570 Biowissenschaften; Biologie
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Arachidonsäurelipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind Lipid-peroxidierenden Enzyme, die bei der Zelldifferenzierung und bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen bedeutsam sind. Im menschlichen Genom gibt es sechs funktionelle ALOX-Gene, die als Einzelkopiegene vorliegen. Für jedes humane ALOX-Gen gibt es ein orthologes Mausgen. Obwohl sich die sechs humanen ALOX-Isoformen strukturell sehr ähnlich sind, unterscheiden sich ihre funktionellen Eigenschaften deutlich voneinander. In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Fragestellungen zum Vorkommen, zur biologischen Rolle und zur Evolutionsabhängigkeit der enzymatischen Eigenschaften von Säugetier-ALOX-Isoformen untersucht:
1) Spitzhörnchen (Tupaiidae) sind evolutionär näher mit dem Menschen verwandt als Nagetiere und wurden deshalb als Alternativmodelle für die Untersuchung menschlicher Erkrankungen vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde erstmals der Arachidonsäurestoffwechsel von Spitzhörnchen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass im Genom von Tupaia belangeri vier unterschiedliche ALOX15-Gene vorkommen und die Enzyme sich hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften ähneln. Diese genomische Vielfalt, die weder beim Menschen noch bei Mäusen vorhanden ist, erschwert die funktionellen Untersuchungen zur biologischen Rolle des ALOX15-Weges. Damit scheint Tupaia belangeri kein geeigneteres Tiermodel für die Untersuchung des ALOX15-Weges des Menschen zu sein.
2) Entsprechend der Evolutionshypothese können Säugetier-ALOX15-Orthologe in Arachidonsäure-12-lipoxygenierende- und Arachidonsäure-15-lipoxygenierende Enzyme eingeteilt werden. Dabei exprimieren Säugetierspezies, die einen höheren Evolutionsgrad als Gibbons aufweisen, Arachidonsäure-15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, während evolutionär weniger weit entwickelte Säugetiere Arachidonsäure-12 lipoxygenierende Enzyme besitzen. In dieser Arbeit wurden elf neue ALOX15-Orthologe als rekombinante Proteine exprimiert und funktionell charakterisiert. Die erhaltenen Ergebnisse fügen sich widerspruchsfrei in die Evolutionshypothese ein und verbreitern deren experimentelle Basis. Die experimentellen Daten bestätigen auch das Triadenkonzept.
3) Da humane und murine ALOX15B-Orthologe unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen, können Ergebnisse aus murinen Krankheitsmodellen zur biologischen Rolle der ALOX15B nicht direkt auf den Menschen übertragen werden. Um die ALOX15B-Orthologen von Maus und Mensch funktionell einander anzugleichen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Knock-in Mäuse durch die In vivo Mutagenese mittels CRISPR/Cas9-Technik hergestellt. Diese exprimieren eine humanisierte Mutante (Doppelmutation von Tyrosin603Asparaginsäure+Histidin604Valin) der murinen Alox15b. Diese Mäuse waren lebens- und fortpflanzungsfähig, zeigten aber geschlechtsspezifische Unterschiede zu ausgekreuzten Wildtyp-Kontrolltieren im Rahmen ihre Individualentwicklung.
4) In vorhergehenden Untersuchungen zur Rolle der ALOX15B in Rahmen der Entzündungsreaktion wurde eine antiinflammatorische Wirkung des Enzyms postuliert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Humanisierung der murinen Alox15b die Entzündungsreaktion in zwei verschiedenen murinen Entzündungsmodellen beeinflusst. Eine Humanisierung der murinen Alox15b führte zu einer verstärkten Ausbildung von Entzündungssymptomen im induzierten Dextran-Natrium-Sulfat-Kolitismodell. Im Gegensatz dazu bewirkte die Humanisierung der Alox15b eine Abschwächung der Entzündungssymptome im Freund‘schen Adjuvans Pfotenödemmodell. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich die Rolle der ALOX15B in verschiedenen Entzündungsmodellen unterscheidet.
Die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode wird auch heute noch als gängige Methode verwendet, vor allem wegen der geringeren Kosten für das Wirkstoffscreening in der pharmazeutischen Forschung, wobei Ionenkanäle sowie einige der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Mehrzahl der Wirkstoffziele ansprechen. Die zellfreie Synthese eukaryotischer Proteine hat nicht die Nachteile, die bei der Überexpression dieser ionenpermeablen Proteine in Zellen auftreten können, wie z. B. Zelltoxizität, geringere Proteinexpression und die Beseitigung der exprimierten Proteine aufgrund veränderter Domänen sowie die zeitaufwändige Pflege von Zelllinien. Die Synthese von Ionenkanälen in zellfreien Proteinsyntheseplattformen für das künftige Wirkstoffscreening ist noch in der Grundlagenforschung. Obwohl die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode in zellbasierten Assays weit verbreitet ist, wurde diese Methode bisher noch nicht in zellfreien Proteinexpressionssystemen verwendet. Insgesamt ist die neue Anwendung der Calcium-Imaging-Methode in eukaryontischen zellfreien Systemen eine Voraussetzung für die schnelle pharmakologische Analyse von Wirkstoffen. Das erste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit bestand darin, die grundlegenden Prinzipien der Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung von Ionenkanälen in zellbasierten Systemen zu untersuchen. Hierfür wurden zwei Tumorzelllinien des Auges verwendet, und zwar benigne Pterygiumzellen und maligne Aderhautmelanom 92.1 Zellen. In diesen Studien wurde die Interaktion zwischen den nativ überexprimierten transient-receptor-potential-Ionenkanälen (TRPs) wie TRP Vanilliod 1 (TRPV1) (Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 (TRPM8) (Mentholrezeptor) in diesen Tumorzellen nach Zugabe von verschiedenen Medikamenten und Hormonen untersucht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Calcium-Mechanismus von GPCRs in den Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde Mas, ein GPCR und Angiotensin (1-7) -Hormonrezeptor, aus dem renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) in der Human Embryonic Kidney-293 (HEK293) Zelllinie überexprimiert. In dieser Studie wurden insbesondere die Aktivierung klassischer GPCR-Signalwege wie Phospholipase C und Proteinkinase C durch Angiotensin-(1-7) über Mas und die Beteiligung von TRP-Kanälen nachgewiesen. Die zellbasierte-Calcium-Imaging-Methode für chemische Calcium-Indikatoren ließ sich aufgrund der Anwesenheit einer großen Menge cytosolischer Carboxylesterasen gut anwenden. Carboxylesterase ist das wichtigste Enzym in der Calcium Imaging Methode, das die Verarbeitung chemischen Calcium-Farbstoffe behandelt. Dieses Enzym fehlt jedoch in Mikrosomen, die als Basismembran für die Integration synthetisierter Ionenkanäle in eukaryontischen zellfreien Systemen verwendet werden. Das dritte Ziel dieser Forschungsarbeit war die Umsetzung der zellbasierten Calcium-Imaging Methode und der Calcium-Signalwege in zellfreie Systeme. Hier wurde die zellfrei synthetisierte Carboxylesterase in Mikrosomen von Spodoptera frugiperda (Sf21) als praktikables Calcium-Imaging-Werkzeug etabliert, um sowohl native ionenpermeable Proteine als auch zellfrei-synthetisierte Ionenkanäle zu untersuchen. Die Enzymaktivität der zellfrei-synthetisierten Carboxylesterase in Mikrosomen wurde durch Esterase-Assays und den Calcium-Fluoreszenzfarbstoff Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) Belastungstests nachgewiesen. Das Calcium-Imaging der nativ vorhandenen Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und der Ryanodin-Rezeptoren (RyR) in den Mikrosomen sowie der zell-frei exprimierten TRP-Ionenkanäle wurden mit dem Fura-5N-AM- Fluoreszenzfarbstoff in mit Carboxylesterase vorsynthetisierten Mikrosomen nachgewiesen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Prinzip der zellbasierten Calcium-Imaging -Methode vielversprechend an das eukaryotische zellfreie Sf21-System angepasst werden konnte, um Ionenkanäle zu analysieren. Nach entsprechender Forschung könnte die etablierte Methode in Zukunft auch auf andere Membranproteine ausgeweitet werden. Dies umfasst die Untersuchung anderer zell-frei exprimierte GPCRs oder anderer Ionenkanäle wie Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionenkanäle.
Die aktuelle COVID-19-Pandemie zeigt deutlich, wie sich Infektionskrankheiten weltweit verbreiten können. Neben Viruserkrankungen breiten sich auch multiresistente bakterielle Erreger weltweit aus. Dementsprechend besteht ein hoher Bedarf, durch frühzeitige Erkennung Erkrankte zu finden und Infektionswege zu unterbrechen.
Herkömmliche kulturelle Verfahren benötigen minimalinvasive bzw. invasive Proben und dauern für Screeningmaßnahmen zu lange. Deshalb werden schnelle, nichtinvasive Verfahren benötigt.
Im klassischen Griechenland verließen sich die Ärzte unter anderem auf ihren Geruchssinn, um Infektionen und andere Krankheiten zu differenzieren. Diese charakteristischen Gerüche sind flüchtige organische Substanzen (VOC), die im Rahmen des Metabolismus eines Organismus entstehen. Tiere, die einen besseren Geruchssinn haben, werden trainiert, bestimmte Krankheitserreger am Geruch zu unterscheiden. Allerdings ist der Einsatz von Tieren im klinischen Alltag nicht praktikabel. Es bietet sich an, auf technischem Weg diese VOCs zu analysieren.
Ein technisches Verfahren, diese VOCs zu unterscheiden, ist die Ionenmobilitätsspektrometrie gekoppelt mit einer multikapillaren Gaschromatographiesäule (MCC-IMS). Hier zeigte sich, dass es sich bei dem Verfahren um eine schnelle, sensitive und verlässliche Methode handelt.
Es ist bekannt, dass verschiedene Bakterien aufgrund des Metabolismus unterschiedliche VOCs und damit eigene spezifische Gerüche produzieren. Im ersten Schritt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die verschiedenen Bakterien in-vitro nach einer kurzen Inkubationszeitzeit von 90 Minuten anhand der VOCs differenziert werden können. Hier konnte analog zur Diagnose in biochemischen Testreihen eine hierarchische Klassifikation der Bakterien erfolgen.
Im Gegensatz zu Bakterien haben Viren keinen eigenen Stoffwechsel. Ob virusinfizierte Zellen andere VOCs als nicht-infizierte Zellen freisetzen, wurde an Zellkulturen überprüft. Hier konnte gezeigt werden, dass sich die Fingerprints der VOCs in Zellkulturen infizierter Zellen mit Respiratorischen Synzytial-Viren (RSV) von nicht-infizierten Zellen unterscheiden.
Virusinfektionen im intakten Organismus unterscheiden sich von den Zellkulturen dadurch, dass hier neben Veränderungen im Zellstoffwechsel auch durch Abwehrmechanismen VOCs freigesetzt werden können.
Zur Überprüfung, inwiefern sich Infektionen im intakten Organismus ebenfalls anhand VOCs unterscheiden lassen, wurde bei Patienten mit und ohne Nachweis einer Influenza A Infektion als auch bei Patienten mit Verdacht auf SARS-CoV-2 (Schweres-akutes-Atemwegssyndrom-Coronavirus Typ 2) Infektion die Atemluft untersucht. Sowohl Influenza-infizierte als auch SARS-CoV-2 infizierte Patienten konnten untereinander und von nicht-infizierten Patienten mittels MCC-IMS Analyse der Atemluft unterschieden werden.
Zusammenfassend erbringt die MCC-IMS ermutigende Resultate in der schnellen nichtinvasiven Erkennung von Infektionen sowohl in vitro als auch in vivo.
Die allergische Kontaktdermatitis ist eine immunologisch bedingte Hauterkrankung mit insbesondere in den westlichen Industrienationen hoher und weiter ansteigender Prävalenz. Es handelt sich hierbei um eine Hypersensitivitätsreaktion vom Typ IV, die sich nach Allergenkontakt durch Juckreiz, Rötung, Bläschenbildung und Abschälung der Haut äußert. Zahlreiche Xenobiotika besitzen das Potenzial, Kontaktallergien auszulösen, darunter Konservierungsstoffe, Medikamente, Duftstoffe und Chemikalien. Die wirksamste Maßnahme zur Eindämmung der Erkrankung ist die Expositionsprophylaxe, also die Vermeidung des Kontakts mit den entsprechenden Substanzen. Dies wiederum setzt die Kenntnis des jeweiligen sensibilisierenden Potenzials einer Substanz voraus, dessen Bestimmung aus diesem Grund eine hohe toxikologische Relevanz besitzt. Zu diesem Zweck existieren von der OECD veröffentlichte Testleitlinien, welche auf entsprechend validierten Testmethoden basieren. Goldstandard bei der Prüfung auf hautsensibilisierendes Potenzial war über lange Zeit der murine Lokale Lymphknotentest. Seit der 7. Änderung der EU-Kosmetikrichtlinie, welche Tierversuche für Kosmetika und deren Inhaltsstoffe untersagt, wurden vermehrt Alternativmethoden in die OECD-Testleitlinien implementiert.. Die bestehenden in vitro Methoden sind jedoch alleinstehend nur begrenzt aussagekräftig, da sie lediglich singuläre Mechanismen bei der Entstehung einer Kontaktallergie abbilden. Die Entwicklung von Testmethoden, welche mehrere dieser Schlüsselereignisse berücksichtigen, erscheint daher richtungsweisend. Einen vielversprechenden Ansatz liefert hierbei der Loose-fit coculture-based sensitisation assay (LCSA), welcher eine Kokultur aus primären Keratinozyten und PBMC darstellt. Bei der Kokultivierung von Immunzellen mit anderen Zelltypen stellt sich allerdings die Frage, inwiefern die Nutzung von Zellen derselben Spender*innen (autologe Kokultur) bzw. verschiedener Spender*innen (allogene Kokultur) einen Einfluss nimmt. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit Hautzellen spenderspezifisch aus gezupften Haarfollikeln isoliert und der LCSA mit den generierten HFDK in autologen und allogenen Ansätzen verglichen. Zusätzlich wurde auch ein Vergleich zwischen der Nutzung von HFDK und NHK, welche aus humaner Vorhaut isoliert wurden, im LCSA durchgeführt. Dabei ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen autologen und allogenen Kokulturen bzw. zwischen der Verwendung von HFDK und NHK. Die Verwendung allogener Zellen aus anonymem Spendermaterial sowie die Nutzung von Keratinozyten aus unterschiedlichen Quellen scheint im Rahmen des LCSA problemlos möglich. Einige der getesteten Kontaktallergene, darunter DNCB und NiCl2, erwiesen sich im LCSA jedoch als problematisch und konnten nicht zufriedenstellend als sensibilisierend detektiert werden. Daher wurde eine Optimierung der Kokultur durch Verwendung ex vivo differenzierter Langerhans Zellen (MoLC) angestrebt, welche ein besseres Modell primärer epidermaler Langerhans Zellen darstellen als die dendritischen Zellen aus dem LCSA. Zusätzlich wurden weitere, den Erfolg der Kokultur beeinflussende Faktoren, wie die Art und Zusammensetzung des Mediums und die Kokultivierungsdauer, untersucht und angepasst. Das schlussendlich etablierte Kokultivierungsprotokoll führte zu einer maßgeblich verstärkten Expression von CD207 (Langerin) auf den MoLC, was auf eine wirkungsvolle Interaktion zwischen Haut- und Immunzellen in der Kokultur hindeutete. Des Weiteren konnten DNCB und NiCl2 im Gegensatz zum LCSA durch Verwendung des kostimulatorischen Moleküls CD86 sowie des Reifungsmarkers CD83 als Ausleseparameter eindeutig als Kontaktallergene identifiziert werden. Die Untersuchungen zur Kokultur von MoLC und HFDK wurden jeweils vergleichend in autologen und allogenen Ansätzen durchgeführt. Ähnlich wie beim LCSA kam es aber auch hier zu keinen signifikanten Unterschieden, weder hinsichtlich der Expression von Charakterisierungs- und Aktivierungsmarkern auf MoLC noch hinsichtlich der Zytokinsekretion in den Zellkulturüberstand. Die Hinweise aus zahlreichen Studien im Mausmodell, dass Zellen des angeborenen Immunsystems zur Erkennung von und Aktivierung durch allogene Zellen bzw. Gewebe in der Lage sind, bestätigten sich im Rahmen dieser Arbeit dementsprechend nicht. Aus diesem Grund wurden abschließend CD4+ T-Lymphozyten, die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems, in die Kokultur aus MoLC und autologen bzw. allogenen HFDK integriert. Überraschenderweise traten auch hier keine verstärkten Aktivierungen in allogener Kokultur im Vergleich zur autologen Kokultur auf. Die Nutzung autologer Primärzellen scheint im Rahmen der hier getesteten Methoden nicht notwendig zu sein, was die Validierung von Kokulturen und deren Implementierung in die OECD-Testleitlinien erleichtern dürfte. Zuletzt wurde eine Kokultivierung primärer Haut- und Immunzellen auch im 3D-Vollhautmodell durchgeführt, wobei autologe MoLC in die Epidermisäquivalente entsprechender Modelle integriert werden sollten. Obwohl die erstellten Hautmodelle unter Verwendung autologer Haarfollikel-generierter Keratinozyten und Fibroblasten eine zufriedenstellende Differenzierung und Stratifizierung aufwiesen, gestaltete sich die Inkorporation der MoLC als problematisch und konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erreicht werden.
Epigenetische Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von Colitis ulcerosa (CU). Ihr Einfluss auf das beobachtete Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-inflammatorischen Cytokinen ist hingegen weitgehend unerforscht. Einige der wichtigsten immunmodulatorischen Cytokine sind die Mitglieder der heterodimeren Interleukin- (IL-) 12-Familie, die durch das Kombinieren einer der drei α-Ketten (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) mit den ß-Untereinheiten IL-12p40 oder EBI3 (Epstein-Barr Virus-induziertes Gen 3) charakterisiert sind. IL-35 (IL-12p35/EBI3) spielt eine bedeutende anti-inflammatorische Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, wohingegen seine Level bei chronischen Entzündungen erniedrigt sind. Eine mögliche Ursache könnte eine transkriptionelle Stilllegung über epigenetische Modifikationen sein. Tatsächlich konnte durch die Stimulation mit dem DNA-Methyltransferase-Inhibitor (DNMTi) Decitabin (DAC; Dacogen®) eine Induktion von EBI3 in humanen Epithelzellen aus gesundem Colon (HCEC) erreicht werden, die als Modell für ein lokales Entzündungsgeschehen dienten. Diese Regulation über DNA-Methylierung konnte in weiteren humanen Zellen unterschiedlichen Ursprungs sowie durch Stimulation von HCEC-Zellen mit zwei weiteren DNMTi, dem Cytosin-Analogon Azacytidin (AZA; Vidaza®) und dem natürlich vorkommenden, epigenetisch wirksamen Polyphenol Epigallocatechingallat (EGCG), verifiziert werden. Die kombinierte Inkubation mit Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα) resultierte jeweils in einer über-additiven Induktion von EBI3.
Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass TNFα trotz Beeinflussung der epigenetischen DNMT- und Ten-eleven Translocation- (TET-) Enzyme keinen Einfluss auf die globalen Methylierungs- oder Hydroxymethylierungslevel hatte, jedoch eine genspezifische DNA-Hypomethylierung im EBI3-Promotor induzierte. Durch Nutzung verschiedener Inhibitoren konnte darüber hinaus nachgewiesen werden, dass der beobachtete synergistische Effekt der gemeinsamen DAC und TNFα-Stimulation hauptsächlich über NFκB (Nuclear factor “kappa-light-chain-enhancer” of activated B-cells) vermittelt wird. Ein Teil verläuft dabei über p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases), während die JNK- (c-Jun N-terminale Kinasen-) und ERK- (extracellular-signal-regulated kinases) Signalwege keine Rolle spielen.
In der vorliegenden Arbeit wurde zudem gezeigt, dass die DNA-Hypomethylierung während eines entzündlichen Zustandes auch in einer erhöhten EBI3-Proteinexpression resultiert. Die Höhe der immunologisch detektierten Banden wies auf eine Dimerbildung sowohl im Zelllysat als auch im Überstand hin. Humane Colonepithelzellen sind demnach in der Lage, Cytokine zu bilden und zu sezernieren, was die Bedeutung von Nicht-Immunzellen bei der lokalen Immunantwort unterstreicht. Mittels Genexpressionsanalysen wurden IL-12p35 und IL-23p19 als mögliche Bindungspartner identifiziert. Aufgrund kreuzreaktiver Antikörper ist ein direkter Nachweis der EBI3-Dimere derzeit nicht möglich. Die stattdessen genutzte Kombination verschiedener Methoden dient als geeigneter Ersatz für die problematischen Antikörper-basierten Analysen wie Immunpräzipitation oder ELISA. Durch molekularbiologische, immunologische und massenspektrometrische Methoden konnte IL-35 identifiziert werden, während IL-39 (IL-23p19/EBI3) nicht detektiert wurde. Dies ist in Einklang mit den Erkenntnissen mehrerer Forschungsgruppen, die eine Bildung des nativen humanen Dimers aus IL-23p19 und EBI3 bezweifeln. Des Weiteren wurde die biologische Aktivität des behandlungsinduzierten IL 35-Proteins durch einen Funktionsassay nachgewiesen.
Neben einer DNMTi-bedingten transkriptionellen Aktivierung konnte eine Regulation von EBI3 über Histonacetylierungen gezeigt werden. Der EBI3-induzierende Effekt des Histondeacetylasen-Inhibitors (HDACi) Trichostatin A (TSA) wurde durch SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat; Zolinza®)) verifiziert. Ähnlich zu der Stimulation mit den hypomethylierenden Substanzen wurde ein synergistischer Effekt bei paralleler Inkubation mit TNFα beobachtet, der in einer gesteigerten Bildung des EBI3-Proteins resultierte.
Um die Befunde in einem komplexeren in vivo-Modell zu untersuchen, wurde eine chronische Colitis in Ebi3-defizienten Mäusen und dem dazugehörigen Wildtypstamm C57BL/6 durch zyklische Applikation von Natriumdextransulfat (Dextran sodium sulfate (DSS)) induziert. Der Vergleich klinischer Parameter wie Mortalitätsrate und Körper- sowie Milzgewicht wies bei Abwesenheit von Ebi3 signifikant stärkere colitische Symptome auf. Dies bestätigte die zentrale Rolle von Ebi3 in der Colitisentwicklung und deutete auf eine bevorzugte Bildung des anti-inflammatorisch wirkenden IL-35 statt des pro-inflammatorischen IL-39 in den Wildtyptieren hin. Durch zusätzliche therapeutische Behandlung der C57BL/6-Mäuse nach der DSS-Gabe konnte die in der Literatur beschriebene positive Wirkung von SAHA auf die Colitismanifestation bestätigt werden. Im Gegensatz dazu war der HDACi in den Ebi3-defizienten Tieren nicht in der Lage, die colitischen Parameter zu verbessern beziehungsweise verschlimmerte den Krankheitsphänotyp. Expressionsanalysen von Up- und Downstream-Target-Genen lieferten weitere Hinweise darauf, dass bei Anwesenheit von Ebi3 IL-35 statt IL-39 gebildet wird, was in Einklang mit den in vitro-Untersuchungen steht.
Die vorliegende Arbeit konnte durch den Vergleich der C57BL/6-Mäuse mit den Ebi3-defizienten Tieren neue Erkenntnisse über die Wirkungsweise von SAHA erbringen. Histonacetylierende Bedingungen verbessern colitische Symptome über einen Mechanismus, der die epigenetische Induktion von Ebi3 mit nachfolgender IL-35-Bildung involviert. Durch Kooperation der epigenetischen Mechanismen Hypomethylierung und Histonacetylierung wurde der stärkste Effekt auf die EBI3-Induktion bewirkt.
Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit durch in vitro- und in vivo-Analysen die epigenetische und NFκB-vermittelte Induktion von EBI3 über DNA-Demethylierung und Histonacetylierung mit nachfolgender IL-35-Bildung und –Sezernierung nachgewiesen werden. Da IL-35 in der Lage ist, colitische Symptome zu mildern, stellt die epigenetische Reaktivierbarkeit von EBI3 durch DNMTi und HDACi eine vielversprechende Alternative für die derzeit genutzten, oft nicht oder nur kurzfristig wirksamen Therapien bei der Behandlung einer CU dar. Einer übermäßigen Immunantwort während schubweiser entzündlicher Phasen könnte entgegengewirkt und Komplikationen wie die Bildung Colitis-assoziierter Karzinome verhindert werden.
Antikörper werden in verschiedensten Bereichen, sowohl zu therapeutischen als auch zu diagnostischen und forschungsorientierten Zwecken verwendet. Vor der Verwendung des Antikörpers bedarf es der Charakterisierung seiner Eigenschaften, in Bezug auf sein Epitop und sein Bindeverhalten gegenüber dem Paratop. Gleichzeitig muss, in Abhängigkeit des Einsatzes, der Antikörper, für den gewünschten Gebrauch, validiert werden. Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit Bead-basierte, multiplexe Testsysteme entworfen, ausgetestet und etabliert mit dem Ziel, eine einfache Screeningmethode zu entwickeln, um eine hohe Anzahl an Proben beziehungsweise Analyten gleichzeitig bestimmen zu können. Dafür wurden drei verschiedene Herangehensweisen etabliert.
So wurden ein phospho-PKA-Substrat Antikörper, welcher phosphorylierte Bindemotive der PKA der Form RRxpS erkennt, gleichzeitig mit einer Reihe an Peptide getestet, welche Punktmutationen im Vergleich zur Konsensussequenz enthielten, um den Einfluss einzelner Aminosäuren auf die Bindung des Antikörpers zu untersuchen. Es konnte im Multiplex gezeigt werden, dass die Unterschiede im Antikörperbindungsverhalten in Abhängigkeit der Aminosäure an verschiedenen P-Positionen detektierbar waren. Mit dem Bead-basierten Multiplexansatz konnten, durch Messungen von Konzentrationsreihen des Antikörpers, Bindungskinetiken aufgenommen und diese mit bereits etablierten Methoden verglichen werden.
Des Weiteren wurden verschiedene Antikörper, welche essenzielle Bestandteile von Bead-basierten Testsystemen darstellten, validiert. Es wurden dabei verschiedene Antikörper, welche spezifisch THC und CBD erkennen ausgetestet und anschließend ein kompetitiver Assay zur Detektion von THC und CBD in humanem Serum etabliert, und die Nachweisgrenzen bestimmt.
Ferner sollten Pferdeseren von Tieren, welche am Sommerekzem leiden, auf ihren IgE-Gehalt hin bestimmt werden. Dafür wurden relevante Proteine rekombinant hergestellt und durch Immobilisierung an Beads im Multiplex mit Serum inkubiert. Die spezifische Bindung des IgE an die Allergen sollte damit messbar gemacht werden können. Für die Gesamtvalidierung des Testsystems wurden zuvor sämtliche Einzelschritte einzeln validiert, um im Anschluss im multiplexen Screening zu vermessen.
Die Nutzung von Bead-basierten Multiplexmessungen als eine Plattformtechnologie erleichtert die Charakterisierung von Antikörpern sowie ihre Validierung für verschiedene Testsysteme.
Synthetische Transkriptionsfaktoren bestehen wie natürliche Transkriptionsfaktoren aus einer DNA-Bindedomäne, die sich spezifisch an die Bindestellensequenz vor dem Ziel-Gen anlagert, und einer Aktivierungsdomäne, die die Transkriptionsmaschinerie rekrutiert, sodass das Zielgen exprimiert wird. Der Unterschied zu den natürlichen Transkriptionsfaktoren ist, sowohl dass die DNA-Bindedomäne als auch die Aktivierungsdomäne wirtsfremd sein können und dadurch künstliche Stoffwechselwege im Wirt, größtenteils chemisch, induziert werden können. Optogenetische synthetische Transkriptionsfaktoren, die hier entwickelt wurden, gehen einen Schritt weiter. Dabei ist die DNA-Bindedomäne nicht mehr an die Aktivierungsdomäne, sondern mit dem Blaulicht-Photorezeptor CRY2 gekoppelt. Die Aktivierungsdomäne wurde mit dem Interaktionspartner CIB1 fusioniert. Unter Blaulichtbestrahlung dimerisieren CRY2 und CIB1 und damit einhergehend die beiden Domänen, sodass ein funktionsfähiger Transkriptionsfaktor entsteht. Dieses System wurde in die Saccharomyces cerevisiae genomisch integriert. Verifiziert wurde das konstruierte System mit Hilfe des Reporters yEGFP, welcher durchflusszytometrisch detektiert werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass die yEGFP Expression variabel gestaltet werden kann, indem unterschiedlich lange Blaulichtimpulse ausgesendet wurden, die DNA-Bindedomäne, die Aktivierungsdomäne oder die Anzahl der Bindestellen, an dem sich die DNA-Bindedomäne anlagert, verändert wurden. Um das System für industrielle Anwendungen attraktiv zu gestalten, wurde das System vom Deepwell-Maßstab auf Photobioreaktor-Maßstab hochskaliert. Außerdem erwies sich das Blaulichtsystem sowohl im Laborstamm YPH500 als auch im industriell oft verwendeten Hefestamm CEN.PK als funktional. Des Weiteren konnte ein industrierelevante Protein ebenso mit Hilfe des verifizierten Systems exprimiert werden. Schlussendlich konnte in dieser Arbeit das etablierte Blaulicht-System erfolgreich mit einem Rotlichtsystem kombiniert werden, was zuvor noch nicht beschrieben wurde.
Hitze ist eine bedeutende klimatische Bedingung, die das Wachstum und das Überleben von Pflanzen bedroht. Extreme Temperaturereignisse in der Natur werden gravierender, häufiger, länger anhaltend, was sich nachteilig auf die landwirtschaftliche Produktion auswirkt. Daher ist es wichtig, mehr über die Mechanismen zu erfahren, die zu einer erhöhten Hitzetoleranz bei Pflanzen führen. Um auszuhalten und zu überleben, haben höhere Pflanzen komplexe Mechanismen entwickelt, um auf verschiedene Intensitäten von Hitzestress zu reagieren. Pflanzen haben eine thermische Toleranz, die es ihnen ermöglicht, schnelle und dramatische Temperaturanstiege für eine begrenzte Zeit zu überleben. Pflanzen können auch darauf vorbereitet werden, Hitzestress (HS) zu widerstehen, der ansonsten tödlich wäre, indem man sie kurzen, moderaten und nicht-tödlichen HS (als Priming-Stimulus bezeichnet) aussetzt, bevor sie hohem HS ausgesetzt werden. Eine erworbene Thermotoleranz kann bei Pflanzen unter optimalen Bedingungen lange aufrechterhalten werden, was bedeutet, dass Pflanzen während dieser Zeit Informationen speichern können. Mehrere Studien haben gezeigt, dass sich erworbene Thermotoleranz (Thermopriming) auf die erhöhte Widerstandsfähigkeit von Zellen, Geweben und Organismen gegenüber erhöhten Temperaturen nach vorheriger Hitzeeinwirkung bezieht. Die Aufrechterhaltung der erworbenen Thermotoleranz (Thermomemory) ist mit der Synthese von speziellen Stressproteinen verbunden, die am Zellschutz und der beschleunigten Gewebereparatur beteiligt sind, wie z. B. Hitzeschockproteine (HSPs). Neuere Studien haben eine Beteiligung von Hitzeschockproteinen, z.B. HSP21, in Chloroplasten an der Regulation des Thermogedächtnisses belegt. Als wichtiges Organell ist die mitochondriale Funktion entscheidend für die Reaktion von Pflanzenzellen auf Hitze. Es ist jedoch noch unbekannt, wie die molekulare und physiologische Beteiligung von HSPs an der mitochondrialen Funktion im Thermogedächtnis erfolgt. In unserer Studie haben wir gezeigt, dass Thermopriming Transkript- und Proteinspiegel von zwei mitochondrialen kleinen Hitzeschockproteinen, HSP23.56 (AT5G51440) und HSP23.6 (AT4G25200), induziert, die während der Thermogedächtnisphase 2-3 Tage andauern. Die morphologische Analyse von HSP23.5/6-transgenen Pflanzen zeigte eine HSP23.5/6-Funktionsredundanz bei Hitzestress. Wir zeigten, dass hsp23.5/6-Doppel-Knockout-Pflanzen Anomalien im Thermogedächtnis im Keimlingsstadium aufwiesen und dass reife hsp23.5/6-Pflanzen sowohl mit basaler Thermotoleranz als auch mit Thermogedächtnis empfindlicher sind. Die Wärmebehandlung beeinflusste die Atmungsrate von hsp23.5/6-Keimlingen im Vergleich zu WT signifikant, was auf eine mitochondriale Dysfunktion in Abhängigkeit von HSP23.5 und HSP23.6 hinweist. Darüber hinaus haben wir die Chaperon-Aktivität von HSP23.6 gegenüber dem Modellsubstratprotein Malatdehydrogenase (MDH) in vitro getestet und bestätigt, was darauf hindeutet, dass HSP23.6 möglicherweise zur Aufrechterhaltung der zellulären Lebensfähigkeit beiträgt. Darüber hinaus entdeckten wir ein neues HSP23.6-Clientprotein, CIB22, ein mitochondriales Komplex-I-Untereinheitsprotein. Nach experimentellen Daten (BiFC und Co-IP) interagieren HSP23.6 und CIB22 in Pflanzenzellen. Wir identifizierten auch einen Hitzereaktionsphänotyp in der cib22-Mutante im Vergleich zu WT sowie einen CIB22-Proteinabbau in der hsp23.5/6-Mutante, wenn sie Hitze ausgesetzt wurde. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die beiden mitochondrial lokalisierten
Hitzeschockproteine eine Rolle bei der Thermotoleranz spielen, vermutlich indem sie die mitochondriale Funktion und Struktur beeinflussen. Um neue genetische Komponenten zu identifizieren, die mit dem Thermogedächtnis in Pflanzen verbunden sind, haben wir weiterhin ein Proteom-Profiling von Arabidopsis WT (Col-0) -Keimlingen während des Thermogedächtnisses durchgeführt. Mehrere Zeitpunkte von Priming und Triggerung mit Kontrollen wurden gesammelt und analysiert, um dynamische Proteomänderungen während der Gedächtnisphase in
Arabidopsis-Zellen aufzudecken. Unter den Top-gedächtnis-assoziierten Proteinen entdeckten wir, dass HSP70-4 nach dem Priming signifikant hochreguliert wurde und für die nächsten vier Tage auf hohem Niveau bleibt (mindestens 2-fach erhöht). Durch Analyse ihres Hitzestressverhaltens konnten wir verifizieren, dass HSP70-4 an der 7 Reaktion von Pflanzen auf Hitzestress beteiligt ist. Interessant ist, dass HSP70-4-GFP nach dem Priming zytosolische Foci erzeugt, die für einige Tage während der Erholungsphase bestehen bleiben. Wir schlagen vor, dass der Fokus mit SGs verbunden ist, da Cycloheximid (CHX) GFP-Foci-Signale unterdrückt, wenn sie der Hitze ausgesetzt werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine HSP70-4-vermittelte Transkriptions- und Translationssteuerungsverbindung (Modul) während der basalen Thermotoleranz und des Thermogedächtnisses sowie auf ihre potenzielle(n) Rolle(n) bei der Reaktion auf Hitzestress hin.
Zusammenfassend bietet unsere Forschung neue Einblicke in die Rolle von Hitzeschockproteinen bei der Kontrolle der Hitzestresstoleranz und des Gedächtnisses.
Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriolär aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und mögliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es während der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am stärksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen während der Mitose wird für Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten äußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 führte zur Ausbildung von überzähligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erhöhten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochauflösende Expansion Microscopy für das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den äußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in räumlicher Nähe zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als möglicher Interaktionspartner identifiziert werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und ermöglichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verständnis der Topologie des Centrosoms.
Angepasste Pathogene besitzen eine Reihe von Virulenzmechanismen, um pflanzliche Immunantworten unterhalb eines Schwellenwerts der effektiven Resistenz zu unterdrücken. Dadurch sind sie in der Lage sich zu vermehren und Krankheiten auf einem bestimmten Wirt zu verursachen. Eine essentielle Virulenzstrategie Gram-negativer Bakterien ist die Translokation von sogenannten Typ-III Effektorproteinen (T3Es) direkt in die Wirtszelle. Dort stören diese die Immunantwort des Wirts oder fördern die Etablierung einer für das Pathogen günstigen Umgebung. Eine kritische Komponente der Pflanzenimmunität gegen eindringende Pathogene ist die schnelle transkriptionelle Umprogrammierung der angegriffenen Zelle. Viele adaptierte bakterielle Pflanzenpathogene verwenden T3Es, um die Induktion Abwehr-assoziierter Gene zu stören. Die Aufklärung von Effektor-Funktionen, sowie die Identifikation ihrer pflanzlichen Zielproteine sind für das Verständnis der bakteriellen Pathogenese essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Typ-III Effektorprotein XopS aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) funktionell charakterisiert werden. Zudem lag hier ein besonderer Fokus auf der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen XopS und seinem in Vorarbeiten identifizierten pflanzlichen Interaktionspartner WRKY40, einem transkriptionellen Regulator der Abwehr-assoziierten Genexpression. Es konnte gezeigt werden, dass XopS ein essentieller Virulenzfaktor des Phytopathogens Xcv während der präinvasiven Immunantwort ist. So zeigten xopS-defiziente Xcv Bakterien bei einer Inokulation der Blattoberfläche suszeptibler Paprika Pflanzen eine deutlich reduzierte Virulenz im Vergleich zum Xcv Wildtyp. Die Translokation von XopS durch Xcv, sowie die ektopische Expression von XopS in Arabidopsis oder N. benthamiana verhinderte das Schließen von Stomata als Reaktion auf Bakterien bzw. einem Pathogen-assoziierten Stimulus, wobei zudem gezeigt werden konnte, dass dies in einer WRKY40-abhängigen Weise geschieht. Weiter konnte gezeigt werden, dass XopS in der Lage ist, die Expression Abwehr-assoziierter Gene zu manipulieren. Dies deutet darauf hin, dass XopS sowohl in die prä-als auch in die postinvasive, apoplastische Abwehr eingreift. Phytohormon-Signalnetzwerke spielen während des Aufbaus einer effizienten pflanzlichen Immunantwort eine wichtige Rolle. Hier konnte gezeigt werden, dass XopS mit genau diesen Signalnetzwerken zu interferieren scheint. Eine ektopische Expression des Effektors in Arabidopsis führte beispielsweise zu einer signifikanten Induktion des Phytohormons Jasmonsäure (JA), während eine Infektion von suszeptiblen Paprika Pflanzen mit einem xopS-defizienten Xcv Stamm zu einer ebenfalls signifikanten Akkumulation des Salicylsäure (SA)-Gehalts führte.
So kann zu diesem Zeitpunkt vermutet werden, dass XopS die Virulenz von Xcv fördert, indem JA-abhängige Signalwege induziert werden und es gleichzeitig zur Unterdrückung SA-abhängiger Signalwege kommt. Die Virus-induzierte Genstilllegung des XopS Interaktionspartners WRKY40a in Paprika erhöhte die Toleranz der Pflanze gegenüber einer Xcv Infektion, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesem Protein um einen transkriptionellen Repressor pflanzlicher Immunantworten handelt. Die Hypothese, dass WRKY40 die Abwehr-assoziierte Genexpression reprimiert, konnte hier über verschiedene experimentelle Ansätze bekräftigt werden. So wurde beispielsweise gezeigt, dass die Expression von verschiedenen Abwehrgenen einschließlich des SA-abhängigen Gens PR1 und die des Negativregulators des JA-Signalwegs JAZ8 von WRKY40 gehemmt wird. Um bei einem Pathogenangriff die Abwehr-assoziierte Genexpression zu gewährleisten, muss WRKY40 als Negativregulator abgebaut werden. Vorarbeiten zeigten, dass WRKY40 über das 26S Proteasom abgebaut wird. In der hier vorliegenden Studie konnte weiter bestätigt, dass der T3E XopS zu einer Stabilisierung des WRKY40 Proteins führt, indem er auf bislang ungeklärte Weise dessen Abbau über das 26S Proteasom verhindert. Die Ergebnisse aus der hier vorliegenden Arbeit lassen die Vermutung zu, dass die Stabilisierung des Negativregulators der Immunantwort WRKY40 seitens XopS dazu führt, dass eine darüber vermittelte Manipulation der Abwehr-assoziierten Genexpression, sowie eine Umsteuerung phytohormoneller Wechselwirkungen die Ausbreitung von Xcv auf suszeptiblen Paprikapflanzen fördert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, weitere potentielle in planta Interaktionspartner von XopS zu identifizieren die für seine Interaktion mit WRKY40 bzw. für die Aufschlüsselung seines Wirkmechanismus relevant sein könnten. So konnte die Deubiquitinase UBP12 als weiterer pflanzlicher Interaktionspartner sowohl von XopS als auch von WRKY40 gefunden werden. Dieses Enzym ist in der Lage, die Ubiquitinierung von Substratproteinen zu modifizieren und seine Funktion könnte somit ein Bindeglied zwischen XopS und dessen Interferenz mit dem proteasomalen Abbau von WRKY40 sein. Während einer kompatiblen Xcv-Wirtsinteraktion führte die Virus-induzierte Genstilllegung von UBP12 zu einer reduzierten Resistenz der Pflanze gegenüber des Pathogens Xcv, was auf dessen positiv-regulatorische Wirkung während der Immunantwort hindeutet. Zudem zeigten Western Blot Analysen, dass das Protein WRKY40 bei einer Herunterregulierung von UBP12 akkumuliert und dass diese Akkumulation von der Anwesenheit des T3Es XopS zusätzlich verstärkt wird. Weiterführende Analysen zur biochemischen Charakterisierung der XopS/WRKY40/UBP12 Interaktion sollten in Zukunft durchgeführt werden, um den genauen Wirkmechanismus des XopS T3Es weiter aufzuschlüsseln.
Eine Störung des Leberstoffwechsels durch die Ausbildung einer Insulinresistenz kann zu Folgeerkrankungen wie der nicht alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) bis hin zur Steatohepatitis (NASH) und zur Entwicklung eines Diabetes Typ II führen. Am Krankheitsverlauf sind residente (Kupfferzellen) sowie infiltrierende Makrophagen beteiligt, die durch inflammatorische Stimuli aktiviert werden und zur Progression von Lebererkrankungen führen können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von mPGES1-abhängig gebildetem Prostaglandin E2 (PGE2) an der Modulation von aktivierten Lebermakrophagen untersucht. Dazu wurden Kupfferzellen und Peritonealmakrophagen (als Modell für infiltrierende Makrophagen) aus Wildtyp und mPGES1-defizienten Mäusen isoliert. Beide Makrophagenpopulationen wurden in Zellkulturversuchen mit Lipopolysacchariden (LPS) aktiviert und auf ihre PGE2-Synthese, Genexpression und Sekretion von verschiedenen Cytokinen hin untersucht. Die beiden Makrophagenpopulationen unterschieden sich hinsichtlich der PGE2-Synthese bei mPGSE1-Defizienz. Während bei Peritonealmakrophagen die LPS-abhängige PGE2-Synthese bei Abwesenheit der mPGES1 fast vollständig reprimiert war, war bei Kupfferzellen nur eine 25%ige Abnahme zu verzeichnen. Die postulierte selbstverstärkende Rückkopplungsschleife von PGE2 im Hinblick auf seine eigene Synthese konnte in isolierten Peritonealmakrophagen, nicht jedoch in Kupfferzellen, bestätigt werden. In Kupfferzellen führte exogenes PGE2 ferner zu einer Repression von den pro-inflammatorischen Cytokinen TNFα und IL-1β und für endogenes PGE2 konnte in diesem Zelltyp kein Effekt festgestellt werden. In Peritonealmakrophagen konnte hingegen auch für endogenes PGE2 eine reprimierende Wirkung auf die Expression von TNFα beobachtet werden. Das ist eventuell auf eine höhere Sensitivität gegenüber PGE2 von Peritonealmakrophagen im Vergleich zu Kupfferzellen zurückzuführen. PGE2 wirkte unter den gewählten Versuchsbedingungen in vitro somit eher anti-inflammatorisch. Cholesterolkristalle induzierten in Kupfferzellen die Expression der PGE2-synthetisierenden Enzyme und verschiedener pro-inflammatorische Cytokine. Sie könnten somit zu einer Progression von NAFL zu NASH beitragen. Die Daten aus dieser Arbeit deuten darauf hin, dass PGE2 im Rahmen von entzündlichen Leberveränderungen eine eher protektive Wirkung im Hinblick auf die Progression von NAFLD und Insulinresistenz haben könnte.
Die funktionelle Charakterisierung von therapeutisch relevanten Proteinen kann bereits durch die Bereitstellung des Zielproteins in adäquaten Mengen limitierend sein. Dies trifft besonders auf Membranproteine zu, die aufgrund von zytotoxischen Effekten auf die Produktionszelllinie und der Tendenz Aggregate zu bilden, in niedrigen Ausbeuten an aktivem Protein resultieren können. Der lebende Organismus kann durch die Verwendung von translationsaktiven Zelllysaten umgangen werden- die Grundlage der zellfreien Proteinsynthese. Zu Beginn der Arbeit wurde die ATP-abhängige Translation eines Lysates auf der Basis von kultivierten Insektenzellen (Sf21) analysiert. Für diesen Zweck wurde ein ATP-bindendes Aptamer eingesetzt, durch welches die Translation der Nanoluziferase reguliert werden konnte. Durch die dargestellte Applizierung von Aptameren, könnten diese zukünftig in zellfreien Systemen für die Visualisierung der Transkription und Translation eingesetzt werden, wodurch zum Beispiel komplexe Prozesse validiert werden können.
Neben der reinen Proteinherstellung können Faktoren wie posttranslationale Modifikationen sowie eine Integration in eine lipidische Membran essentiell für die Funktionalität des Membranproteins sein. Im zweiten Abschnitt konnte, im zellfreien Sf21-System, für den G-Protein-gekoppelten Rezeptor Endothelin B sowohl eine Integration in die endogen vorhandenen Endoplasmatisch Retikulum-basierten Membranstrukturen als auch Glykosylierungen, identifiziert werden.
Auf der Grundlage der erfolgreichen Synthese des ET-B-Rezeptors wurden verschiedene Methoden zur Fluoreszenzmarkierung des Adenosin-Rezeptors A2a (Adora2a) angewandt und optimiert. Im dritten Abschnitt wurde der Adora2a mit Hilfe einer vorbeladenen tRNA, welche an eine fluoreszierende Aminosäure gekoppelt war, im zellfreien Chinesischen Zwerghamster Ovarien (CHO)-System markiert. Zusätzlich konnte durch den Einsatz eines modifizierten tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paares eine nicht-kanonische Aminosäure an Position eines integrierten Amber-Stopcodon in die Polypeptidkette eingebaut und die funktionelle Gruppe im Anschluss an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt werden. Aufgrund des offenen Charakters eignen sich zellfreie Proteinsynthesesysteme besonders für eine Integration von exogenen Komponenten in den Translationsprozess. Mit Hilfe der Fluoreszenzmarkierung wurde eine ligandvermittelte Konformationsänderung im Adora2a über einen Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer detektiert. Durch die Etablierung der Amber-Suppression wurde darüber hinaus das Hormon Erythropoetin pegyliert, wodurch Eigenschaften wie Stabilität und Halbwertszeit des Proteins verändert wurden.
Zu guter Letzt wurde ein neues tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paar auf Basis der Methanosarcina mazei Pyrrolysin-Synthetase etabliert, um das Repertoire an nicht-kanonischen Aminosäuren und den damit verbundenen Kopplungsreaktionen zu erweitern. Zusammenfassend wurden die Potenziale zellfreier Systeme in Bezug auf der Herstellung von komplexen Membranproteinen und der Charakterisierung dieser durch die Einbringung einer positionsspezifischen Fluoreszenzmarkierung verdeutlicht, wodurch neue Möglichkeiten für die Analyse und Funktionalisierung von komplexen Proteinen geschaffen wurden.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen Analysen zur Charakterisierung der periplasmatischen Aldehyd Oxidoreduktase aus E. coli. Kinetische Untersuchungen mit Ferricyanid als Elektronenakzeptor unter anaeroben Bedingungen zeigten für dieses Enzym eine höhere Aktivität als unter aeroben Bedingungen. Die getroffene Hypothese, dass PaoABC fähig ist Elektronen an molekularen Sauerstoff weiter zu geben, konnte bestätigt werden. Für den Umsatz aromatischer Aldehyde mit molekularem Sauerstoff wurde ein Optimum von pH 6,0 ermittelt. Dies steht im Gegensatz zur Reaktion mit Ferricyanid, mit welchem ein pH-Optimum von 4,0 gezeigt wurde. Die Reaktion von PaoABC mit molekularem Sauerstoff generiert zwar Wasserstoffperoxid, die Produktion von Superoxid konnte dagegen nicht beobachtet werden. Dass aerobe Bedingungen einen Einfluss auf das Auslösen der Expression von PaoABC haben, wurde in dieser Arbeit ebenfalls ermittelt.
Im Zusammenhang mit der Produktion von ROS durch PaoABC wurde die Funktion eines kürzlich in Elektronentransfer-Distanz zum FAD identifizierten [4Fe4S]-Clusters untersucht. Ein Austausch der für die Bindung des Clusters zuständigen Cysteine führte zur Instabilität der Proteinvarianten, weswegen für diese keine weiteren Untersuchungen erfolgten. Daher wird zumindest ein struktur-stabilisierender Einfluss des [4Fe4S]-Clusters angenommen. Zur weiteren Untersuchung der Funktion dieses Clusters, wurde ein zwischen FAD und [4Fe4S]-Cluster lokalisiertes Arginin gegen ein Alanin ausgetauscht. Diese Proteinvariante zeigte eine reduzierte Geschwindigkeit der Reaktion gegenüber dem Wildtyp. Die Bildung von Superoxid konnte auch hier nicht beobachtet werden. Die Vermutung, dass dieser Cluster einen elektronen-sammelnden Mechanismus unterstützt, welcher die Radikalbildung verhindert, kann trotz allem nicht ausgeschlossen werden. Da im Umkreis des Arginins weitere geladene und aromatische Aminosäuren lokalisiert sind, können diese den notwendigen Elektronentransfer übernehmen.
Neben der Ermittlung eines physiologischen Elektronenakzeptors und dessen Einfluss auf die Expression von PaoABC zeigt diese Arbeit auch, dass die Chaperone PaoD und MocA während der Reifung des MCD-Kofaktor eine gemeinsame Bindung an PaoABC realisieren. Es konnte im aktiven Zentrum von PaoABC ein Arginin beschrieben werden, welches auf Grund der engen Nachbarschaft zum MCD-Kofaktor und zum Glutamat (PaoABC-EC692) am Prozess der Substratbindung beteiligt ist. Im Zusammenhang mit dem Austausch dieses Arginins gegen ein Histidin oder ein Lysin wurden die Enzymspezifität und der Einfluss physiologischer Bedingungen, wie pH und Ionenstärke, auf die Reaktion des Enzyms untersucht. Gegenüber dem Wildtyp zeigten die Varianten mit molekularem Sauerstoff eine geringere Affinität zum Substrat aber auch eine höhere Geschwindigkeit der Reaktion. Vor allem für die Histidin-Variante konnte im gesamten pH-Bereich ein instabiles Verhalten bestimmt werden. Der Grund dafür wurde durch das Lösen der Struktur der Histidin-Variante beschreiben. Durch den Austausch der Aminosäuren entfällt die stabilisierende Wirkung der delokalisierten Elektronen des Arginins und es kommt zu einer Konformationsänderung im aktiven Zentrum.
Neben der Reaktion von PaoABC mit einer Vielzahl aromatischer Aldehyde konnte auch der Umsatz von Salicylaldehyd zu Salicylsäure durch PaoABC in einer Farbreaktion bestimmt werden. Durch Ausschluss von molekularem Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor, in einer enzym-gekoppelten Reaktion, erfolgte ein Elektronentransport auf Ferrocencarboxylsäure. Die Kombination aus beiden Methoden ermöglichte eine Verwendung von Ferrocen-Derivaten zur Generierung einer enzym-gekoppelten Reaktion mit PaoABC.
Die Untersuchungen zu PaoABC zeigen, dass die Vielfalt der durch das Enzym katalysierten Rektionen weitere Möglichkeiten der enzymatischen Bestimmung biokatalytischer Prozesse bietet.
Um das Immunsystem der Pflanze zu manipulieren translozieren gram-negative pathogene Bakterien Typ-III Effektorproteine (T3E) über ein Typ-III Sekretionssystem (T3SS) in die pflanzliche Wirtszelle. Dort lokalisieren T3Es in verschiedenen subzellulären Kompartimenten, wo sie Zielproteine modifizieren und so die Infektion begünstigen. HopZ1a, ein T3E des Pflanzenpathogens Pseudomonas syringae pv. syringae, ist eine Acetyltransferase und lokalisiert über ein Myristolierungsmotiv an der Plasmamembran der Wirtszelle. Obwohl gezeigt wurde, dass HopZ1a die frühe Signalweiterleitung an der Plasmamembran stört, wurde bisher kein mit der Plasmamembran assoziiertes Zielprotein für diesen T3E identifiziert. Um bisher unbekannte HopZ1a-Zieleproteine zu identifizieren wurde im Vorfeld dieser Arbeit eine Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung mit einer cDNA-Bibliothek aus Tabak durchgeführt, wobei ein nicht näher charakterisiertes Remorin als Interaktor gefunden wurde.
Bei dem Remorin handelt es sich um einen Vertreter der Gruppe 4 der Remorin-Familie, weshalb es in NbREM4 umbenannt wurde. Durch den Einsatz verschiedener Interaktionsstudien konnte demonstriert werden, dass HopZ1a mit NbREM4 in Hefe, in vitro und in planta wechselwirkt. Es wurde ferner deutlich, dass HopZ1a auf spezifische Weise mit dem konservierten C-Terminus von NbREM4 interagiert, das Remorin jedoch in vitro nicht acetyliert. Analysen mittels BiFC haben zudem ergeben, dass NbREM4 in Homodimeren an der Plasmamembran lokalisiert, wo auch die Interaktion mit HopZ1a stattfindet.
Eine funktionelle Charakterisierung von NbREM4 ergab, dass das Remorin eine spezifische Rolle im Immunsystem der Pflanze einnimmt. Die transiente Expression in N. benthamiana induziert die Expression von Abwehrgenen sowie einen veränderten Blattphänotyp. In A. thaliana wird HopZ1a über das Decoy ZED1 und das R-Protein ZAR1 erkannt, was zur Auslösung einer starken Hypersensitiven Antwort (HR von hypersensitive response) führt. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass ZAR1 in N. benthamiana konserviert ist, NbREM4 jedoch nicht in der ETI als Decoy fungiert. Mit Hilfe einer Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung mit NbZAR1 als Köder konnten zwei Proteine, die Catalase CAT1 und der Protonenpumpeninteraktor PPI1, als Interaktoren von NbZAR1 identifiziert werden, welche möglicherweise in der Regulation der HR eine Rolle spielen.
Aus Voruntersuchungen war bekannt, dass NbREM4 mit weiteren, nicht näher charakterisierten Proteinen aus Tabak interagieren könnte. Eine phylogenetische Einordnung hat gezeigt, dass es sich um die bekannte Immun-Kinase PBS1 sowie zwei E3-Ubiquitin-Ligasen, NbSINA1 und NbSINAL3, handelt. PBS1 interagiert mit NbREM4 an der Plasmamembran und phosphoryliert das Remorin innerhalb des intrinsisch ungeordneten N-Terminus. Mittels Massenspektrometrie konnten die Serine an Position 64 und 65 innerhalb der Aminosäuresequenz von NbREM4 als PBS1-abhängige Phosphorylierungsstellen identifiziert wurden.
NbSINA1 und NbSINAL3 besitzen in vitro Ubiquitinierungsaktivität, bilden Homo- und Heterodimere und interagieren ebenfalls mit dem N-terminalen Teil von NbREM4, wobei sie das Remorin in vitro nicht ubiquitinieren.
Aus den in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass der bakterielle T3E HopZ1a gezielt mit dem Tabak-Remorin NbREM4 an der Plasmamembran interagiert und über einen noch unbekannten Mechanismus mit dem Immunsystem der Pflanze interferiert, wobei NbREM4 möglicherweise eine Rolle als Adapter- oder Ankerprotein zukommt, über welches HopZ1a mit weiteren Immunkomponenten interagiert. NbREM4 ist Teil eines größeren Immunnetzwerkes, zu welchem die bekannte Immun-Kinase PBS1 und zwei E3-Ubiquitin-Ligasen gehören. Mit NbREM4 konnte damit erstmalig ein membranständiges Protein mit einer Funktion im Immunsystem der Pflanze als Zielprotein von HopZ1a identifiziert werden.
Kolorektalkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Tumorerkrankung weltweit. Neben dem Alter spielt auch die Ernährung eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Krankheit. Eine vermutlich krebspräventive Wirkung wird dabei dem Spurenelement Selen zugeschrieben, das fast ausschließlich über Lebensmittel aufgenommen wird. So hängt beispielsweise ein niedriger Selenstatus mit dem Risiko, im Laufe des Lebens an CRC zu erkranken, zusammen. Seine Funktionen vermittelt Selen dabei überwiegend durch Selenoproteine, in denen es in Form von Selenocystein eingebaut wird. Zu den bisher am besten untersuchten Selenoproteinen mit möglicher Funktion während CRC zählen die Glutathionperoxidasen (GPXen). Die Mitglieder dieser Familie tragen aufgrund ihrer Hydroperoxid-reduzierenden Eigenschaften entscheidend zum Schutz der Zellen vor oxidativem Stress bei. Dies kann je nach Art und Stadium des Tumors entweder krebshemmend oder -fördernd wirken, da auch transformierte Zellen von dieser Schutzfunktion profitieren.
In dieser Arbeit wurde die GPX2 in HT29-Darmkrebszellen mithilfe stabil-transfizierter shRNA herunterreguliert, um die Funktion des Enzyms vor allem in Hinblick auf regulierte Signalwege zu untersuchen. Ein Knockdowns (KD) der strukturell ähnlichen GPX1 kam ebenfalls zum Einsatz, um gezielt Isoform-spezifische Funktionen unterscheiden zu können. Anhand eines PCR-Arrays wurden Signalwege identifiziert, die auf einen Einfluss der beiden Proteine im Zellwachstum hindeuteten. Anschließende Untersuchungen ließen auf einen verminderten Differenzierungsstatus in den GPX1- und GPX2-KDs aufgrund einer geringeren Aktivität der Alkalischen Phosphatase schließen. Zudem war die Zellviabilität im Neutralrot-Assay (NRU) bei Fehlen der GPX1 bzw. GPX2 im Vergleich zur Kontrolle reduziert. Die Ergebnisse des PCR-Arrays, und speziell für die GPX2 frühere Untersuchungen der Arbeitsgruppe, wiesen weiterhin auf eine Rolle der beiden Proteine in der entzündungsgetriebenen Karzinogenese hin. Daher wurden auch mögliche Interaktionen mit dem NFκB-Signalweg analysiert. Eine Stimulation der Zellen mit dem proinflammatorischen Zytokin IL1β ging mit einer verstärkten Aktivierung der MAP-Kinasen ERK1/2 in den Zellen mit GPX1- bzw. GPX2-KD einher. Die gleichzeitige Behandlung mit dem Antioxidans NAC führte nicht zur Rücknahme der Effekte in den KDs, sodass möglicherweise nicht nur die antioxidativen Eigenschaften der Enzyme bei der Interaktion mit diesen Signalwegsproteinen relevant sind.
Weiterhin wurden Analysen zum Substratspektrum der GPX2 in HCT116-Zellen mit einer Überexpression des Proteins durchgeführt. Dabei zeigte sich mittels NRU-Assay und DNA-Laddering, dass die GPX2 besonders vor den proapoptotischen Effekten einer Behandlung mit den Lipidhydroperoxiden HPODE und HPETE schützt.
Im Gegensatz zur GPX2 lässt sich Selenoprotein H (SELENOH) stärker durch die alimentäre Selenzufuhr beeinflussen. Einer möglichen Nutzung als Biomarker oder gar als Ansatzpunkt bei der Prävention bzw. Behandlung von CRC steht allerdings unvollständiges Wissen über die Funktion des Proteins gegenüber. Zur genaueren Charakterisierung von SELENOH wurden daher stabil-transfizierte KD-Klone in HT29- und Caco2-Zellen hergestellt und zunächst auf ihre Tumorigenität untersucht.
Zellen mit SELENOH-KD bildeten mehr und größere Kolonien im Soft Agar und zeigten ein erhöhtes Proliferations- und Migrationspotenzial im Vergleich zur Kontrolle.
Ein Xenograft in Nacktmäusen resultierte zudem in einer stärkeren Tumorbildung nach Injektion von KD-Zellen. Untersuchungen zur Beteiligung von SELENOH an der Zellzyklusregulation deuten auf eine hemmende Rolle des Proteins in der G1/S-Phase hin.
Die weiterhin beobachtete Hochregulation von SELENOH in humanen Adenokarzinomen und präkanzerösem Mausgewebe lässt sich möglicherweise mit der postulierten Schutzfunktion vor oxidativen Zell- und DNA-Schäden erklären. In gesunden Darmepithelzellen war das Protein vorrangig am Kryptengrund lokalisiert, was zu einer potenziellen Rolle während der gastrointestinalen Differenzierung passt.