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Die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode wird auch heute noch als gängige Methode verwendet, vor allem wegen der geringeren Kosten für das Wirkstoffscreening in der pharmazeutischen Forschung, wobei Ionenkanäle sowie einige der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Mehrzahl der Wirkstoffziele ansprechen. Die zellfreie Synthese eukaryotischer Proteine hat nicht die Nachteile, die bei der Überexpression dieser ionenpermeablen Proteine in Zellen auftreten können, wie z. B. Zelltoxizität, geringere Proteinexpression und die Beseitigung der exprimierten Proteine aufgrund veränderter Domänen sowie die zeitaufwändige Pflege von Zelllinien. Die Synthese von Ionenkanälen in zellfreien Proteinsyntheseplattformen für das künftige Wirkstoffscreening ist noch in der Grundlagenforschung. Obwohl die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode in zellbasierten Assays weit verbreitet ist, wurde diese Methode bisher noch nicht in zellfreien Proteinexpressionssystemen verwendet. Insgesamt ist die neue Anwendung der Calcium-Imaging-Methode in eukaryontischen zellfreien Systemen eine Voraussetzung für die schnelle pharmakologische Analyse von Wirkstoffen. Das erste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit bestand darin, die grundlegenden Prinzipien der Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung von Ionenkanälen in zellbasierten Systemen zu untersuchen. Hierfür wurden zwei Tumorzelllinien des Auges verwendet, und zwar benigne Pterygiumzellen und maligne Aderhautmelanom 92.1 Zellen. In diesen Studien wurde die Interaktion zwischen den nativ überexprimierten transient-receptor-potential-Ionenkanälen (TRPs) wie TRP Vanilliod 1 (TRPV1) (Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 (TRPM8) (Mentholrezeptor) in diesen Tumorzellen nach Zugabe von verschiedenen Medikamenten und Hormonen untersucht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Calcium-Mechanismus von GPCRs in den Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde Mas, ein GPCR und Angiotensin (1-7) -Hormonrezeptor, aus dem renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) in der Human Embryonic Kidney-293 (HEK293) Zelllinie überexprimiert. In dieser Studie wurden insbesondere die Aktivierung klassischer GPCR-Signalwege wie Phospholipase C und Proteinkinase C durch Angiotensin-(1-7) über Mas und die Beteiligung von TRP-Kanälen nachgewiesen. Die zellbasierte-Calcium-Imaging-Methode für chemische Calcium-Indikatoren ließ sich aufgrund der Anwesenheit einer großen Menge cytosolischer Carboxylesterasen gut anwenden. Carboxylesterase ist das wichtigste Enzym in der Calcium Imaging Methode, das die Verarbeitung chemischen Calcium-Farbstoffe behandelt. Dieses Enzym fehlt jedoch in Mikrosomen, die als Basismembran für die Integration synthetisierter Ionenkanäle in eukaryontischen zellfreien Systemen verwendet werden. Das dritte Ziel dieser Forschungsarbeit war die Umsetzung der zellbasierten Calcium-Imaging Methode und der Calcium-Signalwege in zellfreie Systeme. Hier wurde die zellfrei synthetisierte Carboxylesterase in Mikrosomen von Spodoptera frugiperda (Sf21) als praktikables Calcium-Imaging-Werkzeug etabliert, um sowohl native ionenpermeable Proteine als auch zellfrei-synthetisierte Ionenkanäle zu untersuchen. Die Enzymaktivität der zellfrei-synthetisierten Carboxylesterase in Mikrosomen wurde durch Esterase-Assays und den Calcium-Fluoreszenzfarbstoff Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) Belastungstests nachgewiesen. Das Calcium-Imaging der nativ vorhandenen Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und der Ryanodin-Rezeptoren (RyR) in den Mikrosomen sowie der zell-frei exprimierten TRP-Ionenkanäle wurden mit dem Fura-5N-AM- Fluoreszenzfarbstoff in mit Carboxylesterase vorsynthetisierten Mikrosomen nachgewiesen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Prinzip der zellbasierten Calcium-Imaging -Methode vielversprechend an das eukaryotische zellfreie Sf21-System angepasst werden konnte, um Ionenkanäle zu analysieren. Nach entsprechender Forschung könnte die etablierte Methode in Zukunft auch auf andere Membranproteine ausgeweitet werden. Dies umfasst die Untersuchung anderer zell-frei exprimierte GPCRs oder anderer Ionenkanäle wie Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionenkanäle.
Im Rahmen des PSI-Projekts wurde eine Lehrveranstaltung konzipiert, die Lehramtsstudierenden einen vertieften Einblick sowohl in den Ablauf von Forschung als auch eine Bearbeitung einer eigenen experimentellen Forschungsaufgabe ermöglichen soll. Anlass waren die Berücksichtigung eines „Wissens über Erkenntnisgewinnung in der Disziplin“ im Modell des „Erweiterten Fachwissens für den schulischen Kontext“ (PSI) sowie Erkenntnisse empirischer Studien, die die Relevanz eigener Forschungserfahrung für das Unterrichten naturwissenschaftlicher Erkenntnisgewinnungsprozesse zeigen. Hier stellen wir eine neue Lehrveranstaltung (4 SWS) vor, die den angehenden Lehrkräften Forschungserfahrung ermöglicht (Seminar und Praktikum). Die Lehrveranstaltung vermittelt Einblicke in Forschung und die „Natur der Naturwissenschaften“, ermöglicht das Durchführen eigener wissenschaftlicher und schulrelevanter Experimente und bietet eine angemessene Reflexion über die verschiedenen Kurselemente. Die Evaluationsergebnisse sind überwiegend positiv, zeigen aber auch, dass für die Studierenden die wahrgenommene Schulrelevanz und die fachdidaktischen Aspekte ein wichtiges Kriterium für die positive Bewertung sind.
Dielektrophorese ist die Manipulation polarisierbarer Partikel durch inhomogene elektrische Wechselfelder. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Enzyme durch Dielektrophorese immobilisiert und anschließend hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität untersucht: Meerrettichperoxidase, Cholinoxidase aus Alcaligenes sp. und Glucoseoxidase aus Aspergillus niger. Die Immobilisierung erfolgte durch Dielektrophorese auf nano-Elektrodenarrays aus Wolfram-Zylindern mit 500 nm Durchmesser oder aus Titannitrid-Ringen mit 20 nm Breite. Die Immobilisierung der Enzyme konnte fluoreszenzmikroskopisch entweder anhand der intrinsischen Fluoreszenz oder aufgrund einer Fluoreszenzmarkierung vor oder nach der Immobilisierung für alle getesteten Enzyme nachgewiesen werden. Die Messung der Enzymaktivität erfolgte quantitativ durch den direkten oder indirekten Nachweis des gebildeten Produktes oder, im Falle der Cholinoxidase, durch Beobachtung der intrinsischen Fluoreszenz des Cofaktors FAD, die vom Oxidationszustand dieses Enzyms abhängt. Für die Meerrettichperoxidase konnte so eine hohe erhaltene Enzymaktivität nach der Immobilisierung nachgewiesen werden. Die Aktivität der permanent immobilisierten Fraktion der Meerrettichperoxidase entsprach bis zu 47 % der höchstmöglichen Aktivität einer Monolage dieses Enzyms auf den Elektroden des Chips. Diese Aktivität kann als aktive, aber zufällig gegenüber der Oberfläche ausgerichtete Enzymschicht interpretiert werden. Für die permanent immobilisierte Glucoseoxidase wurde nur eine Aktivität entsprechend <1,3 % der Aktivität einer solchen Enzymschicht detektiert, während für die immobilisierte Cholinoxidase gar keine Aktivität nachgewiesen werden konnte. Die Aktivität der durch DEP immobilisierten Enzyme konnte somit quantitativ bestimmt werden. Der Anteil an erhaltener Aktivität hängt dabei stark vom verwendeten Enzym ab.
Monoklonale Antikörper (mAK) sind eines der wichtigsten Biomoleküle für die Umweltanalytik und die medizinische Diagnostik. Für die Detektion von Mikroorganismen bilden sie die Grundlage für ein schnelles und präzises Testverfahren. Bis heute gibt es, aufgrund des hohen zeitlichen und materiellen Aufwandes und der unspezifischen Immunisierungsstrategien, nur wenige mAK, die spezifisch Mikroorganismen erkennen.
Zu diesem Zweck sollte ein anwendbares Verfahren für die Generierung von mAK gegen Mikroorganismen entwickelt werden, welches anhand von Escherichia coli O157:H7 und Legionella pneumophila validiert wurde. In dieser Dissertation konnten neue Oberflächenstrukturen auf den Mikroorganismen mittels vergleichender Genomanalysen und in silico Epitopanalysen identifiziert werden. Diese wurden in das Virushüllprotein VP1 integriert und für eine gezielte Immunisierungsstrategie verwendet. Für die Bestimmung antigenspezifischer antikörperproduzierender Hybridome wurde ein Immunfärbeprotokoll entwickelt und etabliert, um die Hybridome im Durchflusszytometer zu sortieren.
In der vorliegenden Studie konnten für E. coli O157:H7 insgesamt 53 potenzielle Proteinkandidaten und für L. pneumophila 38 Proteine mithilfe der bioinformatischen Analyse identifiziert werden. Fünf verschiedene potenzielle Epitope wurden für E. coli O157:H7 und drei verschiedenen für L. pneumophila ausgewählt und für die Immunisierung mit chimären VP1 verwendet. Alle Immunseren zeigten eine antigenspezifische Immunantwort. Aus den nachfolgend generierten Hybridomzellen konnten mehrere Antikörperkandidaten gewonnen werden, welche in Charakterisierungsstudien eine starke Bindung zu E. coli O157:H7 bzw. L. pneumophila vorwiesen. Kreuzreaktivitäten zu anderen relevanten Mikroorganismen konnten keine bzw. nur in geringem Maße festgestellt werden.
Folglich konnte der hier beschriebene interdisziplinäre Ansatz zur Generierung spezifischer mAK gegen Mikroorganismen nachweislich spezifische mAK hervorbringen und ist als hocheffizienter Arbeitsablauf für die Herstellung von Antikörpern gegen Mikroorganismen einsetzbar.