570 Biowissenschaften; Biologie
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Im Fokus dieser Arbeit stand der Aufbau einer auf DNA basierenden Nanostruktur. Der universelle Vier-Buchstaben-Code der DNA ermöglicht es, Bindungen auf molekularer Ebene zu adressieren. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der DNA prädestinieren dieses Makromolekül für den Einsatz und die Verwendung als Konstruktionselement zum Aufbau von Nanostrukturen. Das Ziel dieser Arbeit war das Aufspannen eines DNA-Stranges zwischen zwei Fixpunkten. Hierfür war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, welche es ermöglicht, Funktionsmoleküle als Ankerelemente ortsaufgelöst auf eine Oberfläche zu deponieren. Das Deponieren dieser Moleküle sollte dabei im unteren Mikrometermaßstab erfolgen, um den Abmaßen der DNA und der angestrebten Nanostruktur gerecht zu werden. Das eigens für diese Aufgabe entwickelte Verfahren zum ortsaufgelösten Deponieren von Funktionsmolekülen nutzt das Bindungspaar Biotin-Neutravidin. Mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops (AFM) wurde eine zu einem „Stift“ umfunktionierte Rasterkraftmikroskopspitze so mit der zu deponierenden „Tinte“ beladen, dass das Absetzen von Neutravidin im unteren Mikrometermaßstab möglich war. Dieses Neutravidinmolekül übernahm die Funktion als Bindeglied zwischen der biotinylierten Glasoberfläche und dem eigentlichen Adressmolekül. Das somit generierte Neutravidin-Feld konnte dann mit einem biotinylierten Adressmolekül durch Inkubation funktionalisiert werden. Namensgebend für dieses Verfahren war die Möglichkeit, Neutravidin mehrmals zu deponieren und zu adressieren. Somit ließ sich sequenziell ein Mehrkomponenten-Feld aufbauen. Die Einschränkung, mit einem AFM nur eine Substanz deponieren zu können, wurde so umgangen. Ferner mußten Ankerelemente geschaffen werden, um die DNA an definierten Punkten immobilisieren zu können. Die Bearbeitung der DNA erfolgte mit molekularbiologischen Methoden und zielte darauf ab, einen DNA-Strang zu generieren, welcher an seinen beiden Enden komplementäre Adressequenzen enthält, um gezielt mit den oberflächenständigen Ankerelementen binden zu können. Entsprechend der Geometrie der mit dem AFM erzeugten Fixpunkte und den oligonukleotidvermittelten Adressen kommt es zur Ausbildung einer definierten DNA-Struktur. Mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden wurde die aufgebaute DNA-Nanostruktur nachgewiesen. Der Nachweis der nanoskaligen Interaktion von DNA-bindenden Molekülen mit der generierten DNA-Struktur wurde durch die Bindung von PNA (peptide nucleic acid) an den DNA-Doppelstrang erbracht. Diese PNA-Bindung stellt ihrerseits ein funktionales Strukturelement im Nanometermaßstab dar und wird als Nanostrukturbaustein verstanden.
Die Bittergeschmacksrezeptoren stellen in der Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine besondere Gruppe dar. Im Menschen können die 25 Rezeptoren eine große Anzahl unterschiedlichster Bittergeschmacksstoffe detektieren. Diese Substanzen können sowohl schädlich, wie etwa Strychnin, als auch der Gesundheit förderliche Arzneistoffe, wie etwa Chloramphenicol sein. Unter den Bittergeschmacksrezeptoren des Menschen gibt es eine Gruppe von drei Rezeptoren, die besonders viele Bitterstoffe detektieren können. Einer von ihnen ist der Rezeptor hTAS2R10. In dieser Arbeit konnte sowohl experimentell als auch durch computergestützte Modellierung gezeigt werden, dass der hTAS2R10 nur eine Bindungstasche besitzt. Das stimmt mit den bisher ausführlich experimentell und in silico untersuchten Rezeptoren hTAS2R1, -R16, -R38 und -R46 überein. Die für die Agonisteninteraktionen nachweislich wichtigen Transmembrandomänen sind in den bisher untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren, wie auch im hTAS2R10, die Transmembrandomänen 3, 5, 6 und 7. Die Untersuchungen zeigten, dass die Bindungstasche des hTAS2R10 in der oberen Hälfte des zum extrazellulären Raum gerichteten Bereichs lokalisiert ist. Insbesondere konnte für die untersuchten Agonisten Strychnin, Parthenolid und Denatoniumbenzoat gezeigt werden, dass die Seitenketten der Aminosäuren in Position 3.29 und 5.40 ausgeprägte agonistenselektive Wechselwirkungen eingehen. Weitere Untersuchungen haben ergeben, dass das weitgefächerte Agonistenspektrum des hTAS2R10 zu Lasten der Sensitivität für einzelne Bitterstoffe geht. Der Vergleich wichtiger Positionen im hTAS2R10, hTAS2R46 und mTas2r105 hat deutlich gemacht, dass sich die Bindungsmodi zwischen diesen Rezeptoren unterscheiden. Dies deutet auf eine getrennte evolutionäre Entwicklung der Bindungseigenschaften dieser Rezeptoren hin. Gleichfalls zeigten die Untersuchungen, dass einige Positionen wie z.B. 7.39 die Funktion aller untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren prägen, sich jedoch die genaue Bedeutung im jeweiligen Rezeptor unterscheiden kann. Einzelne dieser Positionen konnten auch bei der Agonisteninteraktion des Rhodopsins und des β2-adrenergen Rezeptors beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit helfen dabei die Wechselwirkungen zwischen Bitterstoffen und den Bittergeschmacksrezeptoren zu verstehen und geben erste Einblicke in die Entwicklung der Rezeptoren in Hinblick auf ihren Funktionsmechanismus. Diese Erkenntnisse können genutzt werden, um Inhibitoren zu entwickeln, die sowohl ein wichtiges Werkzeug in der Rezeptoranalytik wären, als auch dazu genutzt werden könnten, den unerwünschten bitteren Geschmack von Medikamenten oder gesundheitsfördernden sekundären Pflanzenstoffen zu mindern. Damit könnte ein Beitrag zur Gesundheit der Menschen geleistet werden.
Cellulose is the most abundant biopolymer on earth and the main load-bearing structure in plant cell walls. Cellulose microfibrils are laid down in a tight parallel array, surrounding plant cells like a corset. Orientation of microfibrils determines the direction of growth by directing turgor pressure to points of expansion (Somerville et al., 2004). Hence, cellulose deficient mutants usually show cell and organ swelling due to disturbed anisotropic cell expansion (reviewed in Endler and Persson, 2011). How do cellulose microfibrils gain their parallel orientation? First experiments in the 1960s suggested, that cortical microtubules aid the cellulose synthases on their way around the cell (Green, 1962; Ledbetter and Porter, 1963). This was proofed in 2006 through life cell imaging (Paredez et al., 2006). However, how this guidance was facilitated, remained unknown. Through a combinatory approach, including forward and reverse genetics together with advanced co-expression analysis, we identified pom2 as a cellulose deficient mutant. Map- based cloning revealed that the gene locus of POM2 corresponded to CELLULOSE SYNTHASE INTERACTING 1 (CSI1). Intriguingly, we previously found the CSI1 protein to interact with the putative cytosolic part of the primary cellulose synthases in a yeast-two-hybrid screen (Gu et al., 2010). Exhaustive cell biological analysis of the POM2/CSI1 protein allowed to determine its cellular function. Using spinning disc confocal microscopy, we could show that in the absence of POM2/CSI1, cellulose synthase complexes lose their microtubule-dependent trajectories in the plasma membrane. The loss of POM2/CSI1, however does not influence microtubule- dependent delivery of cellulose synthases (Bringmann et al., 2012). Consequently, POM2/CSI1 acts as a bridging protein between active cellulose synthases and cortical microtubules. This thesis summarizes three publications of the author, regarding the identification of proteins that connect cellulose synthases to the cytoskeleton. This involves the development of bioinformatics tools allowing candidate gene prediction through co-expression studies (Mutwil et al., 2009), identification of candidate genes through interaction studies (Gu et al., 2010), and determination of the cellular function of the candidate gene (Bringmann et al., 2012).
Die Fähigkeit, mit anderen Zellen zu kommunizieren, ist eine grundlegende Eigenschaft aller lebenden Zellen und essentiell für die normale Funktionsweise vielzelliger Organismen. Die Speicheldrüsen der Schmeißfliege Calliphora vicina bilden ein ausgezeichnetes physiologisches Modellsystem um zelluläre Signaltransduktionsprozesse an einem intakten Organ zu untersuchen. Die Speichelsekretion wird dabei hormonell durch das biogene Amin Serotonin (5-Hydroxytryptamin; 5-HT) reguliert. 5-HT aktiviert in den sekretorischen Zellen der Drüsen über die Bindung an mindestens zwei membranständige G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) zwei separate Signalwege, den IP3/Ca2+- und den cAMP-Signalweg. Zur Identifizierung und Charakterisierung der 5-HT-Rezeptoren in den Speicheldrüsen von Calliphora wurden unter Anwendung verschiedener Klonierungsstrategien zwei cDNAs (Cv5-ht2α und Cv5-ht7) isoliert, die große Ähnlichkeit zu 5-HT2- und 5-HT7-Rezeptoren aus Säugetieren aufweisen. Die Hydropathieprofile der abgeleiteten Aminosäuresequenzen postulieren die für GPCRs charakteristische heptahelikale Architektur. Alle Aminosäuremotive, die für die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an G-Proteine essentiell sind, liegen konserviert vor. Interessanterweise wurde für den Cv5-HT7-Rezeptor eine zusätzliche hydrophobe Domäne im N Terminus vorhergesagt. Die Cv5-HT2α-mRNA liegt in zwei alternativ gespleißten Varianten vor. Mittels RT-PCR-Experimenten konnte die Expression beider Rezeptoren in Gehirn und Speicheldrüsen adulter Fliegen nachgewiesen werden. Ein Antiserum gegen den Cv5-HT7 Rezeptor markiert in den Speicheldrüsen die basolaterale Plasmamembran. Die Expression der Rezeptoren in einem heterologen System (HEK 293-Zellen) bestätigte diese als funktionelle 5-HT Rezeptoren. So führte die Stimulation mit Serotonin für den Cv5-HT2α zu einer dosis-abhängigen Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration ([Ca2+]i, EC50 = 24 nM). In Cv5-HT7-exprimierenden Zellen löste 5-HT dosisabhängig (EC50 = 4,1 nM) einen Anstieg der intrazellulären cAMP Konzentration ([cAMP]i) aus. Für beide heterolog exprimierten Rezeptoren wurden pharmakologische Profile erstellt. Liganden, die eine Rezeptorsubtyp-spezifische Wirkung vermuten ließen, wurden daraufhin auf ihre Wirkung auf das transepitheliale Potential (TEP) intakter Speicheldrüsenpräparate getestet. Drei 5-HT-Rezeptoragonisten: AS 19, R-(+)-Lisurid und 5-Carboxamidotryptamin führten zu einer cAMP-abhängigen Positivierung des TEP durch eine selektive Aktivierung der 5 HT7-Rezeptoren. Eine selektive Aktivierung des Ca2+-Signalweges durch den Cv5-HT2 Rezeptor ist mit Hilfe von 5-Methoxytryptamin möglich. Dagegen konnte Clozapin im TEP als selektiver Cv5-HT7-Rezeptorantagonist bestätigt werden. Die Kombination eines molekularen Ansatzes mit physiologischen Messungen ermöglichte somit die Identifikation selektiver Liganden für 5-HT2- bzw. 5-HT7-Rezeptoren aus Calliphora vicina. Dies ermöglicht zukünftig eine separate Aktivierung der 5-HT-gesteuerten Signalwege und erleichtert dadurch die weitere Erforschung der intrazellulären Signalwege und ihrer Wechselwirkungen.
Ten polyQ (polyglutamine) diseases constitute a group of hereditary, neurodegenerative, lethal disorders, characterized by neuronal loss and motor and cognitive impairments. The only common molecular feature of polyQ disease-associated proteins is the homopolymeric polyglutamine repeat. The pathological expansion of polyQ tract invariably leads to protein misfolding and aggregation, resulting in formation of the fibrillar intraneuronal deposits (aggregates) of the disease protein. The polyQ-related cellular toxicity is currently attributed to early, small, soluble aggregate species (oligomers), whereas end-stage, fibrillar, insoluble aggregates are considered to be benign. In the complex cellular environment aggregation and toxicity of mutant polyQ proteins can be affected by both the sequences of the corresponding disease protein (factors acting in cis) and the cellular environment (factors acting in trans). Additionally, the nucleus has been suggested to be the primary site of toxicity in the polyQ-based neurodegeneration. In this study, the dynamics and structure of nuclear and cytoplasmic inclusions were examined to determine the intrinsic and extrinsic factors influencing the cellular aggregation of atrophin-1, a protein implicated in the pathology of dentatorubral-pallidoluysian atrophy (DRPLA), a polyQ-based disease with complex clinical features. Dynamic imaging, combined with biochemical and biophysical approaches revealed a large heterogeneity in the dynamics of atrophin-1 within the nuclear inclusions compared with the compact and immobile cytoplasmic aggregates. At least two types of inclusions of polyQ-expanded atrophin-1 with different mobility of the molecular species and ability to exchange with the surrounding monomer pool coexist in the nucleus of the model cell system, neuroblastoma N2a cells. Furthermore, our novel cross-seeding approach which allows for monitoring of the architecture of the aggregate core directly in the cell revealed an evolution of the aggregate core of the polyQ-expanded ATN1 from one composed of the sequences flanking the polyQ domain at early aggregation phases to one dominated by the polyQ stretch in the later aggregation phase. Intriguingly, these changes in the aggregate core architecture of nuclear and cytoplasmic inclusions mirrored the changes in the protein dynamics and physico-chemical properties of the aggregates in the aggregation time course. 2D-gel analyses followed by MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) were used to detect alterations in the interaction partners of the pathological ATN1 variant compared to the non-pathological ATN1. Based on these results, we propose that the observed complexity in the dynamics of the nuclear inclusions provides a molecular explanation for the enhanced cellular toxicity of the nuclear aggregates in polyQ-based neurodegeneration.
Die Erkennung komplexer Kohlenhydrate durch das Tailspike Protein aus dem Bakteriophagen HK620
(2012)
Kohlenhydrate stellen aufgrund der strukturellen Vielfalt und ihrer oft exponierten Lage auf Zelloberflächen wichtige Erkennungsstrukturen dar. Die Wechselwirkungen von Proteinen mit diesen Kohlenhydraten vermitteln einen spezifischen Informationsaustausch. Protein-Kohlenhydrat-Interaktionen und ihre Triebkräfte sind bislang nur teilweise verstanden, da nur wenig strukturelle Daten von Proteinen im Komplex mit vorwiegend kleinen Kohlenhydraten erhältlich sind. Mit der vorliegenden Promotionsarbeit soll ein Beitrag zum Verständnis von Protein-Kohlenhydrat-Wechselwirkungen durch Analysen struktureller Thermodynamik geleistet werden, um zukünftig Vorhersagen mit zuverlässigen Algorithmen zu erlauben. Als Modellsystem zur Erkennung komplexer Kohlenhydrate diente dabei das Tailspike Protein (TSP) aus dem Bakteriophagen HK620. Dieser Phage erkennt spezifisch seinen E. coli-Wirt anhand der Oberflächenzucker, der sogenannten O-Antigene. Dabei binden die TSP des Phagen das O-Antigen des Lipopolysaccharids (LPS) und weisen zudem eine hydrolytische Aktivität gegenüber dem Polysaccharid (PS) auf. Anhand von isolierten Oligosacchariden des Antigens (Typ O18A1) wurde die Bindung an HK620TSP und verschiedener Varianten davon systematisch analysiert. Die Bindung der komplexen Kohlenhydrate durch HK620TSP zeichnet sich durch große Interaktionsflächen aus. Durch einzelne Aminosäureaustausche im aktiven Zentrum wurden Varianten generiert, die eine tausendfach erhöhte Affinität (KD ~ 100 nM) im Vergleich zum Wildtyp-Protein (KD ~ 130 μM) aufweisen. Dabei zeichnet sich das System dadurch aus, dass die Bindung bei Raumtemperatur nicht nur enthalpisch, sondern auch entropisch getrieben wird. Ursache für den günstigen Entropiebeitrag ist die große Anzahl an Wassermolekülen, die bei der Bindung des Hexasaccharids verdrängt werden. Röntgenstrukturanalysen zeigten für alle TSP-Komplexe außer für Variante D339N unabhängig von der Hexasaccharid-Affinität analoge Protein- und Kohlenhydrat-Konformationen. Dabei kann die Bindestelle in zwei Regionen unterteilt werden: Zum einen befindet sich am reduzierenden Ende eine hydrophobe Tasche mit geringen Beiträgen zur Affinitätsgenerierung. Der Zugang zu dieser Tasche kann ohne große Affinitätseinbuße durch einen einzelnen Aminosäureaustausch (D339N) blockiert werden. In der zweiten Region kann durch den Austausch eines Glutamats durch ein Glutamin (E372Q) eine Bindestelle für ein zusätzliches Wassermolekül generiert werden. Die Rotation einiger Aminosäuren bei Kohlenhydratbindung führt zur Desolvatisierung und zur Ausbildung von zusätzlichen Wasserstoffbrücken, wodurch ein starker Affinitätsgewinn erzielt wird. HK620TSP ist nicht nur spezifisch für das O18A1-Antigen, sondern erkennt zudem das um eine Glucose verkürzte Oligosaccharid des Typs O18A und hydrolysiert polymere Strukturen davon. Studien zur Bindung von O18A-Pentasaccharid zeigten, dass sich die Triebkräfte der Bindung im Vergleich zu dem zuvor beschriebenen O18A1-Hexasaccharid verschoben haben. Durch Fehlen der Seitenkettenglucose ist die Bindung im Vergleich zu dem O18A1-Hexasaccharid weniger stark entropisch getrieben (Δ(-TΔS) ~ 10 kJ/mol), während der Enthalpiebeitrag zu der Bindung günstiger ist (ΔΔH ~ -10 kJ/mol). Insgesamt gleichen sich diese Effekte aus, wodurch sehr ähnliche Affinitäten der TSP-Varianten zu O18A1-Hexasaccharid und O18A-Pentasaccharid gemessen wurden. Durch die Bindung der Glucose werden aus einer hydrophoben Tasche vier Wassermoleküle verdrängt, was entropisch stark begünstigt ist. Unter enthalpischen Aspekten ist dies ebenso wie einige Kontakte zwischen der Glucose und einigen Resten in der Tasche eher ungünstig. Die Bindung der Glucose in die hydrophobe Tasche an HK620TSP trägt somit nicht zur Affinitätsgenerierung bei und es bleibt zu vermuten, dass sich das O18A1-Antigen-bindende HK620TSP aus einem O18A-Antigen-bindenden TSP evolutionär herleitet. In dem dritten Teilprojekt der Dissertation wurde der Infektionsmechanismus des Phagen HK620 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass analog zu dem verwandten Phagen P22 die Ejektion der DNA aus HK620 allein durch das Lipopolysaccharid (LPS) des Wirts in vitro induziert werden kann. Die Morphologie und Kettenlänge des LPS sowie die Aktivität von HK620TSP gegenüber dem LPS erwiesen sich dabei als essentiell. So konnte die DNA-Ejektion in vitro auch durch LPS aus Bakterien der Serogruppe O18A induziert werden, welches ebenfalls von dem TSP des Phagen gebunden und hydrolysiert wird. Diese Ergebnisse betonen die Rolle von TSP für die Erkennung der LPS-Rezeptoren als wichtigen Schritt für die Infektion durch die Podoviren HK620 und P22.
Charakterisierung der neuen centrosomalen Proteine CP148 und CP55 in Dictyostelium discoideum
(2012)
Das im Cytosol liegende Dictyostelium Centrosom ist aus einer geschichteten Core-Region aufgebaut, die von einer Mikrotubuli-nukleierenden Corona umgeben ist. Zudem ist es über eine spezifische Verbindung eng an den Kern geknüpft und durch die Kernmembran hindurch mit den geclusterten Centromeren verbunden. Beim G2/M Übergang dissoziiert die Corona vom Centrosom und der Core verdoppelt sich so dass zwei Spindelpole entstehen. CP55 und CP148 wurden in einer Proteom-Analyse des Centrosoms identifiziert. CP148 ist ein neues coiled-coil Protein der centrosomalen Corona. Es zeigt eine zellzyklusabhängige An- und Abwesenheit am Centrosom, die mit der Dissoziation der Corona in der Prophase und ihrer Neubildung in der Telophase korreliert. Während der Telophase erschienen in GFP-CP148 exprimierenden Zellen viele, kleine GFP-CP148-Foci im Cytoplasma, die zum Teil miteinander fusionierten und zum Centrosom wanderten. Daraus resultierte eine hypertrophe Corona in Zellen mit starker GFP-CP148 Überexpression. Ein Knockdown von CP148 durch RNAi führte zu einem Verlust der Corona und einem ungeordneten Interphase Mikrotubuli-Cytoskelett. Die Bildung der mitotischen Spindel und der astralen Mikrotubuli blieb davon unbeeinflusst. Das bedeutet, dass die Mikrotubuli-Nukleationskomplexe während der Interphase und Mitose über verschiedene Wege mit dem Core assoziiert sind. Des Weiteren bewirkte der Knockdown eine Dispersion der Centromere sowie eine veränderte Sun1 Lokalisation in der Kernhülle. Somit spielt CP148 ebenso eine Rolle in der Centrosomen-Centromer-Verbindung. Zusammengefasst ist CP148 ein essentielles Protein für die Bildung und Organisation der Corona, welche wiederum für die Centrosom/Centromer Verbindung benötigt wird. CP55 wurde als Protein der Core-Region identifiziert und verbleibt während des Zellzyklus am Centrosom. Dort besitzt es strukturelle Aufgaben, da die Mehrheit der GFP-CP55 Moleküle in der Interphase keine Mobilität zeigten. Die GFP-CP55 Überexpression führte zur Bildung von überzähligen Centrosomen mit der üblichen Ausstattung an Markerproteinen der Corona und des Cores. CP55 Knockout-Zellen waren durch eine erhöhte Ploidie, eine weniger strukturierte und leicht vergrößerte Corona sowie zusätzliche cytosolische Mikrotubuli-organisierende Zentren charakterisiert. Letztere entstanden in der Telophase und enthielten nur Corona- aber keine Core-Proteine. In CP55 k/o Zellen erfolgte die Rekrutierung des Corona-Organisators CP148 an den Spindelpol bereits in der frühen Metaphase anstatt, wie üblich, erst in der Telophase. Außerdem zeigten die Knockout-Zellen Wachstumsdefekte, deren Grund vermutlich Schwierigkeiten bei der Centrosomenverdopplung in der Prophase durch das Fehlen von CP55 waren. Darüber hinaus konnten die Knockout-Zellen phagozytiertes Material nicht verwerten, obwohl der Vorgang der Phagozytose nicht beeinträchtigt war. Dieser Defekt kann dem im CP55 k/o auftretenden dispergierten Golgi-Apparat zugeschrieben werden.
Carbohydrate recognition is a ubiquitous principle underlying many fundamental biological processes like fertilization, embryogenesis and viral infections. But how carbohydrate specificity and affinity induce a molecular event is not well understood. One of these examples is bacteriophage P22 that binds and infects three distinct Salmonella enterica (S.) hosts. It recognizes and depolymerizes repetitive carbohydrate structures of O antigen in its host´s outer membrane lipopolysaccharide molecule. This is mediated by tailspikes, mainly β helical appendages on phage P22 short non contractile tail apparatus (podovirus). The O antigen of all three Salmonella enterica hosts is built from tetrasaccharide repeating units consisting of an identical main chain with a distinguished 3,6 dideoxyhexose substituent that is crucial for P22 tailspike recognition: tyvelose in S. Enteritidis, abequose in S. Typhimurium and paratose in S. Paratyphi. In the first study the complexes of P22 tailspike with its host’s O antigen octasaccharide were characterized. S. Paratyphi octasaccharide binds less tightly (ΔΔG≈7 kJ/mol) to the tailspike than the other two hosts. Crystal structure analysis of P22 tailspike co crystallized with S. Paratyphi octasaccharides revealed different interactions than those observed before in tailspike complexes with S. Enteritidis and S. Typhimurium octasaccharides. These different interactions occur due to a structural rearrangement in the S. Paratyphi octasaccharide. It results in an unfavorable glycosidic bond Φ/Ψ angle combination that also had occurred when the S. Paratyphi octasaccharide conformation was analyzed in an aprotic environment. Contributions of individual protein surface contacts to binding affinity were analyzed showing that conserved structural waters mediate specific recognition of all three different Salmonella host O antigens. Although different O antigen structures possess distinct binding behavior on the tailspike surface, all are recognized and infected by phage P22. Hence, in a second study, binding measurements revealed that multivalent O antigen was able to bind with high avidity to P22 tailspike. Dissociation rates of the polymer were three times slower than for an octasaccharide fragment pointing towards high affinity for O antigen polysaccharide. Furthermore, when phage P22 was incubated with lipopolysaccharide aggregates before plating on S. Typhimurium cells, P22 infectivity became significantly reduced. Therefore, in a third study, the function of carbohydrate recognition on the infection process was characterized. It was shown that large S. Typhimurium lipopolysaccharide aggregates triggered DNA release from the phage capsid in vitro. This provides evidence that phage P22 does not use a second receptor on the Salmonella surface for infection. P22 tailspike binding and cleavage activity modulate DNA egress from the phage capsid. DNA release occurred more slowly when the phage possessed mutant tailspikes with less hydrolytic activity and was not induced if lipopolysaccharides contained tailspike shortened O antigen polymer. Furthermore, the onset of DNA release was delayed by tailspikes with reduced binding affinity. The results suggest a model for P22 infection induced by carbohydrate recognition: tailspikes position the phage on Salmonella enterica and their hydrolytic activity forces a central structural protein of the phage assembly, the plug protein, onto the host´s membrane surface. Upon membrane contact, a conformational change has to occur in the assembly to eject DNA and pilot proteins from the phage to establish infection. Earlier studies had investigated DNA ejection in vitro solely for viruses with long non contractile tails (siphovirus) recognizing protein receptors. Podovirus P22 in this work was therefore the first example for a short tailed phage with an LPS recognition organelle that can trigger DNA ejection in vitro. However, O antigen binding and cleaving tailspikes are widely distributed in the phage biosphere, for example in siphovirus 9NA. Crystal structure analysis of 9NA tailspike revealed a complete similar fold to P22 tailspike although they only share 36 % sequence identity. Moreover, 9NA tailspike possesses similar enzyme activity towards S. Typhimurium O antigen within conserved amino acids. These are responsible for a DNA ejection process from siphovirus 9NA triggered by lipopolysaccharide aggregates. 9NA expelled its DNA 30 times faster than podovirus P22 although the associated conformational change is controlled with a similar high activation barrier. The difference in DNA ejection velocity mirrors different tail morphologies and their efficiency to translate a carbohydrate recognition signal into action.
This thesis aims at a better mechanistic understanding of animal communities. Therefore, an allometry- and individual-based model has been developed which was used to simulate mammal and bird communities in heterogeneous landscapes, and to to better understand their response to landscape changes (habitat loss and fragmentation).
In this thesis, different aspects within the research field of protein spectro- and electro-chemistry on nanostructured materials are addressed. On the one hand, this work is related to the investigation of nanostructured transparent and conductive metal oxides as platform for the immobilization of electroactive enzymes. On the other hand the second part of this work is related to the immobilization of sulfite oxidase on gold nanoparticles modified electrode. Finally direct and mediated spectroelectrochemistry protein with high structure complexity such as the xanthine dehydrogenase from Rhodobacter capsulatus and its high homologues the mouse aldehyde oxidase homolog 1. Stable immobilization and reversible electrochemistry of cytochrome c in a transparent and conductive tin-doped and tin-rich indium oxide film with a well-defined mesoporosity is reported. The transparency and good conductivity, in combination with the large surface area of these materials, allow the incorporation of a high amount of electroactive biomolecules (between 250 and 2500 pmol cm-2) and their electrochemical and spectroscopic investigation. Both, the electrochemical behavior and the immobilization of proteins are influenced by the geometric parameters of the porous material, such as the structure and pore shape, the surface chemistry, as well as the protein size and charge. UV-Vis and resonance Raman spectroscopy, in combination with direct protein voltammetry, are employed for the characterization of cytochrome c immobilized in the mesoporous indium tin oxide and reveal no perturbation of the structural integrity of the redox protein. A long term protein immobilization is reached using these unmodified mesoporous indium oxide based materials, i.e. more than two weeks even at high ionic strength. The potential of this modified material as an amperometric biosensor for the detection of superoxide anions is demonstrated. A sensitivity of about 100 A M-1 m-2, in a linear measuring range of the superoxide concentration between 0.13 and 0.67 μM, is estimated. In addition an electrochemical switchable protein-based optical device is designed with the core part composed of cytochrome c immobilized on a mesoporous indium tin oxide film. A color developing redox sensitive dye is used as switchable component of the system. The cytochrome c-catalyzed oxidation of the dye by hydrogen peroxide is spectroscopically investigated. When the dye is co-immobilized with the protein, its redox state is easily controlled by application of an electrical potential at the supporting material. This enables to electrochemical reset the system to the initial state and repetitive signal generation. The case of negative charged proteins, which does not have a good interaction with the negative charged indium oxide based films, is also explored. The modification of an indium tin oxide film with a positive charged polymer and the employment of a antimony doped tin oxide film were investigated in this work in order to overcome the repulsion induced by similar charges of the protein and electrode. Human sulfite oxidase and its separated heme-containing domain are able to direct exchange electrons with the supporting material. A study of a new approach for sulfite biosensing, based on enhanced direct electron transfer of a human sulfite oxidase immobilized on a gold nanoparticles modified electrode is reported. The spherical gold nanoparticles were prepared via a novel method by reduction of HAuCl4 with branched poly(ethyleneimine) in an ionic liquid resulting in particles of about 10 nm in hydrodynamic diameter. These nanoparticles were covalently attached to a mercaptoundecanoic acid modified Au-electrode and act as platform where human sulfite oxidase is adsorbed. An enhanced interfacial electron transfer and electrocatalysis is therefore achieved. UV-Vis and resonance Raman spectroscopy, in combination with direct protein voltammetry, were employed for the characterization of the system and reveal no perturbation of the structural integrity of the redox protein. The proposed biosensor exhibited a quick steady-state current response, within 2 s and a linear detection range between 0.5 and 5.4 μM with high sensitivity (1.85 nA μM-1). The investigated system provides remarkable advantages, since it works at low applied potential and at very high ionic strength. Therefore these properties could make the proposed system useful in the development of bioelectronic devices and its application in real samples. Finally protein with high structure complexity such as the xanthine dehydrogenase from Rhodobacter capsulatus and the mouse aldehyde oxidase homolog 1 were spectroelectrochemically studied. It could be demonstrated that different cofactors present in the protein structure, like the FAD and the molybdenum cofactor, are able to directly exchange electrons with an electrode and are displayed as a single peak in a square wave voltammogram. Protein mutants bearing a serine substituted to the cysteines, bounding to the most exposed iron sulfur cluster additionally showed direct electron transfer which can be attributable to this cluster. On the other hand a mediated spectroelectrochemical titration of the protein bound FAD cofactor was performed in presence of transparent iron and cobalt complex mediators. The results showed the formation of the stable semiquinone and the fully reduced flavin. Two formal potentials for each single electron exchange step were then determined.