570 Biowissenschaften; Biologie
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Das ITC SFN und der Mikronährstoff Se sind bekannt als chemopräventive Inhaltsstoffe von Gemüse der Brassica-Familie, welcher auch Brokkoli angehört. Die Wirkungen von sowohl SFN als auch Se beruhen auf zahlreichen verschiedenen Mechanismen. Es existieren jedoch Schnittstellen, an welchen Interaktionen beider Substanzen möglich sind. Basierend auf diesem Wissen wurden in dieser Arbeit Wechselwirkungen zwischen SFN und Se auf die Aktivität sowie Expression von Phase II Enzymen und Selenoproteinen untersucht. Der Einfluss der Kombination von SFN und Se auf die unter physiologischen Bedingungen stattfindende Proliferation und Apoptose war ebenso Gegenstand der Arbeit wie die Modulation von Entzündungsprozessen sowie der Tumorentstehung während der entzündungsverstärkten Colonkanzerogenese im Mausmodell. Das hinsichtlich seiner Wirksamkeit mit aus GRA hydrolysiertem SFN zunächst als vergleichbar befundene synthetische SFN wurde für die Untersuchung im AOM/DSS-induzierten Colontumormodell gewählt und in Kombination mit 3 verschiedenen Selendiäten verabreicht. Der Einfluss von SFN und Se auf Phase II Enzyme und Selenoproteine entlang des GIT war organabhängig und nach 4 Wochen geringer als nach 7 Tagen. Die schwächere Induktion deutet auf eine Anpassung des Organismus hin. Ein SFN-vermittelter Effekt auf NQO1 war im Selenmangel am deutlichsten. Die Aktivität des Selenoproteins TrxR wurde hingegen erst bei ausreichender Selenversorgung durch SFN beeinflusst. Die als Nrf2-Zielgen bekannte und in der Hierarchie der Selenoproteine einen hohen Rang einnehmende GPx2 konnte in bestimmten Organen bereits unter selenarmen Bedingungen durch SFN induziert werden. Eine Überexpression des Enzyms war jedoch nicht möglich. SFN steigerte, unabhängig vom Selenstatus, im oberen Abschnitt des GIT und im Colon die Aktivität der GST. Eine Induktion des eigenen Metabolismus wäre somit denkbar. Im Falle eines Mangels an GPx2 wurde GPx1 bei hinreichender Selenversorgung stärker exprimiert, allerdings konnte sie die Funktion von GPx2 nicht völlig erset-zen. Im Selenmangel kann die Aktivitätssteigerung der TrxR im Dünndarm, dem Ab-schnitt der Selenabsorption, als ein Versuch der GPx2-Kompensation angesehen werden. SFN war nicht in der Lage, über eine Aktivierung des Nrf2/ARE-Signalweges kompensatorische Effekte zu induzieren. Apoptotische Prozesse wurden unter physiologischen Bedingungen nur marginal durch SFN und Se moduliert. Das elektrophile ITC konnte lediglich im Selenmangel Apoptose im luminalen Bereich der Colonkrypten induzieren. Die durch supranutritive Selenkonzentration induzierte Apoptose im Kryptengrund wurde nicht durch SFN beeinflusst. Einer bei Abwesenheit der GPx2 erhöhten Apoptoserate im Kryptengrund wirkte SFN bei adäquater Selenversorgung entgegen, war indessen proapoptotisch unter selendefizienten Konditionen. Der Einfluss von SFN auf die Entzündung war deutlich abhängig vom Selenstatus. Während SFN im Selenmangel anscheinend prooxidative Prozesse induzierte und die Entzündungssymptome verschlimmerte, wirkte es unter adäquatem Selenstatus an-tiinflammatorisch. Den vergleichsweise milden Grad der Entzündung im selensupplementierten Status konnte SFN nicht zusätzlich beeinflussen. SFN veränderte die Inzi-denz colorektaler Tumore nicht. Ein, die Tumorinitiation blockierender SFN-Effekt durch direkte Hemmung der metabolischen Aktivierung des Prokanzerogens im selenadäquaten Zustand scheint offensichtlich. Eine Überversorgung mit Se kann protektiv im Hinblick auf Entzündung oder Colonkanzerogenese sein, jedoch bewirkt SFN keinen zusätzlichen Schutz. Kombinationseffekte von SFN und Se in Bezug auf Phase II Enzyme, Selenoproteine und Apoptose sowie die entzündungsverstärkte Colonkanzerogenese sind nicht eindeutiger Natur und können, abhängig vom Endpunkt, synergistische oder antagonistische Züge aufweisen. Eine bei Selendefizienz deutlichere Wirkung von SFN kann mit Hilfe der gesteigerten Aktivierung von Nrf2 erklärt werden, dies muss jedoch nicht von Vorteil sein. Bei adäquater Selenversorgung kann SFN kurzfristig antiinflammatorische und antikanzerogene Prozesse induzieren. Von einer längerfristigen ständigen SFN-Aufnahme in Form von GRA-reichen Brassicacea ist jedoch abzuraten, da von einer Adaptation auszugehen ist. Die Wirkung von SFN innerhalb der komplexen Pflanzenmatrix bleibt Gegenstand zukünftiger Untersuchungen.
This work presents the development of entropy-elastic gelatin based networks in the form of films or scaffolds. The materials have good prospects for biomedical applications, especially in the context of bone regeneration. Entropy-elastic gelatin based hydrogel films with varying crosslinking densities were prepared with tailored mechanical properties. Gelatin was covalently crosslinked above its sol gel transition, which suppressed the gelatin chain helicity. Hexamethylene diisocyanate (HDI) or ethyl ester lysine diisocyanate (LDI) were applied as chemical crosslinkers, and the reaction was conducted either in dimethyl sulfoxide (DMSO) or water. Amorphous films were prepared as measured by Wide Angle X-ray Scattering (WAXS), with tailorable degrees of swelling (Q: 300-800 vol. %) and wet state Young’s modulus (E: 70 740 kPa). Model reactions showed that the crosslinking reaction resulted in a combination of direct crosslinks (3-13 mol.-%), grafting (5-40 mol.-%), and blending of oligoureas (16-67 mol.-%). The knowledge gained with this bulk material was transferred to the integrated process of foaming and crosslinking to obtain porous 3-D gelatin-based scaffolds. For this purpose, a gelatin solution was foamed in the presence of a surfactant, Saponin, and the resulting foam was fixed by chemical crosslinking with a diisocyanate. The amorphous crosslinked scaffolds were synthesized with varied gelatin and HDI concentrations, and analyzed in the dry state by micro computed tomography (µCT, porosity: 65±11–73±14 vol.-%), and scanning electron microscopy (SEM, pore size: 117±28–166±32 µm). Subsequently, the work focused on the characterization of the gelatin scaffolds in conditions relevant to biomedical applications. Scaffolds showed high water uptake (H: 630-1680 wt.-%) with minimal changes in outer dimension. Since a decreased scaffold pore size (115±47–130±49 µm) was revealed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) upon wetting, the form stability could be explained. Shape recoverability was observed after removal of stress when compressing wet scaffolds, while dry scaffolds maintained the compressed shape. This was explained by a reduction of the glass transition temperature upon equilibration with water (dynamic mechanical analysis at varied temperature (DMTA)). The composition dependent compression moduli (Ec: 10 50 kPa) were comparable to the bulk micromechanical Young’s moduli, which were measured by atomic force microscopy (AFM). The hydrolytic degradation profile could be adjusted, and a controlled decrease of mechanical properties was observed. Partially-degraded scaffolds displayed an increase of pore size. This was likely due to the pore wall disintegration during degradation, which caused the pores to merge. The scaffold cytotoxicity and immunologic responses were analyzed. The porous scaffolds enabled proliferation of human dermal fibroblasts within the implants (up to 90 µm depth). Furthermore, indirect eluate tests were carried out with L929 cells to quantify the material cytotoxic response. Here, the effect of the sterilization method (Ethylene oxide sterilization), crosslinker, and surfactant were analyzed. Fully cytocompatible scaffolds were obtained by using LDI as crosslinker and PEO40 PPO20-PEO40 as surfactant. These investigations were accompanied by a study of the endotoxin material contamination. The formation of medical-grade materials was successfully obtained (<0.5 EU/mL) by using low-endotoxin gelatin and performing all synthetic steps in a laminar flow hood.
Ghrelin is a unique hunger-inducing stomach-borne hormone. It activates orexigenic circuits in the central nervous system (CNS) when acylated with a fatty acid residue by the Ghrelin O-acyltransferase (GOAT). Soon after the discovery of ghrelin a theoretical model emerged which suggests that the gastric peptide ghrelin is the first “meal initiation molecule
Untersuchungen PEG-basierter thermo-responsiver Polymeroberflächen zur Steuerung der Zelladhäsion
(2010)
Moderne Methoden für die Einzelzellanalyse werden dank der fortschreitenden Weiterentwicklung immer sensitiver. Dabei steigen jedoch auch die Anforderungen an das Probenmaterial. Viele Aufbereitungsprotokolle adhärenter Zellen beinhalten eine enzymatische Spaltung der Oberflächenproteine, um die Ablösung vom Zellkultursubstrat zu ermöglichen. Verschiedene Methoden, wie die Patch-Clamp-Technik oder eine auf der Markierung extrazellulärer Domänen von Membranproteinen basierende Durchflusszytometrie können dann nur noch eingeschränkt eingesetzt werden. Daher ist die Etablierung neuer Zellablösemethoden dringend notwendig. In der vorliegenden Arbeit werden erstmals PEG-basierte thermo-responsive Oberflächen erfolgreich für die Zellkultur eingesetzt. Dabei wird das zerstörungsfreie Ablösen verschiedener Zelllinien von den Oberflächen durch Temperatursenkung realisiert. Die Funktionalität der Oberflächen wird durch Variation der Polymerstruktur, sowie der Konzentration der Beschichtungslösung, durch Beschichtung der Oberflächen mit einem zelladhäsionsfördernden Protein (Fibronektin) und durch Adsorption zelladhäsionsvermittelnder Peptide (RGD) optimiert. Um den Zellablösungsprozess detaillierter zu untersuchen, wird hier zum ersten Mal der direkte Zellkontakt mit thermo-responsiven Oberflächen mittels oberflächensensitiver Mikroskopie (TIRAF) sichtbar gemacht. Mit dieser Technik sind die exakte Quantifizierung und die Analyse der Reduktion der Zelladhäsionsfläche während des Abkühlens möglich. Hierbei werden in Abhängigkeit von der Zelllinie Unterschiede im Zellverhalten während des Ablösens festgestellt: Zellen, wie eine Brustkrebszelllinie und eine Ovarzelllinie, die bekanntermaßen stärker mit ihrer Umgebung in Kontakt treten, vergrößern im Verlauf des Beobachtungszeitraumes den Abstand zwischen Zellmembran und Oberfläche, reduzieren jedoch ihre Zell-Substratkontaktfläche kaum. Mausfibroblasten hingegen verkleinern drastisch die Zelladhäsionsfläche. Der Ablösungsprozess wird vermutlich aktiv von den Zellen gesteuert. Diese Annahme wird durch zwei Beobachtungen gestützt: Erstens verläuft die Reduktion der Zelladhäsionsfläche bei Einschränkung des Zellmetabolismus durch eine Temperatursenkung auf 4 °C verzögert. Zweitens hinterlassen die Zellen Spuren, die nach dem Ablösen der Zellen auf den Oberflächen zurückbleiben. Mittels Kombination von TIRAF- und TIRF-Mikroskopie werden die Zelladhäsionsfläche und die Aktinstruktur gleichzeitig beobachtet. Die Verknüpfung beider Methoden stellt eine neue Möglichkeit dar, intrazelluläre Prozesse mit der Zellablösung von thermo-responsiven Oberflächen zu korrelieren.
Die gesundheitsfördernden Eigenschaften von grünem Tee sind weitgehend akzeptiert. Den Teecatechinen, insbesondere dem Epigallocatechin-3-gallat (EGCG), werden zahlreiche positive Effekte zugesprochen (z. B. antioxidativ, antikanzerogen, antiinflammatorisch, Blutdruck und Cholesterinspiegel senkend). Die Mechanismen, die zu einer Reduktion der in Tierversuchen beschriebenen Körper- und Fettmasse führen, sind nicht ausreichend geklärt. Ziel dieser Arbeit bestand darin, die kurz- und mittelfristigen Wirkungen einer TEAVIGO®-Applikation (mind. 94 % EGCG) am Mausmodell im Hinblick auf den Energie- und Fettstoffwechsel sowie die Expression daran beteiligter Gene in wichtigen Organen und Geweben zu untersuchen. In verschiedenen Tierversuchen wurde männlichen C57BL/6-Mäusen eine Hochfettdiät (HFD) mit und ohne Supplementation (oral, diätetisch) des entkoffeinierten Grüntee-Extraktes TEAVIGO® in unterschiedlichen Dosierungen gefüttert. Es wurden sowohl kurz- als auch mittelfristige Wirkungen des EGCG auf die Energiebilanz (u. a. indirekte Tierkalorimetrie) und Körperzusammensetzung (NMR) sowie die exogene Substratoxidation (Stabilisotopentechnik: Atemtests, Inkorporation natürlicher 13C-angereicherter Triglyceride aus Maiskeimöl in diverse Organe/Gewebe) und Gen-expression (quantitative real-time PCR) untersucht. Die Applikationsform und ihre Dauer riefen unterschiedliche Wirkungen hervor. Mäuse mit diätetischer Supplementation zeigten bereits nach kurzer Zeit eine verminderte Körperfettmasse, die bei weiterer Verabreichung auch zu einer Reduktion der Körpermasse führte. Beide Applikationsformen resultieren, unabhängig von der Dauer der Intervention, in einer erhöhten Energieausscheidung, während die Futter- und Energieaufnahme durch EGCG nicht beeinflusst wurden. Der Energieverlust war von einer erhöhten Fett- und Stickstoffausscheidung begleitet, deren Ursache die in der Literatur beschriebene Interaktion und Hemmung digestiver Enzyme sein könnte. Besonders unter postprandialen Bedingungen wiesen EGCG-Mäuse erniedrigte Triglycerid- und Glycogengehalte in der Leber auf, was auf eine eingeschränkte intestinale Absorption der Nährstoffe hindeutet. Transkriptanalysen ergaben im Darm eine verminderte Expression von Fettsäuretransportern, während die Expression von Glucosetransportern durch EGCG erhöht wurde. Weiterhin reduzierte EGCG, nach Umstellung von Standard- auf eine maiskeimölhaltige Hochfettdiät, die Inkorporation natürlicher 13C-angereicherter Triglyceride in diverse Organe und Gewebe – insbesondere Leber, viszerales und braunes Fettgewebe sowie Skelettmuskel. Die Analyse der 13C-Anreicherung im Atem der Mäuse und die Energieumsatzmessungen ergaben nach kurzer Applikation eine erhöhte Fettoxidation, die im weiteren Verlauf der Intervention auf eine erhöhte Kohlenhydratoxidation umgeschaltet wurde. Weiterhin war die orale Applikation von EGCG bei gleichzeitiger Fütterung einer Hochfettdiät von makroskopischen und mikroskopischen degenerativen Veränderungen der Leber begleitet. Diese Effekte wurden nach diätetischer Supplementation der Hochfettdiät mit EGCG nicht beobachtet. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Körpergewichts- und Fettgewebs-abnahme durch diätetisches EGCG sich durch eine herabgesetzte Verdaulichkeit der Nahrung erklären lässt. Dies führte zu verschiedenen kurz- und mittelfristigen Veränderungen in der Fettverteilung und im Fettmetabolismus.
In dieser Arbeit wurden die Möglichkeiten und Grenzen für Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung untersucht. Dazu wurde ein Messaufbau für Zirkulardichroismus-Messungen an zwei Strahlrohren am Berliner Elektronenspeicherring für Synchrotronstrahlung eingesetzt, die für Messungen im Bereich des ultravioletten Lichts geeignet sind. Eigenschaften der Strahlrohre und des Messaufbau wurden in einigen wichtigen Punkten mit kommerziellen Zirkulardichroismus-Spektrometern verglichen. Der Schwerpunkt lag auf der Ausdehnung des zugänglichen Wellenlängenbereichs unterhalb von 180 nm zur Untersuchung des Zirkulardichroismus von Proteinen in diesem Bereich. In diesem Bereich ist es nicht nur die Lichtquelle sondern vor allem die Absorption des Lichts durch Wasser, die den Messbereich bei der Messung biologischer Proben in wässriger Lösung einschränkt. Es wurden Bedingungen gefunden, unter denen der Messbereich auf etwa 160 nm, in einigen Fällen bis auf 130 nm ausgedehnt werden konnte. Dazu musste die Pfadlänge deutlich reduziert werden und verschieden Probenküvetten wurden getestet. Der Einfluss der dabei auftretenden Spannungsdoppelbrechung in den Probenküvetten auf das Messsignal konnte mit einem alternativen Messaufbau deutlich reduziert werden. Systematische Fehler im Messsignal und auftretende Strahlenschäden begrenzen jedoch die Zuverlässigkeit der gemessenen Spektren. Bei Proteinfilmen schränkt die Absorption von Wasser den Messbereich kaum ein. Es wurden jedoch meist deutliche Unterschiede zwischen den Spektren von Proteinfilmen und den Spektren von Proteinen in wässriger Lösung festgestellt. Solange diese Unterschiede nicht minimiert werden können, stellen Proteinfilme keine praktikable Alternative zu Messungen in wässriger Lösung dar.