570 Biowissenschaften; Biologie
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- Zentrum für Umweltwissenschaften (4)
- Department Sport- und Gesundheitswissenschaften (2)
- Institut für Umweltwissenschaften und Geographie (1)
- Interdisziplinäres Zentrum für Musterdynamik und Angewandte Fernerkundung (1)
Biogene Amine sind kleine organische Verbindungen, die sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen als Neurotransmitter, Neuromodulatoren und/oder Neurohormone wirken können. Sie bilden eine bedeutende Gruppe von Botenstoffen und entfalten ihre Wirkungen über die Bindung an eine bestimmte Klasse von Rezeptorproteinen, die als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bezeichnet werden. Bei Insekten gehören zur Substanzklasse der biogenen Amine die Botenstoffe Dopamin, Tyramin, Octopamin, Serotonin und Histamin. Neben vielen anderen Wirkung ist z.B. gezeigt worden, daß einige dieser biogenen Amine bei der Honigbiene (Apis mellifera) die Geschmacksempfindlichkeit für Zuckerwasser-Reize modulieren können. Ich habe verschiedene Aspekte der aminergen Signaltransduktion an den „Modellorganismen“ Honigbiene und Amerikanische Großschabe (Periplaneta americana) untersucht. Aus der Honigbiene, einem „Modellorganismus“ für das Studium von Lern- und Gedächtnisvorgängen, wurden zwei Dopamin-Rezeptoren, ein Tyramin-Rezeptor, ein Octopamin-Rezeptor und ein Serotonin-Rezeptor charakterisiert. Die Rezeptoren wurden in kultivierten Säugerzellen exprimiert, um ihre pharmakologischen und funktionellen Eigenschaften (Kopplung an intrazelluläre Botenstoffwege) zu analysieren. Weiterhin wurde mit Hilfe verschiedener Techniken (RT-PCR, Northern-Blotting, in situ-Hybridisierung) untersucht, wo und wann während der Entwicklung die entsprechenden Rezeptor-mRNAs im Gehirn der Honigbiene exprimiert werden. Als Modellobjekt zur Untersuchung der zellulären Wirkungen biogener Amine wurden die Speicheldrüsen der Amerikanischen Großschabe genutzt. An isolierten Speicheldrüsen läßt sich sowohl mit Dopamin als auch mit Serotonin Speichelproduktion auslösen, wobei Speichelarten unterschiedlicher Zusammensetzung gebildet werden. Dopamin induziert die Bildung eines völlig proteinfreien, wäßrigen Speichels. Serotonin bewirkt die Sekretion eines proteinhaltigen Speichels. Die Serotonin-induzierte Proteinsekretion wird durch eine Erhöhung der Konzentration des intrazellulären Botenstoffs cAMP vermittelt. Es wurden die pharmakologischen Eigenschaften der Dopamin-Rezeptoren der Schaben-Speicheldrüsen untersucht sowie mit der molekularen Charakterisierung putativer aminerger Rezeptoren der Schabe begonnen. Weiterhin habe ich das ebony-Gen der Schabe charakterisiert. Dieses Gen kodiert für ein Enzym, das wahrscheinlich bei der Schabe (wie bei anderen Insekten) an der Inaktivierung biogener Amine beteiligt ist und im Gehirn und in den Speicheldrüsen der Schabe exprimiert wird.
Das proinflammatorische Zytokin Interleukin-1 (IL-1) spielt eine zentrale Rolle bei Entzündungen und Infektionen. Die zellulären Antworten von IL-1 werden über den IL-1-Rezeptor Typ I (IL-1RI) vermittelt. Adapterproteine und die IL-1RI-assoziierte Kinase IRAK werden nach Ligandenbindung an den Rezeptor rekrutiert. Nach ihrer Phosphorylierung dissoziiert die IRAK vom IL-1RI-Komplex und aktiviert weitere Kinasen, was letztendlich zur Aktivierung von NF-κB und zur Induktion der Transkription von Genen führt. Für eine adäquate Immunantwort ist ein intrazellulärer reduzierter Status von Proteinthiolen essentiell. Vorausgegangene Untersuchungen an der murinen Thymomzelllinie EL-4 zeigten, dass die IL-1-Signalkaskade durch thiolmodifizierende Substanzen wie Menadion (MD) oder Phenylarsinoxid (PAO) gehemmt wird. Eine IL-1-abhängige Aktivierung von IL-1RI-assoziierte Kinasen oder NF-κB fand nicht mehr statt. Ziele dieser Arbeit waren: (i) mögliche Proteine, die für den Angriff von thiolmodifizierenden Agenzien ein Ziel sein könnten, zu identifizieren und (ii) den Einfluss nahrungsrelevanter und redoxaktiver Substanzen auf frühe Ereignisse der IL-1-Signaltransduktion wie der Bildung des IL-1RI-Komplexes zu untersuchen. Als Zellmodell wurden EL-4-Zellen mit stabil überexprimierter IRAK (EL-4<sup>IRAK) verwendet. Um die Bildung des IL-1RI-Komplexes, anschließende Phosphorylierungsereignisse und somit Kinase-Aktivitäten nachzuweisen, wurden Co-Präzipitations-Experimente und in vitro Kinase Tests durchgeführt. Die Markierung von Proteinthiolen erfolgte mit dem thiolspezifischen Reagenz Iodoacetyl-[<sup>125I]-Iodotyrosin ([<sup>125I]-IAIT). Die Vorbehandlung von EL-4<sup>IRAK-Zellen mit MD oder PAO führte zu einer Hemmung der Rekrutierung der IRAK an den IL-1RI und der anschließenden Phosphorylierungen. Zur Identifikation weiterer IL-1RI-assoziierter Proteine wurden IL-1RI-Immunpräzipitate zweidimensional aufgetrennt, Colloidal-Coomassie gefärbte Proteinspots ausgeschnitten und anschließend massenspektrometrisch mittels ESI-Q-TOF analysiert. Bei der Analyse wurden Proteine des Cytoskeletts wie z. B. Actin identifiziert. In Analogie zu den synthetischen Substanzen MD und PAO wurden nahrungsrelevante und redoxaktive Substanzen wie Curcumin (Gelbwurz) und Sulforaphan (Broccoli) eingesetzt, um zu untersuchen, ob sie bereits früh die IL-1-Signaltransduktion beeinflussen. Bislang sind antiinflammatorische Effekte dieser beiden Nahrungsinhaltsstoffe nur auf der Ebene der Zytokin-vermittelten Aktivierung von NF-κB beschrieben. Sowohl Curcumin als auch Sulforaphan blockierten konzentrationsabhängig die Assoziation der IRAK an den IL-1RI in EL-4<sup>IRAK-Zellen, wobei beide Substanzen unterschiedlich wirkten. Curcumin beeinflusste die IRAK-Aktivierung durch direkte Modifikation von Thiolen der IRAK ohne die Bindung von IL-1 mit dem IL-1RI zu beeinträchtigen. Sulforaphan hingegen induzierte auf mRNA- und Proteinebene die Expression von Tollip, welches durch PCR bzw. Western Blot nachgewiesen wurde. Tollip, ein negativer Regulator in TLR/IL-1RI-Signalkaskaden, könnte somit nach Induktion die IRAK-Aktivierung unterdrücken. Die Sulforaphan-abhängige Induktion der Tollip-Expression erfolgte jedoch nicht über Nrf2 und "antioxidant response element" (ARE)-regulierte Transkription, obwohl Sulforaphan ein bekannter Nrf2-Aktivator ist. Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass die IRAK ein redoxsensitives Protein ist und für die Bildung des IL-1RI-Komplexes reduzierte Proteinthiole eine Voraussetzung sind. Der Angriffspunkt für die antiinflammatorische Wirkung der beiden Nahrungsbestandteile Curcumin und Sulforaphan ist die Bildung des IL-1RI-Komplexes als ein frühes Ereignis in der IL-1-Signalkaskade. Die Hemmung dieses Prozesses würde die in der Literatur beobachteten Inhibitionen der abwärts liegenden Signale wie die Aktivierung von NF-κB und die Induktion proinflammatorischer Proteine erklären.
Weltweit versuchen Wissenschaftler, künstliche Viren für den Gentransfer zu konstruieren, die nicht reproduktionsfähig sind. Diese sollen die Vorteile der natürlichen Viren besitzen (effizienter Transport von genetischem Material), jedoch keine Antigene auf ihrer Oberfläche tragen, die Immunreaktionen auslösen. Ziel dieses Projektes ist es, einen künstlichen Viruspartikel herzustellen, dessen Basis eine Polyelektrolytenhohlkugel bildet, die mit einer Lipiddoppelschicht bedeckt ist. Um intakte Doppelschichten zu erzeugen, muss die Wechselwirkung zwischen Lipid und Polyelektrolyt (z.B. DNA) verstanden und optimiert werden. Dazu ist es notwendig, die strukturelle Grundlage der Interaktion aufzuklären. Positiv geladene Lipide gehen zwar starke Wechselwirkungen mit der negativ geladenen DNA ein, sie wirken jedoch toxisch auf biologische Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die durch zweiwertige Kationen vermittelte Kopplung von genomischer oder Plasmid-DNA an zwitterionische oder negativ geladene Phospholipide an zwei Modellsystemen untersucht. 1. Modellsystem: Lipidmonoschicht an der Wasser/Luft-Grenzfläche Methoden: Filmwaagentechnik in Kombination mit IR-Spektroskopie (IRRAS), Röntgenreflexion (XR), Röntgendiffraktion (GIXD), Brewsterwinkel-Mikroskopie (BAM), Röntgenfluoreszenz (XRF) und Oberflächenpotentialmessungen Resultate: A) Die Anwesenheit der zweiwertigen Kationen Ba2+, Mg2+, Ca2+ oder Mn2+ in der Subphase hat keinen nachweisbaren Einfluss auf die Struktur der zwitterionischen DMPE- (1,2-Dimyristoyl-phosphatidyl-ethanolamin) Monoschicht. B) In der Subphase gelöste DNA adsorbiert nur in Gegenwart dieser Kationen an der DMPE-Monoschicht. C) Sowohl die Adsorption genomischer Kalbsthymus-DNA als auch der Plasmid-DNA pGL3 bewirkt eine Reduktion des Neigungswinkels der Alkylketten, die auf einen veränderten Platzbedarf der Kopfgruppe zurückzuführen ist. Durch die Umorientierung der Kopfgruppe wird die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Stickstoffatomen der Lipidkopfgruppen und den negativ geladenen DNA-Phosphaten erhöht. D) Die adsorbierte DNA weist eine geordnete Struktur auf, wenn sie durch Barium-, Magnesium-, Calcium- oder Manganionen komplexiert ist. Der Abstand zwischen parallelen DNA-Strängen hängt dabei von der Größe der DNA-Fragmente sowie von der Art des Kations ab. Die größten Abstände ergeben sich mit Bariumionen, gefolgt von Magnesium- und Calciumionen. Die kleinsten DNA-Abstände werden durch Komplexierung mit Manganionen erhalten. Diese Ionenreihenfolge stellt sich sowohl für genomische DNA als auch für Plasmid-DNA ein. E) Die DNA-Abstände werden durch die Kompression des Lipidfilms nicht beeinflusst. Zwischen der Lipidmonoschicht und der adsorbierten DNA besteht demnach nur eine schwache Wechselwirkung. Offensichtlich befindet sich die durch zweiwertige Kationen komplexierte DNA als weitgehend eigenständige Schicht unter dem Lipidfilm. 2. Modellsystem: Lipiddoppelschicht an der fest/flüssig-Grenzfläche Methoden: Neutronenreflexion (NR) und Quarzmikrowaage (QCM-D) Resultate: A) Das zwitterionische Phospholipid DMPC (1,2-Dimyristoyl-phosphatidylcholin) bildet keine Lipiddoppelschicht auf planaren Polyelektrolytmultischichten aus, deren letzte Lage das positiv geladene PAH (Polyallylamin) ist. B) Hingegen bildet DMPC auf dem negativ geladenen PSS (Polystyrolsulfonat) eine Doppelschicht aus, die jedoch Defekte aufweist. C) Eine Adsorption von genomischer Kalbsthymus-DNA auf dieser Lipidschicht findet nur in Gegenwart von Calciumionen statt. Andere zweiwertige Kationen wurden nicht untersucht. D) Das negativ geladene Phospholipid DLPA (1,2-Dilauryl-phosphatidsäure) bildet auf dem positiv geladenen PAH eine Lipiddoppelschicht aus, die Defekte aufweist. E) DNA adsorbiert ebenfalls erst in Anwesenheit von Calciumionen in der Lösung an die DLPA-Schicht. F) Durch die Zugabe von EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) werden die Calciumionen dem DLPA/DNA-Komplex entzogen, wodurch dieser dissoziiert. Demnach ist die calciuminduzierte Bildung dieser Komplexe reversibel.
In der vorliegenden Arbeit wurden cDNAs, kodierend für bisher unbekannte stärkeabbauende Enzyme, aus Kartoffel isoliert und funktionell analysiert. Die Isolation der cDNAs erfolgte mit Hilfe eines Systems, welches sich der funktionellen Expression von cDNA-Bibliotheken in E. coli bediente. Die mit diesem System zur Expression gebrachten cDNA-Bibliotheken wurden im Rahmen dieser Arbeit hergestellt. Zum einen handelte es sich um eine blattspezifische Phagen-cDNA-Bibliothek (Proben wurden während des Tag/Nacht Übergangs genommen), zum anderen um eine knollenspezifische cDNA-Bibliothek aus kaltgelagerten Knollen. Nach der Überführung der Phagen-Bibliotheken in Plasmid-Bibliotheken wurden diese funktionell in dem E. coli Stamm KV832 exprimiert. Der Stamm KV832 wurde aufgrund seiner Fähigkeit, lineare Glucane zu akkumulieren, ausgewählt. Werden Glucan akkumulierende KV832 Kolonien mit Jod bedampft, so zeigen diese eine typische Blaufärbung. Nach der Expression der Plasmid-Bibliotheken in KV832 wurden solche Kolonien weiter untersucht, welche in ihrer Färbung von den blauen Kolonien abwichen. Mittels eines zweiten E. coli Stamms, PGM −, welcher ebenfalls in der Lage ist, lineare Glucane zu akkumulieren, wurden die Ergebnisse für KV832 bestätigt. Die funktionelle Expression der Bibliotheken führte zur Isolation einer Reihe von unbekannten cDNAs. Zwei dieser cDNAs wurden im Rahmen dieser Arbeit weiterführend untersucht. Zum einen handelte es sich um eine cDNA, die für eine bis dahin unbekannte β-Amylase aus Kartoffel kodierte und deren Homolog aus Arabidopsis (CT-BMY) im Laufe dieser Arbeit von Lao et al. (1999) veröffentlicht wurde, zum anderen um eine cDNA, die für ein unbekanntes Enzym kodierte (DSD10). Das Arabidopsis Homolog zu DSD10 wurde im Zuge der Arabidopsis Genominitiative Ende 2000 publiziert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die isolierte β-Amylase cDNA für eine funktionelle β-Amylase kodiert und dieses Enzym in der Lage ist, neben löslicher auch rohe Stärke anzugreifen. Lokalisationsexperimente zeigten, dass das Enzym in isolierte Erbsenchloroplasten importiert wurde und dass die 100 N-terminalen Aminosäuren für den Import in die Plastiden ausreichten. Die β-Amylase wurde als PCT-BMYI bezeichnet. Die »antisense«-Inhibierung von PCT-BMYI führte zu einem Hochstärke-Phänotyp der Blätter, sowie zu einem Anstieg der Trockenmasse. Der Hochstärke-Phänotyp ist auf eine Reduktion der Stärkemobilisierung und die daraus folgende Akkumulation der Stärke während der Vegetationsperiode zurückzuführen. Damit konnte erstmals die physiologische Bedeutung einer β-Amylase für den Abbau der transitorischen Stärke gezeigt werden. Kein Einfluss zeigte die »antisense« Inhibierung von PCT-BMYI auf den kälteinduzierten Abbau der Speicherstärke in Knollen. Es konnte auch kein Unterschied im Keimverhalten oder der Entwicklung der neuen Pflanze beobachtet werden. Ein Teil der Ergebnisse zu PCT-BMYI wurde bereits publiziert (Scheidig et al., 2002). Die isolierten cDNAs dsd10, sgeI (die Volllängen cDNA zu dsd10) und das Arabidopsis Homolog asgeI kodieren für Enzyme, welche α-Amylase-Aktivität besitzen, aber keine Homologie zu bekannten α-Amylasen aufweisen. Ein mögliches Glucoamylase Motiv erwies sich für die Aktivität des Proteins als essentiell. Lokalisationsexperimente deuteten auf den Import des SGEI Proteins in isolierte Erbsenchloroplasten hin. Die »antisense«-Inhibierung von sgeI führte in den entsprechenden Linien zu einem Hochstärke-Phänotyp in Blättern, einem Anstieg der Trockenmasse in Blättern, sowie zu größeren Stärkekörnern in einer der untersuchten Linien. Ein nicht erwarteter Effekt zeigte sich in Blättern der entsprechenden Linien, welche für längere Zeit dunkel gehalten wurden. Die Blätter der untransformierten Kontrolle waren abgestorben, wohingegen die Blätter der SGEI »antisense« Linien grün und vital erschienen. Die α- und β-Amylase-Aktivität war in Blättern der SGEI »antisense« Linien reduziert, weshalb eine genaue Zuordnung der Funktion von SGEI nicht möglich war. Die vorliegenden Ergebnisse zu den SGEI »antisense« Linien deuten aber darauf hin, dass der beobachtete Hochstärke-Phänotyp nicht alleine auf die Reduktion der β-Amylase-Aktivität zurückzuführen ist. Ein Einfluss von SGEI auf den kälteinduzierten Abbau der Speicherstärke konnte nicht beobachtet werden. Es konnte auch hier kein Unterschied im Keimverhalten oder der Entwicklung der neuen Pflanze beobachtet werden.
Apoptose, der programmierte Zelltod, spielt eine wichtige Rolle für das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Sterben von Zellen und ist außerdem an der Beseitigung von infizierten und geschädigten Zellen beteiligt. Apoptose kann durch Stimulation von Rezeptoren aus der Familie der TNF-Rezeptoren wie CD95, ausgelöst werden. Nach Liganden-induzierter Trimerisierung der Rezeptoren bindet FADD an den zytoplasmatischen Teil des Rezeptors und rekrutiert Caspase-8 und/oder -10. Die räumliche Nähe der Caspasen in diesem als DISC bezeichneten Komplex führt zu ihrer auto- und transkatalytischen Spaltung und damit Aktivierung. Dadurch wird das apoptotische Programm gestartet, welches zum Tod der Zelle führt. Kontrolliert wird dieser Vorgang von einer Vielzahl anti-apoptotischer Proteine. Störungen in diesem System sind an der Entstehung einer Reihe von Krankheiten beteiligt. Die Blockade der Apoptoseinduktion kann zur Entstehung von Tumoren beitragen. Das klassische Hodgkin Lymphom ist eine maligne Erkrankung des lymphatischen Systems. Die Tumorzellen sind große, einkernige Hodgkin- oder mehrkernige Reed/Sternbergzellen (HRS-Zellen). Sie leiten sich von Keimzentrum-B-Zellen ab. In HRS-Zellen fehlt die Expression einer Vielzahl von typischen B-Zellmarkern, darunter die des B-Zellrezeptors. Solche B-Zellen sterben normalerweise während der Keimzentrumsreaktion durch Apoptose. An diesem Prozess ist CD95 beteiligt. In einer Reihe von malignen Erkrankungen wurden eine Herunterregulation der CD95-Expression oder Mutationen im CD95-Gen beobachtet. Es wird daher vermutet, dass CD95-induzierte Apoptose zur Entfernung von Tumorzellen beiträgt. Im Gegensatz dazu exprimieren sowohl primäre HRS-Zellen als auch etablierte HRS-Zelllinien in der Regel Wildtyp-CD95, sind aber trotzdem CD95-resistent. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Komponenten des CD95-Systems, im Gegensatz zu anderen malignen Erkrankungen, in den HRS-Zellen hochreguliert sind, darunter CD95 selbst. In immunpräzipitierten DISCs von CD95-stimulierten HRS-Zellen wurde neben FADD und Caspase-8/-10 auch c-FLIP nachgewiesen. c-FLIP ist ein Caspase-8/-10-Homolog, das ebenfalls an FADD bindet, aber aufgrund fehlender katalytischer Aktivität die Aktivierung der Caspasen im DISC und damit die Apoptoseinduktion verhindert. Eine starke c-FLIP-Expression konnte in allen HRS-Zelllinien und in den HRS-Zellen nahezu aller untersuchter primärer Hodgkinfälle (55/59) gezeigt werden. Durch siRNA-vermittelte Herunterregulation von c-FLIP war es möglich, HRS-Zelllinien gegenüber CD95-induzierter Apoptose zu sensitivieren. Dies zeigt, dass die CD95-Rezeptor-induzierte Apoptose in den HRS-Zellen nicht strukturell, sondern funktionell inhibiert ist und c-FLIP stark zu dieser Inhibition beiträgt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die c-FLIP-Expression in den HRS-Zellen von der konstitutiven Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB abhängt, die charakteristisch für diese Zellen ist. Normalerweise wird NF-κB von Inhibitorproteinen, den IκBs, im Zytoplasma zurückgehalten. Diverse Stimuli können den IKK-Komplex aktivieren, der die IκBs an bestimmten Serinresten phosphoryliert. Dies hat die Ubiquitinylierung und den Abbau der IκBs zur Folge, wodurch NF-κB frei wird, in den Kern wandert und dort seine Zielgene aktiviert. Es wird angenommen, dass in HRS-Zellen ein konstitutiv aktiver IKK-Komplex und teilweise Mutationen der IκB-Proteine zur konstitutiven NF-κB-Aktivität beitragen. Zu den NF-κB-abhängigen Genen in den HRS-Zellen gehören solche mit anti-apoptotischer und Zellzyklus-treibender Wirkung. Die Inhibition der NF-κB-Aktivität in den HRS-Zellen führt zu Apoptose und eingeschränkter Proliferation. Von dreiwertigem Arsen ist bekannt, dass es die Induzierbarkeit des IKK-Komplexes inhibieren kann und damit letztendlich die Aktivierung von NF-κB. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Arsen in HRS-Zellen den konstitutiv aktiven IKK-Komplex inhibiert. In Zelllinien mit intakten IκB-Proteinen führte dies zur NF-κB-Inhibition und Apoptoseinduktion. Die Reduktion der NF-κB-Aktivität ging mit der Herunterregulation von anti-apoptotischen und Proliferations-fördernden Zielgenen einher. Die ektope Überexpression von NF-κB hob die Apoptose-induzierende Wirkung von Arsen teilweise auf. Durch Arsen-Behandlung von Mäusen konnte das Tumorwachstum xenotransplantierter HRS-Zellen stark verlangsamt werden. In explantierten Tumorzellen konnte ebenfalls eine NF-κB-Inhibition nachgewiesen werden. Die NF-κB-Inhibition durch Arsen trägt also stark zur Apoptoseinduktion in den HRS-Zellen bei. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Modulation der Apoptoseresistenz neue therapeutische Ansätze für die Behandlung des Hodgkin Lymphoms bieten könnte. Der Einsatz von Arsen ist dabei besonders interessant, da Arsen schon für die Behandlung anderer maligner Erkrankungen eingesetzt wird.
Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Oktober 2002 bis November 2005 an dem Institut für Biochemie und Biologie der Universität Potsdam in Kooperation mit dem Institut für Chemie des GKSS Forschungszentrums in Teltow unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. B. Micheel und Herrn Prof. Dr. Th. Groth angefertigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Wechselwirkungen von Immunzellen mit verschiedenen Kultursubstraten untersucht. Dafür wurden drei verschiedene Hybridomzelllinien eingesetzt. Eine Hybridomzelllinie (K2) ist im Laufe dieser Arbeit hergestellt und etabliert worden. Der Einsatz von synthetischen und proteinbeschichteten Kulturoberflächen führte bei Hybridomzellen zu einer deutlich gesteigerten Antikörpersynthese im Vergleich zu herkömmlichen Zellkulturmaterialien. Obwohl diese Zellen in der Regel als Suspensionszellen kultiviert werden, führten die eingesetzten Polymermembranen (PAN, NVP) zu einer verbesserten Antikörpersynthese (um 30%) gegenüber Polystyrol als Referenz. Es konnte gezeigt werden, dass es einen Zusammenhang zwischen der Produktivität und dem Adh asionsverhalten der Hybridomzellen gibt. Um den Einfluss von Proteinen der extrazellulären Matrix auf Zellwachstum und Antikörpersynthese von Hybridomzellen zu untersuchen, wurden proteinbeschichtete Polystyrol-Oberflächen eingesetzt. Für die Modifikationen wurden Fibronektin, Kollagen I, Laminin und BSA ausgewählt. Die Modifikation der Polystyrol-Oberfläche mit geringen Mengen Fibronektin (0,2-0,4 µg/ml) führte zu einer beträchtlichen Steigerung der Antikörpersynthese um 70-120%. Für Kollagen I- und BSA-Beschichtungen konnten Steigerungen von 40% beobachtet werden. Modifikationen der Polystyrol-Oberfläche mit Laminin zeigten nur marginale Effekte. Durch weitere Versuche wurde bestätigt, dass die Adhäsion der Zellen an Kollagen I- und Laminin-beschichteten Oberflächen verringert ist. Die alpha2-Kette des alpha2beta1-Integrins konnte auf der Zelloberfläche nicht nachgewiesen werden. Durch ihr Fehlen wird wahrscheinlich die Bindungsfähigkeit der Zellen an Kollagen I und Laminin beeinflusst. Durch die Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass Hybridomzellen nicht nur Suspensionszellen sind und das Kultursubstrate das Zellwachstum und die Produktivität dieser Zellen stark beeinflussen können. Der Einsatz von synthetischen und proteinbeschichteten Kultursubstraten zur Steigerung der Antikörpersynthese kann damit für die industrielle Anwendung von großer Relevanz sein. Für die Modellierung einer Lymphknotenmatrix wurden Fibronektin, Kollagen I, Heparansulfat und N-Acetylglucosamin-mannose in verschiedenen Kombinationen an Glasoberflächen adsorbiert und für Versuche zur In-vitro-Immunisierung eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Modifikation der Oberflächen die Aktivierung und Interaktion von dendritischen Zellen, T- und B-Lymphozyten begünstigt, was durch den Nachweis spezifischer Interleukine (IL12, IL6) und durch die Synthese spezifischer Antikörper bestätigt wurde. Eine spezifische Immunreaktion gegen das Antigen Ovalbumin konnte mit den eingesetzten Zellpopulationen aus Ovalbumin-T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen nachgewiesen werden. Die In-vitro-Immunantwort wurde dabei am stärksten durch eine Kombination von Kollagen I, Heparansulfat und N-Acetylglucosamin-mannose auf einer Glasoberfläche gefördert. Die Etablierung einer künstlichen Immunreaktion kann eine gesteuerte Aktivierung bzw. Inaktivierung von körpereigenen dendritischen Zellen gegen bestehende Krankheitsmerkmale in vitro ermöglichen. Durch die Versuche wurden Grundlagen für spezifische Immunantworten erarbeitet, die u.a. für die Herstellung von humanen Antikörpern eingesetzt werden können.
"Untersuchung kardioprotektiver Wirkungen des Olivenöles und seiner phenolischen Komponenten in einer Gruppe gesunder deutscher Männer" EINLEITUNG: Epidemiologische Daten belegen, dass die mediterrane Ernährung mit einer niedrigen Inzidenz an mit oxidativen Stress assoziierten kardiovaskulären Erkrankungen einhergeht. Dabei wird vor allem dem Olivenöl, als Hauptfettlieferant in der mediterranen Ernährung, eine kardioprotektive Wirkung zugesprochen. Olivenöl zeichnet sich neben dem hohen Gehalt an einfach ungesättigten Fettsäuren (MUFA) durch ein reichhaltiges Spektrum an phenolischen Verbindungen aus, deren antioxidative Wirkung bereits zahlreichen in in vitro Studien beschrieben wurde. Demnach könnte der Verzehr von phenolreichem Olivenöl auch in vivo vor oxidativen Schädigungen schützen und somit das Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen senken. ZIELSTELLUNG: Untersuchung der kardioprotektiven Wirkung von Olivenöl und seiner phenolischen Komponenten in einer Gruppe gesunder deutscher Männer. METHODE: Dazu wurde eine randomisierte cross-over doppelt-verblindete Interventionsstudie an 70 gesunden Männern zwischen 20 - 60 Jahren im Raum Berlin-Brandenburg durchgeführt. In jeweils drei dreiwöchigen Interventionsphasen konsumierten die Probanden täglich 25 ml natives (phenolreich), gemischtes (mittlerer Phenolgehalt) und raffiniertes (annähernd phenolfrei) Olivenöl, was sich ausschließlich im Gehalt an phenolischen Verbindungen unterschied. Das Olivenöl sollte dabei die gewöhnlich verzehrten Fette ersetzen. Die Interventionsphasen waren durch zweiwöchige Wash out-Phasen unterbrochen. Die Erhebung der Blutlipide, Biomarker der Lipidperoxidation und endogene Antioxidantien erfolgte zu Studienbeginn sowie zu Beginn und Ende jeder Verzehrsperiode.ERGEBNISSE: Bei den Blutlipiden sowie den Biomarkern der Lipidperoxidation und den endogenen Antioxidantien konnte keine signifikante Veränderung in Abhängigkeit vom Phenolgehalt der applizierten Olivenöle nachgewiesen werden. Einzig die Glutathion-Reduktase-Aktivität stieg mit zunehmendem Gehalt an phenolischen Verbindungen (pTrend = 0,041). Unabhängig von der Konzentration der Phenole im Olivenöl wurde bei den Probanden durch den Olivenölverzehr eine Senkung von Gesamtcholesterol (p = 0,007) und Triglyzeride (p = 0,013) im Serum erzielt. Diese Wirkung geht einher mit einem gestiegenen MUFA-Anteil in der Ernährung aufgrund des Olivenölkonsums (p < 0,001). SCHLUSSFOLGERUNG: Die Hypothese, dass die Phenole im Olivenöl aufgrund ihrer in in vitro und Tierstudien beschriebenen antioxidativen Wirkung dem Olivenöl neben dem einzigartigen Fettsäureprofil eine zusätzliche kardioprotektive Wirkung bescheren, konnte in der vorliegenden Studie nicht gezeigt werden. Dennoch konnte durch den Olivenölverzehr und der damit einhergehenden Erhöhung des MUFA-Anteils in der Ernährung eine vorteilhafte Beeinflussung der Blutlipide erzielt werden. Obgleich Olivenöl nicht das vorwiegend verzehrte Fett in Deutschland darstellt, zeigten die befragten Probanden eine hohe Akzeptanz. Folglich könnte die Integration von Olivenöl in die habituelle Ernährung einen Beitrag zur Senkung des kardiovaskulären Erkrankungsrisikos leisten.
Nahrungsinhaltsstoffe sind im Organismus an Steuerungsprozessen und Stoffwechselvorgängen beteiligt, wobei die Mechanismen ihrer Wirkung noch nicht völlig aufgeklärt sind. Wie Vitamin E zeigen auch sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe in Zellsystemen sowie in vivo eine Reihe biologischer Wirkungen, deren Erklärung jedoch häufig auf ihre antioxidative Eigenschaft reduziert wird. Ziel der Dissertation war es, den Einfluss von Vitamin E und anderen Pflanzeninhaltsstoffen (in Form von Pflanzenextrakten oder isolierten sekundären Pflanzeninhaltsstoffen, z.B. Polyphenole), die bisher alle hauptsächlich als Antioxidanz klassifiziert wurden, auf die transkriptionelle Regulation von Phase I- und Phase II-Enzymen zu untersuchen. Dazu wurde die Aktivierung des PXR (pregnane X receptor) und des Nrf2 (NF-E2-related factor-2) als zentrale Transkriptionsfaktoren der Phase I- bzw. Phase II-Enzyme getestet. Der Einfluss von verschiedenen Vitamin E-Formen und antioxidativen Pflanzeninhaltsstoffen in Form von Reinsubstanzen (Curcumin, EGCG, Medox, Quercetin, Resveratrol und Sulforaphan) oder Pflanzenextrakten (aus Blaubeeren, Gewürznelken, Himbeeren, Nelkenpfeffer, Thymian oder Walnüssen) auf die Aktivierung von PXR und Nrf2 sowie des Promotors eines jeweiligen Zielgens (CYP3A4 bzw. GI-GPx) wurde in vitro mit Reportergenplasmiden untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl Vitamin E-Formen als auch verschiedene sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe PXR und/oder Nrf2 sowie die Promotoren der jeweiligen Zielgene CYP3A4 bzw. GI-GPx aktivieren. In einem Tierexperiment konnte diese genregulatorische Wirkung von Vitamin E auf die in vivo-Situation übertragen werden. In Lebern von Mäusen, deren Futter unterschiedliche Mengen von Vitamin E enthielt (Mangel-, Normal- und Überflussdiät), wurde eine direkte Korrelation zwischen der alpha-Tocopherol-Konzentration und der Cyp3a11 mRNA-Expression nachgewiesen (Cyp3a11 ist das murine Homolog zum humanen CYP3A4). Entgegen der in vitro-Situation hatte gamma-Tocotrienol in vivo einen nur kaum nachweisbaren Effekt auf die Expression der Cyp3a11 mRNA, induzierte aber die Expression der alpha-TTP mRNA. Es konnte gezeigt werden, dass Vitamin E und sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe Phase I- und Phase II-Enzyme transkriptionell regulieren können. Die Wirkungen des Vitamin E können sich allerdings nur entfalten, wenn die Vitamin E-Formen ausreichend vom Körper aufgenommen werden. Gegenstand der Dissertation waren daher auch Untersuchungen zur Bioverfügbarkeit (zelluläre Akkumulation und Metabolismus) verschiedener Vitamin E-Formen. Es konnte gezeigt werden, dass Unterschiede in der chemischen Struktur der Vitamin E-Formen deren zelluläre Akkumulation und Metabolisierung beeinflussen. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der Dissertation lassen sich protektive Wirkungen von antioxidativen Nahrungsinhaltsstoffen auch unabhängig von ihren antioxidativen Eigenschaften über die Induktion zelleigener Schutzsysteme, einschließlich der Phase I- und Phase II-Enzyme, erklären. Die Induktion der zelleigenen Abwehr lässt sich auch als adaptive Antwort (sog. "adaptive response") des Organismus gegenüber zellschädigenden Ereignissen betrachten.
Charakterisierung von Transportmechanismen in der Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana
(2006)
Die Aktivierung der Speichelsekretion erfolgt in der innervierten Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana durch die biogenen Amine Dopamin (DA) und Serotonin (5-HT). Die Acini der Speicheldrüse sezernieren einen Primärspeichel, der in den Ausführgängen modifiziert wird. Die durch DA und 5-HT aktivierten Signalwege sowie die an der Elektrolyt- und Flüssigkeitssekretion bzw. Speichel-modifikation beteiligten Transportmechanismen sind weitgehend unbekannt. Mikrofluorometrische Ca<sup>2+-, Na<sup>+- und pH-Messungen in Kombination mit pharmakologischen Experimenten, biochemische Messungen der Aktivitäten von Ionentransport-ATPasen sowie videomikroskopische Analysen zu transepithelialen Wasserbewegungen wurden in dieser Arbeit durchgeführt. Sie sollten Informationen über die an der Speichelbildung und -modifikation beteiligten Transportmechanismen und die Signalwege liefern, welche durch DA und/oder 5-HT aktiviert werden. Wesentliche Ergebnisse dieser Arbeit waren: <ul> <li>Messungen des intrazellulären pH (pHi) in Gangzellen zeigten, dass isolierte Ausführgänge mit Acini bei Stimulierung mit DA und 5-HT stark ansäuerten. In isolierten Ausführgängen ohne Acini verursachte nur DA eine schwache Ansäuerung. Da nur die Ausführgänge dopaminerg innerviert sind, die Acini jedoch dopaminerg und serotonerg, zeigt dieses Ergebnis, dass die DA- und/oder 5-HT-induzierte Primärspeichelbildung die Ursache für die pHi-Änderungen in den Gangzellen ist. pHi-Messungen in den Gangzellen geben also auch Hinweise auf Transportvorgänge in den Acini.</li> <li> Der Na<sup>+-K<sup>+-2Cl<sup>--Symporter und der Cl<sup>--HCO3<sup>--Antiporter, gekoppelt mit dem Na<sup>+ H<sup>+-Antiporter (NHE) waren an der NaCl-Aufnahme in die peripheren Zellen der Acini zur Bildung des NaCl-reichen Primärspeichels beteiligt. Die Aktivität dieser Transporter hing von der CO2/HCO3<sup>--Verfügbarkeit ab und war Ca<sup>2+-abhängig.</li> <li>Die starke Ansäuerung in den Gangzellen hing nicht von der Aktivität der apikalen vakuolären Protonen-ATPase (V-H<sup>+-ATPase), aber von der Aktivität der basolateralen Na<sup>+-K<sup>+-ATPase ab, die anscheinend in den Ausführgängen die Speichelmodifikation energetisiert.</li> <li>In isolierten Ausführgängen mit Acini waren die V-H<sup>+-ATPase und Na<sup>+-abhängige Transporter (u. a. NHE) an der Erholung von einer DA-induzierten oder einer NH4Cl-Vorpuls-induzierten Ansäuerung in den Gangzellen beteiligt. Bei der Regulation des pHi in unstimulierten Gangzellen spielten diese Transporter keine Rolle.</li> <li>In isolierten Ausführgängen mit Acini induzierte DA in den Gangzellen einen Anstieg der [Na<sup>+]i und, zeitlich verzögert, auch der [Ca<sup>2+]i. Der [Na<sup>+]i-Anstieg war von der Aktivität der Acini abhängig und erfolgte möglicherweise über apikale Na+-Kanäle. Der [Ca<sup>2+]i-Anstieg war graduiert und tonisch. Der DA-induzierte [Na<sup>+]i-Anstieg in den Gangzellen und deren Depolarisation führten dazu, dass der basolaterale Na<sup>+-Ca<sup>2+-Antiporter in den Ca<sup>2+-Influx-Modus umkehrte. Die daraus resultierende tonische [Ca<sup>2+]i-Erhöhung könnte an der Regulation der Na<sup>+-Rückresorption beteiligt sein.</li> <li>Zum Nachweis transepithelialer Flüssigkeitsbewegungen in isolierten Ausführgängen wurde eine videomikroskopische Methode entwickelt. Isolierte Ausführgänge ohne Acini resorbierten im unstimulierten Zustand Flüssigkeit aus dem Ausführganglumen. Möglicherweise sezernieren die Acini auch im unstimulierten Zustand mit geringerer Rate einen Primärspeichel, der in den Ausführgängen resorbiert wird. Die Resorption war ATP-abhängig. Der ATP-verbrauchende Transportmechanismus konnte nicht identifiziert werden. Weder die Na<sup>+-K<sup>+-ATPase noch die V-H<sup>+-ATPase waren an der Resorption beteiligt.</li> </ul> Diese Arbeit trug zur Kenntnis der komplexen Funktionsweise von Speicheldrüsen in Insekten bei und erweiterte das lückenhafte Wissen über die zellulären Wirkungen biogener Amine in Insekten. Zudem wurden in dieser Arbeit viele Parallelen zu Funktionsweisen der Speicheldrüsen in Vertebraten deutlich.
Die Enzymsuperfamilie der löslichen Sulfotransferasen (SULT) spielt eine wichtige Rolle in der Phase II des Fremdstoffmetabolismus. Sie katalysieren den Transfer einer Sulfonylgruppe auf nucleophile Gruppen endogener und exogener Substrate. Die Sulfokonjugation von Fremdstoffen erhöht deren Wasserlöslichkeit und behindert die passive Permeation von Zellmembranen. Dadurch wird die Ausscheidung dieser konjugierten Substanzen erleichtert. In Abhängigkeit von der Struktur des Zielmoleküls kann die Sulfokonjugation aber auch zur metabolischen Aktivierung von Fremdstoffen durch die Bildung instabiler Metabolite führen. Die SULT-vermittelte Aktivierung promutagener Substanzen ist somit von toxikologischem Interesse. Für die Detektion SULT-vermittelter Mutagenität mittels bakterieller in-vitro Testsysteme ist die heterologe Expression der fremdstoffmetabolisierenden Enzyme direkt in den Indikatorzellen notwendig. S. typhimurium exprimieren selbst keine SULT, und externe Metabolisierungssysteme sind problematisch, weil die negativ geladenen, kurzlebigen Metabolite nur schlecht die Zellmembran penetrieren können. Die Expression humaner Enyme in Bakterien ist jedoch zum Teil sehr kritisch. So zeigen z.B. sehr ähnliche Enzyme (SULT1A2*1 und *2) deutliche Unterschiede im Expressionsniveau bei exakt gleichen äußeren Bedingungen. Dies erschwert den Vergleich der enzymatischen Aktivitäten dieser Enzyme im in-vitro Testsystem. Andere Enzyme (z.B. SULT2B1b) werden unter Verwendung ihrer Wildtyp-cDNA zum Teil nicht detektierbar exprimiert. Deshalb sollte in dieser Arbeit eine Methode zur Optimierung der heterologen Expression fremdstoffmetabolisierender Enzyme für Genotoxizitätsuntersuchungen etabliert werden. Es wurde bereits gezeigt dass synonyme Codonaustausche am 5’-Ende der humanen SULT1A2-cDNA zu einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Enzyms in S. typhimurium führten. Dementsprechend wurden in dieser Arbeit Codonaustausche am 5’-Ende der cDNA verschiedener SULT (1A1*1, 1A2*1, 2B1b) sowie der Ratten Glutathion-S-Transferase Theta 2 (rGSTT2) und dem Reportergen Luciferase durchgeführt. Die Expression der so generierten Konstrukte wurde in verschiedenen S. typhimurium und E. coli Stämmen quantifiziert und die Aktivität der überexprimierten Enzyme im Ames-Test bzw. im Enzym-Aktivitätsassay überprüft. Durch das Einführen seltener Codons in die cDNA konnte die Proteinexpression von SULT1A1*1, SULT1A2*1 und SULT2B1b maximal 7-fach, 18-fach und 100-fach im Vergleich zur Wildtyp-cDNA gesteigert werden. Die Expression der rGSTT2 wurde ebenfalls durch das Einführen seltener Codons erhöht (maximal 5-fach). Bei dem Reportergen Luciferase jedoch führte das Austauschen häufiger Codons gegen seltene Codons zu einer Reduktion der Proteinexpression um 80 %. Die Expression von Fusionsproteinen aus 2B1b (5’-Ende) und Luciferase (3’-Ende) wurde durch das Einführen seltener Codons ebenfalls um 50 % reduziert. Die S. typhimurium Stämme mit optimierter SULT 1A1*1- bzw. 1A2*1-Expression wurden im Ames-Test eingesetzt und zeigten im Vergleich zu den geringer exprimierenden Stämmen eine höhere Sensitivität. Für SULT2B1b konnte keine Mutagenaktivierung im Ames-Test nachgewiesen werden. Allerdings zeigte ein Enzym-Aktivitätsassay mit Dehydroepiandosteron, dass das bakteriell exprimierte Enzym funktionell war. Da in der Literatur der Effekt seltener Codons auf die Expression in Bakterien bisher fast ausschließlich als inhibitorisch beschrieben wurde, sollte die Wirkungsweise der hier beobachteten Expressionserhöhung durch seltene Codons genauer untersucht werden. Dazu wurden verschiedene Konstrukte der SULT1A2*1 und der SULT2B1b, die unterschiedlich viele seltene Codons in verschiedenen Kombinationen besaßen, hergestellt. Es konnten jedoch keine einzelnen Codons, die für die Expressionssteigerung allein verantwortlich waren, identifiziert werden. Die Plasmidkopienzahl in den verschiedenen SULT2B1b-Klonen war konstant und die SULT2B1b-mRNA-Konzentration zeigte nur moderate Schwankungen, die nicht als Ursache für die dramatische Erhöhung der SULT2B1b-Expression in Frage kommen. Die berechnete Stabilität der potentiellen mRNA-Sekundärstrukturen wurde durch die seltenen Codons häufig stark gesenkt und ist als eine mögliche Ursache für die Expressionssteigerung anzusehen. Zusätzlich erhöhten die seltenen Codons den Consensus der Downstream Box zur 16S rRNA, was ebenfalls eine Ursache für die Expressionssteigerung sein kann. In dieser Arbeit konnte somit die Expression der humanen SULT1A1*1, 1A2*1 und der 2B1b sowie der rGSTT2 erfolgreich mittels synonymer Codonaustausche erhöht werden. Die so optimierten S. typhimurium Stämme zeigten im Ames-Test eine erhöhte Sensitivität gegenüber SULT aktivierten Promutagenen bzw. erhöhte Aktivität in spezifischen Enymaktivitätsassays.
Es ist bekannt, dass Änderungen im Kohlenstoff- bzw. Stickstoffstaus der Pflanzen zu einer parallelen statt reziproken Änderung der kohlenstoff- und stickstoffhaltigen Primärmetabolite führen. Unter diesem Gesichtspunkt wurden in der vorliegenden Arbeit der Aminosäurestoffwechsel und der Sekundärstoffwechsel unter reduzierten Stickstoffbedingungen untersucht. Zur Beeinflussung des Stickstoffstoffwechsels wurden nitratmangelernährte Tabakwildtyppflanzen und Genotypen mit unterschiedlich stark reduzierter Nitratreduktase-Aktivität verwendet. Dieses experimentelle System erlaubt zusätzlich durch den Vergleich Nitrat defizienter Wildtyppflanzen mit Nitrat akkumulierenden NIA-Transformanten Prozesse zu identifizieren, die durch Nitrat gesteuert werden. Die Analysen der Primär- und Sekundärmetabolite wurde in allen Genotypen diurnal durchgeführt, um auch tageszeitlich abhängige Prozesse zu identifizieren. Die Analyse der absoluten Gehalte aller individuellen Aminosäuren enthüllte bei den meisten erstaunlich stabile diurnale Muster mit einem Anstieg während des Tages und einem Abfall in der Nacht in Wildtyppflanzen gewachsen mit ausreichend Nitrat. Dieses Ergebnis legt die Schlussfolgerung nahe, dass die Biosynthese der Aminosäuren koordiniert abläuft. In Pflanzen mit reduziertem Stickstoffstatus haben diese diurnalen Muster jedoch keinen Bestand. Die Kombination des erzeugten stickstoffbasierten Aminosäuredatensatz in Kombination mit einem bereits erzeugten Aminosäuredatensatz unter kohlenstofflimitierten Bedingungen von Matt et al. (2002) führte durch Hauptkomponentenanalyse (PCA) und Korrelationsanalyse zu dem Ergebnis, dass die Hypothese nach einer koordinierten Aminosäurebiosynthese nicht allgemeine Gültigkeit hat. Die PCA identifizierte Glutamin, Glutamat, Aspartat, Glycin, Pheny-lalanin und Threonin als Faktoren, die den Datensätzen ihre charakteristische Eigenschaft und deren Varianz verleihen. Die Korrelationsanalyse zeigte, dass die sehr guten Korrelationen der individuellen Aminosäuren untereinander in reduzierten Stickstoff- und Kohlenstoffbedingungen sich verschlechtern. Das Verhältnis einer einzelnen Aminosäure relativ zu den anderen führte zur Identifizierung einiger Aminosäuren, die individuelle Antworten auf Stickstoff- und/oder Kohlenstoffstatus zeigen, und/oder speziell auf Nitrat, Licht und/oder den E-nergiestatus der Thylakoidmembran. Glutamat beispielsweise verhält sich in den meisten Situationen stabil, Phenylalanin dagegen zeigt in jeder physiologischen Situation eine individuelle Antwort. Die Ergebnisse dieser Arbeit führen zu einer Erweiterung der Hypothese einer koordinierten Synthese der Aminosäuren dahingehend, dass diese nicht generell für alle Aminosäuren angenommen werden kann. Es gibt einige Aminosäuren deren, Anteile sich situationsbedingt anpassen. Die Reduktion des Stickstoffstatus in nitratmangelernährten Tabakwildtyppflanzen führte zu der, nach der „Carbon-Nutrient-Balance“ Hypothese erwarteten Verlagerung der kohlenstoffreichen Phenylpropanoide und des stickstoffreichen Nikotins. Die Erhöhung der Phenylpropanoidgehalte war nicht in der Nitrat akkumulierenden NIA-Transformante zu beobachten und somit konnte Nitrat als regulatorisches Element identifiziert werden. Ein Einfluss der Vorläufermetabolite konnte ausgeschlossen werden, da sowohl nitratmangelernährter Wildtyp als auch die Nitrat akkumulierende NIA-Transformante ähnliche Gehalte dieser aufwiesen. Genexpressionsanalysen über Mikroarray-Hybridisierung und quantitative RT-PCR zeigten, dass Nitrat durch noch nicht geklärte Mechanismen Einfluss auf die Expression einiger Gene nimmt, die dem Phenylpropanoidstoffwechsels zugeordnet sind. Aus der Arbeit hervorgegangene Veröffentlichungen: Christina Fritz, Natalia Palacios-Rojas, Regina Feil und Mark Stitt (2006) Regulation of Secondary Metabolism by the Carbon-Nitrogen Status in Tobacco: Nitrate Inhibits Large Sectors of Phenylpropanoid Metabolism. Plant Journal 46, 533 - 548 Christina Fritz, Petra Matt, Cathrin Müller, Regina Feil und Mark Stitt (2006) Impact of the Carbon-Nitrogen Status on the Amino Acid Profile in Tobacco Source Leaves. Plant, Cell and Environment 29 (11), 2009 - 2111
Das Verbundprojekt "Bewirtschaftungsmöglichkeiten im Einzugsgebiet der Havel" hat Methoden und Werkzeuge entwickelt, welche zur Bewertung alternativer Bewirtschaftungsmöglichkeiten im Einzugsgebiet der Havel mit dem Ziel der Verbesserung der Gewässergüte dienen. Neben den naturräumlichen Gegebenheiten dieses typischen, langsam fließenden Tieflandflusses mit eingelagerten Flachseen, weit gespannten Auen und der direkten Kopplung von Grund- und Oberflächenwasser galt das Interesse einer Reihe von Nutzungsansprüchen mit ihren Auswirkungen auf den Wasser- und Stoffhaushalt. Im Mittelpunkt stehen hierbei die Stoffeinträge aus Landwirtschafts- und Siedlungsflächen sowie Aspekte der wasserwirtschaftlichen Steuerung. Es werden die Auswirkungen verschiedener Bewirtschaftungsoptionen der Gewässer und ihrer Einzugsgebiete auf die Wassermenge und -qualität untersucht. Damit werden die wissenschaftlichen Grundlagen für die Bewertung des Zustandes der Gewässer sowie künftiger Handlungsoptionen und Entwicklungsszenarios nach der EG-Wasserrahmenrichtlinie (EG-WRRL) geschaffen. Neben den methodischen Aufgaben zur Erstellung, Anpassung und Kopplung von Modellwerkzeugen (Systemmodelle, Szenarientechniken) werden naturraumspezifische und sozioökonomische Bewertungsmaßstäbe, umsetzungsorientierte Handlungsoptionen sowie Werkzeuge für die Verwertung der Ergebnisse durch die Fachverwaltung erarbeitet.
Das Borna Disease Virus (BDV, Bornavirus) besitzt ein einzelsträngiges RNA-Genom negativer Polarität und ist innerhalb der Ordnung Mononegavirales der Prototyp einer eigenen Virusfamilie, die der Bornaviridae. Eine außergewöhnliche Eigenschaft des Virus ist seine nukleäre Transkription und Replikation, eine weitere besteht in seiner Fähigkeit, als neurotropes Virus sowohl in vivo als auch in vitro persistente Infektionen zu etablieren. Die zugrunde liegenden Mechanismen sowohl der Replikation als auch der Persistenz sind derzeit noch unzureichend verstanden, auch deshalb, weil das Virus noch relativ „jung“ ist: Erste komplette Sequenzen des RNA-Genoms wurden 1994 publiziert und erst vor einigen Monaten gelang die Generierung rekombinanter Viren auf der Basis klonierter cDNA. Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen das p10 Protein und das Phosphoprotein (P), die von der gemeinsamen Transkriptionseinheit II in überlappenden Leserahmen kodiert werden. Als im Kern der Wirtszelle replizierendes Virus ist das Bornavirus auf zelluläre Importmechanismen angewiesen, um den Kernimport aller an der Replikation beteiligten viralen Proteine zu gewährleisten. Das p10 Protein ist ein negativer Regulator der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (L). In vitro Importexperimente zeigten, dass p10 über den klassischen Importin alpha/beta abhängigen Kernimportweg in den Nukleus transportiert wird. Dies war unerwartet, da p10 kein vorhersagbares klassisches Kernlokalisierungssignal (NLS) besitzt und weist darauf hin, dass der zelluläre Importapparat offensichtlich flexibler ist als allgemein angenommen. Die ersten 20 N-terminalen AS vermitteln sowohl Kernimport als auch die Bindung an den Importrezeptor Importin alpha. Durch Di-Alanin-Austauschmutagenese wurden die für diesen Transportprozess essentiellen AS identifiziert und die Bedeutung hydrophober und polarer AS-Reste demonstriert. Die Fähigkeit des Bornavirus, persistente Infektionen zu etablieren, wirft die Frage auf, wie das Virus die zellulären antiviralen Abwehrmechanismen, insbesondere das Typ I Interferon (IFN)-System, unterwandert. Das virale P Protein wurde in dieser Arbeit als potenter Antagonist der IFN-Induktion charakterisiert. Es verhindert die Phosphorylierung des zentralen Transkriptionsfaktors IRF3 durch die zelluläre Kinase TBK1 und somit dessen Aktivierung. Der Befund, dass P mit TBK1 Komplexe bildet und zudem auch als Substrat für die zelluläre Kinase fungiert, erlaubt es, erstmalig einen Mechanismus zu postulieren, in dem ein virales Protein (BDV-P) als putatives TBK1-Pseudosubstrat die IRF3-Aktivierung kompetitiv hemmt.
Die Honigbiene Apis mellifera gilt seit langem als Modell-Organismus zur Untersuchung von Lern- und Gedächtnisvorgängen sowie zum Studium des Sozialverhaltens und der Arbeitsteilung. Bei der Steuerung und Regulation dieser Verhaltensweisen spielt das Indolalkylamin Serotonin eine wesentliche Rolle. Serotonin entfaltet seine Wirkung durch die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). In der vorliegenden Arbeit wird der erste Serotonin-Rezeptor aus der Honigbiene molekular charakterisiert. Durch die Anwendung zwei verschiedener Klonierungsstrategien konnten drei cDNA-Sequenzen isoliert werden, die für potentielle Serotonin-Rezeptoren kodieren. Die Sequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu dem 5-HT7- und 5-HT2-Rezeptor von Drosophila melanogaster bzw. dem 5-HT1-Rezeptor von Panulirus interruptus auf. Die isolierten Serotonin-Rezeptoren der Honigbiene wurden dementsprechend Am(Apis mellifera)5-HT1, Am5-HT2 und Am5-HT7 benannt. Das Hydropathieprofil des Am5-HT1-, Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptors deutet auf das Vorhandensein des charakteristischen heptahelikalen Aufbaus G-Protein-gekoppelter Rezeptoren hin. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen typische Merkmale biogener Amin-Rezeptoren. Aminosäuren, die eine Bedeutung bei der Bildung der Liganden-Bindungstasche, der Rezeptor-Aktivierung und der Kopplung eines G-Proteins an den Rezeptor haben, sind in allen drei Rezeptoren konserviert. Interessanterweise ist jedoch das in den meisten biogenen Amin-Rezeptoren vorhandene DRY-Motiv in dem Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptor nicht konserviert. Das Vorhandensein einer PDZ-Domäne in dem Am5-HT1- und Am5-HT7-Rezeptor lässt vermuten, dass diese Rezeptoren als Adapterproteine fungieren, die Signalmoleküle zu einem Signaltransduktionskomplex vereinigen. RT-PCR-Experimente zeigen die Expression der Rezeptoren in verschiedenen Geweben der Honigbiene. Auffallend ist die hohe Expression im Zentralgehirn. Des Weiteren konnte die Expression der Serotonin-Rezeptoren in den optischen Loben, Antennalloben sowie in der Peripherie, d.h. in der Flugmuskulatur und den Malpighischen Gefäßen nachgewiesen werden. Durch in situ Hybridisierungen wurde die Expression in Gefrierschnitten von Gehirnen adulter Sammlerinnen im Detail untersucht. Transkripte der Rezeptoren sind in den Somata von intrinsischen Pilzkörperzellen, Neuronen der optischen Loben und Neuronen der Antennalloben vorhanden. In einem heterologen Expressionssystem wurde der intrazelluläre Signalweg des Am5-HT7-Rezeptors untersucht. Die Aktivierung des stabil exprimierten Rezeptors durch Serotonin führt zur Bildung von cAMP. Der 5-HT7-Rezeptor spezifische Agonist 5-CT zeigt eine mit Serotonin vergleichbare Fähigkeit, die intrazelluläre cAMP-Konzentration zu erhöhen. Am5-HT7 gehört daher funktionell zu der Gruppe der 5-HT7-Rezeptoren. Der EC50-Wert von 1,06~nM (5-HT), ist im Vergleich zu anderen 5-HT7-Rezeptoren äußert niedrig. Des Weiteren wurde gezeigt, dass das basale cAMP-Niveau in den transfizierten Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen deutlich erhöht ist. Das heißt, dass der Rezeptor auch in der Abwesenheit eines Liganden aktiv ist. Diese konstitutive Aktivität ist auch von anderen biogenen Amin-Rezeptoren bekannt. Methiothepin wurde als wirksamer inverser Agonist des Am5-HT7-Rezeptors identifiziert, da es in der Lage ist, der konstitutiven Aktivität entgegenzuwirken. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass die Serotonin-Rezeptoren in verschiedenen Regionen des ZNS der Honigbiene an der Informationsverarbeitung beteiligt sind. Es kann eine Beeinflussung von Lern- und Gedächtnisprozessen sowie des olfaktorischen und visuellen Systems durch diese Rezeptoren vermutet werden. Mit der Klonierung und funktionellen Charakterisierung des ersten Serotonin-Rezeptors der Honigbiene ist eine Grundlage für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der serotonergen Signaltransduktion geschaffen worden.
Die Entwicklung von Dickdarmkrebs wird durch eine Reihe von Lebens- und Essgewohnheiten sowie Umweltfaktoren begünstigt. Den letzteren beiden sind Substanzen zuzurechnen, die bei der Zubereitung der Nahrung entstehen und mit ihr aufgenommen werden. Zu diesen Verbindungen gehört das 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin (PhIP) aus der Substanzklasse der heterozyklischen aromatischen Amine. Es entsteht bei der Erhitzung zahlreicher proteinhaltiger Nahrungsmittel und die Zielorgane in Nagerstudien stimmen mit der Häufung von Krebsinzidenzen in westlichen Industrienationen überein. Dieser Zusammenhang konnte jedoch bis heute nicht endgültig bewiesen werden. Fütterungsversuche mit Ratten wurden mit Konzentrationen der Substanz durchgeführt, die weit über der menschlichen Exposition liegen. Durch das Verfüttern einer humanrelevanten Dosis PhIP sollte geklärt werden, ob auch geringe Konzentrationen dickdarmkrebstypische Mutationen, präneoplastische Läsionen oder Tumore induzierten. Die mit humanrelevanten Dosen gefütterten Tiere wiesen weniger Läsionen als die Hoch-Dosis-PhIP-Gruppe auf, in der allerdings keinerlei maligne Tumoren des Dickdarms auftraten. Hinweise auf dickdarmkrebstypische Mutationen fanden sich ebenfalls in beiden Gruppen, wobei hier keine Dosisabhängigkeit beobachtet werden konnte. Die Sequenzierung ergab ein deutlich von Literaturdaten abweichendes Spektrum. In Bezug auf das verwendete Tiermodell wurden erhebliche Abweichungen in der Empfindlichkeit der Tiere gegenüber der Substanz im Vergleich zu ähnlichen Studien festgestellt. Beide Fütterungsgruppen zeigten deutlich weniger Läsionen; als mögliche Gründe wurden Unterschiede in der Futterzusammensetzung und –zubereitung sowie in der Tierhaltung und –herkunft ausgemacht. Es konnte erstmalig ein Zusammenhang zwischen PhIP in niedrigen Dosen in der Nahrung und der Induktion von Entzündungen gezeigt werden. Diese waren sowohl makroskopisch als auch histologisch sichtbar, der genaue Mechanismus ihrer Entstehung ist jedoch unbekannt. Die zusammenfassende Betrachtung aller Ergebnisse lässt vermuten, dass PhIP allein über lange Zeiträume aber in geringen Dosen verabreicht nicht für die hohe Zahl an Krebserkrankungen in westlichen Industrienationen ursächlich ist.
Im Norddeutschen Tiefland wurde die Ausbreitung von Gefäßpflanzen durch Rehe, Dam- und Rothirsche sowie Wildschweine untersucht. Diese Tiere transportieren zahlreiche Pflanzenarten in teilweise erheblichen Mengen über größere Distanzen, sowohl durch den Kot nach Darmpassage (Endozoochorie) als auch durch Anheftung an Fell und Schalen (Epizoochorie). Besondere Bedeutung kommt dabei Wildschweinen zu, die potenziell fast alle Pflanzenarten ausbreiten können. Bevorzugt werden im Wald wie im Offenland vorkommende Pflanzen und Arten des Offenlands ausgebreitet, während Arten mit enger Waldbindung nur in geringem Maße transportiert werden. Zoochorie durch Schalenwild bietet Erklärungsansätze sowohl für Ausbreitungsphänomene wie auch für das weitgehend fehlende Ausbreitungspotenzial vieler Pflanzenarten. Der Einfluss des Schalenwilds auf die Artenzusammensetzung und Gefäßpflanzen-Diversität in der mitteleuropäischen Kulturlandschaft sollte in seine naturschutzfachliche Neubewertung miteinbezogen werden. Die Einschränkung von Aktionsradien der Tiere durch die Zerschneidung von Lebensräumen sowie die Wildfütterung können für Ausbreitungsprozesse bisher kaum beachtete Konsequenzen haben.
Das 1817 erstmals schriftlich erwähnte Selen galt lange Zeit nur als toxisch und sogar als procancerogen, bis es 1957 von Schwarz und Foltz als essentielles Spurenelement erkannt wurde, dessen biologische Funktionen in Säugern durch Selenoproteine vermittelt werden. Die Familie der Glutathionperoxidasen nimmt hierbei eine wichtige Stellung ein. Für diese sind konkrete Funktionen und die dazugehörigen molekularen Mechanismen, welche über die von ihnen katalysierte Hydroperoxidreduktion und damit verbundene antioxidative Kapazität hinausgehen, bislang nur unzureichend beschrieben worden. Die Funktion der gastrointestinalen Glutathionperoxidase (GI-GPx) wird als Barriere gegen eine Hydroperoxidabsorption im Gastrointestinaltrakt definiert. Neuen Erkenntnissen zufolge wird die GI-GPx aber auch in verschiedenen Tumoren verstärkt exprimiert, was weitere, bis dato unbekannte, Funktionen dieses Enzymes wahrscheinlich macht. Um mögliche neue Funktionen der GI-GPx, vor allem während der Cancerogenese, abzuleiten, wurde hier die transkriptionale Regulation der GI-GPx detaillierter untersucht. Die Sequenzanalyse des humanen GI-GPx-Promotors ergab das Vorhandensein von zwei möglichen "antioxidant response elements" (ARE), bei welchen es sich um Erkennungssequenzen des Transkriptionsfaktors Nrf2 handelt. Die meisten der bekannten Nrf2-Zielgene gehören in die Gruppe der Phase-II-Enzyme und verfügen über antioxidative und/oder detoxifizierende Eigenschaften. Sowohl auf Promotorebene als auch auf mRNA- und Proteinebene konnte die Expression der GI-GPx durch typische, in der Nahrung enthaltene, Nrf2-Aktivatoren wie z.B. Sulforaphan oder Curcumin induziert werden. Eine direkte Beteiligung von Nrf2 wurde durch Cotransfektion von Nrf2 selbst bzw. von Keap1, das Nrf2 im Cytoplasma festhält, demonstriert. Somit konnte die GI-GPx eindeutig als Nrf2-Zielgen identifiziert werden. Ob sich die GI-GPx in die Gruppe der antiinflammatorischen und anticancerogenen Phase-II-Enzyme einordnen lässt, bleibt noch zu untersuchen. Die Phospholipidhydroperoxid Glutathionperoxidase (PHGPx) nimmt aufgrund ihres breiten Substratspektrums, ihrer hohen Lipophilie und ihrer Fähigkeit, Thiole zu modifizieren, eine Sonderstellung innerhalb der Familie der Glutathionperoxidasen ein. Mit Hilfe eines PHGPx-überexprimierenden Zellmodells wurden deshalb Beeinflussungen des zellulären Redoxstatus und daraus resultierende Veränderungen in der Aktivität redoxsensitiver Transkriptionsfaktorsysteme und in der Expression atheroskleroserelevanter Adhäsionsmoleküle untersucht. Als Transkriptionsfaktoren wurden NF-kB und Nrf2 ausgewählt. Die Bindung von NF-kB an sein entsprechendes responsives Element in der DNA erfordert das Vorhandensein freier Thiole, wohingegen Nrf2 durch Thiolmodifikation von Keap1 freigesetzt wird und in den Kern transloziert. Eine erhöhte Aktivität der PHGPx resultierte in einer Erhöhung des Verhältnisses von GSH zu GSSG, andererseits aber in einer verminderten Markierbarkeit freier Proteinthiole. PHGPx-Überexpression reduzierte die IL-1-induzierte NF-kB-Aktivität, die sich in einer verminderten NF-kB-DNA-Bindefähigkeit und Transaktivierungsaktivität ausdrückte. Auch war die Proliferationsrate der Zellen vermindert. Die Expression des NF-kB-regulierten vaskulären Zelladhäsionsmoleküls, VCAM-1, war ebenfalls deutlich verringert. Umgekehrt war in PHGPx-überexprimierenden Zellen eine erhöhte Nrf2-Aktivität und Expression der Nrf2-abhängigen Hämoxygenase-1 zu verzeichnen. Letzte kann für die meisten der beobachteten Effekte verantwortlich gemacht werden. Die hier dargestellten Ergebnisse verdeutlichen, dass eine Modifizierung von Proteinthiolen als wichtige Determinante für die Regulation der Expression und Funktion von Glutathionperoxidasen angesehen werden kann. Entgegen früheren Vermutungen, welche oxidative Vorgänge generell mit pathologischen Veränderungen assoziierten, scheint ein moderater oxidativer Stress, bedingt durch eine transiente Thiolmodifikation, durchaus günstige Auswirkungen zu haben, da, wie hier dargelegt, verschiedene, miteinander interagierende, cytoprotektive Mechanismen ausgelöst werden. Hieran wird deutlich, dass sich "antioxidative Wirkung" oder "oxidativer Stress" keineswegs nur auf "gute" oder "schlechte" Vorgänge beschränken lassen, sondern im Zusammenhang mit den beeinflussten (patho)physiologischen Prozessen und dem Ausmaß der "Störung" des physiologischen Redoxgleichgewichtes betrachtet werden müssen.
In einer Zeit, in der eine Zunahme von ernährungsbedingten Erkrankungen in steigendem Maße zu beobachten ist, wird dem Getreide als Grundlage der menschlichen Ernährung erhöhte Aufmerksamkeit gewidmet. Ein hoher Verzehr von Ballaststoffen ist ein wesentlicher Aspekt in der präventiv-medizinischen Ernährung. Die von der Deutschen Gesellschaft für Ernährung vorgeschlagene tägliche Ballaststoffzufuhr liegt bei 30 g. Die Aufnahme von Ballaststoffen ist jedoch in Deutschland deutlich unterhalb dieser empfohlenen Menge. Getreideprodukte, besonders vom Vollkorntyp, sind die wichtigste Quelle für Ballaststoffe. Deshalb sollten im Rahmen dieser Arbeit direkt verzehrsfähige, Ballaststoff-angereicherte Haferprodukte (vorwiegend Extrudate) mit hohen Gehalten an b-Glucanen und resistenter Stärke hergestellt, analysiert und nachfolgend auf relevante ernährungsphysiologische Wirkungen geprüft werden. Als Basis für die Produkte wurden Hafermehl und Haferkleie eingesetzt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Analyse der Haferprodukte. Diese wiesen eine hohe Wasserbindungskapazität auf. Bei den Untersuchungen am Tiermodell wurde gezeigt, dass im Dünndarm eine größere Menge an Wasser durch die Haferprodukte gebunden wurde, was zu einem höheren Feuchtigkeitsanteil der gastrointestinalen Inhalte der Tiere führte, die ballaststoffreiches Futter erhielten. Trotz der hydrothermischen Behandlung während der Extrusion wurden Produkte gewonnen, deren β-Glucane im hochmolekularen Zustand erhalten blieben und somit eine hohe Viskosität in wässrigen Lösungen beibehielten. In rheologischen Untersuchungen wurde bestätigt, dass die aus Haferprodukten isolierten β-Glucane ein pseudoplastisches Fließverhalten besitzen. Demgegenüber führte ein Autoklavieren der Produkte zu einer starken Depolymerisation der b-Glucane, was sich in einer Änderung der funktionellen Eigenschaften der b-Glucane widerspiegelte. Im Mittelpunkt der Untersuchungen standen ernährungsphysiologische In-vitro- und In-vivo-Experimente mit Extrudaten und Proben auf der Basis von Hafer, die einen erhöhten Anteil an Ballaststoffen, speziell an b-Glucan und an resistenter Stärke, besaßen und die direkt verzehrbar sind. Diese Haferprodukte zeigten eine Reihe von ernährungsphysiologisch vorteilhaften und protektiven Wirkungen in In-vitro-Experimenten. So traten sie mit Gallensäuren unter den Bedingungen des Dünndarms in Wechselwirkung und waren gut mit Faecesflora vom Menschen fermentierbar. Die In-vitro-Verdauung von Maisstärke durch Pankreatin, wurde durch die ballaststoffreichen Haferprodukte partiell gehemmt. Dieser Befund lässt eine Abschwächung des postprandialen Glukoseanstieges erwarten. In einem sechswöchigen Fütterungsversuch erhielten Ratten Diäten, die zu 50 % aus ballaststoffreichen Haferprodukten bestanden. Diese Haferprodukte bewirkten einen erhöhten Transport von Gallensäuren und neutralen Sterolen in den unteren Intestinaltrakt sowie deren verstärkte Ausscheidung. Durch den Verzehr der ballaststoffreichen Haferprodukte kam es zu Veränderungen in der Mikroflora, wobei sich besonders die coliformen Keime verminderten und die Keimzahlen der Lactobacillen sowie die Bifidobakterien erhöhten. Die Fermentation der Ballaststoffe führte zur erhöhten Bildung von kurzkettigen Fettsäuren einschließlich von Butyrat. Die Bildung der kurzkettigen Fettsäuren geht mit einer pH-Wert-Absenkung im Caecum und Colon einher, die wiederum für eine geringere Bildung von sekundären Gallensäuren verantwortlich ist. Die Ergebnisse des Fütterungsversuchs an Ratten wurden prinzipiell durch eine vierwöchige Pilotstudie am Menschen, in der Probanden täglich 100 g Haferextrudat erhielten, bestätigt. Das Extrudat wurde von den Probanden gut akzeptiert. In der 4. Woche wurden eine geringe Abnahme der Cholesterolfraktionen im Serum, höhere Keimzahlen für Lactobacillen, Bifidobacterien und Bacteroides, geringere pH-Werte und Trockenmassegehalte in den Faeces, eine Zunahme der individuellen und Gesamt-SCFA sowie des Butyratanteils in den Faeces, eine erhöhte Ausscheidung an Steroiden, eine Zunahme der primären Gallensäuren und eine Abnahme des prozentualen Anteils an sekundären Gallensäuren sowie der Cholesterol-Metaboliten gefunden. Diese Parameter gingen 2 Wochen nach Beendigung der Intervention mit dem Haferextrudat wieder in Richtung der Ausgangswerte (0. Woche) zurück. Die untersuchten Haferprodukte erwiesen sich als gut fermentierbare Substrate für die intestinale Mikroflora und können deshalb als ein Präbiotikum mit Ballaststoffcharakter eingeschätzt werden. Diese Produkte, die mit einem erhöhten Anteil an resistenter Stärke und wertvollen Haferballaststoffen hergestellt wurden, können dazu beitragen, die Ballaststofflücke in unserer Ernährung zu schließen und positive ernährungsphysiologische Effekte zu bewirken.
Als Resultat überhöhter Energieaufnahme und zu geringen Energieverbrauchs beobachten wir eine über das normale Maß hinausgehende Akkumulation von Fettgewebe, die sich als Adipositas manifestiert. Sie gilt als einer der Hauptrisikofaktoren für Krankheiten des metabolischen Syndroms. Im Rahmen von Prävention, Diagnose und Therapie der Adipositas, muss ihr wesentliches Charakteristikum; der individuelle Körperfettanteil; einer Messung zugänglich gemacht werden. Eine direkte Bestimmung der Körperzusammensetzung erlauben die Neutronenaktivierungsanalyse und die chemische Analyse. Beide Verfahren sind sehr genau, aber aufwendig und kostenintensiv und darüber hinaus die chemische Analyse nur am menschlichen Cadaver praktizierbar. Um dennoch die Körperzusammensetzung hinreichend genau bestimmen zu können, wurden zahlreiche indirekte Messverfahren entwickelt. Man kann sie in Labor- und Feldmethoden untergliedern. Die Labormethoden bestechen durch hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, sind aber zumeist aufwendig und teuer. Feldmethoden sind im Gegensatz dazu leicht anwendbar, transportabel und preiswert, weisen aber eine weniger hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit auf. In der vorgestellten Arbeit wird über eine jüngere Entwicklung, die das Prinzip der unterschiedlichen Leitfähigkeit für den elektrischen Strom durch die verschiedenen Gewebe des Körpers nutzt, berichtet. Der Prototyp eines Gerätes wurde innerhalb eines von der EU geförderten multizentrischen Projekts entwickelt und auf seine Einsatzfähigkeit und Qualität hin geprüft. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt auf der Einschätzung der Körperzusammensetzung normal- und übergewichtiger Probanden mit der neu entwickelten Technik. Das vorliegende Studiendesign diente nicht nur der Beurteilung der neuen Technik die Körperzusammensetzung und Veränderungen dieser zu erfassen, sondern darüber hinaus, etablierte Methoden hinsichtlich ihrer Genauigkeit zu bewerten. Bezüglich ihrer Anwendbarkeit und Reproduzierbarkeit hat die neue Methode Hoffnung geweckt, sich als eine Feldmethode zu etablieren. Auf der anderen Seite zeigte sich in Abhängigkeit der Gesamtkörperfettmasse eine Überschätzung der Zielgröße im Vergleich zur Referenzmethode (dual energy x ray absorptiometry (DXA)). Die Abweichungen waren dabei gerade für das einzelne Individuum sehr groß. Technische Verbesserungen und die Entwicklung spezifischer Regressionsgleichungen könnten in Zukunft zu einer wesentlichen Verbesserung der neuen Methode beitragen. Die Labormethode "Air Displacement Plethysmography" konnte durch die guten Übereinstimmungen der Ergebnisse mit denen der Referenzmethode DXA und die einfache Anwendung überzeugen. Sie stellt eine durchaus konkurrenzfähige Alternative zur Hydrodensitometrie dar, die noch heute als "goldener Standard" zur Erfassung der Körperzusammensetzung akzeptiert wird. Im Verlauf der durchgeführten Studie stellte sich heraus, dass die Hydrodensitometrie sehr hohe Anforderungen an den Probanden stellt. Das Untertauchen des gesamten Körpers unter Wasser in Kombination mit einer maximalen Ausatmung erwies sich als sehr problematisch. Die dabei auftretenden Fehler schlugen sich in der Berechnung der Gesamtkörperfettmasse des einzelnen Individuums wieder und führten zu zum Teil erheblichen Abweichungen der Ergebnisse von denen der Referenzmethode. Die Feldmethoden bioelektrische Impedanzanalyse und Hautfaltendickenmessung erwiesen sich als kostengünstige und leicht anwendbare Methoden. Die Ergebnisse beider Methoden stimmten im Mittel gut mit den Ergebnissen der Referenzmethoden überein. Dennoch zeigte die BIA größere Abstriche in der Beurteilung der Gesamtkörperfettmasse des einzelnen Individuums und bei der Dokumentation von Veränderungen der Gesamtkörperfettmasse. Die Hautfaltendickenmessung stellt – wendet man sie korrekt an – eine Methode dar, die sowohl die Gesamtkörperfettmasse als auch Veränderungen dieser gut erfassen kann. In Abhängigkeit der geforderten Genauigkeit kann diese Methode für die Erfassung der Körperzusammensetzung empfohlen werden. Demnach bleibt die Frage unbeantwortet, inwieweit die indirekten Methoden in der Lage sind, die "wahre" Körperzusammensetzung adäquat zu erfassen. Jede neu entwickelte Methode – die möglichst viele Vorteile in sich vereint – wird wieder vor dem Problem stehen: eine geeignete und dabei praktikable Referenzmethode zu finden, die die wahre Körperzusammensetzung zu bestimmen in der Lage ist. Daher sollte neben dem Streben nach der Entwicklung einer Methode, die genau und leicht anwendbar ist, das Hauptaugenmerk auf die Überarbeitung der zugrunde liegenden Modellvorstellungen und die Verbesserung von Regressionsgleichungen gelegt werden.