570 Biowissenschaften; Biologie
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The genome can be considered the blueprint for an organism. Composed of DNA, it harbours all organism-specific instructions for the synthesis of all structural components and their associated functions. The role of carriers of actual molecular structure and functions was believed to be exclusively assumed by proteins encoded in particular segments of the genome, the genes. In the process of converting the information stored genes into functional proteins, RNA – a third major molecule class – was discovered early on to act a messenger by copying the genomic information and relaying it to the protein-synthesizing machinery. Furthermore, RNA molecules were identified to assist in the assembly of amino acids into native proteins. For a long time, these - rather passive - roles were thought to be the sole purpose of RNA. However, in recent years, new discoveries have led to a radical revision of this view. First, RNA molecules with catalytic functions - thought to be the exclusive domain of proteins - were discovered. Then, scientists realized that much more of the genomic sequence is transcribed into RNA molecules than there are proteins in cells begging the question what the function of all these molecules are. Furthermore, very short and altogether new types of RNA molecules seemingly playing a critical role in orchestrating cellular processes were discovered. Thus, RNA has become a central research topic in molecular biology, even to the extent that some researcher dub cells as “RNA machines”. This thesis aims to contribute towards our understanding of RNA-related phenomena by applying Bioinformatics means. First, we performed a genome-wide screen to identify sites at which the chemical composition of DNA (the genotype) critically influences phenotypic traits (the phenotype) of the model plant Arabidopsis thaliana. Whole genome hybridisation arrays were used and an informatics strategy developed, to identify polymorphic sites from hybridisation to genomic DNA. Following this approach, not only were genotype-phenotype associations discovered across the entire Arabidopsis genome, but also regions not currently known to encode proteins, thus representing candidate sites for novel RNA functional molecules. By statistically associating them with phenotypic traits, clues as to their particular functions were obtained. Furthermore, these candidate regions were subjected to a novel RNA-function classification prediction method developed as part of this thesis. While determining the chemical structure (the sequence) of candidate RNA molecules is relatively straightforward, the elucidation of its structure-function relationship is much more challenging. Towards this end, we devised and implemented a novel algorithmic approach to predict the structural and, thereby, functional class of RNA molecules. In this algorithm, the concept of treating RNA molecule structures as graphs was introduced. We demonstrate that this abstraction of the actual structure leads to meaningful results that may greatly assist in the characterization of novel RNA molecules. Furthermore, by using graph-theoretic properties as descriptors of structure, we indentified particular structural features of RNA molecules that may determine their function, thus providing new insights into the structure-function relationships of RNA. The method (termed Grapple) has been made available to the scientific community as a web-based service. RNA has taken centre stage in molecular biology research and novel discoveries can be expected to further solidify the central role of RNA in the origin and support of life on earth. As illustrated by this thesis, Bioinformatics methods will continue to play an essential role in these discoveries.
Background: For heterogeneous tissues, such as blood, measurements of gene expression are confounded by relative proportions of cell types involved. Conclusions have to rely on estimation of gene expression signals for homogeneous cell populations, e.g. by applying micro-dissection, fluorescence activated cell sorting, or in-silico deconfounding. We studied feasibility and validity of a non-negative matrix decomposition algorithm using experimental gene expression data for blood and sorted cells from the same donor samples. Our objective was to optimize the algorithm regarding detection of differentially expressed genes and to enable its use for classification in the difficult scenario of reversely regulated genes. This would be of importance for the identification of candidate biomarkers in heterogeneous tissues.
Results: Experimental data and simulation studies involving noise parameters estimated from these data revealed that for valid detection of differential gene expression, quantile normalization and use of non-log data are optimal. We demonstrate the feasibility of predicting proportions of constituting cell types from gene expression data of single samples, as a prerequisite for a deconfounding-based classification approach. Classification cross-validation errors with and without using deconfounding results are reported as well as sample-size dependencies. Implementation of the algorithm, simulation and analysis scripts are available.
Conclusions: The deconfounding algorithm without decorrelation using quantile normalization on non-log data is proposed for biomarkers that are difficult to detect, and for cases where confounding by varying proportions of cell types is the suspected reason. In this case, a deconfounding ranking approach can be used as a powerful alternative to, or complement of, other statistical learning approaches to define candidate biomarkers for molecular diagnosis and prediction in biomedicine, in realistically noisy conditions and with moderate sample sizes.
Multi-color fluorescence imaging experiments of wave forming Dictyostelium cells have revealed that actin waves separate two domains of the cell cortex that differ in their actin structure and phosphoinositide composition. We propose a bistable model of actin dynamics to account for these experimental observation. The model is based on the simplifying assumption that the actin cytoskeleton is composed of two distinct network types, a dendritic and a bundled network. The two structurally different states that were observed in experiments correspond to the stable fixed points in the bistable regime of this model. Each fixed point is dominated by one of the two network types. The experimentally observed actin waves can be considered as trigger waves that propagate transitions between the two stable fixed points.
A large number and wide variety of lake ecosystem models have been developed and published during the past four decades. We identify two challenges for making further progress in this field. One such challenge is to avoid developing more models largely following the concept of others ('reinventing the wheel'). The other challenge is to avoid focusing on only one type of model, while ignoring new and diverse approaches that have become available ('having tunnel vision'). In this paper, we aim at improving the awareness of existing models and knowledge of concurrent approaches in lake ecosystem modelling, without covering all possible model tools and avenues. First, we present a broad variety of modelling approaches. To illustrate these approaches, we give brief descriptions of rather arbitrarily selected sets of specific models. We deal with static models (steady state and regression models), complex dynamic models (CAEDYM, CE-QUAL-W2, Delft 3D-ECO, LakeMab, LakeWeb, MyLake, PCLake, PROTECH, SALMO), structurally dynamic models and minimal dynamic models. We also discuss a group of approaches that could all be classified as individual based: super-individual models (Piscator, Charisma), physiologically structured models, stage-structured models and traitbased models. We briefly mention genetic algorithms, neural networks, Kalman filters and fuzzy logic. Thereafter, we zoom in, as an in-depth example, on the multi-decadal development and application of the lake ecosystem model PCLake and related models (PCLake Metamodel, Lake Shira Model, IPH-TRIM3D-PCLake). In the discussion, we argue that while the historical development of each approach and model is understandable given its 'leading principle', there are many opportunities for combining approaches. We take the point of view that a single 'right' approach does not exist and should not be strived for. Instead, multiple modelling approaches, applied concurrently to a given problem, can help develop an integrative view on the functioning of lake ecosystems. We end with a set of specific recommendations that may be of help in the further development of lake ecosystem models.
Lake ecosystems across the globe have responded to climate warming of recent decades. However, correctly attributing observed changes to altered climatic conditions is complicated by multiple anthropogenic influences on lakes. This thesis contributes to a better understanding of climate impacts on freshwater phytoplankton, which forms the basis of the food chain and decisively influences water quality. The analyses were, for the most part, based on a long-term data set of physical, chemical and biological variables of a shallow, polymictic lake in north-eastern Germany (Müggelsee), which was subject to a simultaneous change in climate and trophic state during the past three decades. Data analysis included constructing a dynamic simulation model, implementing a genetic algorithm to parameterize models, and applying statistical techniques of classification tree and time-series analysis. Model results indicated that climatic factors and trophic state interactively determine the timing of the phytoplankton spring bloom (phenology) in shallow lakes. Under equally mild spring conditions, the phytoplankton spring bloom collapsed earlier under high than under low nutrient availability, due to a switch from a bottom-up driven to a top-down driven collapse. A novel approach to model phenology proved useful to assess the timings of population peaks in an artificially forced zooplankton-phytoplankton system. Mimicking climate warming by lengthening the growing period advanced algal blooms and consequently also peaks in zooplankton abundance. Investigating the reasons for the contrasting development of cyanobacteria during two recent summer heat wave events revealed that anomalously hot weather did not always, as often hypothesized, promote cyanobacteria in the nutrient-rich lake studied. The seasonal timing and duration of heat waves determined whether critical thresholds of thermal stratification, decisive for cyanobacterial bloom formation, were crossed. In addition, the temporal patterns of heat wave events influenced the summer abundance of some zooplankton species, which as predators may serve as a buffer by suppressing phytoplankton bloom formation. This thesis adds to the growing body of evidence that lake ecosystems have strongly responded to climatic changes of recent decades. It reaches beyond many previous studies of climate impacts on lakes by focusing on underlying mechanisms and explicitly considering multiple environmental changes. Key findings show that climate impacts are more severe in nutrient-rich than in nutrient-poor lakes. Hence, to develop lake management plans for the future, limnologists need to seek a comprehensive, mechanistic understanding of overlapping effects of the multi-faceted human footprint on aquatic ecosystems.
Pektatlyase (Pel-15) aus dem alkalophilen Bodenbakterium Bacillus spec. KSM-P15 ist mit 197 Aminosäuren eines der kleinsten, bekannten β-3-Solenoidproteine. Sie spaltet Polygalakturonsäurederivate in einem Ca2+-abhängigen β-Eliminierungsprozess. Wie bei allen Proteinen dieser Enzymfamilie ist auch die Polypeptidkette von Pel-15 zu einer einsträngigen, rechtsgängigen, parallelen β-Helix aufgewunden. In diesem Strukturmotiv enthält jede Windung drei β-Stränge, die jeweils durch flexible Schleifenbereiche miteinander verbunden sind. Insgesamt acht Windungen stapeln sich in Pel-15 übereinander und bilden entlang der Helixachse flächige, parallele β-Faltblätter aus. Im Bereich dieser β-Faltblätter existiert ein ausgedehntes Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen, durch das der hydrophobe Kern, der sich im Inneren der β-Helix befindet, vom umgebenden Lösungsmittel abgeschirmt wird. Besondere Abschlussstrukturen an beiden Enden der β-Helix, wie sie typischerweise bei anderen Ver-tretern dieser Strukturklasse ausgeprägt werden, sind in Pel-15 nicht zu beobachten. Stattdessen sind die terminalen Bereiche der β-Helix über Salzbrücken und hydrophobe Seitenkettenkontakte stabilisiert. In der vorliegenden Dissertation wurde die Pektatlyase Pel-15 hinsichtlich ihres Faltungsgleichgewichtes, ihrer enzymatischen Aktivität und der Kinetik ihrer Strukturbildung charakterisiert. In eine evolutionär konservierte Helixwindung wurden destabilisierende Mutationen eingeführt, und deren Auswirkungen mittels spektroskopischer Methoden analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Pel-15 in Gegenwart des Denaturierungsmittels Guanidiniumhydrochlorid einen hyperfluoreszenten Gleichgewichtsustand (HF) populiert, der nach Messungen von Faltungs- und Entfaltungskinetiken ein konformationelles Ensemble aus den Zuständen HFslow und HFfast darstellt. Diese HF-Zustände sind durch eine hohe Aktivierungsbarriere voneinander getrennt. In Rückfaltungsexperimenten populieren nur etwa 80 % der faltenden Moleküle den Zwischenzustand HFslow, der mit einer Zeitkonstante von ca. 100 s zu HFfast weiterreagiert. Die Denaturierungsmittelabhängigkeit dieser Reaktion ist sehr gering, was eine trans-/cis-Prolylisomerisierung als geschwindigkeitslimitierenden Schritt nahelegt. Die Existenz eines cis-Peptides in der nativen Struktur macht es erforderlich, den denaturierten Zustand als ein Ensemble kinetisch separierter Konformationen, kurz: DSE, zu betrachten, das durch die Spezies Ufast und Uslow populiert wird. Nach dem in dieser Arbeit aufgestellten „Minimalmodell der Pel-15 Faltung“ stehen die HF-Spezies (HFslow, HFfast) mit den Konformationen des DSE in einem thermodynamischen Kreisprozess. Das Modell positioniert HFfast und die native Konformation N auf die „native Seite“ der Aktivierungsbarriere und trägt damit der Tatsache Rechnung, dass die Gleichgewichtseinstellung zwischen diesen Spezies zu schnell ist, um mit manuellen Techniken erfasst zu werden. Die hochaffine Bindung von Ca2+ (Kd = 10 μM) verschiebt sich das Faltungsgleichgewicht bereits in Gegenwart von 1 mM CaCl2 soweit auf die Seite des nativen Zustandes, das HFfast nicht länger nachweisbar ist. Entgegen anfänglicher Vermutungen kommt einer lokalen, evolutionär konservierten Disulfidbrücke im Zentrum der β-Helix eine wichtige Stabilisierungsfunktion zu. Die Disulfidbrücke befindet sich in einem kurzen Schleifenbereich der β-Helix nahe dem aktiven Zentrum. Obwohl ihr Austausch gegen die Reste Val und Ala die freie Stabilisierungsenthalpie des Proteins um ca. 10 kJ/mol reduziert, lässt die Struktur im Bereich der Mutationsstelle keine gravierende Veränderung erkennen. Auch die katalytisch relevante Ca2+-Bindungsaffinität bleibt unbeeinflusst; dennoch zeigen Enzymaktivitätstests für VA-Mutanten eine Reduktion der enzymatischen Aktivität um fast 50 % an. Die evolutionär konservierte Helixwindung im Allgemeinen und die in ihr enthaltene Disulfidbrücke im Besonderen müssen nach den vorliegenden Ergebnissen also eine zentrale Funktion sowohl für die Struktur des katalytischen Zentrums als auch für die Strukturbildung der β-Helix während der Faltungsreaktion besitzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit finden in mehreren Punkten Anklang an Faltungseigenschaften, die für andere β -Helixproteine beschrieben wurden. Vor allem aber prädestinieren sie Pel-15 als ein neues, β-helikales Modellprotein. Aufgrund seiner einfachen Topologie, seiner niedrigen Windungszahl und seiner hohen thermodynamischen Stabilität ist Pel-15 sehr gut geeignet, die Determinanten von Stabilität und Strukturbildung des parallelen β-Helix-Motivs in einer Auflösung zu studieren, die aufgrund der Komplexität bestehender β-helikaler Modellsysteme bislang nicht zur Verfügung stand.
The widespread usage of products containing volatile organic compounds (VOC) has lead to a general human exposure to these chemicals in work places or homes being suspected to contribute to the growing incidence of environmental diseases. Since the causal molecular mechanisms for the development of these disorders are not completely understood, the overall objective of this thesis was to investigate VOC-mediated molecular effects on human lung cells in vitro at VOC concentrations comparable to exposure scenarios below current occupational limits. Although differential expression of single proteins in response to VOCs has been reported, effects on complex protein networks (proteome) have not been investigated. However, this information is indispensable when trying to ascertain a mechanism for VOC action on the cellular level and establishing preventive strategies. For this study, the alveolar epithelial cell line A549 has been used. This cell line, cultured in a two-phase (air/liquid) model allows the most direct exposure and had been successfully applied for the analysis of inflammatory effects in response to VOCs. Mass spectrometric identification of 266 protein spots provided the first proteomic map of A549 cell line to this extent that may foster future work with this frequently used cellular model. The distribution of three typical air contaminants, monochlorobenzene (CB), styrene and 1,2 dichlorobenzene (1,2-DCB), between gas and liquid phase of the exposure model has been analyzed by gas chromatography. The obtained VOC partitioning was in agreement with available literature data. Subsequently the adapted in vitro system has been successfully employed to characterize the effects of the aromatic compound styrene on the proteome of A549 cells (Chapter 4). Initially, the cell toxicity has been assessed in order to ensure that most of the concentrations used in the following proteomic approach were not cytotoxic. Significant changes in abundance and phosphorylation in the total soluble protein fraction of A549 cells have been detected following styrene exposure. All proteins have been identified using mass spectrometry and the main cellular functions have been assigned. Validation experiments on protein and transcript level confirmed the results of the 2-DE experiments. From the results, two main cellular pathways have been identified that were induced by styrene: the cellular oxidative stress response combined with moderate pro-apoptotic signaling. Measurement of cellular reactive oxygen species (ROS) as well as the styrene-mediated induction of oxidative stress marker proteins confirmed the hypothesis of oxidative stress as the main molecular response mechanism. Finally, adducts of cellular proteins with the reactive styrene metabolite styrene 7,8 oxide (SO) have been identified. Especially the SO-adducts observed at both the reactive centers of thioredoxin reductase 1, which is a key element in the control of the cellular redox state, may be involved in styrene-induced ROS formation and apoptosis. A similar proteomic approach has been carried out with the halobenzenes CB and 1,2-DCB (Chapter 5). In accordance with previous findings, cell toxicity assessment showed enhanced toxicity compared to the one caused by styrene. Significant changes in abundance and phosphorylation of total soluble proteins of A549 cells have been detected following exposure to subtoxic concentrations of CB and 1,2-DCB. All proteins have been identified using mass spectrometry and the main cellular functions have been assigned. As for the styrene experiment, the results indicated two main pathways to be affected in the presence of chlorinated benzenes, cell death signaling and oxidative stress response. The strong induction of pro-apoptotic signaling has been confirmed for both treatments by detection of the cleavage of caspase 3. Likewise, the induction of redox-sensitive protein species could be correlated to an increased cellular level of ROS observed following CB treatment. Finally, common mechanisms in the cellular response to aromatic VOCs have been investigated (Chapter 6). A similar number (4.6-6.9%) of all quantified protein spots showed differential expression (p<0.05) following cell exposure to styrene, CB or 1,2-DCB. However, not more than three protein spots showed significant regulation in the same direction for all three volatile compounds: voltage-dependent anion-selective channel protein 2, peroxiredoxin 1 and elongation factor 2. However, all of these proteins are important molecular targets in stress- and cell death-related signaling pathways.
The aim of this thesis is the design, expression and purification of human cytochrome c mutants and their characterization with regard to electrochemical and structural properties as well as with respect to the reaction with the superoxide radical and the selected proteins sulfite oxidase from human and fungi bilirubin oxidase. All three interaction partners are studied here for the first time with human cyt c and with mutant forms of cyt c. A further aim is the incorporation of the different cyt c forms in two bioelectronic systems: an electrochemical superoxide biosensor with an enhanced sensitivity and a protein multilayer assembly with and without bilirubin oxidase on electrodes. The first part of the thesis is dedicated to the design, expression and characterization of the mutants. A focus is here the electrochemical characterization of the protein in solution and immobilized on electrodes. Further the reaction of these mutants with superoxide was investigated and the possible reaction mechanisms are discussed. In the second part of the work an amperometric superoxide biosensor with selected human cytochrome c mutants was constructed and the performance of the sensor electrodes was studied. The human wild-type and four of the five mutant electrodes could be applied successfully for the detection of the superoxide radical. In the third part of the thesis the reaction of horse heart cyt c, the human wild-type and seven human cyt c mutants with the two proteins sulfite oxidase and bilirubin oxidase was studied electrochemically and the influence of the mutations on the electron transfer reactions was discussed. Finally protein multilayer electrodes with different cyt form including the mutant forms G77K and N70K which exhibit different reaction rates towards BOD were investigated and BOD together with the wild-type and engineered cyt c was embedded in the multilayer assembly. The relevant electron transfer steps and the kinetic behavior of the multilayer electrodes are investigated since the functionality of electroactive multilayer assemblies with incorporated redox proteins is often limited by the electron transfer abilities of the proteins within the multilayer. The formation via the layer-by-layer technique and the kinetic behavior of the mono and bi-protein multilayer system are studied by SPR and cyclic voltammetry. In conclusion this thesis shows that protein engineering is a helpful instrument to study protein reactions as well as electron transfer mechanisms of complex bioelectronic systems (such as bi-protein multilayers). Furthermore, the possibility to design tailored recognition elements for the construction of biosensors with an improved performance is demonstrated.
Foraging in space and time
(2010)
All animals are adapted to the environmental conditions of the habitat they chose to live in. It was the aim of this PhD-project, to show which behavioral strategies are expressed as mechanisms to cope with the constraints, which contribute to the natural selection pressure acting on individuals. For this purpose, small mammals were exposed to different levels and types of predation risk while actively foraging. Individuals were either exposed to different predator types (airborne or ground) or combinations of both, or to indirect predators (nest predators). Risk was assumed to be distributed homogeneously, so changing the habitat or temporal adaptations where not regarded as potential options. Results show that wild-caught voles have strategic answers to this homogeneously distributed risk, which is perceived by tactile, olfactory or acoustic cues. Thus, they do not have to know an absolut quality (e.g., in terms of food provisioning and risk levels of all possible habitats), but they can adapt their behavior to the actual circumstances. Deriving risk uniform levels from cues and adjusting activity levels to the perceived risk is an option to deal with predators of the same size or with unforeseeable attack rates. Experiments showed that as long as there are no safe places or times, it is best to reduce activity and behave as inconspicuous as possible as long as the costs of missed opportunities do not exceed the benefits of a higher survival probability. Test showed that these costs apparently grow faster for males than for females, especially in times of inactivity. This is supported by strong predatory pressure on the most active groups of rodents (young males, sexually active or dispersers) leading to extremely female-biased operative sex ratios in natural populations. Other groups of animals, those with parental duties such as nest guarding, for example, have to deal with the actual risk in their habitat as well. Strategies to indirect predation pressure were tested by using bank vole mothers, confronted with a nest predator that posed no actual threat to themselves but to their young (Sorex araneus). They reduced travelling and concentrated their effort in the presence of shrews, independent of the different nutritional provisioning of food by varying resource levels due to the different seasons. Additionally, they exhibited nest-guarding strategies by not foraging in the vicinity of the nest site in order to reduce conspicuous scent marks. The repetition of the experiment in summer and autumn showed that changing environmental constraints can have a severe impact on results of outdoor studies. In our case, changing resource levels changed the type of interaction between the two species. The experiments show that it is important to analyze decision making and optimality models on an individual level, and, when that is not possible (maybe because of the constraints of field work), groups of animals should be classified by using the least common denominator that can be identified (such as sex, age, origin or kinship). This will control for the effects of the sex or stage of life history or the individual´s reproductive and nutritional status on decision making and will narrow the wide behavioral variability associated with the complex term of optimality.
Die Qualität von Nutzpflanzen ist von zahlreichen Einflussfaktoren wie beispielsweise Lagerbedingungen und Sorteneigenschaften abhängig. Um Qualitätsmängel zu minimieren und Absatzchancen von Nutzpflanzen zu steigern sind umfangreiche Analysen hinsichtlich ihrer stofflichen Zusammensetzung notwendig. Chromatographische Techniken gekoppelt an ein Massenspektrometer und die Kernspinresonanzspektroskopie wurden dafür bislang verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Gaschromatograph an ein Flugzeitmassenspektrometer (GC-TOF-MS) gekoppelt, um physiologische Prozesse bzw. Eigenschaften (die Schwarzfleckigkeit, die Chipsbräunung, das Physiologische Alter und die Keimhemmung) von Nutzpflanzen aufzuklären. Als Pflanzenmodell wurde dafür die Kartoffelknolle verwendet. Dazu wurden neue analytische Lösungsansätze entwickelt, die eine zielgerichtete Auswertung einer Vielzahl von Proben, die Etablierung einer umfangreichen Referenzspektrenbibliothek und die sichere Archivierung aller experimentellen Daten umfassen. Das Verfahren der Probenvorbereitung wurde soweit modifiziert, dass gering konzentrierte Substanzen mittels GC-TOF-MS analysiert werden können. Dadurch wurde das durch die Probenvorbereitung limitierte Substanzspektrum erweitert. Anhand dieser Lösungsansätze wurden physiologisch relevante Stoffwechselprodukte identifiziert, welche indikativ (klassifizierend) bzw. prädiktiv (vorhersagend) für die physiologischen Prozesse sind. Für die Schwarzfleckigkeitsneigung und die Chipseignung wurde jeweils ein biochemisches Modell zur Vorhersage dieser Prozesse aufgestellt und auf eine Züchtungspopulation übertragen. Ferner wurden für die Schwarzfleckigkeit Stoffwechselprodukte des Respirationsstoffwechsels identifiziert sowie Aminosäuren, Glycerollipide und Phenylpropanoide für das Physiologische Alter als relevant erachtet. Das physiologische Altern konnte durch die Anwendung höherer Temperaturen beschleunigt werden. Durch Anwendung von Keimhemmern (Kümmelöl, Chlorpropham) wurde eine Verzögerung des physiologischen Alterns beobachtet. Die Applikation von Kümmelöl erwies sich dabei als besonders vorteilhaft. Kümmelöl behandelte Knollen wiesen im Vergleich zu unbehandelten Knollen nur Veränderungen im Aminosäure-, Zucker- und Sekundärstoffwechsel auf. Chlorpropham behandelte Knollen wiesen einen ähnlichen Stoffwechsel wie die unbehandelten Knollen auf. Für die bislang noch nicht identifizierten Stoffwechselprodukte wurden im Rahmen dieser Arbeit das Verfahren der „gezielten An-/Abreicherung“, der „gepaarten NMR/GC-TOF-MS Analyse“ und das „Entscheidungsbaumverfahren“ entwickelt. Diese ermöglichen eine Klassifizierung von GC-MS Signalen im Hinblick auf ihre chemische Funktionalität. Das Verfahren der gekoppelten NMR/GC-TOF-MS Analyse erwies sich dabei als besonders erfolgversprechend, da es eine Aufklärung bislang unbekannter gaschromatographischer Signale ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurden neue Stoffwechselprodukte in der Kartoffelknolle identifiziert, wodurch ein wertvoller Beitrag zur Analytik der Metabolomik geleistet wurde.
How much is too much?
(2010)
Although dietary nutrient intake is often adequate, nutritional supplement use is common among elite athletes. However, high-dose supplements or the use of multiple supplements may exceed the recommended daily allowance (RDA) of particular nutrients or even result in a daily intake above tolerable upper limits (UL). The present case report presents nutritional intake data and supplement use of a highly trained male swimmer competing at international level. Habitual energy and micronutrient intake were analysed by 3 d dietary reports. Supplement use and dosage were assessed, and total amount of nutrient supply was calculated. Micronutrient intake was evaluated based on RDA and UL as presented by the European Scientific Committee on Food, and maximum permitted levels in supplements (MPL) are given. The athlete’s diet provided adequate micronutrient content well above RDA except for vitamin D. Simultaneous use of ten different supplements was reported, resulting in excess intake above tolerable UL for folate, vitamin E and Zn. Additionally, daily supplement dosage was considerably above MPL for nine micronutrients consumed as artificial products. Risks and possible side effects of exceeding UL by the athlete are discussed. Athletes with high energy intake may be at risk of exceeding UL of particular nutrients if multiple supplements are added. Therefore, dietary counselling of athletes should include assessment of habitual diet and nutritional supplement intake. Educating athletes to balance their diets instead of taking supplements might be prudent to prevent health risks
that may occur with long-term excess nutrient intake.
In a very simplified view, the plant leaf growth can be reduced to two processes, cell division and cell expansion, accompanied by expansion of their surrounding cell walls. The vacuole, as being the largest compartment of the plant cell, plays a major role in controlling the water balance of the plant. This is achieved by regulating the osmotic pressure, through import and export of solutes over the vacuolar membrane (the tonoplast) and by controlling the water channels, the aquaporins. Together with the control of cell wall relaxation, vacuolar osmotic pressure regulation is thought to play an important role in cell expansion, directly by providing cell volume and indirectly by providing ion and pH homestasis for the cytosoplasm. In this thesis the role of tonoplast protein coding genes in cell expansion in the model plant Arabidopsis thaliana is studied and genes which play a putative role in growth are identified. Since there is, to date, no clearly identified protein localization signal for the tonoplast, there is no possibility to perform genome-wide prediction of proteins localized to this compartment. Thus, a series of recent proteomic studies of the tonoplast were used to compile a list of cross-membrane tonoplast protein coding genes (117 genes), and other growth-related genes from notably the growth regulating factor (GRF) and expansin families were included (26 genes). For these genes a platform for high-throughput reverse transcription quantitative real time polymerase chain reaction (RT-qPCR) was developed by selecting specific primer pairs. To this end, a software tool (called QuantPrime, see http://www.quantprime.de) was developed that automatically designs such primers and tests their specificity in silico against whole transcriptomes and genomes, to avoid cross-hybridizations causing unspecific amplification. The RT-qPCR platform was used in an expression study in order to identify candidate growth related genes. Here, a growth-associative spatio-temporal leaf sampling strategy was used, targeting growing regions at high expansion developmental stages and comparing them to samples taken from non-expanding regions or stages of low expansion. Candidate growth related genes were identified after applying a template-based scoring analysis on the expression data, ranking the genes according to their association with leaf expansion. To analyze the functional involvement of these genes in leaf growth on a macroscopic scale, knockout mutants of the candidate growth related genes were screened for growth phenotypes. To this end, a system for non-invasive automated leaf growth phenotyping was established, based on a commercially available image capture and analysis system. A software package was developed for detailed developmental stage annotation of the images captured with the system, and an analysis pipeline was constructed for automated data pre-processing and statistical testing, including modeling and graph generation, for various growth-related phenotypes. Using this system, 24 knockout mutant lines were analyzed, and significant growth phenotypes were found for five different genes.
This thesis contains quantum chemical models and force field calculations for the RuBisCO isotope effect, the spectral characteristics of the blue-light sensor BLUF and the light harvesting complex II. The work focuses on the influence of the environment on the corresponding systems. For RuBisCO, it was found that the isotopic effect is almost unaffected by the environment. In case of the BLUF domain, an amino acid was found to be important for the UV/vis spectrum, but unaccounted for in experiments so far (Ser41). The residue was shown to be highly mobile and with a systematic influence on the spectral shift of the BLUF domain chromophore (flavin). Finally, for LHCII it was found that small changes in the geometry of a Chlorophyll b/Violaxanthin chromophore pair can have strong influences regarding the light harvesting mechanism. Especially here it was seen that the proper description of the environment can be critical. In conclusion, the environment was observed to be of often unexpected importance for the molecular properties, and it seems not possible to give a reliable estimate on the changes created by the presence of the environment.
Inverse agonist and neutral antagonist actions of synthetic compounds at an insect 5-HT1 receptor
(2010)
Background and purpose: 5-Hydroxytryptamine (5-HT) has been shown to control and modulate many physiological and behavioural functions in insects. In this study, we report the cloning and pharmacological properties of a 5-HT1 receptor of an insect model for neurobiology, physiology and pharmacology. Experimental approach: A cDNA encoding for the Periplaneta americana 5-HT1 receptor was amplified from brain cDNA. The receptor was stably expressed in HEK 293 cells, and the functional and pharmacological properties were determined in cAMP assays. Receptor distribution was investigated by RT-PCR and by immunocytochemistry using an affinity-purified polyclonal antiserum. Key results: The P. americana 5-HT1 receptor (Pea5-HT1) shares pronounced sequence and functional similarity with mammalian 5-HT1 receptors. Activation with 5-HT reduced adenylyl cyclase activity in a dose-dependent manner. Pea5-HT1 was expressed as a constitutively active receptor with methiothepin acting as a neutral antagonist, and WAY 100635 as an inverse agonist. Receptor mRNA was present in various tissues including brain, salivary glands and midgut. Receptor-specific antibodies showed that the native protein was expressed in a glycosylated form in membrane samples of brain and salivary glands. Conclusions and implications: This study marks the first pharmacological identification of an inverse agonist and a neutral antagonist at an insect 5-HT1 receptor. The results presented here should facilitate further analyses of 5-HT1 receptors in mediating central and peripheral effects of 5-HT in insects.
Fire prone Mediterranean-type vegetation systems like those in the Mediterranean Basin and South-Western Australia are global hot spots for plant species diversity. To ensure management programs act to maintain these highly diverse plant communities, it is necessary to get a profound understanding of the crucial mechanisms of coexistence. In the current literature several mechanisms are discussed. The objective of my thesis is to systematically explore the importance of potential mechanisms for maintaining multi-species, fire prone vegetation by modelling. The model I developed is spatially-explicit, stochastic, rule- and individual-based. It is parameterised on data of population dynamics collected over 18 years in the Mediterranean-type shrublands of Eneabba, Western Australia. From 156 woody species of the area seven plant traits have been identified to be relevant for this study: regeneration mode, annual maximum seed production, seed size, maximum crown diameter, drought tolerance, dispersal mode and seed bank type. Trait sets are used for the definition of plant functional types (PFTs). The PFT dynamics are simulated annual by iterating life history processes. In the first part of my thesis I investigate the importance of trade-offs for the maintenance of high diversity in multi-species systems with 288 virtual PFTs. Simulation results show that the trade-off concept can be helpful to identify non-viable combinations of plant traits. However, the Shannon Diversity Index of modelled communities can be high despite of the presence of ‘supertypes’. I conclude, that trade-offs between two traits are less important to explain multi-species coexistence and high diversity than it is predicted by more conceptual models. Several studies show, that seed immigration from the regional seed pool is essential for maintaining local species diversity. However, systematical studies on the seed rain composition to multi-species communities are missing. The results of the simulation experiments, as presented in part two of this thesis, show clearly, that without seed immigration the local species community found in Eneabba drifts towards a state with few coexisting PFTs. With increasing immigration rates the number of simulated coexisting PFTs and Shannon diversity quickly approaches values as also observed in the field. Including the regional seed input in the model is suited to explain more aggregated measures of the local plant community structure such as species richness and diversity. Hence, the seed rain composition should be implemented in future studies. In the third part of my thesis I test the sensitivity of Eneabba PFTs to four different climate change scenarios, considering their impact on both local and regional processes. The results show that climate change clearly has the potential to alter the number of dispersed seeds for most of the Eneabba PFTs and therefore the source of the ‘immigrants’ at the community level. A classification tree analysis shows that, in general, the response to climate change was PFT-specific. In the Eneabba sand plains sensitivity of a PFT to climate change depends on its specific trait combination and on the scenario of environmental change i.e. development of the amount of rainfall and the fire frequency. This result emphasizes that PFT-specific responses and regional process seed immigration should not be ignored in studies dealing with the impact of climate change on future species distribution. The results of the three chapters are finally analysed in a general discussion. The model is discussed and improvements and suggestions are made for future research. My work leads to the following conclusions: i) It is necessary to support modelling with empirical work to explain coexistence in species-rich plant communities. ii) The chosen modelling approach allows considering the complexity of coexistence and improves the understanding of coexistence mechanisms. iii) Field research based assumptions in terms of environmental conditions and plant life histories can relativise the importance of more hypothetic coexistence theories in species-rich systems. In consequence, trade-offs can play a lower role than predicted by conceptual models. iv) Seed immigration is a key process for local coexistence. Its alteration because of climate change should be considered for prognosis of coexistence. Field studies should be carried out to get data on seed rain composition.
Live cell flattening
(2010)
Eukaryotic cell flattening is valuable for improving microscopic observations, ranging from bright field (BF) to total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Fundamental processes, such as mitosis and in vivo actin polymerization, have been investigated using these techniques. Here, we review the well known agar overlayer protocol and the oil overlay method. In addition, we present more elaborate microfluidics-based techniques that provide us with a greater level of control. We demonstrate these techniques on the social amoebae Dictyostelium discoideum, comparing the advantages and disadvantages of each method.
Die adipositasbedingte Insulinresistenz geht mit einer unterschwelligen Entzündungsreaktion einher. Als Antwort auf dieses Entzündungsgeschehen wird PGE2 unter anderem von Kupffer Zellen der Leber freigesetzt und kann seine Wirkung über vier PGE2-Rezeptorsubtypen (EP1-EP4) vermitteln. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass PGE2 in Rattenhepatozyten über den EP3 R ERK1/2-abhängig die intrazelluläre Weiterleitung des Insulinsignals hemmt. Über die Modulation der Insulinrezeptorsignalkette durch andere EP-Rezeptoren war bisher nichts bekannt. Daher sollte in stabil transfizierten Zelllinien, die jeweils nur einen der vier EP-Rezeptorsubtypen exprimierten, der Einfluss von PGE2 auf die Insulinrezeptorsignalkette untersucht werden. Es wurden HepG2-Zellen, die keinen funktionalen EP-Rezeptor aufwiesen, sowie HepG2-Zellen, die stabil den EP1-R (HepG2-EP1), den EP3β-R (HepG2 EP3β) oder den EP4-R (HepG2 EP4) exprimierten, sowie die humane fötale Hepatozytenzelllinie, Fh hTert, die den EP2- und den EP4-R exprimierte, für die Untersuchungen verwendet. Die Zellen wurden für 330 min mit PGE2 (10 µM) vorinkubiert, um die pathophysiologische Situation nachzustellen und anschließend mit Insulin (10 nM) für 15 min stimuliert. Die insulinabhängige Akt- und ERK1/2-Phosphorylierung wurde im Western-Blot bestimmt. In allen Hepatomzelllinien die EP-R exprimierten, nicht aber in der Zelllinie, die keinen EP R exprimierte, hemmte PGE2 die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung. In allen drei stabil transfizierten Zelllinien, nicht jedoch in den Fh-hTert-Zellen, steigerte PGE2 die basale und insulinstimulierte Phosphorylierung der Serin/Threoninkinase ERK1/2. In den HepG2 EP1- und den HepG2-EP3β-Zellen steigerte PGE2 mutmaßlich über die ERK1/2-Aktivierung die Serinphosphorylierung des IRS, welche die Weiterleitung des Insulinsignals blockiert. Die Hemmung der Aktivierung von ERK1/2 hob in EP3 R-exprimierenden Zellen die Abschwächung der Insulinsignalübertragung teilweise auf. In diesen Zellen scheint die ERK1/2-Aktivierung die größte Bedeutung für die Hemmung der insulinstimulierten Akt-Phosphorylierung zu haben. Da durch die Hemmstoffe die PGE2-abhängige Modulation nicht vollständig aufgehoben wurde, scheinen darüber hinaus aber noch andere Mechanismen zur Modulation beizutragen. In den Fh hTert-Zellen wurde die Insulinrezeptorsignalkette offensichtlich über einen ERK1/2-unabhängigen, bisher nicht identifizierten Weg unterbrochen. Eine gesteigerte PGE2-Bildung im Rahmen der Adipositas ist nicht auf die peripheren Gewebe beschränkt. Auch im Hypothalamus können bei Adipositas Zeichen einer Entzündung nachgewiesen werden, die mit einer gesteigerten PGE2-Bildung einhergehen. Daher wurde das EP R-Profil von primären hypothalamischen Neuronen und neuronalen Modellzelllinien charakterisiert, um zu prüfen, ob PGE2 in hypothalamischen Neuronen die Insulinsignalkette in ähnlicher Weise unterbricht wie in Hepatozyten. In allen neuronalen Zellen hemmte die Vorinkubation mit PGE2 die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung nicht. In der neuronalen hypothalamischen Zelllinie N 41 wirkte PGE2 eher synergistisch mit Insulin. In durch Retinsäure ausdifferenzierten SH SY5Y-Zellen waren die Ergebnisse allerdings widersprüchlich. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Expression der EP Rezeptoren im Verlauf der Kultur stark schwankte und somit die EP R-Ausstattung der Zellen zwischen den Zellversuchen variierte. Auch in den primären hypothalamischen Neuronen variierte die EP R-Expression abhängig vom Differenzierungszustand und PGE2 beeinflusste die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung nicht. Obwohl in allen neuronalen Zellen die Akt-Phosphorylierung durch Insulin gesteigert wurde, konnte in keiner der Zellen eine insulinabhängige Regulation der Expression von Insulinzielgenen (POMC und AgRP) nachgewiesen werden. Das liegt wahrscheinlich an dem niedrigen Differenzierungsgrad der untersuchten Zellen. Im Rahmen der Adipositas kommt es zu einer Überaktivierung des Endocannabinoidsystems. Endocannabinoidrezeptoren sind mit den EP Rezeptoren verwandt. Daher wurde geprüft, ob Endocannabinoide die Insulinsignalweiterleitung in ähnlicher Weise beeinflussen können wie PGE2. Die Vorinkubation der N 41-Zellen für 330 min mit einem Endocannabinoidrezeptoragonisten steigerte die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung, was auf einen insulinsensitiven Effekt von Endocannabinoiden hindeutet. Dies steht im Widerspruch zu der in der Literatur beschriebenen endocannabinoidabhängigen Insulinresistenz, die aber auf indirekte, durch Endocannabinoide ausgelöste Veränderungen zurückzuführen sein könnte.
Die Ca2+/Calmodulin-aktivierte Serin/Threonin-Phosphatase Calcineurin ist ein Schlüsselmolekül des T-Zell-Rezeptorabhängigen Signalnetzwerkes. Calcineurin aktiviert die Transkriptionsfaktoren der NFATc-Familie durch Dephosphorylierung und reguliert darüber die Expression wichtiger Zytokine und Oberflächenproteine. Die Aktivität von Calcineurin wird durch zahlreiche endogene Proteine moduliert und ist Angriffspunkt der immunsuppressiven Substanzen Cyclosporin A und FK506. In dieser Arbeit wurde der alternative niedermolekulare Calcineurin-NFATc-Inhibitor NCI3 hinsichtlich seiner Effekte auf T-Zell-Rezeptor-abhängige Signalwege charakterisiert. Die Ergebnisse zeigen, daß das Pyrazolopyrimidinderivat NCI3 nichttoxisch und zellmembranpermeabel ist. In T-Zell-Rezeptor-stimulierten primären humanen TH-Zellen unterdrückt NCI3 die Proliferation und IL-2-Produktion (IC50-Wert ~4 µM), da die Dephosphorylierung von NFATc und die anschließende nukleäre Translokation gehemmt wird. NCI3 inhibiert die calcineurinabhängige NFAT- und NF-κB-, aber nicht die AP-1-kontrollierte Reprtergenexpression, in mikromolaren Konzentrationen (IC50-Werte 2 bzw. 7 µM). Im Gegensatz zu Cyclosporin A stört NCI3 nicht die Phosphataseaktivität von Calcineurin, sondern interferiert mit der Calcineurin-NFATc-Bindung. Ein wichtiges endogenes Modulatorprotein für die Calcineurinaktivität ist RCAN1, das vermutlich den Calcineurin-NFATc-Signalweg über einen negativen Rückkopplungsmechanismus reguliert. Hier wurde gezeigt, daß RCAN1 in humanen TH-Zellen exprimiert wird. Die Spleißvariante RCAN1-1 ist in ruhenden T-Zellen basal exprimiert und wird nicht durch T-Zell-Rezeptor-Stimulierung in seiner Expression verändert. RCAN1-4 dagegen ist in ruhenden Zellen kaum zu detektieren und wird stimulierungsabhängig induziert. Durch die Verwendung Calcineurin-NFATc-spezifischer Inhibitoren wie NCI3 wurde gezeigt, daß die RCAN1-4-Induktion durch diesen Signalweg limitiert ist. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten und Erkenntnisse tragen dazu bei, das Verständnis der Funktion und Regulation von Calcineurin in T-Zellen zu vertiefen.
This work describes the realization of physically crosslinked networks based on gelatin by the introduction of functional groups enabling specific supramolecular interactions. Molecular models were developed in order to predict the material properties and permit to establish a knowledge-based approach to material design. The effect of additional supramolecular interactions with hydroxyapaptite was then studied in composite materials. The calculated properties are compared to experimental results to validate the models. The models are then further used for the study of physically crosslinked networks. Gelatin was functionalized with desaminotyrosine (DAT) and desaminotyrosyl-tyrosine (DATT) side groups, derived from the natural amino acid tyrosine. These group can potentially undergo to π-π and hydrogen bonding interactions also under physiological conditions. Molecular dynamics (MD) simulations were performed on models with 0.8 wt.-% or 25 wt.-% water content, using the second generation forcefield CFF91. The validation of the models was obtained by the comparison with specific experimental data such as, density, peptide conformational angles and X-ray scattering spectra. The models were then used to predict the supramolecular organization of the polymer chain, analyze the formation of physical netpoints and calculate the mechanical properties. An important finding of simulation was that with the increase of aromatic groups also the number of observed physical netpoints increased. The number of relatively stable physical netpoints, on average zero 0 for natural gelatin, increased to 1 and 6 for DAT and DATT functionalized gelatins respectively. A comparison with the Flory-Rehner model suggested reduced equilibrium swelling by factor 6 of the DATT-functionalized materials in water. The functionalized gelatins could be synthesized by chemoselective coupling of the free carboxylic acid groups of DAT and DATT to the free amino groups of gelatin. At 25 wt.-% water content, the simulated and experimentally determined elastic mechanical properties (e.g. Young Modulus) were both in the order of GPa and were not influenced by the degree of aromatic modification. The experimental equilibrium degree of swelling in water decreased with increasing the number of inserted aromatic functions (from 2800 vol.-% for pure gelatin to 300 vol.-% for the DATT modified gelatin), at the same time, Young’s modulus, elongation at break, and maximum tensile strength increased. It could be show that the functionalization with DAT and DATT influences the chain organization of gelatin based materials together with a controlled drying condition. Functionalization with DAT and DATT lead to a drastic reduction of helical renaturation, that could be more finely controlled by the applied drying conditions. The properties of the materials could then be influenced by application of two independent methods. Composite materials of DAT and DATT functionalized gelatins with hydroxyapatite (HAp) show a drastic reduction of swelling degree. In tensile tests and rheological measurements, the composites equilibrated in water had increased Young’s moduli (from 200 kPa up to 2 MPa) and tensile strength (from 57 kPa up to 1.1 MPa) compared to the natural polymer matrix without affecting the elongation at break. Furthermore, an increased thermal stability from 40 °C to 85 °C of the networks could be demonstrated. The differences of the behaviour of the functionalized gelatins to pure gelatin as matrix suggested an additional stabilizing bond between the incorporated aromatic groups to the hydroxyapatite.
Quantifying uncertainty, variability and likelihood for ordinary differential equation models
(2010)
Background
In many applications, ordinary differential equation (ODE) models are subject to uncertainty or variability in initial conditions and parameters. Both, uncertainty and variability can be quantified in terms of a probability density function on the state and parameter space.
Results
The partial differential equation that describes the evolution of this probability density function has a form that is particularly amenable to application of the well-known method of characteristics. The value of the density at some point in time is directly accessible by the solution of the original ODE extended by a single extra dimension (for the value of the density). This leads to simple methods for studying uncertainty, variability and likelihood, with significant advantages over more traditional Monte Carlo and related approaches especially when studying regions with low probability.
Conclusions
While such approaches based on the method of characteristics are common practice in other disciplines, their advantages for the study of biological systems have so far remained unrecognized. Several examples illustrate performance and accuracy of the approach and its limitations.
Das ITC SFN und der Mikronährstoff Se sind bekannt als chemopräventive Inhaltsstoffe von Gemüse der Brassica-Familie, welcher auch Brokkoli angehört. Die Wirkungen von sowohl SFN als auch Se beruhen auf zahlreichen verschiedenen Mechanismen. Es existieren jedoch Schnittstellen, an welchen Interaktionen beider Substanzen möglich sind. Basierend auf diesem Wissen wurden in dieser Arbeit Wechselwirkungen zwischen SFN und Se auf die Aktivität sowie Expression von Phase II Enzymen und Selenoproteinen untersucht. Der Einfluss der Kombination von SFN und Se auf die unter physiologischen Bedingungen stattfindende Proliferation und Apoptose war ebenso Gegenstand der Arbeit wie die Modulation von Entzündungsprozessen sowie der Tumorentstehung während der entzündungsverstärkten Colonkanzerogenese im Mausmodell. Das hinsichtlich seiner Wirksamkeit mit aus GRA hydrolysiertem SFN zunächst als vergleichbar befundene synthetische SFN wurde für die Untersuchung im AOM/DSS-induzierten Colontumormodell gewählt und in Kombination mit 3 verschiedenen Selendiäten verabreicht. Der Einfluss von SFN und Se auf Phase II Enzyme und Selenoproteine entlang des GIT war organabhängig und nach 4 Wochen geringer als nach 7 Tagen. Die schwächere Induktion deutet auf eine Anpassung des Organismus hin. Ein SFN-vermittelter Effekt auf NQO1 war im Selenmangel am deutlichsten. Die Aktivität des Selenoproteins TrxR wurde hingegen erst bei ausreichender Selenversorgung durch SFN beeinflusst. Die als Nrf2-Zielgen bekannte und in der Hierarchie der Selenoproteine einen hohen Rang einnehmende GPx2 konnte in bestimmten Organen bereits unter selenarmen Bedingungen durch SFN induziert werden. Eine Überexpression des Enzyms war jedoch nicht möglich. SFN steigerte, unabhängig vom Selenstatus, im oberen Abschnitt des GIT und im Colon die Aktivität der GST. Eine Induktion des eigenen Metabolismus wäre somit denkbar. Im Falle eines Mangels an GPx2 wurde GPx1 bei hinreichender Selenversorgung stärker exprimiert, allerdings konnte sie die Funktion von GPx2 nicht völlig erset-zen. Im Selenmangel kann die Aktivitätssteigerung der TrxR im Dünndarm, dem Ab-schnitt der Selenabsorption, als ein Versuch der GPx2-Kompensation angesehen werden. SFN war nicht in der Lage, über eine Aktivierung des Nrf2/ARE-Signalweges kompensatorische Effekte zu induzieren. Apoptotische Prozesse wurden unter physiologischen Bedingungen nur marginal durch SFN und Se moduliert. Das elektrophile ITC konnte lediglich im Selenmangel Apoptose im luminalen Bereich der Colonkrypten induzieren. Die durch supranutritive Selenkonzentration induzierte Apoptose im Kryptengrund wurde nicht durch SFN beeinflusst. Einer bei Abwesenheit der GPx2 erhöhten Apoptoserate im Kryptengrund wirkte SFN bei adäquater Selenversorgung entgegen, war indessen proapoptotisch unter selendefizienten Konditionen. Der Einfluss von SFN auf die Entzündung war deutlich abhängig vom Selenstatus. Während SFN im Selenmangel anscheinend prooxidative Prozesse induzierte und die Entzündungssymptome verschlimmerte, wirkte es unter adäquatem Selenstatus an-tiinflammatorisch. Den vergleichsweise milden Grad der Entzündung im selensupplementierten Status konnte SFN nicht zusätzlich beeinflussen. SFN veränderte die Inzi-denz colorektaler Tumore nicht. Ein, die Tumorinitiation blockierender SFN-Effekt durch direkte Hemmung der metabolischen Aktivierung des Prokanzerogens im selenadäquaten Zustand scheint offensichtlich. Eine Überversorgung mit Se kann protektiv im Hinblick auf Entzündung oder Colonkanzerogenese sein, jedoch bewirkt SFN keinen zusätzlichen Schutz. Kombinationseffekte von SFN und Se in Bezug auf Phase II Enzyme, Selenoproteine und Apoptose sowie die entzündungsverstärkte Colonkanzerogenese sind nicht eindeutiger Natur und können, abhängig vom Endpunkt, synergistische oder antagonistische Züge aufweisen. Eine bei Selendefizienz deutlichere Wirkung von SFN kann mit Hilfe der gesteigerten Aktivierung von Nrf2 erklärt werden, dies muss jedoch nicht von Vorteil sein. Bei adäquater Selenversorgung kann SFN kurzfristig antiinflammatorische und antikanzerogene Prozesse induzieren. Von einer längerfristigen ständigen SFN-Aufnahme in Form von GRA-reichen Brassicacea ist jedoch abzuraten, da von einer Adaptation auszugehen ist. Die Wirkung von SFN innerhalb der komplexen Pflanzenmatrix bleibt Gegenstand zukünftiger Untersuchungen.
This work presents the development of entropy-elastic gelatin based networks in the form of films or scaffolds. The materials have good prospects for biomedical applications, especially in the context of bone regeneration. Entropy-elastic gelatin based hydrogel films with varying crosslinking densities were prepared with tailored mechanical properties. Gelatin was covalently crosslinked above its sol gel transition, which suppressed the gelatin chain helicity. Hexamethylene diisocyanate (HDI) or ethyl ester lysine diisocyanate (LDI) were applied as chemical crosslinkers, and the reaction was conducted either in dimethyl sulfoxide (DMSO) or water. Amorphous films were prepared as measured by Wide Angle X-ray Scattering (WAXS), with tailorable degrees of swelling (Q: 300-800 vol. %) and wet state Young’s modulus (E: 70 740 kPa). Model reactions showed that the crosslinking reaction resulted in a combination of direct crosslinks (3-13 mol.-%), grafting (5-40 mol.-%), and blending of oligoureas (16-67 mol.-%). The knowledge gained with this bulk material was transferred to the integrated process of foaming and crosslinking to obtain porous 3-D gelatin-based scaffolds. For this purpose, a gelatin solution was foamed in the presence of a surfactant, Saponin, and the resulting foam was fixed by chemical crosslinking with a diisocyanate. The amorphous crosslinked scaffolds were synthesized with varied gelatin and HDI concentrations, and analyzed in the dry state by micro computed tomography (µCT, porosity: 65±11–73±14 vol.-%), and scanning electron microscopy (SEM, pore size: 117±28–166±32 µm). Subsequently, the work focused on the characterization of the gelatin scaffolds in conditions relevant to biomedical applications. Scaffolds showed high water uptake (H: 630-1680 wt.-%) with minimal changes in outer dimension. Since a decreased scaffold pore size (115±47–130±49 µm) was revealed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) upon wetting, the form stability could be explained. Shape recoverability was observed after removal of stress when compressing wet scaffolds, while dry scaffolds maintained the compressed shape. This was explained by a reduction of the glass transition temperature upon equilibration with water (dynamic mechanical analysis at varied temperature (DMTA)). The composition dependent compression moduli (Ec: 10 50 kPa) were comparable to the bulk micromechanical Young’s moduli, which were measured by atomic force microscopy (AFM). The hydrolytic degradation profile could be adjusted, and a controlled decrease of mechanical properties was observed. Partially-degraded scaffolds displayed an increase of pore size. This was likely due to the pore wall disintegration during degradation, which caused the pores to merge. The scaffold cytotoxicity and immunologic responses were analyzed. The porous scaffolds enabled proliferation of human dermal fibroblasts within the implants (up to 90 µm depth). Furthermore, indirect eluate tests were carried out with L929 cells to quantify the material cytotoxic response. Here, the effect of the sterilization method (Ethylene oxide sterilization), crosslinker, and surfactant were analyzed. Fully cytocompatible scaffolds were obtained by using LDI as crosslinker and PEO40 PPO20-PEO40 as surfactant. These investigations were accompanied by a study of the endotoxin material contamination. The formation of medical-grade materials was successfully obtained (<0.5 EU/mL) by using low-endotoxin gelatin and performing all synthetic steps in a laminar flow hood.
Ghrelin is a unique hunger-inducing stomach-borne hormone. It activates orexigenic circuits in the central nervous system (CNS) when acylated with a fatty acid residue by the Ghrelin O-acyltransferase (GOAT). Soon after the discovery of ghrelin a theoretical model emerged which suggests that the gastric peptide ghrelin is the first “meal initiation molecule
Untersuchungen PEG-basierter thermo-responsiver Polymeroberflächen zur Steuerung der Zelladhäsion
(2010)
Moderne Methoden für die Einzelzellanalyse werden dank der fortschreitenden Weiterentwicklung immer sensitiver. Dabei steigen jedoch auch die Anforderungen an das Probenmaterial. Viele Aufbereitungsprotokolle adhärenter Zellen beinhalten eine enzymatische Spaltung der Oberflächenproteine, um die Ablösung vom Zellkultursubstrat zu ermöglichen. Verschiedene Methoden, wie die Patch-Clamp-Technik oder eine auf der Markierung extrazellulärer Domänen von Membranproteinen basierende Durchflusszytometrie können dann nur noch eingeschränkt eingesetzt werden. Daher ist die Etablierung neuer Zellablösemethoden dringend notwendig. In der vorliegenden Arbeit werden erstmals PEG-basierte thermo-responsive Oberflächen erfolgreich für die Zellkultur eingesetzt. Dabei wird das zerstörungsfreie Ablösen verschiedener Zelllinien von den Oberflächen durch Temperatursenkung realisiert. Die Funktionalität der Oberflächen wird durch Variation der Polymerstruktur, sowie der Konzentration der Beschichtungslösung, durch Beschichtung der Oberflächen mit einem zelladhäsionsfördernden Protein (Fibronektin) und durch Adsorption zelladhäsionsvermittelnder Peptide (RGD) optimiert. Um den Zellablösungsprozess detaillierter zu untersuchen, wird hier zum ersten Mal der direkte Zellkontakt mit thermo-responsiven Oberflächen mittels oberflächensensitiver Mikroskopie (TIRAF) sichtbar gemacht. Mit dieser Technik sind die exakte Quantifizierung und die Analyse der Reduktion der Zelladhäsionsfläche während des Abkühlens möglich. Hierbei werden in Abhängigkeit von der Zelllinie Unterschiede im Zellverhalten während des Ablösens festgestellt: Zellen, wie eine Brustkrebszelllinie und eine Ovarzelllinie, die bekanntermaßen stärker mit ihrer Umgebung in Kontakt treten, vergrößern im Verlauf des Beobachtungszeitraumes den Abstand zwischen Zellmembran und Oberfläche, reduzieren jedoch ihre Zell-Substratkontaktfläche kaum. Mausfibroblasten hingegen verkleinern drastisch die Zelladhäsionsfläche. Der Ablösungsprozess wird vermutlich aktiv von den Zellen gesteuert. Diese Annahme wird durch zwei Beobachtungen gestützt: Erstens verläuft die Reduktion der Zelladhäsionsfläche bei Einschränkung des Zellmetabolismus durch eine Temperatursenkung auf 4 °C verzögert. Zweitens hinterlassen die Zellen Spuren, die nach dem Ablösen der Zellen auf den Oberflächen zurückbleiben. Mittels Kombination von TIRAF- und TIRF-Mikroskopie werden die Zelladhäsionsfläche und die Aktinstruktur gleichzeitig beobachtet. Die Verknüpfung beider Methoden stellt eine neue Möglichkeit dar, intrazelluläre Prozesse mit der Zellablösung von thermo-responsiven Oberflächen zu korrelieren.
Die gesundheitsfördernden Eigenschaften von grünem Tee sind weitgehend akzeptiert. Den Teecatechinen, insbesondere dem Epigallocatechin-3-gallat (EGCG), werden zahlreiche positive Effekte zugesprochen (z. B. antioxidativ, antikanzerogen, antiinflammatorisch, Blutdruck und Cholesterinspiegel senkend). Die Mechanismen, die zu einer Reduktion der in Tierversuchen beschriebenen Körper- und Fettmasse führen, sind nicht ausreichend geklärt. Ziel dieser Arbeit bestand darin, die kurz- und mittelfristigen Wirkungen einer TEAVIGO®-Applikation (mind. 94 % EGCG) am Mausmodell im Hinblick auf den Energie- und Fettstoffwechsel sowie die Expression daran beteiligter Gene in wichtigen Organen und Geweben zu untersuchen. In verschiedenen Tierversuchen wurde männlichen C57BL/6-Mäusen eine Hochfettdiät (HFD) mit und ohne Supplementation (oral, diätetisch) des entkoffeinierten Grüntee-Extraktes TEAVIGO® in unterschiedlichen Dosierungen gefüttert. Es wurden sowohl kurz- als auch mittelfristige Wirkungen des EGCG auf die Energiebilanz (u. a. indirekte Tierkalorimetrie) und Körperzusammensetzung (NMR) sowie die exogene Substratoxidation (Stabilisotopentechnik: Atemtests, Inkorporation natürlicher 13C-angereicherter Triglyceride aus Maiskeimöl in diverse Organe/Gewebe) und Gen-expression (quantitative real-time PCR) untersucht. Die Applikationsform und ihre Dauer riefen unterschiedliche Wirkungen hervor. Mäuse mit diätetischer Supplementation zeigten bereits nach kurzer Zeit eine verminderte Körperfettmasse, die bei weiterer Verabreichung auch zu einer Reduktion der Körpermasse führte. Beide Applikationsformen resultieren, unabhängig von der Dauer der Intervention, in einer erhöhten Energieausscheidung, während die Futter- und Energieaufnahme durch EGCG nicht beeinflusst wurden. Der Energieverlust war von einer erhöhten Fett- und Stickstoffausscheidung begleitet, deren Ursache die in der Literatur beschriebene Interaktion und Hemmung digestiver Enzyme sein könnte. Besonders unter postprandialen Bedingungen wiesen EGCG-Mäuse erniedrigte Triglycerid- und Glycogengehalte in der Leber auf, was auf eine eingeschränkte intestinale Absorption der Nährstoffe hindeutet. Transkriptanalysen ergaben im Darm eine verminderte Expression von Fettsäuretransportern, während die Expression von Glucosetransportern durch EGCG erhöht wurde. Weiterhin reduzierte EGCG, nach Umstellung von Standard- auf eine maiskeimölhaltige Hochfettdiät, die Inkorporation natürlicher 13C-angereicherter Triglyceride in diverse Organe und Gewebe – insbesondere Leber, viszerales und braunes Fettgewebe sowie Skelettmuskel. Die Analyse der 13C-Anreicherung im Atem der Mäuse und die Energieumsatzmessungen ergaben nach kurzer Applikation eine erhöhte Fettoxidation, die im weiteren Verlauf der Intervention auf eine erhöhte Kohlenhydratoxidation umgeschaltet wurde. Weiterhin war die orale Applikation von EGCG bei gleichzeitiger Fütterung einer Hochfettdiät von makroskopischen und mikroskopischen degenerativen Veränderungen der Leber begleitet. Diese Effekte wurden nach diätetischer Supplementation der Hochfettdiät mit EGCG nicht beobachtet. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Körpergewichts- und Fettgewebs-abnahme durch diätetisches EGCG sich durch eine herabgesetzte Verdaulichkeit der Nahrung erklären lässt. Dies führte zu verschiedenen kurz- und mittelfristigen Veränderungen in der Fettverteilung und im Fettmetabolismus.
In dieser Arbeit wurden die Möglichkeiten und Grenzen für Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung untersucht. Dazu wurde ein Messaufbau für Zirkulardichroismus-Messungen an zwei Strahlrohren am Berliner Elektronenspeicherring für Synchrotronstrahlung eingesetzt, die für Messungen im Bereich des ultravioletten Lichts geeignet sind. Eigenschaften der Strahlrohre und des Messaufbau wurden in einigen wichtigen Punkten mit kommerziellen Zirkulardichroismus-Spektrometern verglichen. Der Schwerpunkt lag auf der Ausdehnung des zugänglichen Wellenlängenbereichs unterhalb von 180 nm zur Untersuchung des Zirkulardichroismus von Proteinen in diesem Bereich. In diesem Bereich ist es nicht nur die Lichtquelle sondern vor allem die Absorption des Lichts durch Wasser, die den Messbereich bei der Messung biologischer Proben in wässriger Lösung einschränkt. Es wurden Bedingungen gefunden, unter denen der Messbereich auf etwa 160 nm, in einigen Fällen bis auf 130 nm ausgedehnt werden konnte. Dazu musste die Pfadlänge deutlich reduziert werden und verschieden Probenküvetten wurden getestet. Der Einfluss der dabei auftretenden Spannungsdoppelbrechung in den Probenküvetten auf das Messsignal konnte mit einem alternativen Messaufbau deutlich reduziert werden. Systematische Fehler im Messsignal und auftretende Strahlenschäden begrenzen jedoch die Zuverlässigkeit der gemessenen Spektren. Bei Proteinfilmen schränkt die Absorption von Wasser den Messbereich kaum ein. Es wurden jedoch meist deutliche Unterschiede zwischen den Spektren von Proteinfilmen und den Spektren von Proteinen in wässriger Lösung festgestellt. Solange diese Unterschiede nicht minimiert werden können, stellen Proteinfilme keine praktikable Alternative zu Messungen in wässriger Lösung dar.