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Das 1817 erstmals schriftlich erwähnte Selen galt lange Zeit nur als toxisch und sogar als procancerogen, bis es 1957 von Schwarz und Foltz als essentielles Spurenelement erkannt wurde, dessen biologische Funktionen in Säugern durch Selenoproteine vermittelt werden. Die Familie der Glutathionperoxidasen nimmt hierbei eine wichtige Stellung ein. Für diese sind konkrete Funktionen und die dazugehörigen molekularen Mechanismen, welche über die von ihnen katalysierte Hydroperoxidreduktion und damit verbundene antioxidative Kapazität hinausgehen, bislang nur unzureichend beschrieben worden. Die Funktion der gastrointestinalen Glutathionperoxidase (GI-GPx) wird als Barriere gegen eine Hydroperoxidabsorption im Gastrointestinaltrakt definiert. Neuen Erkenntnissen zufolge wird die GI-GPx aber auch in verschiedenen Tumoren verstärkt exprimiert, was weitere, bis dato unbekannte, Funktionen dieses Enzymes wahrscheinlich macht. Um mögliche neue Funktionen der GI-GPx, vor allem während der Cancerogenese, abzuleiten, wurde hier die transkriptionale Regulation der GI-GPx detaillierter untersucht. Die Sequenzanalyse des humanen GI-GPx-Promotors ergab das Vorhandensein von zwei möglichen "antioxidant response elements" (ARE), bei welchen es sich um Erkennungssequenzen des Transkriptionsfaktors Nrf2 handelt. Die meisten der bekannten Nrf2-Zielgene gehören in die Gruppe der Phase-II-Enzyme und verfügen über antioxidative und/oder detoxifizierende Eigenschaften. Sowohl auf Promotorebene als auch auf mRNA- und Proteinebene konnte die Expression der GI-GPx durch typische, in der Nahrung enthaltene, Nrf2-Aktivatoren wie z.B. Sulforaphan oder Curcumin induziert werden. Eine direkte Beteiligung von Nrf2 wurde durch Cotransfektion von Nrf2 selbst bzw. von Keap1, das Nrf2 im Cytoplasma festhält, demonstriert. Somit konnte die GI-GPx eindeutig als Nrf2-Zielgen identifiziert werden. Ob sich die GI-GPx in die Gruppe der antiinflammatorischen und anticancerogenen Phase-II-Enzyme einordnen lässt, bleibt noch zu untersuchen. Die Phospholipidhydroperoxid Glutathionperoxidase (PHGPx) nimmt aufgrund ihres breiten Substratspektrums, ihrer hohen Lipophilie und ihrer Fähigkeit, Thiole zu modifizieren, eine Sonderstellung innerhalb der Familie der Glutathionperoxidasen ein. Mit Hilfe eines PHGPx-überexprimierenden Zellmodells wurden deshalb Beeinflussungen des zellulären Redoxstatus und daraus resultierende Veränderungen in der Aktivität redoxsensitiver Transkriptionsfaktorsysteme und in der Expression atheroskleroserelevanter Adhäsionsmoleküle untersucht. Als Transkriptionsfaktoren wurden NF-kB und Nrf2 ausgewählt. Die Bindung von NF-kB an sein entsprechendes responsives Element in der DNA erfordert das Vorhandensein freier Thiole, wohingegen Nrf2 durch Thiolmodifikation von Keap1 freigesetzt wird und in den Kern transloziert. Eine erhöhte Aktivität der PHGPx resultierte in einer Erhöhung des Verhältnisses von GSH zu GSSG, andererseits aber in einer verminderten Markierbarkeit freier Proteinthiole. PHGPx-Überexpression reduzierte die IL-1-induzierte NF-kB-Aktivität, die sich in einer verminderten NF-kB-DNA-Bindefähigkeit und Transaktivierungsaktivität ausdrückte. Auch war die Proliferationsrate der Zellen vermindert. Die Expression des NF-kB-regulierten vaskulären Zelladhäsionsmoleküls, VCAM-1, war ebenfalls deutlich verringert. Umgekehrt war in PHGPx-überexprimierenden Zellen eine erhöhte Nrf2-Aktivität und Expression der Nrf2-abhängigen Hämoxygenase-1 zu verzeichnen. Letzte kann für die meisten der beobachteten Effekte verantwortlich gemacht werden. Die hier dargestellten Ergebnisse verdeutlichen, dass eine Modifizierung von Proteinthiolen als wichtige Determinante für die Regulation der Expression und Funktion von Glutathionperoxidasen angesehen werden kann. Entgegen früheren Vermutungen, welche oxidative Vorgänge generell mit pathologischen Veränderungen assoziierten, scheint ein moderater oxidativer Stress, bedingt durch eine transiente Thiolmodifikation, durchaus günstige Auswirkungen zu haben, da, wie hier dargelegt, verschiedene, miteinander interagierende, cytoprotektive Mechanismen ausgelöst werden. Hieran wird deutlich, dass sich "antioxidative Wirkung" oder "oxidativer Stress" keineswegs nur auf "gute" oder "schlechte" Vorgänge beschränken lassen, sondern im Zusammenhang mit den beeinflussten (patho)physiologischen Prozessen und dem Ausmaß der "Störung" des physiologischen Redoxgleichgewichtes betrachtet werden müssen.
Das seit 1957 als essentiell klassifizierte Spurenelement Selen vermittelt seine Funktion hauptsächlich durch seinen Einbau in Selenoproteine in Form der 21. proteinogenen Aminosäure Selenocystein. Insgesamt wurden 25 humane Gene für Selenoproteine identifiziert, deren genaue Funktion häufig noch nicht bekannt ist. Selen ist das einzige Mitglied aus der Gruppe der Mikronährstoffe, für das nach wie vor eine antikanzerogene Funktion vor allem in Bezug auf Darmkrebs postuliert wird. Die Grundlage dafür liefert eine Interventionsstudie, bei der 1.312 Probanden für 4,5 Jahre mit 200 μg Selen/Tag supplementiert wurden. Dies resultierte in einer Senkung der Gesamtkrebsmortalität um 50 %. Die Fragen einer optimalen Selenzufuhr, die nicht nur den Bedarf deckt, sondern auch die Entfaltung der antikanzerogenen Wirkung von Selen gewährleistet und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch ungeklärt. Zudem liegt die Selenzufuhr bei einem Großteil der europäischen Bevölkerung unter den Empfehlungen. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit vier Wochen alte Mäuse für sechs Wochen marginal defizient (0,086 mg/kg Futter) bzw. selenadäquat (0,15 mg/kg Futter) gefüttert. Dieser geringe Unterschied im Selengehalt resultierte in einer Senkung des Plasmaselenspiegels der selenarmen Tiere auf 13 % und der GPx-Aktivität in der Leber auf 35 %. Zunächst wurde der Einfluss von Selen auf die globale Genexpression im murinen Colon mittels Microarray untersucht. Von den im Colon exprimierten Selenoproteinen reagierte die mRNA von SelW, SelH, GPx1 und SelM im Selenmangel besonders deutlich mit Expressionsverlust. Da diese Selenoproteine nicht nur im Colon, sondern auch in Leukozyten reguliert waren, sind sie auch als humane Biomarker für die in dieser Studie gewählte Schwankung des Selengehalts geeignet. Des Weiteren wurde auf Basis der Microarraydaten eine Signalweganalyse durchgeführt, die der Identifizierung krebsrelevanter Signalwege diente, um mögliche molekularbiologische Erklärungsansätze für die Rolle von Selen im Krebsgeschehen zu finden. Es zeigte sich, dass die mRNA von Schlüsselgenen des Wnt-Signalwegs wie β-Catenin, Gsk3β, Dvl2, Tle2, Lef1 und c-Myc auf Schwankungen des Selengehalts reagiert. Vor allem die Induktion von c-Myc, einem Zielgen des Wnt-Signalwegs, deutet darauf hin, dass dieser im Selenmangel tatsächlich aktiver ist als bei selenadäquater Versorgung. Ein weiterer möglicher Erklärungsansatz für die postulierte präventive Funktion von Selen gegenüber Darmkrebs ist die gastrointestinale Glutathionperoxidase (GPx2), die physiologisch in den proliferierenden Zellen des Kryptengrunds exprimiert wird. Die Regulation dieses Enzyms durch den Wnt-Signalweg, der ebenfalls in proliferierenden Zellen aktiv ist, konnte mittels Reportergenanalyse und endogen auf mRNA- und Proteinebene in Zellkultur gezeigt werden. Die Aktivierung verkürzter Promotorkonstrukte und die Mutation eines potentiellen Bindeelements identifizierten den für die Bindung von TCF und β-Catenin verantwortlichen Bereich. Als Zielgen des Wnt-Signalwegs scheint GPx2 zu den an Proliferationsprozessen beteiligten Genen zu gehören, was unter physiologischen Bedingungen die Aufrechterhaltung des intestinalen Epithels gewährleistet. Bei der Entstehung intestinaler Tumore, die in der Initiationsphase zu über 90 % mit einer konstitutiven Aktivierung des Wnt-Signalwegs einhergeht, wirkt GPx2 möglicherweise prokanzerogen. Die genaue Funktion von GPx2 während der Kanzerogenese bleibt weiter zu untersuchen.
Selen und Jod sind essenzielle Spurenelemente, die gemeinsam für eine optimale Funktionstüchtigkeit der Schilddrüse erforderlich sind. Der Mangel eines oder beider Elemente führt zu Verschiebungen auf Ebene der Schilddrüsenhormonproduktion mit weitreichenden Konsequenzen für Stoffwechselprozesse, neurologische Entwicklung und Erkrankungen. Auch bei Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse spielt die Versorgung mit Jod und Selen eine wichtige Rolle. Als Biomarker für den Selenstatus eignet sich der Gehalt des Gesamtselens oder der des Selenoproteins P im Serum. Zur Bestimmung des Jodstatus wird in der Regel der Jodgehalt im Urin herangezogen. Um den Versorgungszustand an diesen und vier weiteren essenziellen Spurenelementen besser zu erfassen, charakterisiert die Forschungsgruppe TraceAge alters- und geschlechtsspezifische Spurenelementprofile und neue funktionelle Biomarker der einzelnen Spurenelemente. Außerdem sollen Interaktionen weiterer Spurenelemente genauer untersucht werden.
Hintergrund: Die Kombination aus Übergewicht/Adipositas und reduzierter Skelettmuskelmasse (Sarkopenie) führt zu einem prognostisch ungünstigen Phänotyp, der als sarkopene Adipositas bezeichnet wird.
Ziel der Arbeit: Ziel dieser Arbeit ist, eine Übersicht über Diagnosekriterien der sarkopenen Adipositas, ihre klinischen Implikationen, die pathophysiologischen Ursachen mit besonderem Fokus auf der subklinischen Inflammation und den verfügbaren therapeutischen Optionen zu geben.
Ergebnisse: In aktuellen Studien werden verschiedene Diagnosekriterien der sarkopenen Adipositas verwendet, was einen Vergleich zwischen den Arbeiten erschwert und in Prävalenzschätzungen von 2–48 % in verschiedenen Studienpopulationen resultiert. Nichtsdestotrotz scheint die sarkopene Adipositas einen Risikofaktor für erhöhte Morbidität und Mortalität darzustellen, wobei kardiometabolische Erkrankungen und funktionelle Einschränkungen am besten erforscht sind. Neben Lebensstil- und genetischen Faktoren werden altersassoziierte endokrine und neuromuskuläre Parameter diskutiert. Sowohl hohes Lebensalter als auch Adipositas führen zu einer subklinischen Inflammation, die über einen fatalen Feedbackmechanismus zum Muskelabbau und zur Zunahme der Fettmasse beiträgt. Hinsichtlich Therapieoptionen stehen derzeit kombinierte Ernährungs- und Bewegungsinterventionen im Vordergrund.
Schlussfolgerung: Die sarkopene Adipositas stellt einen klinisch relevanten Phänotyp dar, dessen Pathogenese aber nur z. T. verstanden ist, was Maßnahmen der Prävention und Therapie begrenzt. Neue Strategien zu Muskelaufbau und Fettreduktion sind daher dringend erforderlich, um gesundheitliche Beeinträchtigungen im höheren Lebensalter zu minimieren.
Eine Störung des Leberstoffwechsels durch die Ausbildung einer Insulinresistenz kann zu Folgeerkrankungen wie der nicht alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) bis hin zur Steatohepatitis (NASH) und zur Entwicklung eines Diabetes Typ II führen. Am Krankheitsverlauf sind residente (Kupfferzellen) sowie infiltrierende Makrophagen beteiligt, die durch inflammatorische Stimuli aktiviert werden und zur Progression von Lebererkrankungen führen können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von mPGES1-abhängig gebildetem Prostaglandin E2 (PGE2) an der Modulation von aktivierten Lebermakrophagen untersucht. Dazu wurden Kupfferzellen und Peritonealmakrophagen (als Modell für infiltrierende Makrophagen) aus Wildtyp und mPGES1-defizienten Mäusen isoliert. Beide Makrophagenpopulationen wurden in Zellkulturversuchen mit Lipopolysacchariden (LPS) aktiviert und auf ihre PGE2-Synthese, Genexpression und Sekretion von verschiedenen Cytokinen hin untersucht. Die beiden Makrophagenpopulationen unterschieden sich hinsichtlich der PGE2-Synthese bei mPGSE1-Defizienz. Während bei Peritonealmakrophagen die LPS-abhängige PGE2-Synthese bei Abwesenheit der mPGES1 fast vollständig reprimiert war, war bei Kupfferzellen nur eine 25%ige Abnahme zu verzeichnen. Die postulierte selbstverstärkende Rückkopplungsschleife von PGE2 im Hinblick auf seine eigene Synthese konnte in isolierten Peritonealmakrophagen, nicht jedoch in Kupfferzellen, bestätigt werden. In Kupfferzellen führte exogenes PGE2 ferner zu einer Repression von den pro-inflammatorischen Cytokinen TNFα und IL-1β und für endogenes PGE2 konnte in diesem Zelltyp kein Effekt festgestellt werden. In Peritonealmakrophagen konnte hingegen auch für endogenes PGE2 eine reprimierende Wirkung auf die Expression von TNFα beobachtet werden. Das ist eventuell auf eine höhere Sensitivität gegenüber PGE2 von Peritonealmakrophagen im Vergleich zu Kupfferzellen zurückzuführen. PGE2 wirkte unter den gewählten Versuchsbedingungen in vitro somit eher anti-inflammatorisch. Cholesterolkristalle induzierten in Kupfferzellen die Expression der PGE2-synthetisierenden Enzyme und verschiedener pro-inflammatorische Cytokine. Sie könnten somit zu einer Progression von NAFL zu NASH beitragen. Die Daten aus dieser Arbeit deuten darauf hin, dass PGE2 im Rahmen von entzündlichen Leberveränderungen eine eher protektive Wirkung im Hinblick auf die Progression von NAFLD und Insulinresistenz haben könnte.
Zur Ermittlung der Akzeptanz und ihres prädiktiven Wertes für den Verzehr von Lebensmitteln bzw. Getränken, sind Beliebtheitsprüfungen mit Konsumenten unter standardisierten Bedingungen im Sensoriklabor üblich. Die prädiktive Aussagekraft dieser Laboruntersuchungen wird jedoch durch folgende Aspekte eingeschränkt: (1) Der situative Kontext wird ausgeschaltet, d.h. die Verzehrssituation, in der ein Produkt üblicherweise konsumiert wird, ist im Labor bewusst eliminiert und das zu bewertende Produkt wird nicht in einer kompletten Mahlzeit dargeboten (2) Der Produktkontakt im Labor ist im Gegensatz zu der anhaltenden Konfrontation unter alltäglichen Bedingungen nur kurzfristig, was Langzeitaussagen bzw. Dauerpräferenzen nicht zuläßt; (3) Im Labortest ist die freie Auswahl auf eine geringe Anzahl angebotener Produkte beschränkt. In dieser Arbeit soll daher die Frage beantwortet werden, welchen prädiktiven Wert sensorische Beliebtheitsuntersuchungen im Labor für Lebensmittelakzeptanz und -verzehr unter Alltagssituationen haben. Dies wird für verschiedene Altersgruppen gezeigt, die frei in ihrer Entscheidungsfindung sind. Dazu gaben 56 Studenten (23,1±3,7 Jahre) und zwei Seniorengruppen, zum einen aus einer Begegnungsstätte (20 Probanden; 75,6±8,1 Jahre) und zum anderen aus dem betreuten Wohnen (14 Probanden; 76,1±12,5 Jahre), in einer ersten Laboruntersuchung Beliebtheitsbewertungen (Akzeptanz und Rangordnungsprüfung) zu 6 Erfrischungsgetränken ab. Anschließend folgte ein mindestens vierwöchiger Zeitraum, in denen die Probanden aus einem speziell für die Studie konzipierten Automaten Getränke in Einrichtungen der Gemeinschaftsverpflegung entnehmen konnten. Die Entnahme war via Chipkarte ad libitum möglich. Computergestützt wurden dabei individuelle Getränkewahl, Menge und Entnahmezeit aufgezeichnet. Unmittelbar nach der Automatenphase wurde eine erneute Laboruntersuchung durchgeführt. In allen Untersuchungsphasen wurden dieselben Erfrischungsgetränke aus Konzentrat, variiert in Apfel- oder Orangensaftgeschmack, ohne oder mit Zusatz von Zucker (20g/l) und Kohlensäure (4 g/l CO2), angeboten. Eine Quntitativ Deskriptive Analyse bestätigte unterschiedliche Profile bei den Produkten, so dass von sensorisch wahrnehmbaren Unterschieden zwischen den Produkten ausgegangen werden konnte. Die Probanden bekamen zu keiner Zeit Informationen über die exakte Zusammensetzung der Getränke. Sowohl in der Laborbewertung als auch nach Getränkekonsum via Automat, fanden sich unterschiede zwischen den Altersgruppen. In der Akzeptanzprüfung bewerteten Studenten die Apfelvarianten besser als die Orangenvarianten. Senioren, die insgesamt höhere Akzeptanzwerte vergaben, bewerteten alle Getränke in fast allen Attributen gleichermaßen gut. Nach der 4-wöchigen Automatenphase hatte sich die Akzeptanz der sechs Getränke nicht wesentlich geändert. Auch in beiden Rangordnungsprüfungen waren bei den Studenten „Apfel“ und „Apfel mit Kohlensäure“ auf den ersten Plätzen, „Orange mit Zuckerzusatz“ auf dem letzten Platz. Nach Adjustierung auf die individuelle Trinkmenge (in Wenig-, Mittel- Vieltrinker) und wurde „Apfel mit Kohlensäure“ in der Automatenphase von den Studenten am meisten getrunken. In der Vieltrinkergruppe wurde „Orange mit Zuckerzusatz“ deutlich vernachlässigt. Der Automatenkonsum der Studenten bestätigte damit im Wesentlichen die Ergebnisse der Beliebtheitsprüfung im Labor. Bei den Senioren waren in der Rangordnungsprüfung, die eine Lieblingsreihenfolge erzwang, alle süßeren Getränke (mit Zuckerzusatz) auf den ersten Plätzen. In der Automatenphase wurden jedoch viele Getränke ohne Zuckerzusatz bevorzugt. Dies zeigte sich sowohl in der individuellen Präferenz, als auch im Gesamtkonsum. Aufgrund der Ergebnisse kann der prädiktive Wert von Laboruntersuchungen mit Senioren in Bezug auf die Auswahl und den Konsum unter alltäglichen Bedingungen als gering beurteilt werden. Die Getränke mit der individuell höchsten Laborpräferenz wurden unter Alltagsumgebung in der Gemeinschaftsverpflegung in deutlich geringeren Umfang als erwartet verzehrt. In der Vergleichsgruppe der Studenten ist die Übereinstimmung größer(p<0,05). In Häufigkeitsfragebögen vor und nach der Automatenphase wurde das Trinkverhalten speziell von kohlensäurehaltigen Getränken erfragt. Der Anteil von kohlensäurehaltigen Getränken ist sehr variabel, und kann tagesabhängig von einem geringen bis zum Hauptanteil ausmachen. Senioren tranken von den Automatengetränken weniger kohlensäurehaltige Getränke als Studenten(p<0,001). Trotzdem zeigte nur eine Minderheit einen völligen Verzicht, wie sich durch Fragebogen und auch Automatenkonsum ermitteln ließ. Die Verwendung eines computergestützten Getränkeautomaten bietet eine neue Möglichkeit, die Langzeitpräferenz und den tatsächlichen Konsum unter gewohnten Alltagsbedingungen und bei freier Produktauswahl zu ermitteln. Selbst bei Altersgruppen, die mit Laboruntersuchungen überfordert sind, können Vorlieben untersucht werden.
Protektiver Effekt von 6-Shogaol, Ellagsäure und Myrrhe auf die intestinale epitheliale Barriere
(2016)
Viele bioaktive Pflanzeninhaltsstoffe bzw. Pflanzenmetabolite besitzen antiinflammatorische Eigenschaften. Diese versprechen ein hohes Potential für den Einsatz in der Phytotherapie bzw. Prävention von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED). Eine intestinale Barrieredysfunktion ist ein typisches Charakteristikum von CED Patienten, die dadurch an akuter Diarrhoe leiden.
In dieser Arbeit werden die Pflanzenkomponenten 6-Shogaol, Ellagsäure und Myrrhe an den intestinalen Kolonepithelzellmodellen HT-29/B6 und Caco-2 auf ihr Potential hin, die intestinale Barriere zu stärken bzw. eine Barrieredysfunktion zu verhindern, untersucht. Hauptschwerpunkt der Analysen ist die parazelluläre Barrierefunktion und die Regulation der dafür entscheidenden Proteinfamilie der Tight Junctions (TJs), der Claudine.
Die Barrierefunktion wird durch Messung des transepithelialen Widerstands (TER) und der Fluxmessung in der Ussing-Kammer bestimmt. Dazu werden die HT-29/B6- und Caco-2-Monolayer mit den Pflanzenkomponenten (6-Shogaol, Ellagsäure, Myrrhe), dem proinflammatorischen Zytokin TNF-α oder der Kombination von beiden Subsztanzen für 24 oder 48 h behandelt. Außerdem wurden zur weiteren Charakterisierung die Expression sowie die Lokalisation der für die parazelluläre Barriere relevanten Claudine, die TJ-Ultrastruktur und verschiedene Signalwege analysiert.
In Caco-2-Monolayern führten Ellagsäure und Myrrhe, nicht aber 6-Shogaol, allein zu einem TER-Anstieg bedingt durch eine verringerte Permeabilität für Natriumionen. Myrrhe verminderte die Expression des Kationenkanal-bildenden TJ-Proteins Claudin-2 über die Inhibierung des PI3K/Akt-Signalweges, während Ellagsäure die Expression der TJ-Proteine Claudin-4 und -7 reduzierte. Alle Pflanzenkomponenten schützten in den Caco-2-Zellen vor einer TNF-α-induzierten Barrieredysfunktion.
An den HT-29/B6-Monolayern änderte keine der Pflanzenkomponenten allein die Barrierefunktion. Die HT-29/B6-Zellen reagierten auf TNF-α mit einer deutlichen Verminderung des TER und einer erhöhten Fluoreszein-Permeabilität. Die TER-Abnahme war durch eine PI3K/Akt-vermittelte gesteigerte Claudin-2-Expression sowie eine NFκB-vermittelte Umverteilung des abdichtenden TJ-Proteins Claudin-1 gekennzeichnet. 6-Shogaol konnte den TER-Abfall partiell hemmen sowie die PI3K/Akt-induzierte Claudin-2-Expression und die NFκB-bedingte Claudin-1-Umverteilung verhindern. Ebenso inhibierte Myrrhe, nicht aber Ellagsäure, den TNF-α-induzierten TER-Abfall. Dabei konnte Myrrhe zwar den Claudin-2-Expressionsanstieg und die Claudin-1-Umverteilung unterbinden, jedoch weder die NFκB- noch die PI3K/Akt-Aktivierung hemmen. Diese Arbeit zeigt, dass auch STAT6 an dem Claudin-2-Expressionsanstieg durch
TNF-α in HT-29/B6-Zellen beteiligt ist. So wurde durch Myrrhe die TNF-α-induzierte Phosphorylierung von STAT6 und die erhöhte Claudin-2-Expression inhibiert.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Pflanzenkomponenten 6-Shogaol, Ellagsäure und Myrrhe mit unterschiedlichen Mechanismen stärkend auf die Barriere einwirken. Zur Behandlung von intestinalen Erkrankungen mit Barrieredysfunktion könnten daher Kombinationspräparate aus verschiedenen Pflanzen effektiver sein als Monopräparate.
Oxidative posttranslationale Modifikationen endogener Proteine werden v. a. durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies (engl:. Reactive Oxygen Species, ROS, reactive nitrogen species, RNS) hervorgerufen und können sowohl reversibel (z. B. Disulfidbindungen) als auch irreversibel (z. B. Proteincarbonyle) erfolgen [1–3]. Lange wurde angenommen, dass oxidative posttranslationale Proteinmodifikationen (oxPTPM) nur von untergeordneter Bedeutung für den Metabolismus sind. Tatsächlich handelt es sich jedoch um einen physiologischen Prozess, der über die Modulation der Proteinstruktur auch die Proteinfunktion (z. B. Enzymaktivität, Stabilität) und somit zahlreiche Stoffwechselwege wie den Energiestoffwechsel, die Immunfunktion, die vaskuläre Funktion sowie Apoptose und Genexpression beeinflussen kann. Die Bildung von oxPTPM ist dabei hochreguliert und hängt u. a. von der Proteinstruktur, der Verfügbarkeit von ROS und RNS sowie dem lokalen Mikromilieu der Zelle ab [2, 4].
Sekundäre Pflanzenstoffe und ihre gesundheitsfördernden Eigenschaften sind in den letzten zwei Jahrzehnten vielfach ernährungsphysiologisch untersucht und spezifische positive Effekte im humanen Organismus zum Teil sehr genau beschrieben worden. Zu den Carotinoiden zählend ist der sekundäre Pflanzenstoff Lutein insbesondere in der Prävention von ophthalmologischen Erkrankungen in den Mittelpunkt der Forschung gerückt. Das ausschließlich von Pflanzen und einigen Algen synthetisierte Xanthophyll wird über die pflanzliche Nahrung insbesondere grünes Blattgemüse in den humanen Organismus aufgenommen. Dort akkumuliert es bevorzugt im Makulapigment der Retina des menschlichen Auges und ist bedeutend im Prozess der Aufrechterhaltung der Funktionsfähigkeit der Photorezeptorzellen. Im Laufe des Alterns kann die Abnahme der Dichte des Makulapigments und der Abbau von Lutein beobachtet werden. Die dadurch eintretende Destabilisierung der Photorezeptorzellen im Zusammenhang mit einer veränderten Stoffwechsellage im alternden Organismus kann zur Ausprägung der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) führen. Die pathologische Symptomatik der Augenerkrankung reicht vom Verlust der Sehschärfe bis hin zum irreversiblen Erblinden. Da therapeutische Mittel ausschließlich ein Fortschreiten verhindern, bestehen hier Forschungsansätze präventive Maßnahmen zu finden. Die Supplementierung von luteinhaltigen Präparaten bietet dabei einen Ansatzpunkt. Auf dem Markt finden sich bereits Nahrungsergänzungsmittel (NEM) mit Lutein in verschiedenen Applikationen. Limitierend ist dabei die Stabilität und Bioverfügbarkeit von Lutein, welches teilweise kostenintensiv und mit unbekannter Reinheit zu erwerben ist. Aus diesem Grund wäre die Verwendung von Luteinestern als die pflanzliche Speicherform des Luteins im Rahmen eines NEMs vorteilhaft. Neben ihrer natürlichen, höheren Stabilität sind Luteinester nachhaltig und kostengünstig einsetzbar.
In dieser Arbeit wurden physikochemische und ernährungsphysiologisch relevante Aspekte in dem Produktentwicklungsprozess eines NEMs mit Luteinestern in einer kolloidalen Formulierung untersucht. Die bisher einzigartige Anwendung von Luteinestern in einem Mundspray sollte die Aufnahme des Wirkstoffes insbesondere für ältere Menschen erleichtern und verbessern. Unter Beachtung der Ergebnisse und der ernährungsphysiologischen Bewertung sollten u.a. Empfehlungen für die Rezepturzusammensetzungen einer Miniemulsion (Emulsion mit Partikelgrößen <1,0 µm) gegeben werden. Eine Einschätzung der Bioverfügbarkeit der Luteinester aus den entwickelten, kolloidalen Formulierungen konnte anhand von Studien zur Resorption- und Absorptionsverfügbarkeit in vitro ermöglicht werden.
In physikalischen Untersuchungen wurden zunächst Basisbestandteile für die Formulierungen präzisiert. In ersten wirkstofffreien Musteremulsionen konnten ausgewählte Öle als Trägerphase sowie Emulgatoren und Löslichkeitsvermittler (Peptisatoren) hinsichtlich ihrer Eignung zur Bereitstellung einer Miniemulsion physikalisch geprüft werden. Die beste Stabilität und optimale Eigenschaften einer Miniemulsion zeigten sich bei der Verwendung von MCT-Öl (engl. medium chain triglyceride) bzw. Rapsöl in der Trägerphase sowie des Emulgators Tween® 80 (Tween 80) allein oder in Kombination mit dem Molkenproteinhydrolysat Biozate® 1 (Biozate 1).
Aus den physikalischen Untersuchungen der Musteremulsionen gingen die Präemulsionen als Prototypen hervor. Diese enthielten den Wirkstoff Lutein in verschiedenen Formen. So wurden Präemulsionen mit Lutein, mit Luteinestern sowie mit Lutein und Luteinestern konzipiert, welche den Emulgator Tween 80 oder die Kombination mit Biozate 1 enthielten. Bei der Herstellung der Präemulsionen führte die Anwendung der Emulgiertechniken Ultraschall mit anschließender Hochdruckhomogenisation zu den gewünschten Miniemulsionen. Beide eingesetzten Emulgatoren boten optimale Stabilisierungseffekte. Anschließend erfolgte die physikochemische Charakterisierung der Wirkstoffe. Insbesondere Luteinester aus Oleoresin erwiesen sich hier als stabil gegenüber verschiedenen Lagerungsbedingungen. Ebenso konnte bei einer kurzzeitigen Behandlung der Wirkstoffe unter spezifischen mechanischen, thermischen, sauren und basischen Bedingungen eine Stabilität von Lutein und Luteinestern gezeigt werden. Die Zugabe von Biozate 1 bot dabei nur für Lutein einen zusätzlichen Schutz. Bei längerer physikochemischer Behandlung unterlagen die in den Miniemulsionen eingebrachten Wirkstoffe moderaten Abbauvorgängen. Markant war deren Sensitivität gegenüber dem basischen Milieu. Im Rahmen der Rezepturentwicklung des NEMs war hier die Empfehlung, eine Miniemulsion mit einem leicht saurem pH-Milieu zum Schutz des Wirkstoffes durch kontrollierte Zugabe weiterer Inhaltstoffe zu gestalten.
Im weiteren Entwicklungsprozess des NEMs wurden Fertigrezepturen mit dem Wirkstoff Luteinester aufgestellt. Die alleinige Anwendung des Emulgators Biozate 1 zeigte sich dabei als ungeeignet. Die weiterhin zur Verfügung stehenden Fertigrezepturen enthielten in der Öl-phase neben dem Wirkstoff das MCT-ÖL oder Rapsöl sowie a-Tocopherol zur Stabilisierung. Die Wasserphase bestand aus dem Emulgator Tween 80 oder einer Kombination aus Tween 80 und Biozate 1. Zusatzstoffe waren zudem als mikrobiologischer Schutz Ascorbinsäure und Kaliumsorbat sowie für sensorische Effekte Xylitol und Orangenaroma. Die Anordnung der Basisrezeptur und das angewendete Emulgierverfahren lieferten stabile Miniemulsionen. Weiterhin zeigten langfristige Lagerungsversuche mit den Fertigrezepturen bei 4°C, dass eine Aufrechterhaltung der geforderten Luteinestermenge im Produkt gewährleistet war. Analoge Untersuchungen an einem luteinhaltigen, marktgängigen Präparat bestätigten dagegen eine bereits bei kurzfristiger Lagerung auftretende Instabilität von Lutein.
Abschließend wurde durch Resorptions- und Absorptionsstudien in vitro mit den Präemulsionen und Fertigrezepturen die Bioverfügbarkeit von Luteinestern geprüft. Nach Behandlung in einem etablierten in vitro Verdaumodell konnte eine geringfügige Resorptionsverfügbarkeit der Luteinester definiert werden. Limitiert war eine Micellarisierung des Wirkstoffes aus den konzipierten Formulierungen zu beobachten. Eine enzymatische Spaltung der Luteinester zu freiem Lutein wurde nur begrenzt festgestellt. Spezifität und Aktivität von entsprechenden hydrolytischen Lipasen sind als äußerst gering gegenüber Luteinestern zu bewerten. In sich anschließenden Zellkulturversuchen mit der Zelllinie Caco-2 wurden keine zytotoxischen Effekte durch die relevanten Inhaltsstoffe in den Präemulsionen gezeigt. Dagegen konnten eine Sensibilität gegenüber den Fertigrezepturen beobachtet werden. Diese sollte im Zusammenhang mit Irritationen der Schleimhäute des Magen-Darm-Traktes bedacht werden. Eine weniger komplexe Rezeptur könnte die beobachteten Einschränkungen möglicherweise minimieren. Abschließende Absorptionsstudien zeigten, dass grundsätzlich eine geringfügige Aufnahme von vorrangig Lutein, aber auch Luteinmonoestern in den Enterocyten aus Miniemulsionen erfolgen kann. Dabei hatte weder Tween 80 noch Biozate 1 einen förderlichen Einfluss auf die Absorptionsrate von Lutein oder Luteinestern. Die Metabolisierung der Wirkstoffe durch vorherigen in vitro-Verdau steigerte die zelluläre Aufnahme von Wirkstoffen aus Formulierungen mit Lutein und Luteinestern gleichermaßen. Die beobachtete Aufnahme von Lutein und Luteinmonoestern in den Enterocyten scheint über passive Diffusion zu erfolgen, wobei auch der aktive Transport nicht ausgeschlossen werden kann. Dagegen können Luteindiester aufgrund ihrer Molekülgröße nicht über den Weg der Micellarisierung und einfachen Diffusion in die Enterocyten gelangen. Ihre Aufnahme in die Dünndarmepithelzellen bedarf einer vorherigen hydrolytischen Spaltung durch spezifische Lipasen. Dieser Schritt limitiert wiederum die effektive Aufnahme der Luteinester in die Zellen bzw. stellt eine Einschränkung in ihrer Bioverfügbarkeit im Vergleich zu freiem Lutein dar.
Zusammenfassend konnte für die physikochemisch stabilen Luteinester eine geringe Bioverfügbarkeit aus kolloidalen Formulierungen gezeigt werden. Dennoch ist die Verwendung als Wirkstoffquelle für den sekundären Pflanzenstoff Lutein in einem NEM zu empfehlen. Im Zusammenhang mit der Aufnahme von luteinreichen, pflanzlichen Lebensmitteln kann trotz der zu erwartenden geringen Bioverfügbarkeit der Luteinester aus dem NEM ein Beitrag zur Verbesserung des Luteinstatus erreicht werden. Entsprechende Publikationen zeigten eindeutige Korrelationen zwischen der Aufnahme von luteinesterhaltigen Präparaten und einem Anstieg der Luteinkonzentration im Serum bzw. der Makulapigmentdichte in vivo. Die geringfügig bessere Bioverfügbarkeit von freiem Lutein steht im kritischen Zusammenhang mit seiner Instabilität und Kostenintensität. Bilanzierend wurde im Rahmen dieser Arbeit das marktgängige Produkt Vita Culus® konzipiert. Im Ausblick sollten humane Interventionsstudien mit dem NEM die abschließende Bewertung der Bioverfügbarkeit von Luteinestern aus dem Präparat möglich machen.
Physiologie der Laktation
(2000)
Nutrigenetik der metabolischen Adaptation an eine isokalorische Hochfettdiät bei gesunden Zwillingen
(2013)
Als Resultat überhöhter Energieaufnahme und zu geringen Energieverbrauchs beobachten wir eine über das normale Maß hinausgehende Akkumulation von Fettgewebe, die sich als Adipositas manifestiert. Sie gilt als einer der Hauptrisikofaktoren für Krankheiten des metabolischen Syndroms. Im Rahmen von Prävention, Diagnose und Therapie der Adipositas, muss ihr wesentliches Charakteristikum; der individuelle Körperfettanteil; einer Messung zugänglich gemacht werden. Eine direkte Bestimmung der Körperzusammensetzung erlauben die Neutronenaktivierungsanalyse und die chemische Analyse. Beide Verfahren sind sehr genau, aber aufwendig und kostenintensiv und darüber hinaus die chemische Analyse nur am menschlichen Cadaver praktizierbar. Um dennoch die Körperzusammensetzung hinreichend genau bestimmen zu können, wurden zahlreiche indirekte Messverfahren entwickelt. Man kann sie in Labor- und Feldmethoden untergliedern. Die Labormethoden bestechen durch hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, sind aber zumeist aufwendig und teuer. Feldmethoden sind im Gegensatz dazu leicht anwendbar, transportabel und preiswert, weisen aber eine weniger hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit auf. In der vorgestellten Arbeit wird über eine jüngere Entwicklung, die das Prinzip der unterschiedlichen Leitfähigkeit für den elektrischen Strom durch die verschiedenen Gewebe des Körpers nutzt, berichtet. Der Prototyp eines Gerätes wurde innerhalb eines von der EU geförderten multizentrischen Projekts entwickelt und auf seine Einsatzfähigkeit und Qualität hin geprüft. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt auf der Einschätzung der Körperzusammensetzung normal- und übergewichtiger Probanden mit der neu entwickelten Technik. Das vorliegende Studiendesign diente nicht nur der Beurteilung der neuen Technik die Körperzusammensetzung und Veränderungen dieser zu erfassen, sondern darüber hinaus, etablierte Methoden hinsichtlich ihrer Genauigkeit zu bewerten. Bezüglich ihrer Anwendbarkeit und Reproduzierbarkeit hat die neue Methode Hoffnung geweckt, sich als eine Feldmethode zu etablieren. Auf der anderen Seite zeigte sich in Abhängigkeit der Gesamtkörperfettmasse eine Überschätzung der Zielgröße im Vergleich zur Referenzmethode (dual energy x ray absorptiometry (DXA)). Die Abweichungen waren dabei gerade für das einzelne Individuum sehr groß. Technische Verbesserungen und die Entwicklung spezifischer Regressionsgleichungen könnten in Zukunft zu einer wesentlichen Verbesserung der neuen Methode beitragen. Die Labormethode "Air Displacement Plethysmography" konnte durch die guten Übereinstimmungen der Ergebnisse mit denen der Referenzmethode DXA und die einfache Anwendung überzeugen. Sie stellt eine durchaus konkurrenzfähige Alternative zur Hydrodensitometrie dar, die noch heute als "goldener Standard" zur Erfassung der Körperzusammensetzung akzeptiert wird. Im Verlauf der durchgeführten Studie stellte sich heraus, dass die Hydrodensitometrie sehr hohe Anforderungen an den Probanden stellt. Das Untertauchen des gesamten Körpers unter Wasser in Kombination mit einer maximalen Ausatmung erwies sich als sehr problematisch. Die dabei auftretenden Fehler schlugen sich in der Berechnung der Gesamtkörperfettmasse des einzelnen Individuums wieder und führten zu zum Teil erheblichen Abweichungen der Ergebnisse von denen der Referenzmethode. Die Feldmethoden bioelektrische Impedanzanalyse und Hautfaltendickenmessung erwiesen sich als kostengünstige und leicht anwendbare Methoden. Die Ergebnisse beider Methoden stimmten im Mittel gut mit den Ergebnissen der Referenzmethoden überein. Dennoch zeigte die BIA größere Abstriche in der Beurteilung der Gesamtkörperfettmasse des einzelnen Individuums und bei der Dokumentation von Veränderungen der Gesamtkörperfettmasse. Die Hautfaltendickenmessung stellt – wendet man sie korrekt an – eine Methode dar, die sowohl die Gesamtkörperfettmasse als auch Veränderungen dieser gut erfassen kann. In Abhängigkeit der geforderten Genauigkeit kann diese Methode für die Erfassung der Körperzusammensetzung empfohlen werden. Demnach bleibt die Frage unbeantwortet, inwieweit die indirekten Methoden in der Lage sind, die "wahre" Körperzusammensetzung adäquat zu erfassen. Jede neu entwickelte Methode – die möglichst viele Vorteile in sich vereint – wird wieder vor dem Problem stehen: eine geeignete und dabei praktikable Referenzmethode zu finden, die die wahre Körperzusammensetzung zu bestimmen in der Lage ist. Daher sollte neben dem Streben nach der Entwicklung einer Methode, die genau und leicht anwendbar ist, das Hauptaugenmerk auf die Überarbeitung der zugrunde liegenden Modellvorstellungen und die Verbesserung von Regressionsgleichungen gelegt werden.
Die hohe Energieaufnahme durch Fette ist ein Hauptfaktor für die Entstehung von Adipositas, was zu weltweiten Bestrebungen führte, die Fettaufnahme zu verringern. Fettreduzierte Lebensmittel erreichen jedoch, trotz ihrer Weiterentwicklung, nicht die Schmackhaftigkeit ihrer Originale. Die traditionelle Sichtweise, dass die Attraktivität von Fetten allein durch Textur, Geruch, Aussehen und postingestive Effekte bestimmt wird, wird nun durch das Konzept einer gustatorischen Wahrnehmung ergänzt. Bei Nagetieren zeigte sich, dass Lipide unabhängig von den vorgenannten Eigenschaften erkannt werden, sowie, dass Fettsäuren, freigesetzt durch linguale Lipasen, als gustatorische Stimuli fungieren und Fettsäuresensoren in Geschmackszellen exprimiert sind. Die Datenlage für den Menschen erwies sich jedoch als sehr begrenzt, daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit molekulare und histologische Voraussetzungen für eine gustatorische Fettwahrnehmung beim Menschen zu untersuchen.
Zunächst wurde humanes Geschmacksgewebe mittels RT-PCR und immunhistochemischen Methoden auf die Expression von Fettsäuresensoren untersucht, sowie exprimierende Zellen in Kofärbeexperimenten charakterisiert und quantifiziert. Es wurde die Expression fettsäuresensitiver Rezeptoren nachgewiesen, deren Agonisten das gesamte Spektrum an kurz- bis langkettigen Fettsäuren abdecken (GPR43, GPR84, GPR120, CD36, KCNA5). Ein zweifelsfreier Nachweis des Proteins konnte für den auf langkettige Fettsäuren spezialisierten Rezeptor GPR120 in Typ-I- und Typ-III-Geschmackszellen der Wallpapillen erbracht werden. Etwa 85 % dieser GPR120-exprimierenden Zellen enthielten keine der ausgewählten Rezeptoren der Geschmacksqualitäten süß (TAS1R2/3), umami (TAS1R1/3) oder bitter (TAS2R38). Somit findet sich in humanen Geschmackspapillen nicht nur mindestens ein Sensor, sondern möglicherweise auch eine spezifische, fettsäuresensitive Zellpopulation. Weitere RT-PCR-Experimente und Untersuchungen mittels In-situ-Hybridisierung wurden zur Klärung der Frage durchgeführt, ob Lipasen in den Von-Ebner-Speicheldrüsen (VED) existieren, die freie Fettsäuren aus Triglyceriden als gustatorischen Stimulus freisetzen können. Es zeigte sich zwar keine Expression der bei Nagetieren gefundenen Lipase F (LIPF), jedoch der eng verwandten Lipasen K, M und N in den serösen Zellen der VED. In-silico-Untersuchungen der Sekundär- und Tertiärstrukturen zeigten die hohe Ähnlichkeit zu LIPF, erwiesen aber auch Unterschiede in den Bindungstaschen der Enzyme, welche auf ein differenziertes Substratspektrum hinweisen. Die Anwesenheit eines spezifischen Signalpeptids macht eine Sekretion der Lipasen in den die Geschmacksporen umspülenden Speichel wahrscheinlich und damit auch eine Bereitstellung von Fettsäuren als Stimuli für Fettsäuresensoren. Die Übertragung des durch diese Stimuli hervorgerufenen Signals von Geschmackszellen auf gustatorische Nervenfasern über P2X-Rezeptormultimere wurde mit Hilfe einer vorherigen Intervention mit einem P2X3 /P2X2/3-spezifischen Antagonisten an der Maus als Modellorganismus im Kurzzeit-Präferenztest untersucht. Es zeigte sich weder eine Beeinträchtigung der Wahrnehmung einer Fettsäurelösung, noch einer zuckerhaltigen Kontrolllösung, wohingegen die Wahrnehmung einer Bitterstofflösung reduziert wurde. Somit ist anhand der Ergebnisse dieser Arbeit eine Beteiligung des P2X3-Homomers bzw. des P2X2/3-Heteromers unwahrscheinlich, jedoch die des P2X2-Homomers und damit der gustatorischen Nervenfasern nicht ausgeschlossen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf die Erfüllung grundlegender Voraussetzungen für die gustatorische Fett(säure)wahrnehmung hin und tragen zum Verständnis der sensorischen Fettwahrnehmung und der Regulation der Fettaufnahme bei. Das Wissen um die Regulation dieser Mechanismen stellt eine Grundlage zur Aufklärung der Ursachen und damit der Bekämpfung von Adipositas und assoziierten Krankheiten dar.
Die adipositasbedingte Insulinresistenz geht mit einer unterschwelligen Entzündungsreaktion einher. Als Antwort auf dieses Entzündungsgeschehen wird PGE2 unter anderem von Kupffer Zellen der Leber freigesetzt und kann seine Wirkung über vier PGE2-Rezeptorsubtypen (EP1-EP4) vermitteln. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass PGE2 in Rattenhepatozyten über den EP3 R ERK1/2-abhängig die intrazelluläre Weiterleitung des Insulinsignals hemmt. Über die Modulation der Insulinrezeptorsignalkette durch andere EP-Rezeptoren war bisher nichts bekannt. Daher sollte in stabil transfizierten Zelllinien, die jeweils nur einen der vier EP-Rezeptorsubtypen exprimierten, der Einfluss von PGE2 auf die Insulinrezeptorsignalkette untersucht werden. Es wurden HepG2-Zellen, die keinen funktionalen EP-Rezeptor aufwiesen, sowie HepG2-Zellen, die stabil den EP1-R (HepG2-EP1), den EP3β-R (HepG2 EP3β) oder den EP4-R (HepG2 EP4) exprimierten, sowie die humane fötale Hepatozytenzelllinie, Fh hTert, die den EP2- und den EP4-R exprimierte, für die Untersuchungen verwendet. Die Zellen wurden für 330 min mit PGE2 (10 µM) vorinkubiert, um die pathophysiologische Situation nachzustellen und anschließend mit Insulin (10 nM) für 15 min stimuliert. Die insulinabhängige Akt- und ERK1/2-Phosphorylierung wurde im Western-Blot bestimmt. In allen Hepatomzelllinien die EP-R exprimierten, nicht aber in der Zelllinie, die keinen EP R exprimierte, hemmte PGE2 die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung. In allen drei stabil transfizierten Zelllinien, nicht jedoch in den Fh-hTert-Zellen, steigerte PGE2 die basale und insulinstimulierte Phosphorylierung der Serin/Threoninkinase ERK1/2. In den HepG2 EP1- und den HepG2-EP3β-Zellen steigerte PGE2 mutmaßlich über die ERK1/2-Aktivierung die Serinphosphorylierung des IRS, welche die Weiterleitung des Insulinsignals blockiert. Die Hemmung der Aktivierung von ERK1/2 hob in EP3 R-exprimierenden Zellen die Abschwächung der Insulinsignalübertragung teilweise auf. In diesen Zellen scheint die ERK1/2-Aktivierung die größte Bedeutung für die Hemmung der insulinstimulierten Akt-Phosphorylierung zu haben. Da durch die Hemmstoffe die PGE2-abhängige Modulation nicht vollständig aufgehoben wurde, scheinen darüber hinaus aber noch andere Mechanismen zur Modulation beizutragen. In den Fh hTert-Zellen wurde die Insulinrezeptorsignalkette offensichtlich über einen ERK1/2-unabhängigen, bisher nicht identifizierten Weg unterbrochen. Eine gesteigerte PGE2-Bildung im Rahmen der Adipositas ist nicht auf die peripheren Gewebe beschränkt. Auch im Hypothalamus können bei Adipositas Zeichen einer Entzündung nachgewiesen werden, die mit einer gesteigerten PGE2-Bildung einhergehen. Daher wurde das EP R-Profil von primären hypothalamischen Neuronen und neuronalen Modellzelllinien charakterisiert, um zu prüfen, ob PGE2 in hypothalamischen Neuronen die Insulinsignalkette in ähnlicher Weise unterbricht wie in Hepatozyten. In allen neuronalen Zellen hemmte die Vorinkubation mit PGE2 die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung nicht. In der neuronalen hypothalamischen Zelllinie N 41 wirkte PGE2 eher synergistisch mit Insulin. In durch Retinsäure ausdifferenzierten SH SY5Y-Zellen waren die Ergebnisse allerdings widersprüchlich. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Expression der EP Rezeptoren im Verlauf der Kultur stark schwankte und somit die EP R-Ausstattung der Zellen zwischen den Zellversuchen variierte. Auch in den primären hypothalamischen Neuronen variierte die EP R-Expression abhängig vom Differenzierungszustand und PGE2 beeinflusste die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung nicht. Obwohl in allen neuronalen Zellen die Akt-Phosphorylierung durch Insulin gesteigert wurde, konnte in keiner der Zellen eine insulinabhängige Regulation der Expression von Insulinzielgenen (POMC und AgRP) nachgewiesen werden. Das liegt wahrscheinlich an dem niedrigen Differenzierungsgrad der untersuchten Zellen. Im Rahmen der Adipositas kommt es zu einer Überaktivierung des Endocannabinoidsystems. Endocannabinoidrezeptoren sind mit den EP Rezeptoren verwandt. Daher wurde geprüft, ob Endocannabinoide die Insulinsignalweiterleitung in ähnlicher Weise beeinflussen können wie PGE2. Die Vorinkubation der N 41-Zellen für 330 min mit einem Endocannabinoidrezeptoragonisten steigerte die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung, was auf einen insulinsensitiven Effekt von Endocannabinoiden hindeutet. Dies steht im Widerspruch zu der in der Literatur beschriebenen endocannabinoidabhängigen Insulinresistenz, die aber auf indirekte, durch Endocannabinoide ausgelöste Veränderungen zurückzuführen sein könnte.
Micronutrients play an important role in function and health maintenance for the eye. Especially lutein, zeaxanthin and omega-3 fatty acids perform remarkable functions: lutein together with zeaxanthin forms the macular pigment, these carotenoids filter out the damaging blue light component from the sunlight as well as the ultraviolet light which leads to improved contrast sensitivity and less problems with screen glare. Furthermore, the macular pigment has antioxidant and anti-inflammatory effects. The omega-3 fatty acids also possess anti-inflammatory effects and, when converted into neuroprotectin, they protect against oxidative induced apoptosis in the retina. They are also responsible for the fluidity and supply to the photoreceptor membrane. These properties are important for the prevention and treatment of degenerative eye diseases like age-related macular degeneration. However, older people are often not sufficiently supplied of micronutrients in their diet. Because the supply of nutrients can hardly be achieved by dietary change, the additional intake in the form of food supplements is useful in this age group. Scientific studies have shown the positive effects of supplementation with micronutrients such as lutein/zeaxanthin, vitamin C, vitamin E, zinc and omega-3 fatty acids, docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid (DHA and EPA). Currently available nutritional products are based in part on the ingredients of the ARED study (Age Related Eye Disease Study). According to more recent studies formulations containing lutein and omega-3 fatty acids in physiologically meaningful doses without additional beta-carotene should be preferred. 10 to 20 mg of lutein and zeaxanthin represent a safe daily dose Regarding to the context above, beta-carotene in high doses plays a minor role to the eye and is especially critical for the health of smokers. This paper summarises the functions of the presented micronutrients in the eye and can assist ophthalmologists in advising their patients.
Die Toxizität und Kanzerogenität von rein aromatischen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) ist seit Jahrzehnten bekannt und umfassend erforscht. Die alkylierten PAK (alkPAK) besitzen jedoch aufgrund ihrer Alkylgruppe eine weitere Möglichkeit zur Bioaktivierung und müssen daher gesondert betrachtet werden. Die Alkylgruppe wird zunächst hydroxyliert, anschließend zur Säure oxidiert oder direkt konjugiert. Entstehen hierbei instabile benzylische Sulfokonjugate, so können diese DNA-Addukte bilden und zu Mutationen führen. In Hinblick auf die Bioaktivierung von alkPAK galt es daher zu klären welchen Einfluss die Struktur auf die benzylische Hydroxylierung hat und welche humanen Formen der löslichen Sulfotransferasen besonders an der Umsetzung der alkPAK-Derivate beteiligt sind. Die Untersuchung der Albuminbindung von Schwefelsäureestern sowie ihre Aufnahme in Nierenzellen sollten Aufschluss hinsichtlich möglicher Transportvorgänge geben. Für die in-vivo-Situation wurde weiterhin die Modulation des Metabolismus ausgewählter benzylischer Alkohole durch verschiedene Nahrungsmittelbestandteile, Arzneimittel und Fremdstoffe an Ratten untersucht. Als Biomarker wurden benzylische Carbonsäuren im Urin und die entsprechenden Mercaptursäuren in Urin und Fäzes betrachtet. Zunächst wurde anhand von Inkubationen mit Rattenlebermikrosomen festgestellt, dass insbesondere größere Ringsystemen wie etwa alkylierte Benzo[a]pyrene im Gegensatz zu Methylpyrenen in wesentlich geringerem Umfang zum benzylischen Alkohol umgesetzt werden. Dies wurde auch in Untersuchungen mit humanen Lebermikrosomen bestätigt. Untersuchungen an einzelnen humanen Cytochromen P450 zeigten, dass insbesondere die durch PAK induzierbaren Formen hCYP1A1 und 1B1 hohe Umsatzraten aufwiesen. Die hepatisch exprimierten Formen hCYP1A2 und 3A4 waren jedoch auch zur Bildung der benzylischen Alkohole in der Lage. Für die anschließende Sulfonierung der benzylischen Alkohole wurden besonders hohe Aktivitäten mit den humanen Sulfotransferasen hSULT1A1, 1A2, 1C2 und 1E1 festgestellt. Aufgrund der Enzymexpression und der guten Durchblutung, die eine gute Substratversorgung ermöglicht, ist die Leber als Hauptort der benzylischen Hydroxylierung und Sulfonierung anzusehen. Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zeigen jedoch, dass nach 1-Hydroxymethylpyren-Applikation bei Ratten die Niere die höchste Zahl an DNA-Addukten aufweist. Wegen der Fokussierung der Sulfonierung auf die Leber ist die systemische Verteilung der Schwefelsäureester die einzig plausible Erklärung. So wurde im Rahmen dieser Arbeit eine hochaffine Bindungsstelle für 2-Sulfoxymethylpyren an Albumin beschrieben und die Aufnahme von benzylischen Sulfaten durch die humanen organischen Anionentransporter hOAT1, 3 und 4 in Nierenzellen in vitro gezeigt. Für die in-vivo-Situation wurde der Einfluss von Ethanol, 4-Methylpyrazol, Pentachlorphenol, Quercetin und Disulfiram untersucht. Neben der durch die Detoxifizierung mittels Alkoholdehydrogenase und Aldehyddehydrogenase entstandenen benzylischen Carbonsäure kann als Biomarker die entsprechende Mercaptursäure herangezogen werden. Sie ist ein indirekter Nachweis für die reaktiven und toxischen benzylischen Sulfate der alkPAK. Für die beiden im Tierversuch eingesetzten benzylischen Alkohole (1-Hydroxymethylpyren und 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren) konnte sie in Urin und Fäzes nachgewiesen werden. Es wurde jedoch ein deutlicher Unterschied in der gebildeten Menge sowie der Verteilung zwischen Urin und Fäzes für die beiden Mercaptursäuren festgestellt. Hierfür sind wahrscheinlich Unterschiede im Transport der benzylischen Schwefelsäureester sowie der Spezifität der an der Mercaptursäurebildung beteiligten Enzyme verantwortlich. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass der humane organische Anionentransporter hOAT1 1,8-Dimethylpyrenmercaptursäure nicht und der hOAT3 nur mit niedrigen Umsatzraten transportiert. Bei den Modulatoren zeigte die Gabe der kompetitiven Alkoholdehydrogenase-Hemmstoffe Ethanol und 4-Methylpyrazol die Bedeutung der Alkoholdehydrogenasen für die Entgiftung der benzylischen Alkohole: Die Oxidation zur entsprechenden Carbonsäure war reduziert und die Bildung der Mercaptursäure erhöht. Eine Hemmung der Toxifizierung vermittelt durch Sulfotransferase-Inhibitoren konnte nur für Pentachlorphenol beim Metabolismus des 1-Hydroxymethylpyrens beobachtet werden. Gleichzeitig erwies sich Pentachlorphenol als kompetitiver Alkoholdehydrogenase-Inhibitor, da eine signifikant geminderte Carbonsäureausscheidung zu beobachten war. Bei 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren traten diese Effekte nicht auf. Die unterschiedlichen bzw. unterschiedlich starken Effekte der Modulatoren beim Metabolismus der verschiedenen benzylischen Alkohole bestätigen die Beobachtungen aus den in-vitro-Untersuchungen, dass unterschiedliche Enzym- und Transporteraffinitäten und –aktivitäten vorliegen.
Mercaptursäure und Nukleosidaddukt im Harn als Biomarker in 1-Hydroxymethylpyren-exponierten Ratten
(2002)
1-Methylpyren (MP) ist hepatokanzerogen in neugeborenen männlichen Mäusen. Durch Hydroxylierung an der benzylischen Stelle und anschließende Sulfonierung wird MP zu DNA-reaktivem 1-Sulfooxymethylpyren (SMP) aktiviert. In der Ratte führt die Exposition des benzylischen Alkohols, 1-Hydroxymethylpyren (HMP), zur DNA-Adduktbildung in verschiedenen Geweben. Eventuelle Konsequenz der Toxifizierung ist die Ausscheidung entsprechender Mercaptursäure und Nukleosidaddukt im Harn, welche aufgrund ihrer Herkunft als Biomarker eignen könnten. In dieser Arbeit wird die Ausscheidung der Mercaptursäure und des N2-Desoxyguanosinadduktes in HMP-exponierten Ratten untersucht. Nach der Applikation von HMP bzw. MP wurden weniger als 1 % der Dosis als MPMA über Urin und Faeces ausgeschieden (0 - 48 h). Die Ausscheidung erfolgt hauptsächlich in den ersten 24 h nach der Applikation. MPdG konnte weder in Urin noch in Faeces der HMP-behandelten Tieren identifiziert werden. Nach direkter SMP-Applikation wurde MPdG nur in sehr geringe Menge (weniger als 0,9 ppm in 12 h) im Urin gefunden. Aufgrund der geringen Menge eignet sich MPdG nicht als Biomarker. MPMA dagegen, lässt sich analytisch gut erfassen. Es sollte daher untersucht werden, ob MPMA die Toxifizierung des HMP wiederspiegelt. Die Voraussetzung dafür ist die Kenntnisse über das Metabolismusmuster von HMP. Es wurde daher umfassende Untersuchungen zum Metabolismus des HMP durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass mehr als 80 % der Metaboiten in ihrer oxidierten Form (PCS, deren Glucuronsäure-Konjugate sowie phenolische Sulfatester der PCS) ausgeschieden wurden. Demnach spielt die Oxidation des HMP zu PCS eine sehr wichtige Rolle bei der Detoxifizierung und Ausscheidung von HMP. Ferne konnte nachgewiesen werden, dass die Enzyme Alkohol- und Aldehyd-Dehydrogenase an der Oxidation von HMP beteiligt waren. Die Inhibitoren Disulfiram und Ethanol der o. g. Enzyme wurde daher zur Modulation der Detoxifizierung in vivo eingesetzt. Die Veränderungen in der Toxifizierung von HMP zu SMP wurden durch die SMP-Konzentration im Plasma, die DNA-Addukthäufigkeit und die MPMA-Ausscheidung erfasst. Die Vorbehandlung von Disulfiram und Ethanol führte zu tendentielle Erhöhung der SMP-Konzentration im Plasma, DNA-Addukthäufigkeit in der Leber und die MPMA-Ausscheidung. Bemerkenswert ist jedoch, dass bereits eine Dosis von 0,2 g Ethanol/kg Körpermasse bereits zu statistisch signifikanten Erhöhungen der MPMA-Ausscheidung bei weiblichen Ratten.
Mechanismen zur Detoxifizierung von Benzo[a]pyren-Metaboliten in der gastrointestinalen Barriere
(2009)
Insulinresistenz ist ein zentraler Bestandteil des metabolischen Syndroms und trägt maßgeblich zur Ausbildung eines Typ-2-Diabetes bei. Eine mögliche Ursache für die Entstehung von Insulinresistenz ist eine chronische unterschwellige Entzündung, welche ihren Ursprung im Fettgewebe übergewichtiger Personen hat. Eingewanderte Makrophagen produzieren vermehrt pro-inflammatorische Mediatoren, wie Zytokine und Prostaglandine, wodurch die Konzentrationen dieser Substanzen sowohl lokal als auch systemisch erhöht sind. Darüber hinaus weisen übergewichtige Personen einen gestörten Fettsäuremetabolismus und eine erhöhte Darmpermeabilität auf. Ein gesteigerter Flux an freien Fettsäuren vom Fettgewebe in andere Organe führt zu einer lokalen Konzentrationssteigerung in diesen Organen. Eine erhöhte Darmpermeabilität erleichtert das Eindringen von Pathogenen und anderer körperfremder Substanzen in den Körper.
Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob hohe Konzentrationen von Insulin, des bakteriellen Bestandteils Lipopolysaccharid (LPS) oder der freien Fettsäure Palmitat eine Entzündungsreaktion in Makrophagen auslösen oder verstärken können und ob diese Entzündungsantwort zur Ausbildung einer Insulinresistenz beitragen kann. Weiterhin sollte untersucht werden, ob Metabolite und Signalsubstanzen, deren Konzentrationen beim metabolischen Syndrom erhöht sind, die Produktion des Prostaglandins (PG) E2 begünstigen können und ob dieses wiederum die Entzündungsreaktion und seine eigene Produktion in Makrophagen regulieren kann. Um den Einfluss dieser Faktoren auf die Produktion pro-inflammatorischer Mediatoren in Makrophagen zu untersuchen, wurden Monozyten-artigen Zelllinien und primäre humane Monozyten, welche aus dem Blut gesunder Probanden isoliert wurden, in Makrophagen differenziert und mit Insulin, LPS, Palmitat und/ oder PGE2 inkubiert. Überdies wurden primäre Hepatozyten der Ratte isoliert und mit Überständen Insulin-stimulierter Makrophagen inkubiert, um zu untersuchen, ob die Entzündungsanwort in Makrophagen an der Ausbildung einer Insulinresistenz in Hepatozyten beteiligt ist.
Insulin induzierte die Expression pro-inflammatorischer Zytokine in Makrophagen-artigen Zelllinien wahrscheinlich vorrangig über den Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-Akt-Signalweg mit anschließender Aktiverung des Transkriptionsfaktors NF-κB (nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells). Die dabei ausgeschütteten Zytokine hemmten in primären Hepatozyten der Ratte die Insulin-induzierte Expression der Glukokinase durch Überstände Insulin-stimulierter Makrophagen.
Auch LPS oder Palmitat, deren lokale Konzentrationen im Zuge des metabolischen Syndroms erhöht sind, waren in der Lage, die Expression pro-inflammatorischer Zytokine in Makrophagen-artigen Zelllinien zu stimulieren. Während LPS seine Wirkung, laut Literatur, unbestritten über eine Aktivierung des Toll-ähnlichen Rezeptors (toll-like receptor; TLR) 4 vermittelt, scheint Palmitat jedoch weitestgehend TLR4-unabhängig wirken zu können. Vielmehr schien die de novo-Ceramidsynthese eine entscheidene Rolle zu spielen. Darüber hinaus verstärkte Insulin sowohl die LPS- als auch die Palmitat-induzierte Ent-zündungsantwort in beiden Zelllinien. Die in Zelllinien gewonnenen Ergebnisse wurden größtenteils in primären humanen Makrophagen bestätigt.
Desweiteren induzierten sowohl Insulin als auch LPS oder Palmitat die Produktion von PGE2 in den untersuchten Makrophagen. Die Daten legen nahe, dass dies auf eine gesteigerte Expression PGE2-synthetisierender Enzyme zurückzuführen ist.
PGE2 wiederum hemmte auf der einen Seite die Stimulus-abhängige Expression des pro-inflammatorischen Zytokins Tumornekrosefaktor (TNF) α in U937-Makrophagen. Auf der anderen Seite verstärkte es jedoch die Expression der pro-inflammatorischen Zytokine Interleukin- (IL-) 1β und IL-8. Darüber hinaus verstärkte es die Expression von IL-6-Typ-Zytokinen, welche sowohl pro- als auch anti-inflammatorisch wirken können. Außerdem vestärkte PGE2 die Expression PGE2-synthetisierender Enzyme. Es scheint daher in der Lage zu sein, seine eigene Synthese zu verstärken.
Zusammenfassend kann die Freisetzung pro-inflammatorischer Mediatoren aus Makro-phagen im Zuge einer Hyperinsulinämie die Entstehung einer Insulinresistenz begünstigen. Insulin ist daher in der Lage, einen Teufelskreis der immer stärker werdenden Insulin-resistenz in Gang zu setzen.
Auch Metabolite und Signalsubstanzen, deren Konzentrationen beim metabolischen Syndrom erhöht sind (zum Beispiel LPS, freie Fettsäuren und PGE2), lösten Entzündungsantworten in Makrophagen aus. Das wechselseitige Zusammenspiel von Insulin und diesen Metaboliten und Signalsubstanzen löste eine stärkere Entzündungsantwort in Makrophagen aus als jeder der Einzelkomponenten. Die dadurch freigesetzten Zytokine könnten zur Manifestation einer Insulinresistenz und des metabolischen Syndroms beitragen.
Darmkrebs ist die zweithäufigste malignombedingte Todesursache in den westlichen Industrieländern. Durch eine frühzeitige Diagnose besteht jedoch eine hohe Chance auf Heilung. Der Goldstandard zur Darmkrebsfrüherkennung ist gegenwärtig die Koloskopie. Eine Darmspiegelung ist jedoch invasiv und mit Unannehmlichkeiten für den Patienten verbunden. Die Akzeptanz in der Bevölkerung ist daher gering. Ziel des BMBF- Projektes „Entwicklung eines nichtinvasiven Nachweissystems zur Früherkennung von humanem Darmkrebs“, in dessen Rahmen diese Arbeit entstand, ist die Bereitstellung eines nichtinvasiven Nachweisverfahrens zur Darmkrebsfrüherkennung. Der Nachweis soll über die Detektion von aus neoplastischen Zellen stammender DNA in Stuhl erfolgen. Die Entartung dieser Zellen beruht auf Veränderungen im Erbgut, welches unter anderem Mutationen sind. Im ersten Teil des BMBF-Projektes wurde ein Set von Mutationen zusammengestellt, welches eine hohe Sensitivität für Vorstufen von Darmkrebs aufweist. Ziel dieser Arbeit war es, eine Nachweismethode für die zuvor identifizierten Punktmutationen zu entwickeln. Das Nachweisverfahren musste dabei unempfindlich gegen einen hohen Hintergrund nichtmutierter DNA sein, da im Stuhl geringe Mengen DNA aus neoplastischen Zellen bei einem hohen Hintergrund von DNA aus gesunden Zellen vorliegen. Hierzu wurden Plasmidmodellsysteme für die aus dem Marker-Set stammenden Genfragmente BRAF und dessen Mutante V600E, CTNNB1 und T41I, T41A, S45P und K-ras G12C hergestellt. Mit Hilfe dieser Plasmidmodellsysteme wurde dann das Nachweissystem entwickelt. Der entscheidende Schritt für die Detektion von Punktmutationen bei hohem Wildtypüberschuss ist eine vorhergehende Anreicherung. In der vorliegenden Arbeit wurde dazu die Methode der LNA-clamp-PCR (locked nucleic acid) etabliert. Die Bewertung der erzielten Anreicherung erfolgte über das relative Detektionslimit. Zur Bestimmung des Detektionslimits wurde die Schmelzkurvenanalyse von Hybridisierungssonden eingesetzt; diese wurde im Rahmen dieser Arbeit für die drei oben genannten Genfragmente und ihre Mutanten entwickelt. Die LNA-clamp-PCR wird in Anwesenheit eines LNA-Blockers durchgeführt. Das Nukleotidanalogon LNA weist im Vergleich zu DNA eine erhöhte Affinität zu komplementären DNA-Strängen auf. Gleichzeitig kommt es bei Anwesenheit einer Basenfehlpaarung zu einer größeren Destabilisierung der Bindung. Als Blocker werden kurze LNA-DNA-Hybridoligonukleotide eingesetzt, die den mutierten Sequenzbereich überspannen und selbst der Wildtypsequenz entsprechen. Durch Bindung an die Wildtypsequenz wird deren Amplifikation während der PCR verhindert (clamp = arretieren, festklemmen). Der Blocker selbst wird dabei nicht verlängert. Der Blocker bindet unter optimalen Bedingungen jedoch nicht an die mutierte Sequenz. Die Mutante wird daher ungehindert amplifiziert und somit gegenüber dem Wildtyp-Fragment angereichert. Die Position des Blockers kann im Bindungsbereich eines der Primer sein und hier dessen Hybridisierung an dem Wildtyp-Fragment verhindern oder zwischen den beiden Primern liegen und so die Synthese durch die Polymerase inhibieren. Die Anwendbarkeit beider Systeme wurde in dieser Arbeit gezeigt. Die LNA-clamp-PCR mit Primerblocker wurde für BRAF etabliert. Es wurde ein Detektionslimit von mindestens 1:100 erzielt. Die LNA-clamp-PCR mit Amplifikationsblocker wurde erfolgreich für BRAF, K-ras und CTNNB1: T41I, T41A mit einem Detektionslimit von 1:1000 bis 1:10 000 entwickelt. In Stuhlproben liegt DNA aus neoplastischen Zellen nach Literaturangaben zu einem Anteil von 1% bis 0,1% vor. Die LNA-clamp-PCR weist also mit Amplifikationsblockern ein ausreichend hohes Detektionslimit für die Analyse von Stuhlproben auf. Durch die erfolgreiche Etablierung der Methode auf drei verschiedenen Genfragmenten und vier unterschiedlichen Punktmutationen konnte deren universelle Einsetzbarkeit gezeigt werden. Für die Ausweitung der LNA-clamp-PCR auf die übrigen Mutationen des Marker-Sets wurden Richtlinien ausgearbeitet und die Blockereffizienz als Kennzahl eingeführt. Die LNA-clamp-PCR ist ein schnelles, kostengünstiges Verfahren, welches einen geringen Arbeitsaufwand erfordert und wenig fehleranfällig ist. Sie ist somit ein geeignetes Anreicherungsverfahren für Punktmutationen in einem diagnostischen System zur Darmkrebsfrüherkennung. Darüber hinaus kann die LNA-clamp-PCR auch in anderen Bereichen, in denen die Detektion von Punktmutationen in einem hohen Wildtyphintergrund erforderlich ist, eingesetzt werden.
Lexikon der Veterinärmedizin
(2000)