570 Biowissenschaften; Biologie
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Die Speicheldrüsen der Schmeißfliege Calliphora vicina produzieren bei Stimulierung mit dem Neurohormon Serotonin (5-Hydroxytryptamine, 5-HT) einen KCl-reichen Primärspeichel. Der transepitheliale K+-Transport wird durch eine apikal lokalisierte vakuoläre H+-ATPase (V-ATPase) energetisiert. Stimulierung der Speicheldrüsen mit 5-HT aktiviert die apikale V-ATPase, die Protonen aus der Zelle in das Drüsenlumen transportiert. Trotz des auswärts gerichteten Protonentransportes führt die 5-HT-Stimulierung kurioserweise zu einer intrazellulären Ansäuerung. Die Ursachen dieser 5-HT-induzierten Ansäuerung waren unzureichend untersucht. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit die Identifikation aller Transporter, die an der intrazellulären pH-(pHi)-Regulation in unstimulierten Speicheldrüsen von Calliphora vicina beteiligt sind und an der Entstehung und Regulation der 5-HT-induzierten pHi-Änderungen mitwirken. Von besonderem Interesse war hierbei die funktionelle Mitwirkung der V-ATPase, deren Beteiligung an der pHi-Regulation in tierischen Zellen bisher wenig untersucht war. Wesentliche Ergebnisse dieser Arbeit waren: • Messungen des pHi-Wertes in der unstimulierten Drüse zeigten, dass vor allem die V-ATPase und mindestens ein Na+-abhängiger HCO3--Transporter an der Aufrechterhaltung des Ruhe-pHi beteiligt sind. • Zur Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Ansäuerung (NH4Cl-Vorpuls) tragen ebenfalls im Wesentlichen die V-ATPase und mindestens ein Na+-abhängiger HCO3--Transporter bei. Der Na+/H+-Antiporter hat in der unstimulierten Drüse keinen messbaren Einfluss auf den Ruhe-pHi. • Die Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Alkalisierung (Na-acetat-Vorpuls) ist Cl--abhängig, aber auch unter extremen Bedingungen waren die Zellen noch in der Lage sich vollständig von einer intrazellullären Alkalisierung zu erholen. Einen entscheidenden Anteil daran hat offenbar die hohe intrazelluläre Pufferkapazität. • Ein Na+-abhängiger Glutamat-Transporter ist per se kein pHi-regulierender Transporter, seine Aktivität hat jedoch Einfluss auf den Ruhe-pHi in der unstimulierten Speicheldrüse von Calliphora vicina. • 10 nM 5-HT induzieren in den Calliphora Speicheldrüsen eine intrazelluläre Ansäuerung. An dieser Ansäuerung ist der Na+/H+-Antiporter entscheidend beteiligt. Auch eine klare Cl--Abhängigkeit der 5-HT-induzierten Ansäuerung konnte beobachtet werden. Wahrscheinlich ist eine gekoppelte Aktivität von Na+/H+-Antiporter und Cl-/HCO3--Antiporter. • Messungen mit einem O2-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff zeigten, dass Stimulierung der Speicheldrüsen mit 5-HT die Zellatmung aktivierte. Der cAMP- und der IP3/Ca2+-Weg tragen auf komplexe Weise zu der 5-HT-induzierten Aktivierung der Zellatmung und damit auch zu den 5-HT-induzierten pHi-Änderungen bei. • Mit molekularbiologischen Untersuchungen ist es gelungen den Na+-abhängigen Glutamat-Transporter, den Na+/H+-Antiporter, die Carboanhydrase und die Untereinheit C der V-ATPase in den Calliphora Speicheldrüsen direkt nachzuweisen. Zudem konnte erstmals der direkte Nachweis für die Expression eines nH+/K+-Antiporters in den Speicheldrüsen von Calliphora vicina erbracht werden. Diese Arbeit trug ganz wesentlich zum Verständnis der pHi-Regulation in der unstimulierten und stimulierten Speicheldrüse von Calliphora vicina bei. Mechanismen die zur Aufrechterhaltung und Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Ansäuerung bzw. Alkalisierung beitragen, konnten mit pHi-Messungen und auch molekularbiologisch nachgewiesen werden. Die Mechanismen, welche die 5-HT-induzierte intrazelluläre Ansäuerung verursachen, konnten ebenfalls aufgeklärt werden. Zudem wurde an den Calliphora Speicheldrüsen eine neue optische Methode zur Messung des O2-Verbrauchs in tierischen Geweben etabliert.
Das seit 1957 als essentiell klassifizierte Spurenelement Selen vermittelt seine Funktion hauptsächlich durch seinen Einbau in Selenoproteine in Form der 21. proteinogenen Aminosäure Selenocystein. Insgesamt wurden 25 humane Gene für Selenoproteine identifiziert, deren genaue Funktion häufig noch nicht bekannt ist. Selen ist das einzige Mitglied aus der Gruppe der Mikronährstoffe, für das nach wie vor eine antikanzerogene Funktion vor allem in Bezug auf Darmkrebs postuliert wird. Die Grundlage dafür liefert eine Interventionsstudie, bei der 1.312 Probanden für 4,5 Jahre mit 200 μg Selen/Tag supplementiert wurden. Dies resultierte in einer Senkung der Gesamtkrebsmortalität um 50 %. Die Fragen einer optimalen Selenzufuhr, die nicht nur den Bedarf deckt, sondern auch die Entfaltung der antikanzerogenen Wirkung von Selen gewährleistet und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch ungeklärt. Zudem liegt die Selenzufuhr bei einem Großteil der europäischen Bevölkerung unter den Empfehlungen. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit vier Wochen alte Mäuse für sechs Wochen marginal defizient (0,086 mg/kg Futter) bzw. selenadäquat (0,15 mg/kg Futter) gefüttert. Dieser geringe Unterschied im Selengehalt resultierte in einer Senkung des Plasmaselenspiegels der selenarmen Tiere auf 13 % und der GPx-Aktivität in der Leber auf 35 %. Zunächst wurde der Einfluss von Selen auf die globale Genexpression im murinen Colon mittels Microarray untersucht. Von den im Colon exprimierten Selenoproteinen reagierte die mRNA von SelW, SelH, GPx1 und SelM im Selenmangel besonders deutlich mit Expressionsverlust. Da diese Selenoproteine nicht nur im Colon, sondern auch in Leukozyten reguliert waren, sind sie auch als humane Biomarker für die in dieser Studie gewählte Schwankung des Selengehalts geeignet. Des Weiteren wurde auf Basis der Microarraydaten eine Signalweganalyse durchgeführt, die der Identifizierung krebsrelevanter Signalwege diente, um mögliche molekularbiologische Erklärungsansätze für die Rolle von Selen im Krebsgeschehen zu finden. Es zeigte sich, dass die mRNA von Schlüsselgenen des Wnt-Signalwegs wie β-Catenin, Gsk3β, Dvl2, Tle2, Lef1 und c-Myc auf Schwankungen des Selengehalts reagiert. Vor allem die Induktion von c-Myc, einem Zielgen des Wnt-Signalwegs, deutet darauf hin, dass dieser im Selenmangel tatsächlich aktiver ist als bei selenadäquater Versorgung. Ein weiterer möglicher Erklärungsansatz für die postulierte präventive Funktion von Selen gegenüber Darmkrebs ist die gastrointestinale Glutathionperoxidase (GPx2), die physiologisch in den proliferierenden Zellen des Kryptengrunds exprimiert wird. Die Regulation dieses Enzyms durch den Wnt-Signalweg, der ebenfalls in proliferierenden Zellen aktiv ist, konnte mittels Reportergenanalyse und endogen auf mRNA- und Proteinebene in Zellkultur gezeigt werden. Die Aktivierung verkürzter Promotorkonstrukte und die Mutation eines potentiellen Bindeelements identifizierten den für die Bindung von TCF und β-Catenin verantwortlichen Bereich. Als Zielgen des Wnt-Signalwegs scheint GPx2 zu den an Proliferationsprozessen beteiligten Genen zu gehören, was unter physiologischen Bedingungen die Aufrechterhaltung des intestinalen Epithels gewährleistet. Bei der Entstehung intestinaler Tumore, die in der Initiationsphase zu über 90 % mit einer konstitutiven Aktivierung des Wnt-Signalwegs einhergeht, wirkt GPx2 möglicherweise prokanzerogen. Die genaue Funktion von GPx2 während der Kanzerogenese bleibt weiter zu untersuchen.
Das 1817 erstmals schriftlich erwähnte Selen galt lange Zeit nur als toxisch und sogar als procancerogen, bis es 1957 von Schwarz und Foltz als essentielles Spurenelement erkannt wurde, dessen biologische Funktionen in Säugern durch Selenoproteine vermittelt werden. Die Familie der Glutathionperoxidasen nimmt hierbei eine wichtige Stellung ein. Für diese sind konkrete Funktionen und die dazugehörigen molekularen Mechanismen, welche über die von ihnen katalysierte Hydroperoxidreduktion und damit verbundene antioxidative Kapazität hinausgehen, bislang nur unzureichend beschrieben worden. Die Funktion der gastrointestinalen Glutathionperoxidase (GI-GPx) wird als Barriere gegen eine Hydroperoxidabsorption im Gastrointestinaltrakt definiert. Neuen Erkenntnissen zufolge wird die GI-GPx aber auch in verschiedenen Tumoren verstärkt exprimiert, was weitere, bis dato unbekannte, Funktionen dieses Enzymes wahrscheinlich macht. Um mögliche neue Funktionen der GI-GPx, vor allem während der Cancerogenese, abzuleiten, wurde hier die transkriptionale Regulation der GI-GPx detaillierter untersucht. Die Sequenzanalyse des humanen GI-GPx-Promotors ergab das Vorhandensein von zwei möglichen "antioxidant response elements" (ARE), bei welchen es sich um Erkennungssequenzen des Transkriptionsfaktors Nrf2 handelt. Die meisten der bekannten Nrf2-Zielgene gehören in die Gruppe der Phase-II-Enzyme und verfügen über antioxidative und/oder detoxifizierende Eigenschaften. Sowohl auf Promotorebene als auch auf mRNA- und Proteinebene konnte die Expression der GI-GPx durch typische, in der Nahrung enthaltene, Nrf2-Aktivatoren wie z.B. Sulforaphan oder Curcumin induziert werden. Eine direkte Beteiligung von Nrf2 wurde durch Cotransfektion von Nrf2 selbst bzw. von Keap1, das Nrf2 im Cytoplasma festhält, demonstriert. Somit konnte die GI-GPx eindeutig als Nrf2-Zielgen identifiziert werden. Ob sich die GI-GPx in die Gruppe der antiinflammatorischen und anticancerogenen Phase-II-Enzyme einordnen lässt, bleibt noch zu untersuchen. Die Phospholipidhydroperoxid Glutathionperoxidase (PHGPx) nimmt aufgrund ihres breiten Substratspektrums, ihrer hohen Lipophilie und ihrer Fähigkeit, Thiole zu modifizieren, eine Sonderstellung innerhalb der Familie der Glutathionperoxidasen ein. Mit Hilfe eines PHGPx-überexprimierenden Zellmodells wurden deshalb Beeinflussungen des zellulären Redoxstatus und daraus resultierende Veränderungen in der Aktivität redoxsensitiver Transkriptionsfaktorsysteme und in der Expression atheroskleroserelevanter Adhäsionsmoleküle untersucht. Als Transkriptionsfaktoren wurden NF-kB und Nrf2 ausgewählt. Die Bindung von NF-kB an sein entsprechendes responsives Element in der DNA erfordert das Vorhandensein freier Thiole, wohingegen Nrf2 durch Thiolmodifikation von Keap1 freigesetzt wird und in den Kern transloziert. Eine erhöhte Aktivität der PHGPx resultierte in einer Erhöhung des Verhältnisses von GSH zu GSSG, andererseits aber in einer verminderten Markierbarkeit freier Proteinthiole. PHGPx-Überexpression reduzierte die IL-1-induzierte NF-kB-Aktivität, die sich in einer verminderten NF-kB-DNA-Bindefähigkeit und Transaktivierungsaktivität ausdrückte. Auch war die Proliferationsrate der Zellen vermindert. Die Expression des NF-kB-regulierten vaskulären Zelladhäsionsmoleküls, VCAM-1, war ebenfalls deutlich verringert. Umgekehrt war in PHGPx-überexprimierenden Zellen eine erhöhte Nrf2-Aktivität und Expression der Nrf2-abhängigen Hämoxygenase-1 zu verzeichnen. Letzte kann für die meisten der beobachteten Effekte verantwortlich gemacht werden. Die hier dargestellten Ergebnisse verdeutlichen, dass eine Modifizierung von Proteinthiolen als wichtige Determinante für die Regulation der Expression und Funktion von Glutathionperoxidasen angesehen werden kann. Entgegen früheren Vermutungen, welche oxidative Vorgänge generell mit pathologischen Veränderungen assoziierten, scheint ein moderater oxidativer Stress, bedingt durch eine transiente Thiolmodifikation, durchaus günstige Auswirkungen zu haben, da, wie hier dargelegt, verschiedene, miteinander interagierende, cytoprotektive Mechanismen ausgelöst werden. Hieran wird deutlich, dass sich "antioxidative Wirkung" oder "oxidativer Stress" keineswegs nur auf "gute" oder "schlechte" Vorgänge beschränken lassen, sondern im Zusammenhang mit den beeinflussten (patho)physiologischen Prozessen und dem Ausmaß der "Störung" des physiologischen Redoxgleichgewichtes betrachtet werden müssen.
Flüssigkeitssekretion und Proteinsekretion werden in Speicheldrüsen von Insekten über Hormone und Neurotransmitter gesteuert. Diese entfalten ihre physiologische Wirkung in den sekretorischen Drüsenzellen hauptsächlich über den zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Signalweg und den Inositoltrisphosphat (IP<SUB>3</SUB>) / Ca<sup>2+-Signalweg. Die Mechanismen möglicher Wechselwirkungen zwischen diesen Signalwegen und ihre physiologischen Auswirkungen sind unzureichend bekannt. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Frage, ob und wie sich der Ca<sup>2+-Signalweg und der cAMP-Signalweg in der Speicheldrüse der Diptere Calliphora vicina beeinflussen. Substanzen wie 5-Fluoro-α-Methyltryptamin und Histamin wurden in früheren Arbei-ten als Agonisten genutzt, um in den Speicheldrüsen von C. vicina selektiv den cAMP-Signalweg (getrennt vom IP<SUB>3</SUB>/Ca<sup>2+-Signalweg) zu aktivieren. Es zeigte sich in transepithelialen Potentialmessungen und mikrofluorometrischen Ca<sup>2+-Untersuchungen, dass beide Substanzen sowohl den cAMP-Weg als auch den Ca<sup>2+-Signalweg aktivierten. Die physiologischen Ursachen der Histamin-induzierten Ca<sup>2+-Erhöhung wurden genauer untersucht. Zusammengefasst zeigten diese Untersuchungen, dass Histamin wie 5-HT den cAMP-Weg und die Phosphoinositidkaskade aktivierte. Im Gegensatz zu den 5-HT-induzierten Ca<sup>2+-Oszillationen, welche durch interzelluläre Ca<sup>2+-Wellen synchronisiert werden, verursachte Histamin bei niedrigen Konzentrationen lokale Ca<sup>2+-Oszillationen in einzelnen Zellen (keine Wellen). Bei höheren Histamin-Konzentrationen war eine anhaltende Ca<sup>2+-Erhöhung oder ein synchrones <quote>Ca<sup>2+-beating</quote> in der gesamten Drüse zu beobachten. Des Weiteren wurde die Frage untersucht, ob eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration den IP<SUB>3</SUB> Ca<sup>2+-Signalweg in den Epithelzellen der Speicheldrüse beeinflussen kann. Es zeigte sich, dass cAMP den durch schwellennahe 5-HT-Konzentrationen induzierten Ca<sup>2+-Anstieg verstärkte. Diese Verstärkung wurde durch eine PKA-vermittelte Sensitivierung des IP<SUB>3</SUB>-Rezeptor/Ca<sup>2+-Kanals für IP<SUB>3</SUB> verursacht. Immunzytochemische Untersuchungen deuten dar-auf hin, dass die Proteinkinase A eng mit dem IP<SUB>3</SUB>-Rezeptor/Ca<sup>2+-Kanal assoziiert ist. Diese Messungen zeigen erstmals, dass auch bei Invertebraten der Botenstoff cAMP, PKA-vermittelt, den IP<SUB>3</SUB>-Rezeptor/Ca<sup>2+-Kanal des ER für IP<SUB>3</SUB> sensitiviert.
Aromatische Amine und Amide (aAA) sind aufgrund ihrer starken Verbreitung in der menschlichen Umwelt und ihres kanzerogenen Potenzials von großer toxikologischer Bedeutung. Die Kanzerogenität der aAA wird durch die Mutagenität hochreaktiver Stoffwechselprodukte vermittelt, die in zwei sequenziellen katalytischen Reaktionen entstehen. Die erste ist meistens eine N-Hydroxylierung, die oft durch Cytochrom P450 1A2 (CYP1A2) katalysiert wird. Daran schließt sich eine O-Konjugation durch Sulfotransferasen (SULT) oder N-Acetyltransferasen (NAT) an. Die Bioaktivierung ist ein kritischer Parameter für die Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tiermodellen auf den Menschen. Rekombinante in vitro Systeme, die fremdstoffmetabolisierende Enzyme verschiedener Spezies exprimieren, ermöglichen die vergleichende Untersuchung der Bioaktivierung im Menschen und in Versuchstieren. Ziel des Projektes war die Aufklärung der Bioaktivierung der aAA durch humane Enzyme. Im Vordergrund stand die Untersuchung der Rolle humaner SULT in diesem Prozess. Es wurden rekombinante in vitro Systeme, konstruiert, die CYP1A2 und SULT des Menschen koexprimieren. SULT-cDNAs wurden in den Säugerzell Expressionsvektor pMPSV kloniert und in Standardindikatorzellen für Mutagenitätsuntersuchungen (V79 Zellen aus dem Chinesischen Hamster) transfiziert. Das Expressionsniveau von CYP1A2 und SULT wurde mittels Immunblotanalyse und radiometrischen Aktivitätsmessungen charakterisiert. In den rekombinanten Zellen wurden vier aAA als Modellsubstanzen (2-Acetylaminofluoren, 2-Aminoanthracen, 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol, 2,4-Diaminotoluol) auf ihre Mutagenität am hprt-Locus hin untersucht.Die aAA waren in Zellen, die keine rekombinanten Enzyme oder lediglich CYP1A2 exprimierten, nicht mutagen. In Zellen, die CYP1A2 und SULT der Subfamilie 1A koexprimierten, erzeugten sie bereits in geringen Konzentrationen klare mutagene Effekte (0,3 µM für 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol; 0,1 µM für 2-Aminoanthracen; 10 µM für 2,4-Diaminotoluol). Die stärkste Aktivierung von 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A2 koexprimierte; die stärkste Aktivierung von 2,4-Diaminotoluol und 2-Aminoanthracen erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A1 koexprimierte. Sowohl SULT1A1 als auch SULT1A2 sind im Menschen genetisch polymorph. Ein unterschiedlich starkes Aktivierungspotenzial der Alloenzyme könnte eine individuell unterschiedliche Suszeptibilität für die durch aAA ausgelöste Kanzerogenese bedingen. In HPRT-Mutationsuntersuchungen mit rekombinanten Zellen zeigten die allelischen Varianten der SULT1A2 starke Unterschiede in ihrem Aktivierungpotenzial. Nur in der Zelllinie, die das Alloenzym SULT1A2*1 mit CYP1A2 koexprimierte, wurde 2-Acetylaminofluoren zum Mutagen aktiviert. Zur Aktivierung von 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol waren jedoch sowohl das Alloenzym SULT1A2*1 als auch das Alloenzym SULT1A2*2 in der Lage. Die Alloenzyme der SULT1A1 zeigten ein ähnlich gutes Aktivierungspotenzial für aAA. In früheren Studien wurde gezeigt, dass die SULT1C1 der Ratte eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der aAA in dieser Spezies spielt. Dahingegen war die humane SULT1C1 nicht in der Lage die untersuchten aAA zu aktivieren. Die Kenntnis solcher Spezieunterschiede könnte wichtig sein um unterschiedliche Organotropismen aAA in Menschen und Tiermodellen zu erklären, da SULT mit starker Gewebespezifität exprimiert werden und das Expressionsmuster für die einzelnen SULT-Formen in Menschen und Ratten sich stark unterscheidet.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen Signaltransduktionsprozesse in den Strukturen der Kraftübertragung quergestreifter Muskelzellen, d. h. in den Costameren (Zell-Matrix-Kontakten) und den Glanzstreifen (Zell-Zell-Kontakten der Kardiomyozyten).Es ließ sich zeigen, dass sich die Morphologie der Zell-Matrix-Kontakte während der Differenzierung von Skelettmuskelzellen dramatisch ändert, was mit einer veränderten Proteinzusammensetzung einhergeht. Immunfluoreszenz-Analysen von Skelettmuskelzellen verschiedener Differenzierungsstadien implizieren, dass die Signalwege, welche die Dynamik der Fokalkontakte in Nichtmuskelzellen bestimmen, nur für frühe Stadien der Muskeldifferenzierung Relevanz haben können. Ausgehend von diesem Befund wurde begonnen, noch unbekannte Signalwege zu identifizieren, welche die Ausbildung von Costameren kontrollieren: In den Vorläuferstrukturen der Costamere gelang es, eine transiente Interaktion der Proteine Paxillin und Ponsin zu identifizieren. Biochemische Untersuchungen legen nahe, dass Ponsin über eine Skelettmuskel-spezifische Insertion im Carboxyterminus das Adapterprotein Nck2 in diesen Komplex rekrutiert. Es wird vorgeschlagen, dass die drei Proteine einen ternären Signalkomplex bilden, der die Umbauvorgänge der Zell-Matrix-Kontakte kontrolliert und dessen Aktivität von mitogen activated protein kinases (MAPK) reguliert wird.Die Anpassungsvorgänge der Strukturen der Kraftübertragung an pathologische Situtation (Kardiomyopathien) in der adulten quergestreiften Muskulatur wurden ausgehend von einem zweiten Protein, dem muscle LIM protein (MLP), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein mutiertes MLP-Protein, das im Menschen eine hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) auslöst, strukturelle Defekte aufweist und weniger stabil ist. Weiterhin zeigte dieses mutierte Protein eine verringerte Bindungsfähigkeit an die beiden Liganden N-RAP und alpha-Actinin. Die molekulare Grundlage der HCM-verursachenden Mutationen im MLP-Gen könnte folglich eine Veränderung der Homöostase im ternären Komplex MLP – N-RAP – alpha-Actinin sein. Die Expressionsdaten eines neu generierten monoklonalen MLP-Antikörpers deuten darauf hin, dass die Funktionen des MLP nicht nur für die Integrität des Myokards, sondern auch für die der Skelettmuskulatur notwendig sind.
Das ITC SFN und der Mikronährstoff Se sind bekannt als chemopräventive Inhaltsstoffe von Gemüse der Brassica-Familie, welcher auch Brokkoli angehört. Die Wirkungen von sowohl SFN als auch Se beruhen auf zahlreichen verschiedenen Mechanismen. Es existieren jedoch Schnittstellen, an welchen Interaktionen beider Substanzen möglich sind. Basierend auf diesem Wissen wurden in dieser Arbeit Wechselwirkungen zwischen SFN und Se auf die Aktivität sowie Expression von Phase II Enzymen und Selenoproteinen untersucht. Der Einfluss der Kombination von SFN und Se auf die unter physiologischen Bedingungen stattfindende Proliferation und Apoptose war ebenso Gegenstand der Arbeit wie die Modulation von Entzündungsprozessen sowie der Tumorentstehung während der entzündungsverstärkten Colonkanzerogenese im Mausmodell. Das hinsichtlich seiner Wirksamkeit mit aus GRA hydrolysiertem SFN zunächst als vergleichbar befundene synthetische SFN wurde für die Untersuchung im AOM/DSS-induzierten Colontumormodell gewählt und in Kombination mit 3 verschiedenen Selendiäten verabreicht. Der Einfluss von SFN und Se auf Phase II Enzyme und Selenoproteine entlang des GIT war organabhängig und nach 4 Wochen geringer als nach 7 Tagen. Die schwächere Induktion deutet auf eine Anpassung des Organismus hin. Ein SFN-vermittelter Effekt auf NQO1 war im Selenmangel am deutlichsten. Die Aktivität des Selenoproteins TrxR wurde hingegen erst bei ausreichender Selenversorgung durch SFN beeinflusst. Die als Nrf2-Zielgen bekannte und in der Hierarchie der Selenoproteine einen hohen Rang einnehmende GPx2 konnte in bestimmten Organen bereits unter selenarmen Bedingungen durch SFN induziert werden. Eine Überexpression des Enzyms war jedoch nicht möglich. SFN steigerte, unabhängig vom Selenstatus, im oberen Abschnitt des GIT und im Colon die Aktivität der GST. Eine Induktion des eigenen Metabolismus wäre somit denkbar. Im Falle eines Mangels an GPx2 wurde GPx1 bei hinreichender Selenversorgung stärker exprimiert, allerdings konnte sie die Funktion von GPx2 nicht völlig erset-zen. Im Selenmangel kann die Aktivitätssteigerung der TrxR im Dünndarm, dem Ab-schnitt der Selenabsorption, als ein Versuch der GPx2-Kompensation angesehen werden. SFN war nicht in der Lage, über eine Aktivierung des Nrf2/ARE-Signalweges kompensatorische Effekte zu induzieren. Apoptotische Prozesse wurden unter physiologischen Bedingungen nur marginal durch SFN und Se moduliert. Das elektrophile ITC konnte lediglich im Selenmangel Apoptose im luminalen Bereich der Colonkrypten induzieren. Die durch supranutritive Selenkonzentration induzierte Apoptose im Kryptengrund wurde nicht durch SFN beeinflusst. Einer bei Abwesenheit der GPx2 erhöhten Apoptoserate im Kryptengrund wirkte SFN bei adäquater Selenversorgung entgegen, war indessen proapoptotisch unter selendefizienten Konditionen. Der Einfluss von SFN auf die Entzündung war deutlich abhängig vom Selenstatus. Während SFN im Selenmangel anscheinend prooxidative Prozesse induzierte und die Entzündungssymptome verschlimmerte, wirkte es unter adäquatem Selenstatus an-tiinflammatorisch. Den vergleichsweise milden Grad der Entzündung im selensupplementierten Status konnte SFN nicht zusätzlich beeinflussen. SFN veränderte die Inzi-denz colorektaler Tumore nicht. Ein, die Tumorinitiation blockierender SFN-Effekt durch direkte Hemmung der metabolischen Aktivierung des Prokanzerogens im selenadäquaten Zustand scheint offensichtlich. Eine Überversorgung mit Se kann protektiv im Hinblick auf Entzündung oder Colonkanzerogenese sein, jedoch bewirkt SFN keinen zusätzlichen Schutz. Kombinationseffekte von SFN und Se in Bezug auf Phase II Enzyme, Selenoproteine und Apoptose sowie die entzündungsverstärkte Colonkanzerogenese sind nicht eindeutiger Natur und können, abhängig vom Endpunkt, synergistische oder antagonistische Züge aufweisen. Eine bei Selendefizienz deutlichere Wirkung von SFN kann mit Hilfe der gesteigerten Aktivierung von Nrf2 erklärt werden, dies muss jedoch nicht von Vorteil sein. Bei adäquater Selenversorgung kann SFN kurzfristig antiinflammatorische und antikanzerogene Prozesse induzieren. Von einer längerfristigen ständigen SFN-Aufnahme in Form von GRA-reichen Brassicacea ist jedoch abzuraten, da von einer Adaptation auszugehen ist. Die Wirkung von SFN innerhalb der komplexen Pflanzenmatrix bleibt Gegenstand zukünftiger Untersuchungen.
Alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe werden in vielen Matrizes wie Fahrzeugabgasen und Tabakrauch und auch als Kontaminanten in Nahrungsmitteln neben rein aromatischen Kongeneren gefunden. Alkylierte PAK können über die Alkylseitenkette über benzylische Hydroxylierung und nachfolgende Sulfonierung katalysiert über Sulfotransferasen (SULT) zu reaktiven Schwefelsäureestern umgesetzt werden. Die SULT-vermittelte Bioaktivierung zu einem genotoxischen Schwefelsäureester wurde für den benzylischen Alkohol 1-Hydroxymethylpyren des Hepatokanzerogens 1-Methylpyren in früheren Arbeiten gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob die benzylischen Alkohole weiterer alkylierter PAK über Sulfonierung zu genotoxischen Schwefelsäureestern umgesetzt werden. Hierzu wurde eine Gruppe von 17 Modellsubstanzen ausgewählt, um die Ableitung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen zu ermöglichen. Das genotoxische Potenzial authentischer benzylischer Schwefelsäureester der Modellsubstanzen wurde zunächst in vitro über DNA-Adduktbildung im zellfreien System und Mutagenität im Salmonella-Rückmutationstest untersucht. Die Sulfate zeigten große Reaktivitätsunterschiede in Abhängigkeit von der Struktur des aromatischen Systems und der Position der Alkylseitenkette, wobei die Endpunkte DNA-Adduktbildung und Mutagenität gut korrelierten. Des Weiteren wurde der Salmonella-Mutagenitätstest mit den benzylischen Alkoholen der untersuchten alkylierten PAK und gentechnisch veränderten S. typhimurium-Stämmen, die SULT-Formen des Menschen heterolog exprimieren, durchgeführt. Bis auf die Alkohole 2- und 4-HMP zeigten alle untersuchten benzylischen Alkohole deutliche mutagene Effekte in einem oder mehreren humane SULT exprimierenden Stämmen. Die durchgeführten in vitro-Versuche zeigten das Potenzial der benzylischen Metabolite alkylierter PAK für genotoxische Wirkungen. Nachfolgend musste geklärt werden, welche Relevanz die beobachteten Effekte für die komplexere in vivo-Situation haben. Nach Verabreichung verschiedener benzylischer Schwefelsäureester und Alkohole an männliche Ratten konnten DNA-Addukte in den untersuchten Organen detektiert werden, was im Fall der Schwefelsäureester deren systemische Bioverfügbarkeit und im Fall der benzylischen Alkohole deren Umsatz durch SULT der männlichen Ratte zeigte. Da im Gegensatz zum Menschen die SULT-Expression in der Ratte auf die Leber fokussiert ist, musste ein Großteil des Umsatzes zu genotoxischen Sulfaten in der Leber stattgefunden haben. DNA-Addukte wurden jedoch auch in extrahepatischen Organen gefunden, was über einen hepatischen Export der gebildeten reaktiven Sulfate und deren Transport über den Blutkreislauf zu diesen Geweben erklärt werden kann. Für die weiterführenden in vivo-Studien wurden die benzylischen Alkohole 1-HMP und 1-HM-8-MP ausgewählt, die trotz großer struktureller Ähnlichkeit toxikodynamische Unterschiede zeigten. Zur Untersuchung der Bedeutung des SULT-vermittelten Toxifizierungsweges als auch konkurrierender detoxifizierender oxidativer Stoffwechselprozesse, wurden für 1-HMP und 1-HM-8-MP in vivo-Inhibitionsstudien mit SULT-Inhibitoren und für 1-HM-8-MP auch mit ADH/ALDH-Inhibitoren durchgeführt. Eine Vorbehandlung mit dem SULT-Hemmstoff Pentachlorphenol führte zu einer Reduktion der DNA-Adduktniveaus in Organen 1-HMP- und 1-HM-8-MP-behandelter Tiere. Die Verabreichung von Quercetin hatte keine Auswirkung auf die DNA-Adduktniveaus. Die Hemmung der DNA-Adduktbildung bei Verabreichung von Pentachlorphenol verdeutlichte jedoch, dass benzylische Alkohole alkylierter PAK in vivo über Sulfonierung bioaktiviert werden. Eine Vorbehandlung mit dem ADH-Inhibitor 4-Methylpyrazol und dem ADH-Substrat Ethanol führte zu erhöhten DNA-Adduktniveaus in Organen 1-HM-8-MP-behandelter Tiere. Den gleichen Effekt, jedoch in geringerem Ausmaß, hatte auch die Vorbehandlung mit dem ALDH-Inhibitor Disulfiram. Dies deutet darauf hin, dass oxidative Modifikationen an der Seitenkette des 1-HM-8-MP einen Detoxifizierungsmechanismus darstellen. Nach Verabreichung benzylischer Metabolite alkylierter PAK wurden oftmals hohe Adduktniveaus in der Niere detektiert. Als mögliche Ursache hierfür wurde eine Transporter-vermittelte renale Sekretion reaktiver Sulfate postuliert, die über Vorbehandlung mit Probenecid vor Verabreichung von 1-HMP und 1-HM-8-MP überprüft wurde. Der Haupteffekt der Probenecid-Behandlung wurde jedoch nicht in der Niere, sondern in der Leber beobachtet, die stark erhöhte Adduktniveaus zeigte. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die Hemmung des Exportes in der Leber gebildeter reaktiver Sulfate über Inhibition hepatischer organischer Anionentransporter.
The impact of collagen modifications by methylglyoxal on fibroblast function and the role in aging
(2016)
Hitze ist eine bedeutende klimatische Bedingung, die das Wachstum und das Überleben von Pflanzen bedroht. Extreme Temperaturereignisse in der Natur werden gravierender, häufiger, länger anhaltend, was sich nachteilig auf die landwirtschaftliche Produktion auswirkt. Daher ist es wichtig, mehr über die Mechanismen zu erfahren, die zu einer erhöhten Hitzetoleranz bei Pflanzen führen. Um auszuhalten und zu überleben, haben höhere Pflanzen komplexe Mechanismen entwickelt, um auf verschiedene Intensitäten von Hitzestress zu reagieren. Pflanzen haben eine thermische Toleranz, die es ihnen ermöglicht, schnelle und dramatische Temperaturanstiege für eine begrenzte Zeit zu überleben. Pflanzen können auch darauf vorbereitet werden, Hitzestress (HS) zu widerstehen, der ansonsten tödlich wäre, indem man sie kurzen, moderaten und nicht-tödlichen HS (als Priming-Stimulus bezeichnet) aussetzt, bevor sie hohem HS ausgesetzt werden. Eine erworbene Thermotoleranz kann bei Pflanzen unter optimalen Bedingungen lange aufrechterhalten werden, was bedeutet, dass Pflanzen während dieser Zeit Informationen speichern können. Mehrere Studien haben gezeigt, dass sich erworbene Thermotoleranz (Thermopriming) auf die erhöhte Widerstandsfähigkeit von Zellen, Geweben und Organismen gegenüber erhöhten Temperaturen nach vorheriger Hitzeeinwirkung bezieht. Die Aufrechterhaltung der erworbenen Thermotoleranz (Thermomemory) ist mit der Synthese von speziellen Stressproteinen verbunden, die am Zellschutz und der beschleunigten Gewebereparatur beteiligt sind, wie z. B. Hitzeschockproteine (HSPs). Neuere Studien haben eine Beteiligung von Hitzeschockproteinen, z.B. HSP21, in Chloroplasten an der Regulation des Thermogedächtnisses belegt. Als wichtiges Organell ist die mitochondriale Funktion entscheidend für die Reaktion von Pflanzenzellen auf Hitze. Es ist jedoch noch unbekannt, wie die molekulare und physiologische Beteiligung von HSPs an der mitochondrialen Funktion im Thermogedächtnis erfolgt. In unserer Studie haben wir gezeigt, dass Thermopriming Transkript- und Proteinspiegel von zwei mitochondrialen kleinen Hitzeschockproteinen, HSP23.56 (AT5G51440) und HSP23.6 (AT4G25200), induziert, die während der Thermogedächtnisphase 2-3 Tage andauern. Die morphologische Analyse von HSP23.5/6-transgenen Pflanzen zeigte eine HSP23.5/6-Funktionsredundanz bei Hitzestress. Wir zeigten, dass hsp23.5/6-Doppel-Knockout-Pflanzen Anomalien im Thermogedächtnis im Keimlingsstadium aufwiesen und dass reife hsp23.5/6-Pflanzen sowohl mit basaler Thermotoleranz als auch mit Thermogedächtnis empfindlicher sind. Die Wärmebehandlung beeinflusste die Atmungsrate von hsp23.5/6-Keimlingen im Vergleich zu WT signifikant, was auf eine mitochondriale Dysfunktion in Abhängigkeit von HSP23.5 und HSP23.6 hinweist. Darüber hinaus haben wir die Chaperon-Aktivität von HSP23.6 gegenüber dem Modellsubstratprotein Malatdehydrogenase (MDH) in vitro getestet und bestätigt, was darauf hindeutet, dass HSP23.6 möglicherweise zur Aufrechterhaltung der zellulären Lebensfähigkeit beiträgt. Darüber hinaus entdeckten wir ein neues HSP23.6-Clientprotein, CIB22, ein mitochondriales Komplex-I-Untereinheitsprotein. Nach experimentellen Daten (BiFC und Co-IP) interagieren HSP23.6 und CIB22 in Pflanzenzellen. Wir identifizierten auch einen Hitzereaktionsphänotyp in der cib22-Mutante im Vergleich zu WT sowie einen CIB22-Proteinabbau in der hsp23.5/6-Mutante, wenn sie Hitze ausgesetzt wurde. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die beiden mitochondrial lokalisierten
Hitzeschockproteine eine Rolle bei der Thermotoleranz spielen, vermutlich indem sie die mitochondriale Funktion und Struktur beeinflussen. Um neue genetische Komponenten zu identifizieren, die mit dem Thermogedächtnis in Pflanzen verbunden sind, haben wir weiterhin ein Proteom-Profiling von Arabidopsis WT (Col-0) -Keimlingen während des Thermogedächtnisses durchgeführt. Mehrere Zeitpunkte von Priming und Triggerung mit Kontrollen wurden gesammelt und analysiert, um dynamische Proteomänderungen während der Gedächtnisphase in
Arabidopsis-Zellen aufzudecken. Unter den Top-gedächtnis-assoziierten Proteinen entdeckten wir, dass HSP70-4 nach dem Priming signifikant hochreguliert wurde und für die nächsten vier Tage auf hohem Niveau bleibt (mindestens 2-fach erhöht). Durch Analyse ihres Hitzestressverhaltens konnten wir verifizieren, dass HSP70-4 an der 7 Reaktion von Pflanzen auf Hitzestress beteiligt ist. Interessant ist, dass HSP70-4-GFP nach dem Priming zytosolische Foci erzeugt, die für einige Tage während der Erholungsphase bestehen bleiben. Wir schlagen vor, dass der Fokus mit SGs verbunden ist, da Cycloheximid (CHX) GFP-Foci-Signale unterdrückt, wenn sie der Hitze ausgesetzt werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine HSP70-4-vermittelte Transkriptions- und Translationssteuerungsverbindung (Modul) während der basalen Thermotoleranz und des Thermogedächtnisses sowie auf ihre potenzielle(n) Rolle(n) bei der Reaktion auf Hitzestress hin.
Zusammenfassend bietet unsere Forschung neue Einblicke in die Rolle von Hitzeschockproteinen bei der Kontrolle der Hitzestresstoleranz und des Gedächtnisses.