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Human and murine studies identified the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase (ASM) as a target for antidepressant therapy and revealed its role in the pathophysiology of major depression. In this study, we generated a mouse model with overexpression of Asm (Asm-tg(fb)) that is restricted to the forebrain to rule out any systemic effects of Asm overexpression on depressive-like symptoms. The increase in Asm activity was higher in male Asm-tg(fb) mice than in female Asm-tg(fb) mice due to the breeding strategy, which allows for the generation of wild-type littermates as appropriate controls. Asm overexpression in the forebrain of male mice resulted in a depressive-like phenotype, whereas in female mice, Asm overexpression resulted in a social anxiogenic-like phenotype. Ceramides in male Asm-tg(fb) mice were elevated specifically in the dorsal hippocampus. mRNA expression analyses indicated that the increase in Asm activity affected other ceramide-generating pathways, which might help to balance ceramide levels in cortical brain regions. This forebrain-specific mouse model offers a novel tool for dissecting the molecular mechanisms that play a role in the pathophysiology of major depression.
Gut bacteria exert beneficial and harmful effects in metabolic diseases as deduced from the comparison of germfree and conventional mice and from fecal transplantation studies. Compositional microbial changes in diseased subjects have been linked to adiposity, type 2 diabetes and dyslipidemia. Promotion of an increased expression of intestinal nutrient transporters or a modified lipid and bile acid metabolism by the intestinal microbiota could result in an increased nutrient absorption by the host. The degradation of dietary fiber and the subsequent fermentation of monosaccharides to short-chain fatty acids (SCFA) is one of the most controversially discussed mechanisms of how gut bacteria impact host physiology. Fibers reduce the energy density of the diet, and the resulting SCFA promote intestinal gluconeogenesis, incretin formation and subsequently satiety. However, SCFA also deliver energy to the host and support liponeogenesis. Thus far, there is little knowledge on bacterial species that promote or prevent metabolic disease. Clostridium ramosum and Enterococcus cloacae were demonstrated to promote obesity in gnotobiotic mouse models, whereas bifidobacteria and Akkermansia muciniphila were associated with favorable phenotypes in conventional mice, especially when oligofructose was fed. How diet modulates the gut microbiota towards a beneficial or harmful composition needs further research. Gnotobiotic animals are a valuable tool to elucidate mechanisms underlying diet-host-microbe interactions.
Sekundäre Pflanzenstoffe und ihre gesundheitsfördernden Eigenschaften sind in den letzten zwei Jahrzehnten vielfach ernährungsphysiologisch untersucht und spezifische positive Effekte im humanen Organismus zum Teil sehr genau beschrieben worden. Zu den Carotinoiden zählend ist der sekundäre Pflanzenstoff Lutein insbesondere in der Prävention von ophthalmologischen Erkrankungen in den Mittelpunkt der Forschung gerückt. Das ausschließlich von Pflanzen und einigen Algen synthetisierte Xanthophyll wird über die pflanzliche Nahrung insbesondere grünes Blattgemüse in den humanen Organismus aufgenommen. Dort akkumuliert es bevorzugt im Makulapigment der Retina des menschlichen Auges und ist bedeutend im Prozess der Aufrechterhaltung der Funktionsfähigkeit der Photorezeptorzellen. Im Laufe des Alterns kann die Abnahme der Dichte des Makulapigments und der Abbau von Lutein beobachtet werden. Die dadurch eintretende Destabilisierung der Photorezeptorzellen im Zusammenhang mit einer veränderten Stoffwechsellage im alternden Organismus kann zur Ausprägung der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) führen. Die pathologische Symptomatik der Augenerkrankung reicht vom Verlust der Sehschärfe bis hin zum irreversiblen Erblinden. Da therapeutische Mittel ausschließlich ein Fortschreiten verhindern, bestehen hier Forschungsansätze präventive Maßnahmen zu finden. Die Supplementierung von luteinhaltigen Präparaten bietet dabei einen Ansatzpunkt. Auf dem Markt finden sich bereits Nahrungsergänzungsmittel (NEM) mit Lutein in verschiedenen Applikationen. Limitierend ist dabei die Stabilität und Bioverfügbarkeit von Lutein, welches teilweise kostenintensiv und mit unbekannter Reinheit zu erwerben ist. Aus diesem Grund wäre die Verwendung von Luteinestern als die pflanzliche Speicherform des Luteins im Rahmen eines NEMs vorteilhaft. Neben ihrer natürlichen, höheren Stabilität sind Luteinester nachhaltig und kostengünstig einsetzbar.
In dieser Arbeit wurden physikochemische und ernährungsphysiologisch relevante Aspekte in dem Produktentwicklungsprozess eines NEMs mit Luteinestern in einer kolloidalen Formulierung untersucht. Die bisher einzigartige Anwendung von Luteinestern in einem Mundspray sollte die Aufnahme des Wirkstoffes insbesondere für ältere Menschen erleichtern und verbessern. Unter Beachtung der Ergebnisse und der ernährungsphysiologischen Bewertung sollten u.a. Empfehlungen für die Rezepturzusammensetzungen einer Miniemulsion (Emulsion mit Partikelgrößen <1,0 µm) gegeben werden. Eine Einschätzung der Bioverfügbarkeit der Luteinester aus den entwickelten, kolloidalen Formulierungen konnte anhand von Studien zur Resorption- und Absorptionsverfügbarkeit in vitro ermöglicht werden.
In physikalischen Untersuchungen wurden zunächst Basisbestandteile für die Formulierungen präzisiert. In ersten wirkstofffreien Musteremulsionen konnten ausgewählte Öle als Trägerphase sowie Emulgatoren und Löslichkeitsvermittler (Peptisatoren) hinsichtlich ihrer Eignung zur Bereitstellung einer Miniemulsion physikalisch geprüft werden. Die beste Stabilität und optimale Eigenschaften einer Miniemulsion zeigten sich bei der Verwendung von MCT-Öl (engl. medium chain triglyceride) bzw. Rapsöl in der Trägerphase sowie des Emulgators Tween® 80 (Tween 80) allein oder in Kombination mit dem Molkenproteinhydrolysat Biozate® 1 (Biozate 1).
Aus den physikalischen Untersuchungen der Musteremulsionen gingen die Präemulsionen als Prototypen hervor. Diese enthielten den Wirkstoff Lutein in verschiedenen Formen. So wurden Präemulsionen mit Lutein, mit Luteinestern sowie mit Lutein und Luteinestern konzipiert, welche den Emulgator Tween 80 oder die Kombination mit Biozate 1 enthielten. Bei der Herstellung der Präemulsionen führte die Anwendung der Emulgiertechniken Ultraschall mit anschließender Hochdruckhomogenisation zu den gewünschten Miniemulsionen. Beide eingesetzten Emulgatoren boten optimale Stabilisierungseffekte. Anschließend erfolgte die physikochemische Charakterisierung der Wirkstoffe. Insbesondere Luteinester aus Oleoresin erwiesen sich hier als stabil gegenüber verschiedenen Lagerungsbedingungen. Ebenso konnte bei einer kurzzeitigen Behandlung der Wirkstoffe unter spezifischen mechanischen, thermischen, sauren und basischen Bedingungen eine Stabilität von Lutein und Luteinestern gezeigt werden. Die Zugabe von Biozate 1 bot dabei nur für Lutein einen zusätzlichen Schutz. Bei längerer physikochemischer Behandlung unterlagen die in den Miniemulsionen eingebrachten Wirkstoffe moderaten Abbauvorgängen. Markant war deren Sensitivität gegenüber dem basischen Milieu. Im Rahmen der Rezepturentwicklung des NEMs war hier die Empfehlung, eine Miniemulsion mit einem leicht saurem pH-Milieu zum Schutz des Wirkstoffes durch kontrollierte Zugabe weiterer Inhaltstoffe zu gestalten.
Im weiteren Entwicklungsprozess des NEMs wurden Fertigrezepturen mit dem Wirkstoff Luteinester aufgestellt. Die alleinige Anwendung des Emulgators Biozate 1 zeigte sich dabei als ungeeignet. Die weiterhin zur Verfügung stehenden Fertigrezepturen enthielten in der Öl-phase neben dem Wirkstoff das MCT-ÖL oder Rapsöl sowie a-Tocopherol zur Stabilisierung. Die Wasserphase bestand aus dem Emulgator Tween 80 oder einer Kombination aus Tween 80 und Biozate 1. Zusatzstoffe waren zudem als mikrobiologischer Schutz Ascorbinsäure und Kaliumsorbat sowie für sensorische Effekte Xylitol und Orangenaroma. Die Anordnung der Basisrezeptur und das angewendete Emulgierverfahren lieferten stabile Miniemulsionen. Weiterhin zeigten langfristige Lagerungsversuche mit den Fertigrezepturen bei 4°C, dass eine Aufrechterhaltung der geforderten Luteinestermenge im Produkt gewährleistet war. Analoge Untersuchungen an einem luteinhaltigen, marktgängigen Präparat bestätigten dagegen eine bereits bei kurzfristiger Lagerung auftretende Instabilität von Lutein.
Abschließend wurde durch Resorptions- und Absorptionsstudien in vitro mit den Präemulsionen und Fertigrezepturen die Bioverfügbarkeit von Luteinestern geprüft. Nach Behandlung in einem etablierten in vitro Verdaumodell konnte eine geringfügige Resorptionsverfügbarkeit der Luteinester definiert werden. Limitiert war eine Micellarisierung des Wirkstoffes aus den konzipierten Formulierungen zu beobachten. Eine enzymatische Spaltung der Luteinester zu freiem Lutein wurde nur begrenzt festgestellt. Spezifität und Aktivität von entsprechenden hydrolytischen Lipasen sind als äußerst gering gegenüber Luteinestern zu bewerten. In sich anschließenden Zellkulturversuchen mit der Zelllinie Caco-2 wurden keine zytotoxischen Effekte durch die relevanten Inhaltsstoffe in den Präemulsionen gezeigt. Dagegen konnten eine Sensibilität gegenüber den Fertigrezepturen beobachtet werden. Diese sollte im Zusammenhang mit Irritationen der Schleimhäute des Magen-Darm-Traktes bedacht werden. Eine weniger komplexe Rezeptur könnte die beobachteten Einschränkungen möglicherweise minimieren. Abschließende Absorptionsstudien zeigten, dass grundsätzlich eine geringfügige Aufnahme von vorrangig Lutein, aber auch Luteinmonoestern in den Enterocyten aus Miniemulsionen erfolgen kann. Dabei hatte weder Tween 80 noch Biozate 1 einen förderlichen Einfluss auf die Absorptionsrate von Lutein oder Luteinestern. Die Metabolisierung der Wirkstoffe durch vorherigen in vitro-Verdau steigerte die zelluläre Aufnahme von Wirkstoffen aus Formulierungen mit Lutein und Luteinestern gleichermaßen. Die beobachtete Aufnahme von Lutein und Luteinmonoestern in den Enterocyten scheint über passive Diffusion zu erfolgen, wobei auch der aktive Transport nicht ausgeschlossen werden kann. Dagegen können Luteindiester aufgrund ihrer Molekülgröße nicht über den Weg der Micellarisierung und einfachen Diffusion in die Enterocyten gelangen. Ihre Aufnahme in die Dünndarmepithelzellen bedarf einer vorherigen hydrolytischen Spaltung durch spezifische Lipasen. Dieser Schritt limitiert wiederum die effektive Aufnahme der Luteinester in die Zellen bzw. stellt eine Einschränkung in ihrer Bioverfügbarkeit im Vergleich zu freiem Lutein dar.
Zusammenfassend konnte für die physikochemisch stabilen Luteinester eine geringe Bioverfügbarkeit aus kolloidalen Formulierungen gezeigt werden. Dennoch ist die Verwendung als Wirkstoffquelle für den sekundären Pflanzenstoff Lutein in einem NEM zu empfehlen. Im Zusammenhang mit der Aufnahme von luteinreichen, pflanzlichen Lebensmitteln kann trotz der zu erwartenden geringen Bioverfügbarkeit der Luteinester aus dem NEM ein Beitrag zur Verbesserung des Luteinstatus erreicht werden. Entsprechende Publikationen zeigten eindeutige Korrelationen zwischen der Aufnahme von luteinesterhaltigen Präparaten und einem Anstieg der Luteinkonzentration im Serum bzw. der Makulapigmentdichte in vivo. Die geringfügig bessere Bioverfügbarkeit von freiem Lutein steht im kritischen Zusammenhang mit seiner Instabilität und Kostenintensität. Bilanzierend wurde im Rahmen dieser Arbeit das marktgängige Produkt Vita Culus® konzipiert. Im Ausblick sollten humane Interventionsstudien mit dem NEM die abschließende Bewertung der Bioverfügbarkeit von Luteinestern aus dem Präparat möglich machen.
Background: Consumption of whole-grain, coffee, and red meat were consistently related to the risk of developing type 2 diabetes in prospective cohort studies, but potentially underlying biological mechanisms are not well understood. Metabolomics profiles were shown to be sensitive to these dietary exposures, and at the same time to be informative with respect to the risk of type 2 diabetes. Moreover, graphical network-models were demonstrated to reflect the biological processes underlying high-dimensional metabolomics profiles.
Aim: The aim of this study was to infer hypotheses on the biological mechanisms that link consumption of whole-grain bread, coffee, and red meat, respectively, to the risk of developing type 2 diabetes. More specifically, it was aimed to consider network models of amino acid and lipid profiles as potential mediators of these risk-relations.
Study population: Analyses were conducted in the prospective EPIC-Potsdam cohort (n = 27,548), applying a nested case-cohort design (n = 2731, including 692 incident diabetes cases). Habitual diet was assessed with validated semiquantitative food-frequency questionnaires. Concentrations of 126 metabolites (acylcarnitines, phosphatidylcholines, sphingomyelins, amino acids) were determined in baseline-serum samples. Incident type 2 diabetes cases were assed and validated in an active follow-up procedure. The median follow-up time was 6.6 years.
Analytical design: The methodological approach was conceptually based on counterfactual causal inference theory. Observations on the network-encoded conditional independence structure restricted the space of possible causal explanations of observed metabolomics-data patterns. Given basic directionality assumptions (diet affects metabolism; metabolism affects future diabetes incidence), adjustment for a subset of direct neighbours was sufficient to consistently estimate network-independent direct effects. Further model-specification, however, was limited due to missing directionality information on the links between metabolites. Therefore, a multi-model approach was applied to infer the bounds of possible direct effects. All metabolite-exposure links and metabolite-outcome links, respectively, were classified into one of three categories: direct effect, ambiguous (some models indicated an effect others not), and no-effect.
Cross-sectional and longitudinal relations were evaluated in multivariable-adjusted linear regression and Cox proportional hazard regression models, respectively. Models were comprehensively adjusted for age, sex, body mass index, prevalence of hypertension, dietary and lifestyle factors, and medication.
Results: Consumption of whole-grain bread was related to lower levels of several lipid metabolites with saturated and monounsaturated fatty acids. Coffee was related to lower aromatic and branched-chain amino acids, and had potential effects on the fatty acid profile within lipid classes. Red meat was linked to lower glycine levels and was related to higher circulating concentrations of branched-chain amino acids. In addition, potential marked effects of red meat consumption on the fatty acid composition within the investigated lipid classes were identified.
Moreover, potential beneficial and adverse direct effects of metabolites on type 2 diabetes risk were detected. Aromatic amino acids and lipid metabolites with even-chain saturated (C14-C18) and with specific polyunsaturated fatty acids had adverse effects on type 2 diabetes risk. Glycine, glutamine, and lipid metabolites with monounsaturated fatty acids and with other species of polyunsaturated fatty acids were classified as having direct beneficial effects on type 2 diabetes risk.
Potential mediators of the diet-diabetes links were identified by graphically overlaying this information in network models. Mediation analyses revealed that effects on lipid metabolites could potentially explain about one fourth of the whole-grain bread effect on type 2 diabetes risk; and that effects of coffee and red meat consumption on amino acid and lipid profiles could potentially explain about two thirds of the altered type 2 diabetes risk linked to these dietary exposures.
Conclusion: An algorithm was developed that is capable to integrate single external variables (continuous exposures, survival time) and high-dimensional metabolomics-data in a joint graphical model. Application to the EPIC-Potsdam cohort study revealed that the observed conditional independence patterns were consistent with the a priori mediation hypothesis: Early effects on lipid and amino acid metabolism had the potential to explain large parts of the link between three of the most widely discussed diabetes-related dietary exposures and the risk of developing type 2 diabetes.
Housing in metabolic cages can induce a pronounced stress response. Metabolic cage systems imply housing mice on metal wire mesh for the collection of urine and feces in addition to monitoring food and water intake. Moreover, mice are single-housed, and no nesting, bedding, or enrichment material is provided, which is often argued to have a not negligible impact on animal welfare due to cold stress. We therefore attempted to reduce stress during metabolic cage housing for mice by comparing an innovative metabolic cage (IMC) with a commercially available metabolic cage from Tecniplast GmbH (TMC) and a control cage. Substantial refinement measures were incorporated into the IMC cage design. In the frame of a multifactorial approach for severity assessment, parameters such as body weight, body composition, food intake, cage and body surface temperature (thermal imaging), mRNA expression of uncoupling protein 1 (Ucp1) in brown adipose tissue (BAT), fur score, and fecal corticosterone metabolites (CMs) were included. Female and male C57BL/6J mice were single-housed for 24 h in either conventional Macrolon cages (control), IMC, or TMC for two sessions. Body weight decreased less in the IMC (females—1st restraint: 6.94%; 2nd restraint: 6.89%; males—1st restraint: 8.08%; 2nd restraint: 5.82%) compared to the TMC (females—1st restraint: 13.2%; 2nd restraint: 15.0%; males—1st restraint: 13.1%; 2nd restraint: 14.9%) and the IMC possessed a higher cage temperature (females—1st restraint: 23.7°C; 2nd restraint: 23.5 °C; males—1st restraint: 23.3 °C; 2nd restraint: 23.5 °C) compared with the TMC (females—1st restraint: 22.4 °C; 2nd restraint: 22.5 °C; males—1st restraint: 22.6 °C; 2nd restraint: 22.4 °C). The concentration of fecal corticosterone metabolites in the TMC (females—1st restraint: 1376 ng/g dry weight (DW); 2nd restraint: 2098 ng/g DW; males—1st restraint: 1030 ng/g DW; 2nd restraint: 1163 ng/g DW) was higher compared to control cage housing (females—1st restraint:
640 ng/g DW; 2nd restraint: 941 ng/g DW; males—1st restraint: 504 ng/g DW; 2nd restraint: 537 ng/g DW). Our results show the stress potential induced by metabolic cage restraint that is markedly influenced by the lower housing temperature. The IMC represents a first attempt to target cold stress reduction during metabolic cage application thereby producing more animal welfare friendly data.
As an essential trace element, copper plays a pivotal role in physiological body functions. In fact, dysregulated copper homeostasis has been clearly linked to neurological disorders including Wilson and Alzheimer’s disease. Such neurodegenerative diseases are associated with progressive loss of neurons and thus impaired brain functions. However, the underlying mechanisms are not fully understood. Characterization of the element species and their subcellular localization is of great importance to uncover cellular mechanisms. Recent research activities focus on the question of how copper contributes to the pathological findings. Cellular bioimaging of copper is an essential key to accomplish this objective. Besides information on the spatial distribution and chemical properties of copper, other essential trace elements can be localized in parallel. Highly sensitive and high spatial resolution techniques such as LA-ICP-MS, TEM-EDS, S-XRF and NanoSIMS are required for elemental mapping on subcellular level. This review summarizes state-of-the-art techniques in the field of bioimaging. Their strengths and limitations will be discussed with particular focus on potential applications for the elucidation of copper-related diseases. Based on such investigations, further information on cellular processes and mechanisms can be derived under physiological and pathological conditions. Bioimaging studies might enable the clarification of the role of copper in the context of neurodegenerative diseases and provide an important basis to develop therapeutic strategies for reduction or even prevention of copper-related disorders and their pathological consequences.
Investigation of processes that contribute to the maintenance of genomic stability is one crucial factor in the attempt to understand mechanisms that facilitate ageing. The DNA damage response (DDR) and DNA repair mechanisms are crucial to safeguard the integrity of DNA and to prevent accumulation of persistent DNA damage. Among them, base excision repair (BER) plays a decisive role. BER is the major repair pathway for small oxidative base modifications and apurinic/apyrimidinic (AP) sites. We established a highly sensitive non-radioactive assay to measure BER incision activity in murine liver samples. Incision activity can be assessed towards the three DNA lesions 8-oxo-2’-deoxyguanosine (8-oxodG), 5-hydroxy-2’-deoxyuracil (5-OHdU), and an AP site analogue. We applied the established assay to murine livers of adult and old mice of both sexes. Furthermore, poly(ADP-ribosyl)ation (PARylation) was assessed, which is an important determinant in DDR and BER. Additionally, DNA damage levels were measured to examine the overall damage levels. No impact of ageing on the investigated endpoints in liver tissue were found. However, animal sex seems to be a significant impact factor, as evident by sex-dependent alterations in all endpoints investigated. Moreover, our results revealed interrelationships between the investigated endpoints indicative for the synergetic mode of action of the cellular DNA integrity maintaining machinery.
Sphingolipids are a class of lipids that share a sphingoid base backbone. They exert various effects in eukaryotes, ranging from structural roles in plasma membranes to cellular signaling. De novo sphingolipid synthesis takes place in the endoplasmic reticulum (ER), where the condensation of the activated C₁₆ fatty acid palmitoyl-CoA and the amino acid L-serine is catalyzed by serine palmitoyltransferase (SPT). The product, 3-ketosphinganine, is then converted into more complex sphingolipids by additional ER-bound enzymes, resulting in the formation of ceramides. Since sphingolipid homeostasis is crucial to numerous cellular functions, improved assessment of sphingolipid metabolism will be key to better understanding several human diseases. To date, no assay exists capable of monitoring de novo synthesis sphingolipid in its entirety. Here, we have established a cell-free assay utilizing rat liver microsomes containing all the enzymes necessary for bottom-up synthesis of ceramides. Following lipid extraction, we were able to track the different intermediates of the sphingolipid metabolism pathway, namely 3-ketosphinganine, sphinganine, dihydroceramide, and ceramide. This was achieved by chromatographic separation of sphingolipid metabolites followed by detection of their accurate mass and characteristic fragmentations through high-resolution mass spectrometry and tandem-mass spectrometry. We were able to distinguish, unequivocally, between de novo synthesized sphingolipids and intrinsic species, inevitably present in the microsome preparations, through the addition of stable isotope-labeled palmitate-d₃ and L-serine-d₃. To the best of our knowledge, this is the first demonstration of a method monitoring the entirety of ER-associated sphingolipid biosynthesis. Proof-of-concept data was provided by modulating the levels of supplied cofactors (e.g., NADPH) or the addition of specific enzyme inhibitors (e.g., fumonisin B₁). The presented microsomal assay may serve as a useful tool for monitoring alterations in sphingolipid de novo synthesis in cells or tissues. Additionally, our methodology may be used for metabolism studies of atypical substrates – naturally occurring or chemically tailored – as well as novel inhibitors of enzymes involved in sphingolipid de novo synthesis.
Der Fettsäurestoffwechsel unterliegt vielfältigen Kontrollmechanismen. So wird der Fettsäureabbau über die Induktion und Aktivität spezifischer Enzyme reguliert. Ein zentraler Regulator ist dabei der nukleäre Rezeptor Peroxisomenproliferator-aktivierter-Rezeptor-α (PPARα). PPARα wird durch freie Fettsäuren in der Zelle aktiviert und fördert über die Induktion von Zielgenen den Fettsäuretransport und -abbau sowie die Gluconeogenese und Ketogenese. Der Anstieg an freien Fettsäuren beim Fasten, aber auch im Diabetes aktiviert PPARα. Unabhängig davon wurde in beiden Stoffwechsellagen auch eine erhöhte Expression des nukleären Rezeptors Constitutiver-Androstan-Rezeptor (CAR) und einiger CAR-Zielgene, vorrangig Enzyme des Fremdstoffmetabolismus wie Cytochrom P450 2B (CYP2B), festgestellt. Bei der Adaption an eine Fastensituation scheinen PPARα- und CAR-Signalwege über einen bisher unbekannten Mechanismus miteinander verschaltet zu sein. In der vorliegenden Arbeit sollte der der Verschaltung zugrunde liegende Mechanismus anhand eines Modelsystems, der PPARα-Agonisten-vermittelten Verstärkung der Phenobarbital (PB)-abhängigen Induktion des CAR-Zielgens CYP2B, in vitro untersucht werden. Zudem sollte die physiologische Relevanz einer durch PPARα-Agonisten vermittelten Modulierung der CYP2B-Aktivität in einer Ganztierstudie in vivo belegt werden. Die verwendeten synthetischen PPARα-Agonisten steigerten in primären Hepatozyten der Ratte signifikant die Phenobarbital (PB)-abhängige mRNA- und Protein-Expression sowie die Aktivität von CYP2B. Ohne vorherige PB-Behandlung induzierten PPARα-Agonisten CYP2B nicht. In Gegenwart von PB war die Steigerung der CYP2B-Aktivität durch PPARα-Agonisten dosisabhängig. In einem Luciferase-Reportergenassay wurde gezeigt, dass die Induktion durch PB unter der Kontrolle des CYP2B1-Promotors von einem distalen PBREM (PB-responsive-enhancer-module), an welches CAR binden kann, abhängig war. PPARα-Agonisten steigerten diese PB- und PBREM-abhängige Reportergentranskription und induzierten die CAR-mRNA und CAR-Proteinexpression. Sie aktivierten die Transkription eines Reportergens unter der Kontrolle eines Promotorfragments von bis zu 4,4 kb oberhalb des mutmaßlichen CAR-Transkriptionsstarts. Mit Hilfe von Deletionskonstrukten konnte ein potentielles Peroxisomenproliferator-aktivierter-Rezeptor-responsives Element (PPRE) im CAR-Promotorbereich von -942 bp bis -930 bp identifiziert werden, welches essentiell für die Initiation der Transkription durch PPARα-Agonisten ist. In band shift Experimenten akkumulierte verstärkt Kernprotein mit diesem PPRE. Ein Überschuss an unmarkiertem Wildtyp-CAR-Reportergenvektor, nicht aber an CAR-Reportergenvektor mit PPRE-Deletion, konnte mit dem markierten PPRE um die Bindung von Kernprotein konkurrieren. Nach Chromatin-Immunpräzipitation mit einem PPARα-Antikörper wiederum wurde das betreffende PPRE amplifiziert. Bei in vivo Experimenten an männlichen Ratten resultierte die Behandlung mit PPARα-Agonisten in einer signifikanten Induktion der CAR-mRNA-Expression und signifikant erhöhter PB-abhängiger CYP2B-Aktivität. Die physiologisch Relevanz wurde durch weiterführenden Experimente unterstrichen, in denen gezeigt wurde, dass die Fasten-abhängige Induktion von CAR in PPARα-defizienten Mäusen unterdrückt war. Diese Experimente legen nahe, dass durch PPARα-Agonisten aktiviertes PPARα an das PPRE im CAR-Promotorbereich von -942 bp bis -930 bp bindet und dadurch die CAR-Transkription induziert. Somit kann CAR als PPARα-Zielgen betrachtet werden, was die Schlussfolgerung zulässt, dass die PPARα- und CAR-Signalwege über die direkte Bindung von PPARα an den CAR-Promotor unmittelbar miteinander verknüpft sind. Allerdings ist davon unabhängig eine Aktivierung von CAR, etwa durch PB, für die vermehrte Induktion von CAR-Zielgenen notwendig . Die physiologische Relevanz der PPARα-abhängige CAR-Expression zeigt sich in den Ganztierexperimenten, bei denen die Wirksamkeit der PPARα-Agonisten bestätigt werden konnte. CAR-abhängig induzierte Enzyme sind nicht nur in großem Umfang am Fremdstoffmetabolismus beteiligt, sondern auch am Abbau von Schilddrüsenhormonen und Glucocorticoiden. Sie können damit direkt Einfluss auf den Kohlenhydrat- und Energiestoffwechsel sowie die Regulation der Nahrungsaufnahme nehmen. Über eine PPARα-abhängige Induktion von CAR im Rahmen der Fastenadaption könnten die CAR-Zielgene UDP-Glucuronyltransferase 1A1 und Sulfotransferase N beispielsweise verstärkt Schilddrüsenhormone abbauen und in der Folge den Grundumsatz senken. Der in dieser Arbeit erstmals beschriebene Mechanismus ist dafür von zentraler Bedeutung.
Die Induktion antioxidativer Enzyme gilt als eine Möglichkeit, die antioxidative Kapazität von Zellen zu steigern und dadurch mit oxidativem Stress assoziierten Erkrankungen (z. B. Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Neurodegeneration, Atherosklerose) vorzubeugen. Ausgehend davon wurde in der vorliegenden Arbeit der Dual-Luciferase-Reportergen-(DLR)-Assay zum Nachweis der Induktion der antioxidativen Enzyme Katalase (CAT), zytosolische Glutathion-Peroxidase (GPX1) und Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase (SOD1) entwickelt. Im Zuge dessen wurden drei Säugetierzelllinien (CaCo2, IEC-18, V79) auf ihre Eignung zur Modellzelllinie untersucht. Aufgrund der Transfektionseffizienz wurde die Fibroblastenzelllinie V79 ausgewählt. Zur Gewährleistung eines hohen Substanzdurchsatzes des DLR-Assays wurden bei der Etablierung Parameter wie Kulturplattenformat, DNA-Menge, Luciferasen-Kinetik berücksichtigt. Nach erfolgreicher Etablierung des Versuchs im 96-Well-Format wurden L-Carnitin, Catechin, Epigallocatechingallat, Genistein, Wasserstoffperoxid (H2O2), Natrium-Ascorbat, Paraquat, Quercetin, 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA) und Trolox in nicht-zytotoxischen Konzentrationen hinsichtlich der Aktivierung des Ratten-CAT-, des humanen GPX1- und des humanen SOD1-Promotors untersucht. Die Bestimmung der maximal tolerierbaren Behandlungskonzentration erfolgte im Vorfeld mittels Resazurintest. Von den zehn Verbindungen zeichneten sich drei Substanzen als potente Induktoren für die SOD1 und die GPX1 aus. Die 24-stündige Behandlung von mit Reportergenkonstrukten transient transfizierten V79-Zellen mit 100 µM Paraquat resultierte in einer Verdopplung der relativen SOD1-Promotor-Aktivität und einer Erhöhung der relativen GPX1-Promotor-Aktivität auf 1,6 bzw. 1,7. Die Stimulation mit 20 µM Genistein oder 10 µM Quercetin führte wiederum zu einer Verdopplung bis Verdreifachung der relativen SOD1- und GPX1-Promotor-Aktivität. Der Promotor der Rattenkatalase konnte demgegenüber nur durch 50 µM H2O2 aktiviert werden (1,5fach). Für diesen DLR-Assays bieten sich folglich Genistein, Quercetin wie auch H2O2 als Referenzsubstanzen an. Um aber eine qualitative Charakterisierung der einzelnen Verbindungen hinsichtlich ihres Induktionspotentials zu gewährleisten, sollten von allen getesteten Substanzen Dosis-Wirkungskurven aufgenommen werden. Zudem wird für den routinemäßigen Einsatz die Verwendung stabil transfizierter Zellen zur Vermeidung von mit der Transfektion verbundenen experimentellen Schwankungen empfohlen.