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Der Embryonale Stammzelltest (EST) ist ein validierter In-vitro-Embryotoxizitätstest, der zur Untersuchung embryotoxischer Wirkungen von Chemikalien eingesetzt werden kann. Während des zehntägigen Differenzierungsassays differenzieren sich die pluripotenten murinen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) der Linie D3 in vitro in spontan kontrahierende Herzmuskelzellen. Dabei rekapitulieren sie Prozesse der frühen Embryogenese in vivo. Ein Zytotoxizitätsassay mit D3-Zellen und ausdifferenzierten, adulten 3T3-Maus-Fibroblasten dient der Ermittlung allgemeiner zytotoxischer Effekte und unterschiedlicher Sensitivitäten beider Zelllinien. Somit basiert der EST auf den beiden wichtigsten Mechanismen pränataler Toxizität, der Störung der Differenzierung und der Zytotoxizität. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe des EST das embryotoxische Potential der vier Chemikalien Trichostatin A (TSA), Methylazoxymethanolacetat (MAMac), Natriumdodecylsulfat (SDS) und Benzoesäure (BA) abzuschätzen. Dazu wurde mikroskopisch ermittelt, bei welcher Testsubstanzkonzentration in 50 % der während der In-vitro-Differenzierung gebildeten Embryonalkörperchen die Kardiomyozytendifferenzierung inhibiert wird (ID50). Außerdem wurde die halbmaximale Hemmkonzentration des Zellwachstums auf die beiden Zelllinien bestimmt (IC50D3 bzw. IC503T3). Als Erweiterung dieses konventionellen EST wurden mittels quantitativer Real Time-PCR an den Tagen 5, 7 und 10 der Differenzierung zusätzlich Genexpressionsanalysen etablierter herzmuskelspezifischer Markergene (Mesoderm Posterior 1, Tag 5; Myosin light chain 1, Tag 7 und 10) durchgeführt. Deren Expression korreliert in den ES-Zellen mit der embryonalen Herzdifferenzierung in vivo und kann zur Ermittlung der von der Prüfsubstanz hervorgerufenen halbmaximalen Hemmung der Genexpression in den Kardiomyozyten (IC50 Exp) herangezogen werden. Um letztlich embryotoxische Effekte in vivo auf Grundlage der ermittelten In-vitro-Daten abschätzen zu können, wurden die ermittelten Parameter mittels eines für den EST empirisch abgeleiteten mathematischen Prädiktionsmodells (PM) zur Klassifizierung der Testsubstanzen als nicht, schwach oder stark embryotoxisch herangezogen. Für jede der Substanzen waren die ermittelten Halbhemmkonzentrationen in den überwiegenden Fällen vergleichbar und führten unter Verwendung des PMs im konventionellen und im molekularen EST zu deren identischer Klassifizierung. TSA wurde als „stark embryotoxisch“ klassifiziert und beeinflusste insbesondere das Differenzierungspotential der ES-Zellen. Das als „schwach embryotoxisch“ klassifizierte SDS wirkte auf die D3-Zellen stärker differenzierungsinhibierend als zytotoxisch, hemmte jedoch das Wachstum der 3T3-Zellen bereits in deutlich niedrigeren Konzentrationen. MAMac und BA wurden als „nicht embryotoxisch“ klassifiziert. Bei ihnen stand die zytotoxische Wirkung deutlich im Vordergrund. Diese Prädiktionen stimmten mit In-vivo-Befunden überein, was von der Stabilität und der Brauchbarkeit der im konventionellen und molekularen EST ermittelten Parameter zeugte. Einzige Ausnahme war das als Entwicklungsneurotoxin in vivo bekannte MAMac. Da der EST auf mesodermaler Differenzierung basiert, können spezifische Effekte auf neuronale Entwicklungsprozesse offenbar nicht vollständig erfasst werden. Substanzkonzentrationen, die sich als differenzierungsinhibierend auf die morphologische Kardiomyozytendifferenzierung erwiesen haben, führten auch zu einer messbaren Repression der herzmuskelspezifischen Genexpression. Dabei erwies sich die IC50 Exp als ebenso sensitiv wie die konventionellen Parameter und als nutzbringende Ergänzung zu diesen, da sie bereits nach 5 bzw. 7 Tagen der In-vitro-Differenzierung eine mit dem mikroskopischen Parameter übereinstimmende Einschätzung des embryotoxischen Potentials der Chemikalien in vivo ermöglichte. Genexpressionsanalysen weiterer differenzierungsspezifischer Gene können zusätzlich zur Aufklärung zu Grunde liegender Mechanismen der Embryotoxizität von Testsubstanzen dienen. Somit kann der EST durch die Vorteile der Stammzelltechnologie und der Genexpressionsanalyse als neues prädiktives Screening-Instrument zur frühzeitigen Detektion embryotoxischer Substanzeffekte in der pharmazeutischen und chemischen Industrie genutzt werden.
Ein hoher Verzehr von Obst und Gemüse scheint das Risiko der Inzidenz verschiedener Erkrankungen zu reduzieren. Es wird vermutet, dass eine Gruppe sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe, die Flavonoide, hierfür verantwortlich sind. Mögliche Effekte auf die intestinale Barrierefunktion dieser Substanzklasse sind jedoch weitgehend ungeklärt. Parazelluläre Eigenschaften epithelialer Zellen werden hauptsächlich durch die Zell-Zell-Kontakte der Tight Junction (TJ) insbesondere durch die Proteine Occludin und die Claudine definiert. Ziel dieser Arbeit war es, die Effekte des am häufigsten vorkommenden Flavonoids Quercetin auf die Barrierefunktion der Kolonkarzinom-Zelllinie Caco-2 zu untersuchen. Hierbei zeigte sich, dass Quercetin konzentrationsabhängig (50-200 µM) den transepithelialen Widerstand erhöhte. Die Wirkung von 200 µM Quercetin war bereits nach 4 h Inkubation erkennbar und erreichte nach 48 h maximale Werte. Der Wirkverlust, welcher nach 72 h Inkubation eintrat, konnte durch eine tägliche Gabe des Flavonoids verhindert werden. Weiterhin zeigte sich, dass der Quercetin-induzierte Widerstandsanstieg durch mukosale oder serosale Zugabe gleichermaßen auslösbar war. Western Blot-Analysen der TJ-Proteine Occludin, Claudin-1, -3, -4 und -7 ergaben, dass der durch Quercetin-induzierte Widerstandsanstieg insbesondere mit einer Zunahme der Expression des abdichtenden TJ-Proteins Claudin-4 einherging. Quercetin erhöhte ebenfalls die mRNA-Expression von Claudin-4 (quantitative RT-PCR) und bewirkte eine Aktivierung des Claudin-4-Promotors (Luciferase-Reportergen-Analysen). Mittels Immunfluoreszenz-Färbungen und Laserscanning-Mikroskopie konnte ein vermehrter Einbau von Claudin-4 in die TJ nachgewiesen werden. Funktionelle Untersuchungen mittels radioaktiven Fluxmessungen zeigten, dass das Flavonoid die parazelluläre Permeabilität für Natrium und Chlorid reduzierte, aber die Durchlässigkeit von Mannitol als parazellulärer Marker unverändert blieb. Wir konnten hiermit erstmals nachweisen, dass Quercetin die Expression des abdichtenden TJ-Proteins Claudin-4 in den TJ-Komplex verstärkte, wodurch die Ionen-Durchlässigkeit für Natrium und Chlorid vermindert wurde. Das führte zu einer Abdichtung der intestinalen Barriere. Dieser direkte Effekte von Quercetin könnte eine neue Möglichkeit für die Behandlung oder Prävention von Diarrhöe-bedingten intestinalen Barrieredefekten darstellen.