ZPB2, identifiziert und synthetisiert. Zwei der synthetischen Peptide (P3, P6) wurden zur Herstellung von Antikörpern an BSA konjugiert und zusammen mit Freundschem Adjuvans in Ratten verimpft. Die kontrazeptive Relevanz beider Peptide sowie der Ratten Anti-Peptid Antiseren wurde im in vitro Befruchtungssystem der Hauskatze geprüft. Zur Untersuchung der Immunogenität der Peptide in der Zielspezies Hauskatze erfolgte die Entwicklung von Vakzin-Prototypen für die einmalige Applikation. Neben der Eruierung der Stärke und Dauer der Immunantwort wurde durch Verpaarung der Tiere auch das kontrazeptive Potential in vivo abgeschätzt.
Seit der Einführung von Antibiotika in die medizinische Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten existiert ein Wettlauf zwischen der Evolution von Bakterienresistenzen und der Entwicklung wirksamer Antibiotika. Während bis in die 80er Jahre verstärkt an neuen Antibiotika geforscht wurde, gewinnen multiresistente Keime heute zunehmend die Oberhand. Um einzelne Pathogene erfolgreich nachzuweisen und zu bekämpfen, ist ein grundlegendes Wissen über den Erreger unumgänglich. Bakterielle Proteine, die bei einer Infektion vorrangig vom Immunsystem prozessiert und präsentiert werden, könnten für die Entwicklung von Impfstoffen oder gezielten Therapeutika nützlich sein. Auch für die Diagnostik wären diese immundominanten Proteine interessant. Allerdings herrscht ein Mangel an Wissen über spezifische Antigene vieler pathogener Bakterien, die eine eindeutige Diagnostik eines einzelnen Erregers erlauben würden.
Daher wurden in dieser Arbeit vier verschiedene Humanpathogene mittels Phage Display untersucht: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Borrelia burgdorferi und Clostridium difficile. Hierfür wurden aus der genomischen DNA der vier Erreger Bibliotheken konstruiert und durch wiederholte Selektion und Amplifikation, dem sogenannten Panning, immunogene Proteine isoliert. Für alle Erreger bis auf C. difficile wurden immunogene Proteine aus den jeweiligen Bibliotheken isoliert. Die identifizierten Proteine von N. meningitidis und B. burgdorferi waren größtenteils bekannt, konnten aber in dieser Arbeit durch Phage Display verifiziert werden. Für N. gonorrhoeae wurden 21 potentiell immunogene Oligopeptide isoliert, von denen sechs Proteine als neue zuvor unbeschriebene Proteine mit immunogenem Charakter identifiziert wurden. Von den Phagen-präsentierten Oligopeptide der 21 immunogenen Proteine wurden Epitopmappings mit verschiedenen polyklonalen Antikörpern durchgeführt, um immunogene Bereiche näher zu identifizieren und zu charakterisieren. Bei zehn Proteinen wurden lineare Epitope eindeutig mit drei polyklonalen Antikörpern identifiziert, von fünf weiteren Proteinen waren Epitope mit mindestens einem Antikörper detektierbar. Für eine weitere Charakterisierung der ermittelten Epitope wurden Alaninscans durchgeführt, die eine detaillierte Auskunft über kritische Aminosäuren für die Bindung des Antikörpers an das Epitop geben.
Ausgehend von dem neu identifizierten Protein mit immunogenem Charakter NGO1634 wurden 26 weitere Proteine aufgrund ihrer funktionellen Ähnlichkeit ausgewählt und mithilfe bioinformatischer Analysen auf ihre Eignung zur Entwicklung einer diagnostischen Anwendung analysiert. Durch Ausschluss der meisten Proteine aufgrund ihrer Lokalisation, Membrantopologie oder unspezifischen Proteinsequenz wurden scFv-Antikörper gegen acht Proteine mittels Phage Display generiert und anschließend als scFv-Fc-Fusionsantikörper produziert und charakterisiert.
Die hier identifizierten Proteine und linearen Epitope könnten einen Ansatzpunkt für die Entwicklung einer diagnostischen oder therapeutischen Anwendung bieten. Lineare Epitopsequenzen werden häufig für die Impfstoffentwicklung eingesetzt, sodass vor allem die in dieser Arbeit bestimmten Epitope von Membranproteinen interessante Kandidaten für weitere Untersuchungen in diese Richtung sind. Durch weitere Untersuchungen könnten möglicherweise unbekannte Virulenzfaktoren entdeckt werden, deren Inhibierung einen entscheidenden Einfluss auf Infektionen haben könnten.
Zur Detektion neuer IgE- reaktiver Proteine wurde in dieser Arbeit ein zweidimensionales Proteintrennverfahren verwendet. Resultierende Proteinfraktionen wurden mithilfe von 18 tomatensensibiliesierten Patientenseren im Immunoblot getestet. Detektierte Proteine in der SDS-PAGE wurden mittels LC-MS/MS identifiziert. Dadurch konnten 2 Tomatensamenproteine, die im Immunoblot ein IgE- reaktives Signal zeigten eindeutig mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. Diese Proteine sind Legumin und Vicilin. Durch Sequenzabgleich und Proteinstrukturmodellierung im Vergleich zu bereits bekannten Allergenen (Erdnuss und Cashewnuss), konnte eine hohe Homologie gezeigt werden.
Für alle Organismen ist die Aufrechterhaltung ihres energetischen Gleichgewichts unter fluktuierenden Umweltbedingungen lebensnotwendig. In Eukaryoten steuern evolutionär konservierte Proteinkinasen, die in Pflanzen als SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) bezeichnet werden, die Adaption an Stresssignale aus der Umwelt und an die Limitierung von Nährstoffen und zellulärer Energie. Die Aktivierung von SnRK1 bedingt eine umfangreiche transkriptionelle Umprogrammierung, die allgemein zu einer Repression energiekonsumierender Prozesse wie beispielsweise Zellteilung und Proteinbiosynthese und zu einer Induktion energieerzeugender, katabolischer Stoffwechselwege führt. Wie unterschiedliche Signale zu einer generellen sowie teilweise gewebe- und stressspezifischen SnRK1-vermittelten Antwort führen ist bisher noch nicht ausreichend geklärt, auch weil bislang nur wenige Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion identifiziert wurden. In dieser Arbeit konnte ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk um die SnRK1αUntereinheiten aus Arabidopsis AKIN10/AKIN11 etabliert werden. Dadurch wurden zunächst Mitglieder der pflanzenspezifischen DUF581-Proteinfamilie als Interaktionspartner der SnRK1α-Untereinheiten identifiziert. Diese Proteine sind über ihre konservierte DUF581Domäne, in der ein Zinkfinger-Motiv lokalisiert ist, fähig mit AKIN10/AKIN11 zu interagieren. In planta Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass die DUF581-Proteine eine Verschiebung der nucleo-cytoplasmatischen Lokalisierung von AKIN10 hin zu einer nahezu ausschließlichen zellkernspezifischen Lokalisierung begünstigen sowie die Ko-Lokalisierung von AKIN10 und DUF581-Proteinen im Nucleus. In Bimolekularen Fluoreszenzkomplementations-Analysen konnte die zellkernspezifische Interaktion von DUF581-Proteinen mit SnRK1α-Untereinheiten in planta bestätigt werden. Außerhalb der DUF581-Domäne weisen die Proteine einander keine große Sequenzähnlichkeit auf. Aufgrund ihrer Fähigkeit mit SnRK1 zu interagieren, dem Fehlen von SnRK1Phosphorylierungsmotiven sowie ihrer untereinander sehr variabler gewebs-, entwicklungs- und stimulusspezifischer Expression wurde für DUF581-Proteine eine Funktion als Adaptoren postuliert, die unter bestimmten physiologischen Bedingungen spezifische Substratproteine in den SnRK1-Komplex rekrutieren. Auf diese Weise könnten DUF581Proteine die Interaktion von SnRK1 mit deren Zielproteinen modifizieren und eine Feinjustierung der SnRK1-Signalweiterleitung ermöglichen. Durch weiterführende Interaktionsstudien konnten DUF581-interagierende Proteine darunter Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen sowie regulatorische Proteine gefunden werden, die teilweise ebenfalls Wechselwirkungen mit SnRK1α-Untereinheiten aufzeigten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eines dieser Proteine für das eine Beteiligung an der SnRK1Signalweiterleitung als Transkriptionsregulator vermutet wurde näher charakterisiert. STKR1 (STOREKEEPER RELATED 1), ein spezifischer Interaktionspartner von DUF581-18, gehört zu einer pflanzenspezifischen Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktorfamilie und interagiert in Hefe sowie in planta mit SnRK1. Die zellkernspezifische Interaktion von STKR1 und AKIN10 in Pflanzen unterstützt die Vermutung der kooperativen Regulation von Zielgenen. Weiterhin stabilisierte die Anwesenheit von AKIN10 die Proteingehalte von STKR1, das wahrscheinlich über das 26S Proteasom abgebaut wird. Da es sich bei STKR1 um ein Phosphoprotein mit SnRK1-Phosphorylierungsmotiv handelt, stellt es sehr wahrscheinlich ein SnRK1-Substrat dar. Allerdings konnte eine SnRK1-vermittelte Phosphorylierung von STKR1 in dieser Arbeit nicht gezeigt werden. Der Verlust von einer Phosphorylierungsstelle beeinflusste die Homo- und Heterodimerisierungsfähigkeit von STKR1 in Hefeinteraktionsstudien, wodurch eine erhöhte Spezifität der Zielgenregulation ermöglicht werden könnte. Außerdem wurden Arabidopsis-Pflanzen mit einer veränderten STKR1-Expression phänotypisch, physiologisch und molekularbiologisch charakterisiert. Während der Verlust der STKR1-Expression zu Pflanzen führte, die sich kaum von Wildtyp-Pflanzen unterschieden, bedingte die konstitutive Überexpression von STKR1 ein stark vermindertes Pflanzenwachstum sowie Entwicklungsverzögerungen hinsichtlich der Blühinduktion und Seneszenz ähnlich wie sie auch bei SnRK1α-Überexpression beschrieben wurden. Pflanzen dieser Linien waren nicht in der Lage Anthocyane zu akkumulieren und enthielten geringere Gehalte an Chlorophyll und Carotinoiden. Neben einem erhöhten nächtlichen Stärkeumsatz waren die Pflanzen durch geringere Saccharosegehalte im Vergleich zum Wildtyp gekennzeichnet. Eine Transkriptomanalyse ergab, dass in den STKR1-überexprimierenden Pflanzen unter Energiemangelbedingungen, hervorgerufen durch eine verlängerte Dunkelphase, eine größere Anzahl an Genen im Vergleich zum Wildtyp differentiell reguliert war als während der Lichtphase. Dies spricht für eine Beteiligung von STKR1 an Prozessen, die während der verlängerten Dunkelphase aktiv sind. Ein solcher ist beispielsweise die SnRK1-Signaltransduktion, die unter energetischem Stress aktiviert wird. Die STKR1Überexpression führte zudem zu einer verstärkten transkriptionellen Induktion von Abwehrassoziierten Genen sowie NAC- und WRKY-Transkriptionsfaktoren nach verlängerter Dunkelphase. Die Transkriptomdaten deuteten auf eine stimulusunabhängige Induktion von Abwehrprozessen hin und konnten eine Erklärung für die phänotypischen und physiologischen Auffälligkeiten der STKR1-Überexprimierer liefern.
Die Mykorrhiza (griechisch: mýkēs für „Pilz”; rhiza für „Wurzel”) stellt eine Symbiose zwischen Pilzen und einem Großteil der Landpflanzen dar. Der Pilz verbessert durch die Symbiose die Versorgung der Pflanze mit Nährstoffen, während die Pflanze den Pilz mit Kohlenhydraten versorgt. Die arbuskuläre Mykorrhiza (AM) stellt dabei einen beson-dere Form der Mykorrhiza dar. Der AM-Pilz bildet dabei während der Symbiose die namensgebenden Arbuskeln innerhalb der Wurzelzellen als Ort des primären Nährstoff- austausches aus. Die AM-Symbiose (AMS) ist der Forschungsschwerpunkt dieser Arbeit. Als Modellorganismen wurden Medicago truncatula und Glomus intraradices verwendet. Es wurden Transkriptionsanalysen durchgeführt um u.a. AMS regulierte Transkriptions- faktoren (TFs) zu identifizieren. Die Aktivität der Promotoren von drei der so identifizier-ten AMS-regulierten TFs (MtOFTN, MtNTS, MtDES) wurde mit Hilfe eine Reportergens visualisiert. Der Bereich der größten Promotoraktivität waren in einem Fall nur die ar- buskelhaltigen Zellen (MtOFTN). Im zweiten Fall war der Promotor auch aktiv in nicht arbuskelhaltigen Zellen, jedoch am stärksten aktiv in den arbuskelhaltigen Zellen (MtNTS). Ein weiterer Promotor war in arbuskelhaltigen Zellen und den diesen benach-barten Zellen gleich aktiv (MtDES). Zusätzlich wurden weitere Gene als AMS-reguliert identifiziert und es wurde für drei dieser Gene (MtPPK, MtAmT, MtMDRL) ebenfalls eine Promotor::Reporter-Aktivitäts- studie durchgeführt. Die Promotoren der Kinase (MtPPK) und des Ammoniumtrans-porters (MtAmt) waren dabei ausschließlich in arbuskelhaltigen Zellen aktiv, während die Aktivität des ABC-Transporters (MtMDRL) keinem bestimmten Zelltyp zuzuordnen war. Für zwei weitere identifizierte Gene, ein Kupfertransporter (MtCoT) und ein Zucker- bzw. Inositoltransporter (MtSuT), wurden RNA-Interferenz (RNAi)-Untersuchungen durchgeführt. Dabei stellte sich in beiden Fällen heraus, dass, sobald ein RNAi-Effekt in den transformierten Wurzeln vorlag, diese in einem deutlich geringerem Ausmaß wie in der Wurzelkontrolle von G. intraradices kolonisiert worden sind. Im Falle von MtCoT könnte das aus dem selben Grund geschehen, wie im Falle von MtPt4. Welche Rolle MtSuT genau in der Ausbildung der AMS spielt und welche Rolle Inositol in der Aus- bildung der AMS spielt müsste durch weitere Untersuchungen am Protein untersucht werden. Weitere Untersuchen an den in dieser Arbeit als spezifisch für arbuskelhaltige Zellen gezeigten Genen MtAmT, MtPPK und MtOFTN könnten ebenfalls aufschlussreich für das weitere Verständnis der AMS sein. Dies trifft auch auf die TFs MtNTS und MtDES zu, die zwar nicht ausschließlich arbuskelspezifisch transkribiert werden, aber auch eine Rolle in der Regulation der AMS innerhalb von M. truncatula Wurzeln zu spielen scheinen.
Die Folgen einer lebensmittelbedingten Erkrankung sind zum Teil gravierend, insbesondere für Kinder und immunsupprimierte Menschen. Hierbei gehören Salmonella und Campylobacter zu den häufigsten Erregern, die verantwortlich für gastrointestinale Erkrankungen in Deutschland sind. Trotz umfassender Maßnahmen der EU zur Prävention und Bekämpfung von Salmonellen in Geflügelbeständen und der Lebensmittel-Industrie, wird von einem stagnierenden Trend von Infektionszahlen berichtet. Zoonose-Erreger wie Salmonellen können über Nutztiere in die Nahrungskette des Menschen gelangen, wodurch sich Infektionsherde schnell ausbreiten können. Dabei sind bestehende Präventionsstrategien für Geflügel vorhanden, die aber nicht auf den Menschen übertragbar sind. Folglich sind Diagnostik und Prävention in der Lebensmittelindustrie essentiell. Deshalb besteht ein hoher Bedarf für spezifische, sensitive und zuverlässige Nachweismethoden, die eine Point-of-care Diagnostik gewährleisten. Durch ein wachsendes Verständnis der wirtsspezifischen Faktoren von S. enterica Serovaren kann die Entwicklung sowohl neuartiger diagnostischer Methoden, als auch neuartiger Therapien und Impfstoffe maßgeblich vorangetrieben werden.
Infolgedessen wurde in dieser Arbeit ein infektionsähnliches in vitro Modell für S. Enteritidis etabliert und darauf basierend eine umfassende Untersuchung zur Identifizierung neuer Zielstrukturen für den Erreger durchgeführt. Während einer Salmonellen-Infektion ist die erste zelluläre Barriere im Wirt die Epithelschicht. Dementsprechend wurde eine humane Zelllinie (CaCo 2, Darmepithel) für die Pathogen-Wirt-Studie ausgewählt. Das Salmonellen-Transkriptom und morphologische Eigenschaften der Epithelzellen wurden in verschiedenen Phasen der Salmonellen-Infektion untersucht und mit bereits gut beschriebenen Virulenzfaktoren und Beobachtungen in Bezug gesetzt. Durch dieses Infektionsmodell konnte ein spezifischer Phänotyp für die intrazellulären Salmonellen in den Epithelzellen nachgewiesen werden. Zudem wurde aufgezeigt, dass bereits die Kultivierung in Flüssigmedium einen invasionsaktiven Zustand der Salmonellen erzeugt. Allerdings wurde durch die Kokultivierung mit Epithelzellen eine zusätzliche Expression relevanter Gene induziert, um eine effiziente Adhäsion und Transmembran-Transport zu gewährleisten. Letzterer ist charakteristisch für die intrazelluläre Limitierung von Nährstoffen und prägt den infektionsrelevanten Status. Unter Berücksichtigung dieser Faktoren ergab sich ein Phänotyp, der eindeutig Mechanismen zur Wirtsadaptation und möglicherweise auch Pathogenese aufzeigt. Die intrazellulären Bakterien müssen vom Wirt separiert werden, was ein wesentlicher Schritt für Pathogen-bestimmende Analysen ist. Hierbei wurde mithilfe einer Detergenz-basierten Lyse der eukaryotischen Zellmembran und differentieller Zentrifugation, der eukaryotische Eintrag minimal gehalten. Unter Verwendung der Virulenz-adaptierten Salmonellen wurden Untersuchungen in Hinblick auf die Identifizierung neuer Zielstrukturen für S. Enteritidis durchgeführt. Mithilfe eines immunologischen Screenings wurden neue potentielle Antigene entdeckt. Zu diesem Zweck wurden bakterielle cDNA-basierte Expressionsbibliotheken hergestellt, die durch eine vereinfachte Microarray-Anwendung ein Hochdurchsatzscreening von Proteinen als potentielle Binder ermöglichen. Folglich konnten neue unbeschriebene Proteine identifiziert werden, die sich durch eine Salmonella-Spezifität oder Membranständigkeit auszeichnen. Ebenso wurde ein Vergleich der im Screening identifizierten Proteine mit der Regulation der kodierenden Gene im infektionsähnlichen Modell durchgeführt. Dabei wurde deutlich, dass die Häufigkeit von Transkripten einen Einfluss auf die Verfügbarkeit in der cDNA-Bibliothek und folglich auch auf die Expressionsbibliothek nimmt. Angesichts eines Ungleichgewichts zwischen der Gesamtzahl protein-kodierender Gene in S. Enteritidis zu möglichen Klonen, die während des Microarray-Screenings untersucht werden können, besteht der Bedarf einer Anreicherung von Proteinen in der Expressionsbibliothek. Das infektionsähnliche Modell zeigte, dass nicht nur Virulenz-assoziierte, sondern auch Stress- und Metabolismus-relevante Gene hochreguliert werden. Durch die Konstruktion dieser spezifischen cDNA-Bibliotheken ist die Erkennung von charakteristischen molekularen Markern gegeben.
Weiterhin wurden anhand der Transkriptomanalyse spezifisch hochregulierte Gene identifiziert, die relevant für das intrazelluläre Überleben von S. Enteritidis in humanen Epithelzellen sind. Hiervon wurden drei Gene näher untersucht, indem ihr Einfluss im infektionsähnlichen Modell mittels entsprechender Gen-Knockout-Stämme analysiert wurde. Dabei wurde für eine dieser Mutanten ein reduziertes Wachstum in der späten intrazellulären Phase nachgewiesen. Weiterführende in vitro Analysen sind für die Charakterisierung des Knockout-Stamms notwendig, um den Einsatz als potenzielles Therapeutikum zu verifizieren.
Zusammenfassend wurde ein in vitro Infektionsmodell für S. Enteritidis etabliert, wodurch neue Zielstrukturen des Erregers identifiziert wurden. Diese sind für diagnostische oder therapeutische Anwendungen interessant. Das Modell lässt sich ebenso für andere intrazelluläre Pathogene übertragen und gewährleistet eine zuverlässige Identifizierung von potentiellen Antigenen.
Homogene Immunoassays sind immunologische Testverfahren, bei deren Durchführung vollständig auf Separations- und Waschschritte verzichtet werden kann. Der Substrate Channeling Immunoassay beruht auf der Weitergabe eines Substrates in einem immunologischen Komplex aus zwei Enzymen. Das Produkt des ersten Enzyms dient dem zweiten Enzym als Substrat zur Generierung eines photometrisch nachweisbaren Produktes. Voraussetzung für diese Weitergabe ist die enge räumliche Nähe beider Enzyme. Diese Nähe wird durch eine Bindung zwischen Analyt und anti-Analyt Antikörper vermittelt. Ein solcher Substrate Channeling Immunoassay wurde unter Verwendung der Enzyme Glucoseoxidase und Peroxidase aufgebaut. Das so etablierte System war funktionstüchtig, jedoch blieb seine Sensitivität hinter der normaler, heterogener Immunoassays zurück. Die Grundlage eines Fluorescence Quenching Immunoassays ist der gegenseitige Ausschluß zweier Antikörper bei der Bindung eines Dihapten-Konjugates. Das Konjugat besteht dabei aus dem Analyten und einem Fluorophor. Die beiden um die Konjugatbindung konkurrierenden Antikörper sind ein anti-Analyt Antikörper und ein anti-Fluorophor Antikörper, der zudem über die Eigenschaft verfügt, bei Bindung des Fluorophors dessen Fluoreszenz zu löschen. Externe Gaben des freien Analyten verschieben das eingestellte Gleichgewicht in Richtung Fluorophor-Bindung und damit Fluoreszenz-Löschung. Die Änderung der Fluoreszenz ist direkt an die Konzentration des freien Analyten gekoppelt und dient zu deren Bestimmung. Ein solcher Fluorescence Quenching Immunoassays wurde für die Konzentrationsbestimmung des Herbizides Diuron etabliert. Die erreichten Sensitivitäten erlauben die praktische, immundiagnostische Anwendung des Systems. Ein Dihapten-Konjugat wurde ebenfalls zum Aufbau eines Verfahrens zur Selektion Antikörper produzierender Zellen eingesetzt. Die Selektion der Antikörper produzierenden Zellen erfolgt unter Verwendung eines Toxinkonjugates. Dieses Konjugat besteht aus einem Liganden und einem Toxin. Die Antikörperbindung des Liganden behindert sterisch die Wechselwirkung der Toxinkomponente im Konjugat mit deren Zielstruktur in oder auf der Zelle. Nur Zellen die einen geeigneten Antikörper sezernieren, überleben die Selektion und reichern sich in der Kultur an. Das Selektionsverfahren wurde erfolgreich für die Selektion von E.coli Zellen eingesetzt, die einen rekombinanten, Fluorescein bindenden Antikörper produzierten. Das hierfür synthetisierte Toxinkonjugat bestand aus Fluorescein (Ligand) und Ampicillin (Toxinkomponente). Eine Ablösung der bisher für diese Aufgabe gebräuchlichen, außerordentlich kostenintensiven, Screening Methoden wird damit möglich.
Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleinsäure-basierte Methoden für den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchführbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleinsäure-basierten Diagnostik kann durch die Einführung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kostengünstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielfältige Detektionsmöglichkeiten, die sowohl für Schnelltest- als auch für Monitoring-Anwendungen geeignet sind.
Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode für den einfachen, schnellen und günstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abhängiger Detektionsverfahren. Hier wurden zunächst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe für die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden können. Als Alternative für die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe für den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus für die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt.
Ergebnisse: Für den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivität zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegenüber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zusätzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen für die Endpunktdetektion verwendet werden. Darüber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das für den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch für die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zusätzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abhängige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP über das Pyrophosphat identifiziert werden. Dafür wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilität und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden können. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabhängigkeit zwischen den einzelnen Komponenten für einen fluorimetrischen Verdrängungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verhältnis’ als Intensitätsmatrix (heatmap) konnten zunächst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als günstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abhängige Zunahme der Fluoreszenzintensität. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich für die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilität und Homogenität der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tröpfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S möglich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abhängige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gewährleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die Rückfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivität am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur möglich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification“ (HIP) konnte abschließend durch die Verkürzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-ähnlichen Primer verbessert werden.
Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsfähigen Alternative für die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsfähigkeit der qualitativen und quantitativen LAMP für die Feldanwendungen und für die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden können und so eine einfache Pathogendiagnostik ermöglichen. Die gezeigten Methoden können darüber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegenüber den herkömmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP für den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei können die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abhängigen Reaktionen ermöglicht darüber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zukünftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik möglich.
Biomakromoleküle sind in der Natur für viele Abläufe in lebenden Organismen verantwortlich. Dies reicht vom Aufbau der extrazellulären Matrix und dem Cytoskelett über die Erkennung von Botenstoffen durch Rezeptoren bis hin zur Katalyse der verschiedensten Reaktionen in den Zellen selbst. Diese Aufgaben werden zum größten Teil von Proteinen übernommen, und besonders das spezifische Erkennen der Interaktionspartner ist für alle diese Moleküle äußerst wichtig, um eine fehlerfreie Funktion zu gewährleisten. Als Alternative zur evolutiven Erzeugung von optimalen Bindern und Katalysatoren auf der Basis von Aminosäuren und Nukleotiden wurden von Wulff, Shea und Mosbach synthetische molekular geprägte Polymere (molecularly imprinted polymers, MIPs) konzipiert. Das Prinzip dieser künstlichen Erkennungselemente beruht auf der Tatsache, dass sich funktionelle Monomere spezifisch um eine Schablone (Templat) anordnen. Werden diese Monomere dann vernetzend polymerisiert, entsteht ein Polymer mit molekularen Kavitäten, in denen die Funktionalitäten komplementär zum Templat fixiert sind. Dadurch ist die selektive Bindung des Templats in diese Kavitäten möglich. Aufgrund ihrer hohen chemischen und thermischen Stabilität und ihrer geringen Kosten haben “bio-inspirierte” molekular geprägte Polymere das Potential, biologische Erkennungselemente in der Affinitätschromatographie sowie in Biosensoren und Biochips zu ersetzen. Trotz einiger publizierter Sensorkonfigurationen steht der große Durchbruch noch aus. Ein Hindernis für Routineanwendungen ist die Signalgenerierung bei Bindung des Analyten an das Polymer. Eine Möglichkeit für die markerfreie Detektion ist die Benutzung von Kalorimetern, die Bindungs- oder Reaktionswärmen direkt messen können. In der Enzymtechnologie wird der Enzym-Thermistor für diesen Zweck eingesetzt, da enzymatische Reaktionen eine Enthalpie in einer Größenordnung von 5 – 100 kJ/mol besitzen. In dieser Arbeit wird die Herstellung von katalytisch geprägten Polymeren nach dem Verfahren des Oberflächenprägens erstmalig beschrieben. Die Methode zur Immobilisierung des Templats auf der Oberfläche von porösem Kieselgel sowie die Polymerzusammensetzung wurden optimiert. Weiter wird die Evaluation der katalytischen Eigenschaften über einen optischen Test, sowie das erste Mal die Kombination eines kalorimetrischen Transduktors – des Thermistors – mit der Analyterkennung durch ein katalytisch aktives MIP gezeigt. Bei diesen Messungen konnte zum ersten Mal gleichzeitig die Bindung/Desorption, sowie die katalytische Umwandlung des Substrats durch konzentrationsabhängige Wärmesignale nachgewiesen werden.
Biogene Amine sind kleine organische Verbindungen, die sowohl bei Vertebraten als auch bei Invertebraten als Neurotransmitter, Neuromodulatoren und/oder Neurohormone wirken. Sie bilden eine bedeutende Gruppe von Botenstoffen und entfalten ihre Wirkungen vornehmlich über die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Bei Insekten wurde eine Vielzahl von Wirkungen biogener Amine beschrieben. Das führte schon frühzeitig zur Vermutung, dass Insekten (u. a. Invertebraten) wie die Wirbeltiere ein diverses Repertoire an aminergen Rezeptoren besitzen. Für ein umfassendes Verständnis der komplexen physiologischen Wirkungen biogener Amine fehlten jedoch wichtige Informationen über die molekulare Identität der entsprechenden Rezeptorproteine und ihrer pharmakologischen Eigenschaften, ihre Lokalisation und ihre intrazellulären Reaktionspartner. Viele bei Schaben gut untersuchte (neuro)physiologische Prozesse sowie Verhaltensweisen werden durch Serotonin und Dopamin gesteuert bzw. moduliert. Über die beteiligten Rezeptoren ist jedoch bisher vergleichsweise wenig bekannt. Die Klonierung und Charakterisierung von Serotonin- und Dopaminrezeptoren der Amerikanischen Schabe P. americana ist damit ein längst überfälliger Schritt auf dem Weg zu einem umfassenden Verständnis der vielfältigen Wirkungen biogener Amine bei Insekten. Durch die Anwendung verschiedener Klonierungsstrategien konnten cDNAs isoliert werden, die für potentielle Serotoninrezeptoren und einen Dopaminrezeptor kodieren. Die Sequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu Mitgliedern der 5-HT1- und 5-HT7-Rezeptorklassen bzw. den Invertebratentyp-Dopaminrezeptoren auf. Die isolierten Rezeptoren der Amerikanischen Schabe wurden dementsprechend Pea(Periplaneta americana)5-HT1, Pea5-HT7 und PeaDop2 benannt. Das Hydropathieprofil dieser Rezeptoren postuliert das Vorhandensein der charakteristischen heptahelikalen Architektur G-Protein-gekoppelter Rezeptoren. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen typische Merkmale aminerger Rezeptoren. So sind Aminosäuren, die bedeutend für die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an GProteine sind, in den Rezeptoren konserviert. Expressionsstudien zeigten eine auffallend hohe Expression aller drei Rezeptor-mRNAs im Gehirn sowie in den Speicheldrüsen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden polyklonale Antikörper gegen den Pea5-HT1-Rezeptor sowie den PeaDop2-Rezeptor hergestellt. Der anti-Pea5-HT1-Antikörper detektiert im Homogenat von Schabengehirnen, Speicheldrüsen und Pea5-HT1-exprimierenden HEK 293-Zellen die glykosylierte Form des Rezeptors. In Gehirnschnitten markiert der anti-Pea5-HT1-Antikörper spezifisch einige Zellkörper in der Pars intercerebralis und deren Axone, welche in den Corpora cardiaca Nerv I projizieren. Der PeaDop2-Rezeptor wurde durch den spezifischen anti-PeaDop2-Antikörper in Neuronen mit Somata im anterioren Randbereich der Medulla nachgewiesen. Diese Neurone innervieren die optischen Loben und projizieren in das ventrolaterale Protocerebrum. Die intrazellulären Signalwege der heterolog exprimierten Pea5-HT1- und PeaDop2-Rezeptoren wurden in HEK 293-Zellen untersucht. Die Aktivierung des Pea5-HT1-Rezeptors durch Serotonin führt zur Hemmung der cAMP-Synthese. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der Rezeptor konstitutive Aktivität besitzt. WAY 100635, ein hoch selektiver 5-HT1A-Rezeptorantagonist, wurde als wirksamer inverser Agonist am Pea5-HT1-Rezeptor identifiziert. Der stabil exprimierte PeaDop2-Rezeptor antwortet auf eine Aktivierung durch Dopamin mit einer Erhöhung der cAMP-Konzentration. Eine C-terminal trunkierte Variante dieses Rezeptors ist eigenständig nicht funktional. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit indizieren, dass die untersuchten aminergen Rezeptoren im zentralen Nervensystems der Schabe an der Informationsverarbeitung beteiligt sind und verschiedene physiologische Prozesse in peripheren Organen regulieren. Mit der Klonierung und funktionellen Charakterisierung der ersten Serotoninrezeptoren und eines Dopaminrezeptors ist damit eine wichtige Grundlage für die Untersuchung ihrer Funktionen geschaffen worden.