570 Biowissenschaften; Biologie
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Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleinsäure-basierte Methoden für den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchführbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleinsäure-basierten Diagnostik kann durch die Einführung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kostengünstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielfältige Detektionsmöglichkeiten, die sowohl für Schnelltest- als auch für Monitoring-Anwendungen geeignet sind.
Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode für den einfachen, schnellen und günstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abhängiger Detektionsverfahren. Hier wurden zunächst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe für die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden können. Als Alternative für die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe für den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus für die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt.
Ergebnisse: Für den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivität zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegenüber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zusätzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen für die Endpunktdetektion verwendet werden. Darüber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das für den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch für die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zusätzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abhängige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP über das Pyrophosphat identifiziert werden. Dafür wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilität und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden können. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabhängigkeit zwischen den einzelnen Komponenten für einen fluorimetrischen Verdrängungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verhältnis’ als Intensitätsmatrix (heatmap) konnten zunächst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als günstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abhängige Zunahme der Fluoreszenzintensität. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich für die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilität und Homogenität der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tröpfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S möglich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abhängige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gewährleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die Rückfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivität am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur möglich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification“ (HIP) konnte abschließend durch die Verkürzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-ähnlichen Primer verbessert werden.
Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsfähigen Alternative für die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsfähigkeit der qualitativen und quantitativen LAMP für die Feldanwendungen und für die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden können und so eine einfache Pathogendiagnostik ermöglichen. Die gezeigten Methoden können darüber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegenüber den herkömmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP für den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei können die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abhängigen Reaktionen ermöglicht darüber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zukünftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik möglich.
Molekulare Charakterisierung des Centrosom-assoziierten Proteins CP91 in Dictyostelium discoideum
(2016)
Das Dictyostelium-Centrosom ist ein Modell für acentrioläre Centrosomen. Es besteht aus einer dreischichtigen Kernstruktur und ist von einer Corona umgeben, welche Nukleationskomplexe für Mikrotubuli beinhaltet. Die Verdoppelung der Kernstruktur wird einmal pro Zellzyklus am Übergang der G2 zur M-Phase gestartet. Durch eine Proteomanalyse isolierter Centrosomen konnte CP91 identifiziert werden, ein 91 kDa großes Coiled-Coil Protein, das in der centrosomalen Kernstruktur lokalisiert. GFP-CP91 zeigte fast keine Mobilität in FRAP-Experimenten während der Interphase, was darauf hindeutet, dass es sich bei CP91 um eine Strukturkomponente des Centrosoms handelt. In der Mitose hingegen dissoziieren das GFP-CP91 als auch das endogene CP91 ab und fehlen an den Spindelpolen von der späten Prophase bis zur Anaphase. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verschwinden der zentralen Schicht der Kernstruktur zu Beginn der Centrosomenverdopplung. Somit ist CP91 mit großer Wahrscheinlichkeit ein Bestandteil dieser Schicht. CP91-Fragmente der N-terminalen bzw. C-terminalen Domäne (GFP-CP91 N-Terminus, GFP-CP91 C-Terminus) lokalisieren als GFP-Fusionsproteine exprimiert auch am Centrosom, zeigen aber nicht die gleiche mitotische Verteilung des Volllängenproteins. Das CP91-Fragment der zentralen Coiled-Coil Domäne (GFP-CP91cc) lokalisiert als GFP-Fusionsprotein exprimiert, als ein diffuser cytosolische Cluster, in der Nähe des Centrosoms. Es zeigt eine partiell ähnliche mitotische Verteilung wie das Volllängenprotein. Dies lässt eine regulatorische Domäne innerhalb der Coiled-Coil Domäne vermuten. Die Expression der GFP-Fusionsproteine unterdrückt die Expression des endogenen CP91 und bringt überzählige Centrosomen hervor. Dies war auch eine markante Eigenschaft nach der Unterexpression von CP91 durch RNAi. Zusätzlich zeigte sich in CP91-RNAi Zellen eine stark erhöhte Ploidie verursacht durch schwere Defekte in der Chromosomensegregation verbunden mit einer erhöhten Zellgröße und Defekten im Abschnürungsprozess während der Cytokinese. Die Unterexpression von CP91 durch RNAi hatte auch einen direkten Einfluss auf die Menge an den centrosomalen Proteinen CP39, CP55 und CEP192 und dem Centromerprotein Cenp68 in der Interphase. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CP91 eine zentrale centrosomale Kernkomponente ist und für den Zusammenhalt der beiden äußeren Schichten der Kernstruktur benötigt wird. Zudem spielt CP91 eine wichtige Rolle für eine ordnungsgemäße Centrosomenbiogenese und, unabhängig davon, bei dem Abschnürungsprozess der Tochterzellen während der Cytokinese.
Seit der Einführung von Antibiotika in die medizinische Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten existiert ein Wettlauf zwischen der Evolution von Bakterienresistenzen und der Entwicklung wirksamer Antibiotika. Während bis in die 80er Jahre verstärkt an neuen Antibiotika geforscht wurde, gewinnen multiresistente Keime heute zunehmend die Oberhand. Um einzelne Pathogene erfolgreich nachzuweisen und zu bekämpfen, ist ein grundlegendes Wissen über den Erreger unumgänglich. Bakterielle Proteine, die bei einer Infektion vorrangig vom Immunsystem prozessiert und präsentiert werden, könnten für die Entwicklung von Impfstoffen oder gezielten Therapeutika nützlich sein. Auch für die Diagnostik wären diese immundominanten Proteine interessant. Allerdings herrscht ein Mangel an Wissen über spezifische Antigene vieler pathogener Bakterien, die eine eindeutige Diagnostik eines einzelnen Erregers erlauben würden.
Daher wurden in dieser Arbeit vier verschiedene Humanpathogene mittels Phage Display untersucht: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Borrelia burgdorferi und Clostridium difficile. Hierfür wurden aus der genomischen DNA der vier Erreger Bibliotheken konstruiert und durch wiederholte Selektion und Amplifikation, dem sogenannten Panning, immunogene Proteine isoliert. Für alle Erreger bis auf C. difficile wurden immunogene Proteine aus den jeweiligen Bibliotheken isoliert. Die identifizierten Proteine von N. meningitidis und B. burgdorferi waren größtenteils bekannt, konnten aber in dieser Arbeit durch Phage Display verifiziert werden. Für N. gonorrhoeae wurden 21 potentiell immunogene Oligopeptide isoliert, von denen sechs Proteine als neue zuvor unbeschriebene Proteine mit immunogenem Charakter identifiziert wurden. Von den Phagen-präsentierten Oligopeptide der 21 immunogenen Proteine wurden Epitopmappings mit verschiedenen polyklonalen Antikörpern durchgeführt, um immunogene Bereiche näher zu identifizieren und zu charakterisieren. Bei zehn Proteinen wurden lineare Epitope eindeutig mit drei polyklonalen Antikörpern identifiziert, von fünf weiteren Proteinen waren Epitope mit mindestens einem Antikörper detektierbar. Für eine weitere Charakterisierung der ermittelten Epitope wurden Alaninscans durchgeführt, die eine detaillierte Auskunft über kritische Aminosäuren für die Bindung des Antikörpers an das Epitop geben.
Ausgehend von dem neu identifizierten Protein mit immunogenem Charakter NGO1634 wurden 26 weitere Proteine aufgrund ihrer funktionellen Ähnlichkeit ausgewählt und mithilfe bioinformatischer Analysen auf ihre Eignung zur Entwicklung einer diagnostischen Anwendung analysiert. Durch Ausschluss der meisten Proteine aufgrund ihrer Lokalisation, Membrantopologie oder unspezifischen Proteinsequenz wurden scFv-Antikörper gegen acht Proteine mittels Phage Display generiert und anschließend als scFv-Fc-Fusionsantikörper produziert und charakterisiert.
Die hier identifizierten Proteine und linearen Epitope könnten einen Ansatzpunkt für die Entwicklung einer diagnostischen oder therapeutischen Anwendung bieten. Lineare Epitopsequenzen werden häufig für die Impfstoffentwicklung eingesetzt, sodass vor allem die in dieser Arbeit bestimmten Epitope von Membranproteinen interessante Kandidaten für weitere Untersuchungen in diese Richtung sind. Durch weitere Untersuchungen könnten möglicherweise unbekannte Virulenzfaktoren entdeckt werden, deren Inhibierung einen entscheidenden Einfluss auf Infektionen haben könnten.
Für alle Organismen ist die Aufrechterhaltung ihres energetischen Gleichgewichts unter fluktuierenden Umweltbedingungen lebensnotwendig. In Eukaryoten steuern evolutionär konservierte Proteinkinasen, die in Pflanzen als SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) bezeichnet werden, die Adaption an Stresssignale aus der Umwelt und an die Limitierung von Nährstoffen und zellulärer Energie. Die Aktivierung von SnRK1 bedingt eine umfangreiche transkriptionelle Umprogrammierung, die allgemein zu einer Repression energiekonsumierender Prozesse wie beispielsweise Zellteilung und Proteinbiosynthese und zu einer Induktion energieerzeugender, katabolischer Stoffwechselwege führt. Wie unterschiedliche Signale zu einer generellen sowie teilweise gewebe- und stressspezifischen SnRK1-vermittelten Antwort führen ist bisher noch nicht ausreichend geklärt, auch weil bislang nur wenige Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion identifiziert wurden. In dieser Arbeit konnte ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk um die SnRK1αUntereinheiten aus Arabidopsis AKIN10/AKIN11 etabliert werden. Dadurch wurden zunächst Mitglieder der pflanzenspezifischen DUF581-Proteinfamilie als Interaktionspartner der SnRK1α-Untereinheiten identifiziert. Diese Proteine sind über ihre konservierte DUF581Domäne, in der ein Zinkfinger-Motiv lokalisiert ist, fähig mit AKIN10/AKIN11 zu interagieren. In planta Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass die DUF581-Proteine eine Verschiebung der nucleo-cytoplasmatischen Lokalisierung von AKIN10 hin zu einer nahezu ausschließlichen zellkernspezifischen Lokalisierung begünstigen sowie die Ko-Lokalisierung von AKIN10 und DUF581-Proteinen im Nucleus. In Bimolekularen Fluoreszenzkomplementations-Analysen konnte die zellkernspezifische Interaktion von DUF581-Proteinen mit SnRK1α-Untereinheiten in planta bestätigt werden. Außerhalb der DUF581-Domäne weisen die Proteine einander keine große Sequenzähnlichkeit auf. Aufgrund ihrer Fähigkeit mit SnRK1 zu interagieren, dem Fehlen von SnRK1Phosphorylierungsmotiven sowie ihrer untereinander sehr variabler gewebs-, entwicklungs- und stimulusspezifischer Expression wurde für DUF581-Proteine eine Funktion als Adaptoren postuliert, die unter bestimmten physiologischen Bedingungen spezifische Substratproteine in den SnRK1-Komplex rekrutieren. Auf diese Weise könnten DUF581Proteine die Interaktion von SnRK1 mit deren Zielproteinen modifizieren und eine Feinjustierung der SnRK1-Signalweiterleitung ermöglichen. Durch weiterführende Interaktionsstudien konnten DUF581-interagierende Proteine darunter Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen sowie regulatorische Proteine gefunden werden, die teilweise ebenfalls Wechselwirkungen mit SnRK1α-Untereinheiten aufzeigten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eines dieser Proteine für das eine Beteiligung an der SnRK1Signalweiterleitung als Transkriptionsregulator vermutet wurde näher charakterisiert. STKR1 (STOREKEEPER RELATED 1), ein spezifischer Interaktionspartner von DUF581-18, gehört zu einer pflanzenspezifischen Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktorfamilie und interagiert in Hefe sowie in planta mit SnRK1. Die zellkernspezifische Interaktion von STKR1 und AKIN10 in Pflanzen unterstützt die Vermutung der kooperativen Regulation von Zielgenen. Weiterhin stabilisierte die Anwesenheit von AKIN10 die Proteingehalte von STKR1, das wahrscheinlich über das 26S Proteasom abgebaut wird. Da es sich bei STKR1 um ein Phosphoprotein mit SnRK1-Phosphorylierungsmotiv handelt, stellt es sehr wahrscheinlich ein SnRK1-Substrat dar. Allerdings konnte eine SnRK1-vermittelte Phosphorylierung von STKR1 in dieser Arbeit nicht gezeigt werden. Der Verlust von einer Phosphorylierungsstelle beeinflusste die Homo- und Heterodimerisierungsfähigkeit von STKR1 in Hefeinteraktionsstudien, wodurch eine erhöhte Spezifität der Zielgenregulation ermöglicht werden könnte. Außerdem wurden Arabidopsis-Pflanzen mit einer veränderten STKR1-Expression phänotypisch, physiologisch und molekularbiologisch charakterisiert. Während der Verlust der STKR1-Expression zu Pflanzen führte, die sich kaum von Wildtyp-Pflanzen unterschieden, bedingte die konstitutive Überexpression von STKR1 ein stark vermindertes Pflanzenwachstum sowie Entwicklungsverzögerungen hinsichtlich der Blühinduktion und Seneszenz ähnlich wie sie auch bei SnRK1α-Überexpression beschrieben wurden. Pflanzen dieser Linien waren nicht in der Lage Anthocyane zu akkumulieren und enthielten geringere Gehalte an Chlorophyll und Carotinoiden. Neben einem erhöhten nächtlichen Stärkeumsatz waren die Pflanzen durch geringere Saccharosegehalte im Vergleich zum Wildtyp gekennzeichnet. Eine Transkriptomanalyse ergab, dass in den STKR1-überexprimierenden Pflanzen unter Energiemangelbedingungen, hervorgerufen durch eine verlängerte Dunkelphase, eine größere Anzahl an Genen im Vergleich zum Wildtyp differentiell reguliert war als während der Lichtphase. Dies spricht für eine Beteiligung von STKR1 an Prozessen, die während der verlängerten Dunkelphase aktiv sind. Ein solcher ist beispielsweise die SnRK1-Signaltransduktion, die unter energetischem Stress aktiviert wird. Die STKR1Überexpression führte zudem zu einer verstärkten transkriptionellen Induktion von Abwehrassoziierten Genen sowie NAC- und WRKY-Transkriptionsfaktoren nach verlängerter Dunkelphase. Die Transkriptomdaten deuteten auf eine stimulusunabhängige Induktion von Abwehrprozessen hin und konnten eine Erklärung für die phänotypischen und physiologischen Auffälligkeiten der STKR1-Überexprimierer liefern.
Molekulare Charakterisierung von CP75, einem neuen centrosomalen Protein in Dictyostelium discoideum
(2016)
Das Centrosom ist ein Zellkern-assoziiertes Organell, das nicht von einer Membran umschlossen ist. Es spielt eine wichtige Rolle in vielen Mikrotubuli- abhängigen Prozessen wie Organellenpositionierung, Zellpolarität oder die Organisation der mitotischen Spindel. Das Centrosom von Dictyostelium besteht aus einer dreischichtigen Core-Struktur umgeben von einer Corona, die Mikrotubuli-nukleierende Komplexe enthält. Die Verdoppelung des Centrosoms in Dictyostelium findet zu Beginn der Mitose statt. In der Prophase vergrößert sich die geschichtete Core-Struktur und die Corona löst sich auf. Anschließend trennen sich die beiden äußeren Lagen der Core-Struktur und bilden in der Metaphase die beiden Spindelpole, die in der Telophase zu zwei vollständigen Centrosomen heranreifen. Das durch eine Proteom-Analyse identifizierte Protein CP75 lokalisiert am Centrosom abhängig von den Mitosephasen. Es dissoziiert von der Core-Struktur in der Prometaphase und erscheint an den Spindelpolen in der Telophase wieder. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verhalten der mittleren Lage der Core-Struktur in der Mitose, was darauf hinweist, dass CP75 eine Komponente dieser Schicht sein könnte. Die FRAP-Experimente am Interphase- Centrosom zeigen, dass GFP-CP75 dort nicht mobil ist. Das deutet darauf hin, dass das Protein wichtige Funktionen im Strukturerhalt der centrosomalen Core- Struktur übernehmen könnte. Sowohl die C- als auch die N-terminale Domäne von CP75 enthalten centrosomale Targeting-Domäne. Als GFP-Fusionsproteine (GFP-CP75-N und -C) lokalisieren die beiden Fragmente am Centrosom in der Interphase. Während GFP-CP75-C in der Mitose am Centrosom verbleibt, verschwindet GFP-CP75-N in der Metaphase und kehrt erst in der späten Telophase zurück. GFP-CP75-C und GFP-CP75O/E kolokalisieren mit F-Aktin am Zellcortex, zeigen aber keine Interaktion mit Aktin mit der BioID-Methode. Die N-terminale Domäne von CP75 enthält eine potentielle Plk1- Phosphorylierungssequenz. Die Überexpression der nichtphosphorylierbaren Punktmutante (GFP-CP75-Plk-S143A) ruft verschiedene Phänotypen wie verlängerte oder überzählige Centrosomen, vergrößerte Zellkerne und Anreicherung von detyrosinierten Mikrotubuli hervor. Die ähnlichen Phänotypen konnten auch bei GFP-CP75-N und CP75-RNAi beobachtet werden. Der
Phänotyp der detyrosinierten Mikrotubuli bringt erstmals den Beweis dafür, dass I
in Dictyostelium posttranslationale Modifikation an Tubulinen stattfindet. Außerdem zeigten CP75-RNAi-Zellen Defekte in der Organisation der mitotischen Spindel. Mittels BioID-Methode konnten drei potentielle Interaktionspartner von CP75 identifiziert werden. Diese drei Proteine CP39, CP91 und Cep192 sind ebenfalls Bestandteile des Centrosoms.
Im Hinblick auf die Problematik der Umweltverschmutzung durch die Nutzung fossiler Brennstoffe ist es nötig, eine langfristig stabile und umweltfreundliche Energieversorgung zu gewährleisten. Eine Möglichkeit, den Energiebedarf CO2-neutral zu decken, ist die Nutzung von Biogas. Hierbei spielt der Einsatz von biogenen Reststoffen, die durch einen hohen Anteil an Kohlenhydraten, Fetten und Proteinen gekennzeichnet sind und daher ein hohes Biogaspotential besitzen, eine wichtige Rolle. Voraussetzung für die Effizienz und Rentabilität solcher Anlagen ist u. a. ein stabiler Gasbildungsprozess. Da bisher noch nicht alle Aspekte der Biogasbildung vollständig verstanden sind, werden die Anlagen oft nicht optimal ausgelastet, um Prozessstörungen wie z. B. Übersäuerung zu vermeiden.
Um dennoch auftretende Prozessstörungen zu beheben, können unterschiedliche Maßnahmen durchgeführt werden. Neben der Senkung der Raumbelastung, ist es möglich, den pH-Wert durch die Zugabe von Natronlauge oder Calciumoxid anzuheben.
In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl Prozessstörungen als auch Prozessregenerierungen an einer großtechnischen Biogasanlage und in Laborversuchen untersucht. Dabei galt es, neben den physikalischen und chemischen Parametern, die mikrobielle Biozönose mit Hilfe des genetischen Fingerprintings zu charakterisieren und Änderungen zu detektieren.
Während der Prozessregenerierungen wurden nach der Zugabe von CaO Veränderungen des Gärrestes beobachtet. Es bildeten sich Pellets, die im Hinblick auf ihre Funktion für die Prozessregenerierung und die Prozessstabilität molekularbiologisch und mikroskopisch untersucht wurden. Es wurde weiterhin der Frage nachgegangen, welche Rolle die Mikroorganismen bei der Entstehung der Pellets spielen.
Die vor allem aus Calcium und Fettsäuren bestehenden Pellets dienten als Aufwuchsflächen für verschiedene Mikroorganismen. Die Bildung von Biofilmen, wie sie auf und in den Pellets nachgewiesen wurde, bot für Mikroorganismen einen Schutz vor negativen Umwelteinflüssen wie z. B. hohe Propionsäurekonzentrationen. Unter diesen günstigen Bedingungen war die Bildung von Biogas auch unter hohen Wasserstoffpartialdrücken, die den Abbau von Propionsäure hemmten, möglich. Als Indikator für bessere Lebensbedingungen wurde im Laborversuch ein Methanoculleus receptaculi-verwandter Organismus identifiziert. Dieses methanogene Archaeon wurde im Pellet nachgewiesen, während es im Gärrest erst nach der Prozessregenerierung detektiert wurde. Der Nachweis eines im Vergleich zum umgebenden Gärrest höheren Anteils an Archaeen im Kern der Pellets sowie von Biofilmen/EPS, verschiedenen Phosphatsalzen und schwerlöslichen Calciumsalzen zeigte, dass sowohl Präzipitation und Adsorption als auch Degradation von LCFA dazu führen, dass deren Konzentration im flüssigen Gärrest gesenkt wird. Dadurch nimmt die Hemmung auf die Biozönose ab und die Biogasbildungsrate steigt. Daher ist der Abbau der Fettsäuren auch bei einem niedrigen pH-Wert und unter hohen Wasserstoffpartialdrücken möglich und der Biogasbildungsprozess ist langfristig stabil. Die Bildung von Pellets unterstützt die Prozessstabilität, sofern diese nicht zu groß werden und dann u. a. die Durchmischung behindern und den Ablauf verstopfen.
Nach erfolgreicher Prozessstabilisierung wurden keine Pellets im Gärrest beobachtet. Der Abbau des organischen Materials wurde sowohl durch die steigende Calciumkonzentration als auch die steigende Gasproduktion angezeigt.
Der Na⁺-K⁺-2Cl⁻-Kotransporter (NKCC2) wird im distalen Nephron der Niere exprimiert. Seine Verteilung umfasst die Epithelien der medullären und kortikalen Teile der dicken aufsteigenden Henle-Schleife (Thick ascending limb, TAL) und die Macula densa. Resorptiver NaCl-Transport über den NKCC2 dient dem renalen Konzentrierungsmechanismus und reguliert systemisch auch Volumenstatus und Blutdruck. Die Aktivität des NKCC2 ist mit der Phosphorylierung seiner N-terminalen Aminosäurereste Serin 126 und Threonin 96/101 verbunden. Vermittelt wird diese durch die homologen Kinasen SPAK (SPS-related proline/alanine-rich kinase) und OSR1 (Oxidative stress responsive kinase 1), die hierzu ihrerseits phosphoryliert werden müssen. Der regulatorische Kontext dieser Kinasen ist mittlerweile gut charakterisiert. Über Mechanismen und Produkte, die den NKCC2 deaktivieren, war hingegen weniger bekannt. Ziel der Arbeit war daher zu untersuchen, welche Wege zur Deaktivierung des Transporters führen. Der intrazelluläre Sortierungsrezeptor SORLA (Sorting-protein-related receptor with A-type repeats) war zuvor in seiner Bedeutung für das Nephron charakterisiert worden. Ein SORLA-defizientes Mausmodell weist unter anderem eine stark verringerte NKCC2-Phosphorylierung auf. Unter osmotischem Stress können SORLA-defiziente Mäuse ihren Urin weniger effizient konzentrieren. Meine Resultate zeigen mit hochauflösender Technik, dass SORLA apikal im TAL lokalisiert ist und dass mit NKCC2 eine anteilige Kolokalisation besteht. Unter SORLA Defizienz war die für die NKCC2 Aktivität maßgebliche SPAK/OSR1-Phosphorylierung gegenüber dem Wildtyp nicht verändert. Jedoch war die ebenfalls im TAL exprimierte Phosphatase Calcineurin Aβ (CnAβ) per Western blot um das zweifache gesteigert. Parallel hierzu wurde immunhistochemisch die Kolokalisation von verstärktem CnAβ-Signal und NKCC2 bestätigt. Beide Befunde geben zusammen den Hinweis auf einen Bezug zwischen der reduzierten NKCC2-Phosphorylierung und der gesteigerten Präsenz von CnAβ bei SORLA Defizienz. Die parallel induzierte Überexpression von SORLA in HEK-Zellen zeigte entsprechend eine Halbierung der CnAβ Proteinmenge. SORLA steuert demzufolge sowohl die Abundanz als auch die zelluläre Verteilung der Phosphatase. Weiterhin ließ sich die Interaktion zwischen CnAβ und SORLA (intrazelluläre Domäne) mittels Co-Immunpräzipitation bzw. GST-pulldown assay nachweisen. Auch die Interaktion zwischen CnAβ und NKCC2 wurde auf diesem Weg belegt. Da allerdings weder SORLA noch NKCC2 ein spezifisches Bindungsmuster für CnAβ aufweisen, sind vermutlich intermediäre Adapterproteine bei ihrer Bindung involviert. Die pharmakologische Inhibition von CnAβ mittels Cyclosporin A (CsA; 1 h) führte bei SORLA Defizienz zur Normalisierung der NKCC2-Phosphorylierung. Entsprechend führte in vitro die Gabe von CsA bei TAL Zellen zu einer 7-fach gesteigerten NKCC2-Phosphorylierung. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Phosphatase CnAβ über ihre Assoziation mit NKCC2 diesen im adluminalen Zellkompartiment deaktivieren kann. Gesteuert wird dieser Vorgang durch die Eigenschaft von SORLA, CnAβ apikal zu reduzieren und damit die adluminale Phosphorylierung und Aktivität von NKCC2 zu unterstützen. Da Calcineurin-Inhibitoren derzeit die Grundlage der immunsupprimierenden Therapie darstellen, haben die Ergebnisse eine klinische Relevanz. Angesichts der Co-Expression von SORLA und CnAβ in verschiedenen anderen Organen können die Ergebnisse auch über die Niere hinaus Bedeutung erlangen.
Die Honigbiene Apis mellifera zeigt innerhalb einer Kolonie eine an das Alter gekoppelte Arbeitsteilung. Junge Honigbienen versorgen die Brut (Ammenbienen), während ältere Honigbienen (Sammlerinnen) außerhalb des Stocks Pollen und Nektar eintragen. Die biogenen Amine Octopamin und Tyramin sind an der Steuerung der Arbeitsteilung maßgeblich beteiligt. Sie interagieren mit Zielzellen über die Bindung an G Protein gekoppelte Rezeptoren. A. mellifera besitzt fünf charakterisierte Octopaminrezeptoren (AmOctαR1, AmOctβR1-4), einen charakterisierten Tyraminrezeptor (AmTyr1) sowie einen weiteren putativen Tyraminrezeptor.
In der vorliegenden Arbeit wurde dieser putative Aminrezeptor als zweiter Tyraminrezeptor (AmTyr2) identifiziert, lokalisiert und pharmakologisch charakterisiert.
Die von der cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz weist strukturelle Eigenschaften und konservierte Motive von G Protein gekoppelten Rezeptoren auf. Phylogenetisch ordnet sich der AmTyr2 Rezeptor bei den Tyramin 2 Rezeptoren anderer Insekten ein. Die funktionelle und pharmakologische Charakterisierung des putativen Tyraminrezeptors erfolgte in modifizierten HEK293 Zellen, die mit der Rezeptor cDNA transfiziert wurden. Die Applikation von Tyramin aktiviert Adenylylcyclasen in diesen Zellen und resultiert in einem Anstieg des intrazellulären cAMP Gehalts. Der AmTyr2 Rezeptor kann durch Tyramin in nanomolaren Konzentrationen halbmaximal aktiviert werden. Während es sich bei Octopamin um einen wirkungsvollen Agonisten des Rezeptors handelt, sind Mianserin und Yohimbin effektive Antagonisten. Für die Lokalisierung des Rezeptorproteins wurde ein polyklonaler Antikörper generiert. Eine AmTyr2-ähnliche Immunreaktivität zeigt sich im Gehirn in den optischen Loben, den Antennalloben, dem Zentralkomplex und in den Kenyon Zellen der Pilzkörper.
Des Weiteren wurde die Rolle der Octopamin- und Tyraminrezeptoren bei der Steuerung der altersabhängigen Arbeitsteilung analysiert.
Die Genexpression des AmOctαR1 in verschiedenen Gehirnteilen korreliert unabhängig vom Alter mit der sozialen Rolle, während sich die Genexpression von AmOctβR3/4 und den Tyraminrezeptoren AmTyr1 und AmTyr2 maximal mit dem Alter aber nicht der sozialen Rolle ändert. Sammlerinnen weisen einen höheren Octopamingehalt im Gesamtgehirn auf als Ammenbienen; bei Tyramin zeigen sich keine Unterschiede. Während Tyramin offensichtlich keine direkte Rolle spielt, werden durch Octopamin gesteuerte Prozesse der altersabhängigen Arbeitsteilung bei der Honigbiene vermutlich über den AmOctαR1 vermittelt.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen die wichtige Rolle von biogenen Aminen, insbesondere Octopamin bei der sozialen Organisation von Insektenstaaten.