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Arabidopsis thaliana trichomes exhibit strong birefringence under polarized light, a characteristic of cell walls containing large amounts of highly ordered cellulose microfibrils. The tbr1 mutant of Arabidopsis lacks trichome birefringence and is deficient in secondary cell wall cellulose synthesis (Potikha and Delmer, 1995). The TBR gene was identified by recombinational mapping, candidate gene sequencing and molecular complementation using genomic cosmid clones, as well as a p35S:TBR genomic DNA construct, fully rescuing the mutant phenotype in both cases. The only mutant allele available (tbr-1) carries a substitution (G to E) in a conserved aminoacid domain of the protein. TBR gene structure was proved to have a longer size than the one found to be annotated at the time of identification in the data-base. A full cDNA clone containing the full transcript was available and also complementation experiments using different gene fragments (annotated and suggested) leaded to the result that TBR gene is indeed, longer. TBR encodes a novel plant-specific protein with predicted plasma membrane localization, therefore being consistent with idea that is required for-, or is a novel component of a functional cellulose synthase complex. TBR is part of an Arabidopsis gene/protein family, (TBL-trichome birefringence like) which, depending on homology, comprises up to 20 members, none of which has a biological or biochemical function attributed. T-DNA insertion lines in TBR gene and two close homologues have been screened by PCR, but no homozygous were found and no trichomes phenotype was identified. Promoter-GUS lines were produced for TBR, as well as for its two closest homologues (one being a segmentally duplicated gene on chromosome III), using 1.6-2 kb of promoter sequence upstream of the annotated start codons. The TBR promoter was the only one of the three that yielded trichome expression, this probably explaining the phenotype of the TBR mutant. Moreover, TBR is expressed in leaves, in growing lateral roots, and in vascular tissues of young Arabidopsis seedlings and plantlets. Later on, the expression appears in inflorescens, stems, flowers and green siliques. This expression pattern is largely overlapping with those of the two analyzed homologues and it corresponds with data of RT-PCR expression profiling performed for TBR and the two analyzed homologues in different tissues, at different developmental stages. Biochemical analysis of cell wall (leaves and trichomes), as GC and MALDI-TOF, were performed, but revealed no major differences between tbr1 and wild type plants. Scanning electron microscopy analysis and cell wall polysaccharides antibody labeling showed a clear difference in the trichomes cell wall structure between mutant plant and wild type.
Die Tailspike Proteine (TSP) der Bakteriophagen P22, Sf6 und HK620 dienen der Erkennung von Kohlenhydratstrukturen auf ihren gram-negativen Wirtsbakterien und zeigen, von den ersten 110 Aminosäuren des N-Terminus abgesehen, keine Sequenzübereinstimmung. Mit Röntgenkristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, dass HK620TSP und Sf6TSP ebenfalls zu einer parallelen, rechtsgängigen beta-Helix falten, wie dies schon für P22TSP bekannt war. Die Kohlenhydratbindestelle ist bei Sf6TSP im Vergleich zu P22TSP zwischen die Untereinheiten verschoben.
Das Borna Disease Virus (BDV, Bornavirus) besitzt ein einzelsträngiges RNA-Genom negativer Polarität und ist innerhalb der Ordnung Mononegavirales der Prototyp einer eigenen Virusfamilie, die der Bornaviridae. Eine außergewöhnliche Eigenschaft des Virus ist seine nukleäre Transkription und Replikation, eine weitere besteht in seiner Fähigkeit, als neurotropes Virus sowohl in vivo als auch in vitro persistente Infektionen zu etablieren. Die zugrunde liegenden Mechanismen sowohl der Replikation als auch der Persistenz sind derzeit noch unzureichend verstanden, auch deshalb, weil das Virus noch relativ „jung“ ist: Erste komplette Sequenzen des RNA-Genoms wurden 1994 publiziert und erst vor einigen Monaten gelang die Generierung rekombinanter Viren auf der Basis klonierter cDNA. Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen das p10 Protein und das Phosphoprotein (P), die von der gemeinsamen Transkriptionseinheit II in überlappenden Leserahmen kodiert werden. Als im Kern der Wirtszelle replizierendes Virus ist das Bornavirus auf zelluläre Importmechanismen angewiesen, um den Kernimport aller an der Replikation beteiligten viralen Proteine zu gewährleisten. Das p10 Protein ist ein negativer Regulator der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (L). In vitro Importexperimente zeigten, dass p10 über den klassischen Importin alpha/beta abhängigen Kernimportweg in den Nukleus transportiert wird. Dies war unerwartet, da p10 kein vorhersagbares klassisches Kernlokalisierungssignal (NLS) besitzt und weist darauf hin, dass der zelluläre Importapparat offensichtlich flexibler ist als allgemein angenommen. Die ersten 20 N-terminalen AS vermitteln sowohl Kernimport als auch die Bindung an den Importrezeptor Importin alpha. Durch Di-Alanin-Austauschmutagenese wurden die für diesen Transportprozess essentiellen AS identifiziert und die Bedeutung hydrophober und polarer AS-Reste demonstriert. Die Fähigkeit des Bornavirus, persistente Infektionen zu etablieren, wirft die Frage auf, wie das Virus die zellulären antiviralen Abwehrmechanismen, insbesondere das Typ I Interferon (IFN)-System, unterwandert. Das virale P Protein wurde in dieser Arbeit als potenter Antagonist der IFN-Induktion charakterisiert. Es verhindert die Phosphorylierung des zentralen Transkriptionsfaktors IRF3 durch die zelluläre Kinase TBK1 und somit dessen Aktivierung. Der Befund, dass P mit TBK1 Komplexe bildet und zudem auch als Substrat für die zelluläre Kinase fungiert, erlaubt es, erstmalig einen Mechanismus zu postulieren, in dem ein virales Protein (BDV-P) als putatives TBK1-Pseudosubstrat die IRF3-Aktivierung kompetitiv hemmt.
The major aim of this work was the identification of new phloem sap proteins and a metabolic characterisation of this transport fluid. The experiments were performed on the three plant species C. sativus, C. maxima and B. napus. To characterise the phloem samples from B. napus, a new model plant for phloem analysis, western blot tests together with metabolite profiling were performed. GC-MS metabolite profiling and enzyme assays were used for measuring metabolites in the phloem of B. napus. Results from the phloem sap measurements showed, as expected, a typical sugar distribution for apoplasmic phloem loaders with sucrose being the predominant sugar. In stem extracts, the most abundant sugar was glucose with much lower fructose and sucrose levels. With the GC-MS approach it was possible to identify a number of metabolites which showed a differential distribution when phloem and stem tissue extracts were compared. For protein identification, two different approaches were employed (i) screening expression libraries with total phloem protein specific antisera and (ii) protein separation on 2 DE gels followed by ESI-MS/MS sequence analyses. For the first approach, three different phloem protein-specific antisera were produced and expression libraries were constructed. Phloem protein antisera were tested for specificity and some attempts to estimate specific epitopes were undertaken. Screening of the libraries resulted in the identification of 14 different proteins from all investigated species. Analyses of B. napus phloem sap proteins from 2 DE with ESI-MS/MS resulted in the identification of 5 different proteins. The phloem localisation of the identified proteins was additionally confirmed by western blot tests using specific antibodies. In order to functionally characterise some selected phloem proteins from B. napus, the group of potential calcium-binding polypeptides was analysed for functional Ca<sup>+2 binding properties and several Ca<sup>+2–binding proteins could be isolated. However, their sequences could as yet not be determined. Another approach used for functional protein characterisation was the analysis of Arabidopsis T-DNA insertion mutants. Four available mutants with insertions in phloem protein-specific genes were chosen from the SALK and GABI-Kat collections and selected homozygous lines were tested for the presence of the investigated proteins. In order to verify if the product of one of the mutated gene (GRP 7) is transported through the phloem, grafting experiments were performed followed by western blot analyses. Although the employed antiserum against GRP 7 protein did not allow distinguishing between the mutant and the wild type plants, successful Arabidopsis grafting could be established as a promising method for further studies on protein translocation through the phloem.
Die Honigbiene Apis mellifera gilt seit langem als Modell-Organismus zur Untersuchung von Lern- und Gedächtnisvorgängen sowie zum Studium des Sozialverhaltens und der Arbeitsteilung. Bei der Steuerung und Regulation dieser Verhaltensweisen spielt das Indolalkylamin Serotonin eine wesentliche Rolle. Serotonin entfaltet seine Wirkung durch die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). In der vorliegenden Arbeit wird der erste Serotonin-Rezeptor aus der Honigbiene molekular charakterisiert. Durch die Anwendung zwei verschiedener Klonierungsstrategien konnten drei cDNA-Sequenzen isoliert werden, die für potentielle Serotonin-Rezeptoren kodieren. Die Sequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu dem 5-HT7- und 5-HT2-Rezeptor von Drosophila melanogaster bzw. dem 5-HT1-Rezeptor von Panulirus interruptus auf. Die isolierten Serotonin-Rezeptoren der Honigbiene wurden dementsprechend Am(Apis mellifera)5-HT1, Am5-HT2 und Am5-HT7 benannt. Das Hydropathieprofil des Am5-HT1-, Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptors deutet auf das Vorhandensein des charakteristischen heptahelikalen Aufbaus G-Protein-gekoppelter Rezeptoren hin. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen typische Merkmale biogener Amin-Rezeptoren. Aminosäuren, die eine Bedeutung bei der Bildung der Liganden-Bindungstasche, der Rezeptor-Aktivierung und der Kopplung eines G-Proteins an den Rezeptor haben, sind in allen drei Rezeptoren konserviert. Interessanterweise ist jedoch das in den meisten biogenen Amin-Rezeptoren vorhandene DRY-Motiv in dem Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptor nicht konserviert. Das Vorhandensein einer PDZ-Domäne in dem Am5-HT1- und Am5-HT7-Rezeptor lässt vermuten, dass diese Rezeptoren als Adapterproteine fungieren, die Signalmoleküle zu einem Signaltransduktionskomplex vereinigen. RT-PCR-Experimente zeigen die Expression der Rezeptoren in verschiedenen Geweben der Honigbiene. Auffallend ist die hohe Expression im Zentralgehirn. Des Weiteren konnte die Expression der Serotonin-Rezeptoren in den optischen Loben, Antennalloben sowie in der Peripherie, d.h. in der Flugmuskulatur und den Malpighischen Gefäßen nachgewiesen werden. Durch in situ Hybridisierungen wurde die Expression in Gefrierschnitten von Gehirnen adulter Sammlerinnen im Detail untersucht. Transkripte der Rezeptoren sind in den Somata von intrinsischen Pilzkörperzellen, Neuronen der optischen Loben und Neuronen der Antennalloben vorhanden. In einem heterologen Expressionssystem wurde der intrazelluläre Signalweg des Am5-HT7-Rezeptors untersucht. Die Aktivierung des stabil exprimierten Rezeptors durch Serotonin führt zur Bildung von cAMP. Der 5-HT7-Rezeptor spezifische Agonist 5-CT zeigt eine mit Serotonin vergleichbare Fähigkeit, die intrazelluläre cAMP-Konzentration zu erhöhen. Am5-HT7 gehört daher funktionell zu der Gruppe der 5-HT7-Rezeptoren. Der EC50-Wert von 1,06~nM (5-HT), ist im Vergleich zu anderen 5-HT7-Rezeptoren äußert niedrig. Des Weiteren wurde gezeigt, dass das basale cAMP-Niveau in den transfizierten Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen deutlich erhöht ist. Das heißt, dass der Rezeptor auch in der Abwesenheit eines Liganden aktiv ist. Diese konstitutive Aktivität ist auch von anderen biogenen Amin-Rezeptoren bekannt. Methiothepin wurde als wirksamer inverser Agonist des Am5-HT7-Rezeptors identifiziert, da es in der Lage ist, der konstitutiven Aktivität entgegenzuwirken. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass die Serotonin-Rezeptoren in verschiedenen Regionen des ZNS der Honigbiene an der Informationsverarbeitung beteiligt sind. Es kann eine Beeinflussung von Lern- und Gedächtnisprozessen sowie des olfaktorischen und visuellen Systems durch diese Rezeptoren vermutet werden. Mit der Klonierung und funktionellen Charakterisierung des ersten Serotonin-Rezeptors der Honigbiene ist eine Grundlage für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der serotonergen Signaltransduktion geschaffen worden.
Im Norddeutschen Tiefland wurde die Ausbreitung von Gefäßpflanzen durch Rehe, Dam- und Rothirsche sowie Wildschweine untersucht. Diese Tiere transportieren zahlreiche Pflanzenarten in teilweise erheblichen Mengen über größere Distanzen, sowohl durch den Kot nach Darmpassage (Endozoochorie) als auch durch Anheftung an Fell und Schalen (Epizoochorie). Besondere Bedeutung kommt dabei Wildschweinen zu, die potenziell fast alle Pflanzenarten ausbreiten können. Bevorzugt werden im Wald wie im Offenland vorkommende Pflanzen und Arten des Offenlands ausgebreitet, während Arten mit enger Waldbindung nur in geringem Maße transportiert werden. Zoochorie durch Schalenwild bietet Erklärungsansätze sowohl für Ausbreitungsphänomene wie auch für das weitgehend fehlende Ausbreitungspotenzial vieler Pflanzenarten. Der Einfluss des Schalenwilds auf die Artenzusammensetzung und Gefäßpflanzen-Diversität in der mitteleuropäischen Kulturlandschaft sollte in seine naturschutzfachliche Neubewertung miteinbezogen werden. Die Einschränkung von Aktionsradien der Tiere durch die Zerschneidung von Lebensräumen sowie die Wildfütterung können für Ausbreitungsprozesse bisher kaum beachtete Konsequenzen haben.
Nitrogen is an essential macronutrient for plants and nitrogen fertilizers are indispensable for modern agriculture. Unfortunately, we know too little about how plants regulate their use of soil nitrogen, to maximize fertilizers-N use by crops and pastures. This project took a dual approach, involving forward and reverse genetics, to identify N-regulators in plants, which may prove useful in the future to improve nitrogen-use efficiency in agriculture. To identify nitrogen-regulated transcription factor genes in Arabidopsis that may control N-use efficiency we developed a unique resource for qRT-PCR measurements on all Arabidpsis transcription factor genes. Using closely spaced, gene-specific primer pairs and SYBR® Green to monitor amplification of double-stranded DNA, transcript levels of 83% of all target genes could be measured in roots or shoots of young Arabidopsis wild-type plants. Only 4% of reactions produced non-specific PCR products, and 13% of TF transcripts were undetectable in these organs. Measurements of transcript abundance were quantitative over six orders of magnitude, with a detection limit equivalent to one transcript molecule in 1000 cells. Transcript levels for different TF genes ranged between 0.001-100 copies per cell. Real-time RT-PCR revealed 26 root-specific and 39 shoot-specific TF genes, most of which have not been identified as organ-specific previously. An enlarged and improved version of the TF qRT-PCR platform contains now primer pairs for 2256 Arabidopsis TF genes, representing 53 gene families and sub-families arrayed on six 384-well plates. Set-up of real-time PCR reactions is now fully robotized. One researcher is able to measure expression of all 2256 TF genes in a single biological sample in a just one working day. The Arabidopsis qRT-PCT platform was successfully used to identify 37 TF genes which transcriptionaly responded at the transcriptional level to N-deprivation or to nitrate per se. Most of these genes have not been characterized previously. Further selection of TF genes based on the responses of selected candidates to other macronutrients and abiotic stresses allowed to distinguish between TFs regulated (i) specifically by nitrogen (29 genes) (ii) regulated by general macronutrient or by salt and osmotic stress (6 genes), and (iii) responding to all major macronutrients and to abiotic stresses. Most of the N-regulated TF genes were also regulated by carbon. Further characterization of sixteen selected TF genes, revealed: (i) lack of transcriptional response to organic nitrogen, (ii) two major types of kinetics of induction by nitrate, (iii) specific responses for the majority of the genes to nitrate but not downstream products of nitrate assimilation. All sixteen TF genes were cloned into binary vectors for constitutive and ethanol inducible over expression, and the first generation of transgenic plants were obtained for almost all of them. Some of the plants constitutively over expressing TF genes under control of the 35S promoter revealed visible phenotypes in T1 generation. Homozygous T-DNA knock out lines were also obtained for many of the candidate TF genes. So far, one knock out line revealed a visible phenotype: retardation of flowering time. A forward genetic approach using an Arabidopsis ATNRT2.1 promoter : Luciferase reporter line, resulted in identification of eleven EMS mutant reporter lines affected in induction of ATNRT2.1 expression by nitrate. These lines could by divided in the following classes according to expression of other genes involved in primary nitrogen and carbon metabolism: (i) lines affected exclusively in nitrate transport, (ii) those affected in nitrate transport, acquisition, but also in glycolysis and oxidative pentose pathway, (iii) mutants affected moderately in nitrate transport, oxidative pentose pathway and glycolysis but not in primary nitrate assimilation. Thus, several different N-regulatory genes may have been mutated in this set of mutants. Map-based cloning has begun to identify the genes affected in these mutants.
Natural and human induced environmental changes affect populations at different time scales. If they occur in a spatial heterogeneous way, they cause spatial variation in abundance. In this thesis I addressed three topics, all related to the question, how environmental changes influence population dynamics. In the first part, I analysed the effect of positive temporal autocorrelation in environmental noise on the extinction risk of a population, using a simple population model. The effect of autocorrelation depended on the magnitude of the effect of single catastrophic events of bad environmental conditions on a population. If a population was threatened by extinction only, when bad conditions occurred repeatedly, positive autocorrelation increased extinction risk. If a population could become extinct, even if bad conditions occurred only once, positive autocorrelation decreased extinction risk. These opposing effects could be explained by two features of an autocorrelated time series. On the one hand, positive autocorrelation increased the probability of series of bad environmental conditions, implying a negative effect on populations. On the other hand, aggregation of bad years also implied longer periods with relatively good conditions. Therefore, for a given time period, the overall probability of occurrence of at least one extremely bad year was reduced in autocorrelated noise. This can imply a positive effect on populations. The results could solve a contradiction in the literature, where opposing effects of autocorrelated noise were found in very similar population models. In the second part, I compared two approaches, which are commonly used for predicting effects of climate change on future abundance and distribution of species: a "space for time approach", where predictions are based on the geographic pattern of current abundance in relation to climate, and a "population modelling approach" which is based on correlations between demographic parameters and the inter-annual variation of climate. In this case study, I compared the two approaches for predicting the effect of a shift in mean precipitation on a population of the sociable weaver Philetairus socius, a common colonially living passerine bird of semiarid savannahs of southern Africa. In the space for time approach, I compared abundance and population structure of the sociable weaver in two areas with highly different mean annual precipitation. The analysis showed no difference between the two populations. This result, as well as the wide distribution range of the species, would lead to the prediction of no sensitive response of the species to a slight shift in mean precipitation. In contrast, the population modelling approach, based on a correlation between reproductive success and rainfall, predicted a sensitive response in most model types. The inconsistency of predictions was confirmed in a cross-validation between the two approaches. I concluded that the inconsistency was caused, because the two approaches reflect different time scales. On a short time scale, the population may respond sensitively to rainfall. However, on a long time scale, or in a regional comparison, the response may be compensated or buffered by a variety of mechanisms. These may include behavioural or life history adaptations, shifts in the interactions with other species, or differences in the physical environment. The study implies that understanding, how such mechanisms work, and at what time scale they would follow climate change, is a crucial precondition for predicting ecological consequences of climate change. In the third part of the thesis, I tested why colony sizes of the sociable weaver are highly variable. The high variation of colony sizes is surprising, as in studies on coloniality it is often assumed that an optimal colony size exists, in which individual bird fitness is maximized. Following this assumption, the pattern of bird dispersal should keep colony sizes near an optimum. However, I showed by analysing data on reproductive success and survival that for the sociable weaver fitness in relation to colony size did not follow an optimum curve. Instead, positive and negative effects of living in large colonies overlaid each other in a way that fitness was generally close to one, and density dependence was low. I showed in a population model, which included an evolutionary optimisation process of dispersal that this specific shape of the fitness function could lead to a dispersal strategy, where the variation of colony sizes was maintained.
During this PhD project three technical platforms were either improved or newly established in order to identify interesting genes involved in SNF, validate their expression and functionally characterise them. An existing 5.6K cDNA array (Colebatch et al., 2004) was extended to produce the 9.6K LjNEST array, while a second array, the 11.6K LjKDRI array, was also produced. Furthermore, the protocol for array hybridisation was substantially improved (Ott et al., in press). After functional classification of all clones according to the MIPS database and annotation of their corresponding tentative consensus sequence (TIGR) these cDNA arrays were used by several international collaborators and by our group (Krusell et al., 2005; in press). To confirm results obtained from the cDNA array analysis different sets of cDNA pools were generated that facilitate rapid qRT-PCR analysis of candidate gene expression. As stable transformation of Lotus japonicus takes several months, an Agrobacterium rhizogenes transformation system was established in the lab and growth conditions for screening transformants for symbiotic phenotypes were improved. These platforms enable us to identify genes, validate their expression and functionally characterise them in the minimum of time. The resources that I helped to establish, were used in collaboration with other people to characterise several genes like the potassium transporter LjKup and the sulphate transporter LjSst1, that were transcriptionally induced in nodules compared to uninfected roots, in more detail (Desbrosses et al., 2004; Krusell et al., 2005). Another gene that was studied in detail was LjAox1. This gene was identified during cDNA array experiments and detailed expression analysis revealed a strong and early induction of the gene during nodulation with high expression in young nodules which declines with the age of the nodule. Therefore, LjAox1 is an early nodulin. Promoter:gus fusions revealed an LjAox1 expression around the nodule endodermis. The physiological role of LjAox1 is currently being persued via RNAi. Using RNA interference, the synthesis of all symbiotic leghemoglobins was silenced simultaneously in Lotus japonicus. As a result, growth of LbRNAi lines was severely inhibited compared to wild-type plants when plants were grown under symbiotic conditions in the absence of mineral nitrogen. The nodules of these plants were arrested in growth 14 post inoculation and lacked the characteristic pinkish colour. Growing these transgenic plants in conditions where reduced nitrogen is available for the plant led to normal plant growth and development. This demonstrates that leghemoglobins are not required for plant development per se, and proves for the first time that leghemoglobins are indispensable for symbiotic nitrogen fixation. Absence of leghemoglobins in LbRNAi nodules led to significant increases in free-oxygen concentrations throughout the nodules, a decrease in energy status as reflected by the ATP/ADP ratio, and an absence of the bacterial nitrogenase protein. The bacterial population within nodules of LbRNAi plants was slightly reduced. Alterations of plant nitrogen and carbon metabolism in LbRNAi nodules was reflected in changes in amino acid composition and starch deposition (Ott et al., 2005). These data provide strong evidence that nodule leghemoglobins function as oxygen transporters that facilitate high flux rates of oxygen to the sites of respiration at low free oxygen concentrations within the infected cells.
Nitrogen is often a limiting factor for plant growth due to its heterogenous distribution in the soil and to seasonal and diurnal changes in growth rates. In most soils, NH4+ and NO3 – are the predominant sources of inorganic nitrogen that are available for plant nutrition. In this context, plants have evolved mechanisms that enable them to optimize nitrogen acquisition, which include transporters specialized in the uptake of nitrogen and susceptible to a regulation that responds to nitrogen limiting or excess conditions. Although the average NH4+ concentrations of soils are generally 100 to 1000 times lower than those of NO3 – (Marschner, 1995), most plants preferentially take up NH4+ when both forms are present because unlike NO3– , NH4+ has not to be reduced prior to assimilation and thus requires less energy for assimilation (Bloom et al., 1992). Apart from high uptake rates in roots, high intracellular ammonium concentrations also result from quantitatively important internal breakdown of amino acids (Feng et al., 1998), and originates in high quantities during photorespiration (Mattson et al., 1997, Pearson et al., 1998). Thus, NH4+ is a key component of nitrogen metabolism for all plants and can accumulate to varying concentrations in all compartments of the cell, including the cytosol, the vacuole and in the apoplast (Wells and Miller, 2000; Nielsen and Schjoerring, 1998). Two related families of ammonium transporters (AMT1 and AMT2), containing six genes which encode transporter proteins that are specific for ammonium had been identified prior to this thesis and some genes had partially been characterised in Arabidopsis (Gazzarrini et al., 1999; Sohlenkamp et al. 2002; Kaiser et al., 2002). However, these studies were not sufficient to assign physiological functions to the individual transporters and AMT1.4 and AMT1.5 had not been studied prior to this thesis. Given this background, it was considered desirable to acquire a deeper knowledge of the physiological functions of the six Arabidopsis ammonium transporters. To this end, tissue specific expression profiles of the individual wildtype AtAMT genes were performed by quantitative real time PCR (qRT-PCR) and promoter-GUS expression. Modern approaches such as the use of T-DNA insertional mutants and RNAi hairpin constructs were employed to reduce the expression levels of AMT genes. Transcript levels were determined, and physiological, biochemical and developmental analysis such as growth tests on different media and 14C-MA and NH4+ uptake studies with the isolated insertional mutants and RNAi lines were performed to deepen the knowledge of the individual functions of the six AMTs in Arabidopsis. In addition, double mutants of the insertional mutants were created to investigate the extent in which homologous genes could compensate for lost transporter functions. The results described in this thesis show that the six AtAMT genes display a high degree of specifity in their tissue specific expression and are likely to play complementary roles in ammonium uptake into roots, in shoots, and in flowers. AtAMT1.1 is likely to be a ‘work horse’ for cellular ammonium transport and reassimilation. A major role is probably the recapture of photorespiratory NH3/NH4+ escaping from the cytosol. In roots, it is likely to transport NH4+ from the apoplast into cortical cells. AtAMT1.3 and AtAMT1.5 appear to be specialised in the acquisition of external NH4+ from the soil. Furthermore, AtAMT1.5 plays an additional role in the reassimilation of NH3/NH4+ released during the breakdown of storage proteins in the cotyledons of germinating seedlings. It was difficult to distinguish a specialisation between the transporters AtAMt1.2 and AtAMt1.1, however the root and flower specific expression patterns are different and indicate alternative functions of both. AtAMT1.4 has a very distinct expression which is restricted to the vascular bundels of leaves and to pollen only, where it is likely to be involved in the loading of NH4+ into the cells.The AtAMT2.1 expression pattern is confined to vascular bundels and meristematic active tissues in leaves where ammonium concentrations can reach very high levels. Additionally, the Vmax of AtAMT2 increases with increasing external pH, contrasting to AtAMT1.1. Thus, AtAMT2.1 it might be specialised in ammonium transport in ammonium rich environments, where the functions of other transporters are limited, enabling cells to take up NH4+ over a wide range of concentrations. The root hair expression ascribes an additional role in NH3/NH4+ acquisition where it possibly serves as a transporter that is able to acquire ammonium from basic soils where other transporters become less effective.RNAi lines showing a reduction in AtAMT gene mRNA levels and NH4+ transport kinetics, grew slower and flowering time was delayed. This indicates that NH4+ is a crucial and limiting factor for plant growth.
The protection of species is one major focus in conservation biology. The basis for any management concept is the knowledge of the species autecology. In my thesis, I studied the life-history traits and population dynamics of the endangered Lesser Spotted Woodpecker (Picoides minor) in Central Europe. Here, I combine a range of approaches, from empirical investigations of a Lesser Spotted Woodpecker population in the Taunus low mountain range in Germany, the analysis of empirical data and the development of an individual-based stochastic model simulating the population dynamics. In the field studies I collected basic demographic data of reproductive success and mortality. Moreover, breeding biology and behaviour were investigated in detail. My results showed a significant decrease of the reproductive success with later timing of breeding, caused by deterioration in food supply. Moreover, mate fidelity was of benefit, since pairs composed of individuals that bred together the previous year started earlier with egg laying and obtained a higher reproductive success. Both sexes were involved in parental care, but the care was only shared equally during incubation and the early nestling stage. In the late nestling stage, parental care strategies differed between sexes: Females considerably decreased feeding rate with number of nestlings and even completely deserted small broods. Males fed their nestlings irrespective of brood size and compensated for the females absence. The organisation of parental care in the Lesser Spotted Woodpecker is discussed to provide the possibility for females to mate with two males with separate nests and indeed, polyandry was confirmed. To investigate the influence of the observed flexibility in the social mating system on the population persistence, a stochastic individual-based model simulating the population dynamics of the Lesser Spotted Woodpecker was developed, based on empirical results. However, pre-breeding survival rates could not be obtained empirically and I present in this thesis a pattern-oriented modelling approach to estimate pre-breeding survival rates by comparing simulation results with empirical pattern of population structure and reproductive success on population level. Here, I estimated the pre-breeding survival for two Lesser Spotted Woodpecker populations on different latitudes to test the reliability of the results. Finally, I used the same simulation model to investigate the effect of flexibility in the mating system on the persistence of the population. With increasing rate of polyandry in the population, the persistence increased and even low rates of polyandry had a strong influence. Even when presuming only a low polyandry rate and costs of polyandry in terms of higher mortality and lower reproductive success for the secondary male, the positive effect of polyandry on the persistence of the population was still strong. This thesis greatly helped to increase the knowledge of the autecology of an endangered woodpecker species. Beyond the relevance for the species, I could demonstrate here that in general flexibility in mating systems are buffer mechanisms and reduce the impact of environmental and demographic noise.
Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des multidisziplinären Deutsch-Russischen Verbundprojektes "Laptev See 2000" erstellt. Die dargestellten bodenkundlichen und mikro-biologischen Untersuchungen verfolgten das Ziel die mikrobielle Lebensgemeinschaft eines Permafrostbodens im sibirischen Lena Delta zu charakterisieren, wobei den methanogenen Archaea besondere Beachtung zukam. Die Probennahme wurde im August 2001 im zentralen Lenadelta, auf der Insel Samoylov durchgeführt. Das Delta liegt im Bereich des kontinuierlichen Permafrostes, was bedeutet, dass nur eine flache saisonale Auftauschicht während der Sommermonate auftaut. Das untersuchte Bodenprofil lag im Zentrum eines für die Landschaft repräsentativen Low Center Polygons. Zum Zeitpunkt der Beprobung betrug die Auftautiefe des untersuchten Bodens 45 cm.. Der Wasserstand lag zum Untersuchungszeitpunkt 18 cm unter der Geländeoberfläche, so dass alle tiefer liegenden Horizonte durch anaerobe Verhältnisse charakterisiert waren. Die Untersuchung der bodenkundlichen Parameter ergab unter anderem eine mit zunehmender Tiefe abnehmende Konzentration von Kohlenstoff und Stickstoff, sowie eine Abnahme von Temperatur und Wurzeldichte. Um die Auswirkungen der sich mit der Tiefe verändernden Bodeneigenschaften auf die Mikroorganismen zu ermitteln, wurden die Mikroorganismenpopulationen der verschiedenen Bodentiefen mit Hilfe der Fluoreszenz in situ Hybridisierung hinsichtlich ihrer Anzahl, Aktivität und Zusammensetzung beschrieben. Für die Charakterisierung des physiologischen Profils dieser Gemeinschaften, bezüglich der von ihr umsetzbaren Kohlenstoffverbindungen, wurden BIOLOG Mikrotiterplatten unter den in situ Bedingungen angepassten Bedingungen eingesetzt. Die sich im Profil verändernden Bodenparameter, vor allem die abnehmende Substratversorgung, die geringe Temperatur und die anaeroben Verhältnisse in den unteren Bodenschichten führten zu einer Veränderung der Mikroorganismenpopulation im Bodenprofil. So nahm von oben nach unten die Gesamtanzahl der ermittelten Mikroorganismen von 23,0 × 108 auf 1,2 × 108 Zellen g-1 ab. Gleichzeitig sank der Anteil der aktiven Zellen von 59% auf 33%. Das bedeutet, dass im Bereich von 0-5 cm 35mal mehr aktive Zellen g-1 als im Bereich von 40-45 cm gefunden wurden. Durch den Einsatz spezieller rRNS-Sonden konn-te zusätzlich eine Abnahme der Diversität mit zunehmender Bodentiefe nachgewiesen werden. Die geringere Aktivität der Population in den unteren Horizonten sowie die Unterschiede in der Zusammensetzung wirkten sich auf den Abbau der organischen Substanz aus. So wur-den die mit Hilfe der BIOLOG Mikrotiterplatten angebotenen Substanzen in größerer Tiefe langsamer und unvollständiger abgebaut. Insbesondere in den oberen 5 cm konnten einige der angebotenen Polymere und Kohlehydrate deutlich besser als im restlichen Profil umge-setzt werden. Das außerdem unter anaeroben Versuchsbedingungen diese Substrate deutlich schlechter umgesetzt wurden, kann so interpretiert werden, dass die konstant anaeroben Bedingungen in den unteren Horizonten ein Auftreten der Arten, die diese Substrate umset-zen, erschweren. Die in den oberen, aeroben Bodenabschnitten wesentlich höheren Zellzahlen und Aktivitäten und die dadurch schnellere C-Umsetzung führen auch zu einer besseren Substratversorgung der methanogenen Archaea in den makroskopisch aeroben Horizonten. Die erhöhte Substratverfügbarkeit erklärt die Tatsache, dass im Bereich von 0-5 cm die meisten methanogenen Archaea gefunden wurden, obwohl sich dieser Bereich zum Zeitpunkt der Probennahme oberhalb des wassergesättigten Bodenbereichs befand. Trotz der aeroben Bedingungen in, liegt im Bereich von 5 10 cm die für die methanogenen Archaea am besten geeignete Kombination aus Substratangebot und anaeroben Nischen vor. Hinzu kommt, dass in diesen Tiefen die Sommertemperaturen etwas höher liegen als in den tieferen Horizonten, was wiederum die Aktivität positiv beeinflusst. Bei zusammenfassender Betrachtung der Untersuchungsergebnisse von Anzahl, Aktivität, Zusammensetzung und Leistung der gesamten, aber im besonderen auch der methanogenen Mikroorganismenpopulation wird deutlich, dass in dem untersuchten Bodenprofil unter ökologischen Gesichtspunkten die oberen 15-20 cm den für den C-Umsatz relevantesten Bereich darstellen. Das Zusammenspiel wichtiger Bodenparameter wie Bodentemperatur, Wasserstand, Nährstoffversorgung und Durchwurzelung führt dazu, dass in dem untersuchten Tundraboden in den oberen 15-20 cm eine wesentlich größere und diversere Anzahl an Mikroorganismen existiert, die für einen schnelleren und umfassenderen Kohlenstoffumsatz in diesem Bereich des active layers sorgt.
Das Superoxidradikal kann mit fast allen Bestandteilen von Zellen reagieren und diese schädigen. Die medizinische Forschung stellte eine Beteiligung des Radikals an Krebs, Herzinfarkten und neuraler Degeneration fest. Ein empfindlicher Superoxidnachweis ist daher zum besseren Verständnis von Krankheitsverläufen wichtig. Dabei stellen die geringen typischen Konzentrationen und seine kurze Lebensdauer große Anforderungen. Ziel dieser Arbeit war es zum einen, zwei neuartige Proteinarchitekturen auf Metallelektroden zu entwickeln und deren elektrochemisches Ansprechverhalten zu charakterisieren. Zum anderen waren diese Elektroden zur empfindlichen quantitativen Superoxiddetektion einzusetzen. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Protein-Multischichtelektrode aus Cytochrom c und dem Polyelektrolyten Poly(anilinsulfonsäure) nach dem Layer-by-layer-Verfahren aufgebaut. Für zwei bis 15 Schichten an Protein wurde eine deutliche Zunahme an elektrodenaktivem Cytochrom c mit jedem zusätzlichen Aufbringungsschritt nachgewiesen. Die Zunahme verlief linear und ergab bei 15 Schichten eine Zunahme der redoxaktiven Proteinmenge um deutlich mehr als eine Größenordnung. Während das formale Potential im Multischichtsystem sich im Vergleich zur Monoschichtelektrode nicht veränderte, wurde für die Kinetik eine Abhängigkeit der Geschwindigkeit des Elektronentransfers von der Zahl der Proteinschichten beobachtet. Mit zunehmender Scangeschwindigkeit trat ein reversibler Kontaktverlust zu den äußeren Schichten auf. Die lineare Zunahme an elektroaktivem Protein mit steigender Zahl an Depositionsschritten unterscheidet sich deutlich von in der Literatur beschriebenen Protein/Polyelektrolyt-Multischichtelektroden, bei denen ab etwa 6-8 Schichten keine Zunahme an elektroaktivem Protein mehr festgestelltwurde. Auch ist bei diesen die Zunahme an kontaktierbaren Proteinmolekülen auf das Zwei- bis Fünffache limitiert. Diese Unterschiede des neu vorgestellten Systems zu bisherigen Multischichtassemblaten erklärt sich aus einem in dieser Arbeit für derartige Systeme erstmals beschriebenen Elektronentransfermechanismus. Der Transport von Elektronen zwischen der Elektrodenoberfläche und den Proteinmolekülen in den Schichten verläuft über einen Protein-Protein-Elektronenaustausch. Dieser Mechanismus beruht auf dem schnellen Selbstaustausch von Cytochrom c-Molekülen und einer verbleibenden Rotationsflexibilität des Proteins im Multischichtsystem. Die Reduzierung des Proteins durch das Superoxidradikal und eine anschließende Reoxidation durch die Elektrode konnten nachgewiesen werden. In einem amperometrischen Messansatz wurde das durch Superoxidradikale hervorgerufene elektrochemische Signal in Abhängigkeit von der Zahl an Proteinschichten gemessen. Ein maximales Ansprechverhalten auf das Radikal wurde mit 6-Schichtelektroden erzielt. Die Empfindlichkeit der 6-Schichtelektroden wurde im Vergleich zum Literaturwert der Monoschichtelektrode um Faktor 14, also mehr als eine Größenordnung, verbessert. Somit konnte eine Elektrode mit 6 Schichten aus Cytochrom c und Poly(anilinsulfonsäure) als neuartiger Superoxidsensor mit einer 14-fachen Verbesserung der Empfindlichkeit im Vergleich zum bislang benutzten System entwickelt werden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt die Auswahl, Gewinnung und Charakterisierung von Mutanten des Proteins Cu,Zn-Superoxiddismutase zur elektrochemischen Quantifizierung von Superoxidradikalen. Monomere Mutanten des humanen dimeren Enzyms wurden entworfen, die durch Austausch von Aminosäuren ein oder zwei zusätzliche Cysteinreste besaßen, mit welchem sie direkt auf der Goldelektrodenoberfläche chemisorbieren sollten. 6 derartige Mutanten konnten in ausreichender Menge und Reinheit in aktiver Form gewonnen werden. Die Bindung der Superoxiddismutase-Mutanten an Goldoberflächen konnte durch Oberflächen-plasmonresonanz und Impedanzspektroskopie nachgewiesen werden. Alle Mutanten wiesen einen quasi-reversiblen Elektronentransfer zwischen SOD und Elektrode auf. Durch Untersuchung von kupferfreien SOD-Mutanten sowie des Wildtyps konnte nachgewiesen werden, das die Mutanten über die eingefügten Cysteinreste auf der Elektrode chemisorptiv gebunden wurden und der Elektronentransfer zwischen der Elektrode und dem Kupfer im aktiven Zentrum der SOD erfolgte. Die Superoxiddismutase katalysiert die Zersetzung von Superoxidmolekülen durch Oxidation und durch Reduktion der Radikale. Somit sind beide Teilreaktionen von analytischem Interesse. Zyklovoltammetrisch konnte sowohl die Oxidation als auch die Reduktion des Radikals durch die immobilisierten Superoxiddismutase-Mutanten nachgewiesen werden. In amperometrischen Messanordnungen konnten beide Teilreaktionen zur analytischen Quantifizierung von Superoxidradikalen genutzt werden. Im positiven Potentialfenster wurde die Empfindlichkeit um einen Faktor von etwa 10 gegenüber der Cytochrom c–Monoschichtelektrode verbessert.
Durch die anthropogene Nutzung sind viele Auen in Mitteleuropa verändert worden, wobei insbesondere die Retentionsflächen stark verringert wurden. Während Auen seit längerem im Fokus der wissenschaftlichen Bearbeitung stehen, gibt es bisher große Wissensdefizite in der Frage der Auenreaktivierungen. Zum einen sind derartige Projekte bisher kaum verwirklicht und zum anderen ist ein langfristiges Monitoring notwendig, um die Anpassung von Biozönosen an die veränderten Standortbedingungen beobachten zu können. Um die Folgen derartiger Eingriffe zu analysieren, bieten sich computergestützte Modellierungen der Landschaftsentwicklung an, wie sie in der vorliegenden Arbeit verwirklicht wurden. Ziel der Arbeit war, mit Hilfe eines Geografischen Informationssystems (GIS) das Entwicklungspotenzial der Landschaft bei verschiedenen Rückdeichungsvarianten auf der Ebene der Biotoptypen darzustellen. Dabei ging es nicht um die Erstellung eines allgemein gültigen Auenmodells sondern um die Erarbeitung eines Modells für einen konkreten Anwendungsfall. Der erarbeitete Ansatz sollte zudem für die landschaftsplanerische Praxis geeignet sein. Als Beispielgebiete wurden Flächen an der Mittleren Elbe bei Rogätz und Sandau, beide im nördlichen Teil von Sachsen-Anhalt, ausgewählt. Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Im ersten Teil werden Erhebungen und Auswertungen als Grundlage der Modellentwicklung dargestellt. Dazu wurden die Biotoptypen der Beispielgebiete flächendeckend erhoben und mit punktuellen Vegetationserhebungen ergänzt. Aus dem Forschungsprojekt "Rückgewinnung von Retentionsflächen und Altauenreaktivierung an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt" des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) standen standortökologische Daten der Hydrologie und Bodenkunde zur Verfügung. Ziel der Auswertung war, Schlüsselfaktoren für Hydrologie und Bodenbedingungen innerhalb der rezenten Aue zu identifizieren, die zur Ausprägung bestimmter Biotoptypen führen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Modell für Biotoptypenpotenziale auf den geplanten Rück–deichungsflächen entwickelt. Das Modell bearbeitet die Datenbank der verwendeten GIS-Dateien, die auf Daten zum Bestand beruht und um solche der Prognose der Standortökologie (Hydrologie und Boden) im Rückdeichungsfalle aus dem BMBF-Projekt erweitert wurde. Weitere Voraussetzung für die Modellierung war die Erarbeitung von Leitbildern, in denen unterschiedliche Nutzungsszenarios für die Landschaft nach Deichrückverlegung hypothetisch festgelegt wurden. Insbesondere die Nutzungsintensität wurde variiert, von einer Variante intensiver land- und forstwirtschaftlicher Nutzung über sogenannte integrierte Entwicklungsziele aus dem BMBF-Projekt bis hin zu einer Variante der Naturschutznutzung. Zusätzlich wurde eine zukünftige Potentielle Natürliche Vegetation modelliert. Eine Überprüfung des Modell fand für den Raum der rezenten Aue in der intensiven Nutzungsvariante statt, die der gegenwärtigen Nutzung am nächsten kommt. Werden Informationen des Bestandsbiotoptyps als Korrekturgröße in das Modell einbezogen, konnte für viele Biotoptypen eine Trefferquote von über 90 % erreicht werden. Bei flächenmäßig weniger bedeutenden Bio–toptypen lag dieser Wert aufgrund der schmaleren Datenbasis zwischen 20 und 40 %. Als Ergebnis liegt für unterschiedliche Deichvarianten und Leitbilder in den Beispielgebieten die Landschaftsentwicklung als Biotoppotenzial vor. Als eine vereinfachte Regionalisierung der punktuellen Vegetationsdaten wurde im Modell geprüft, inwieweit die modellierten Biotopflächen der Charakteristik der pflanzensoziologischen Aufnahmen aus der rezenten Aue entsprechen. In dem Falle wurde die Pflanzengesellschaft der jeweiligen ökologisch im Rahmen der Untersuchung einheitlichen Flächeneinheit zugeordnet. Anteilig lässt sich damit die Biotopprognosefläche pflanzensoziologisch konkretisieren. Die vorliegende Arbeit gehört zu den bisher wenigen Arbeiten, die sich mit den Folgen von Auenreaktivierung auf die Entwicklung der Landschaft auseinandersetzen. Sie zeigt eine Möglichkeit auf, Prognosemodelle für Biotoptypen und Vegetation anhand begrenzter Felduntersuchungen zu entwerfen. Derartige Modelle können zum Verständnis von Eingriffen in den Naturhaushalt, wie sie die Deichrückverlegungen darstellen, beitragen und eine Folgenabschätzung unterstützen.
In den letzten 20 Jahren hat sich der Maiszünsler (Ostrinia nubilalis HÜBNER), aus der Schmetterlingsfamilie der Pyralidae oder Zünsler, zum bedeutendsten tierischen Schädling des Maises (Zea mays) entwickelt. Eine Möglichkeit den Befall des Maiszünslers abzuwenden, bietet der Anbau von Bacillus thuringiensis-Mais (Bt-Mais). Mit Hilfe der Gentechnik wurden Gene des Bakteriums Bacillus thuringiensis übertragen, die einen für Fraßinsekten giftigen Wirkstoff bilden, wodurch die Pflanzen während der kompletten Vegetation vor den Larven des Maiszünslers geschützt sind. Ziel des vorliegenden Projektes war es, in einer 3-jährigen Studie die Auswirkungen des großflächigen Anbaus von Bt-Mais auf die ökologische Situation und den Handlungsrahmen des integrierten Pflanzenschutzes komplex zu untersuchen. Dazu wurden in Betrieben im Oderbruch, das als permanentes Befallsgebiet des Maiszünslers gilt, in den Jahren 2002 bis 2004 jährlich zwei Felder mit jeweils einer Bt-Sorte und einer konventionellen Sorte angelegt. Zusätzlich wurden biologische und chemische Maiszünsler-Bekämpfungsvarianten geprüft. Durch verschiedene Methoden wie Bonituren, Ganzpflanzenernten, Bodenfallenfänge und Beobachtungen des Wahlverhaltens von (Flug-)insekten konnten Aussagen zum Vorkommen von Insekten und Spinnentieren getroffen werden, wobei hierfür Daten aus Untersuchungen der Jahre 2000 und 2001 im Oderbruch ergänzend herangezogen werden konnten. Durch Ertragsmessungen, Energie- und Qualitätsermittlungen, sowie Fusarium- und Mykotoxinanalysen konnte der Anbau von Bt-Mais als neue Alternative zur Bekämpfung des Maiszünslers bewertet werden. Bezüglich des Auftretens von Insekten und Spinnentieren wurden im Mittel der fünfjährigen Datenerhebung beim Vergleich der Bt-Sorte zur konventionellen Sorte, mit Ausnahme der fast 100 %igen Bekämpfung des Maiszünslers, keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Hierfür wurde ein besonderes Augenmerk auf Thripse, Wanzen, Blattläuse und deren Fraßfeinde, sowie mittels Bodenfallenfängen auf Laufkäfer und Spinnen gerichtet. Die erwarteten ökonomischen Vorteile wie etwa Ertragsplus oder bessere Nährstoff- und Energiegehalte durch geringeren Schaden beim Anbau von Bt-Mais als Silomais blieben in den Untersuchungsjahren aus. Allerdings zeigten Fusarium- und Mykotoxinanalysen eine geringere Belastung des Bt-Maises, was möglicherweise auf den geringeren Schaden zurückzuführen ist, da beschädigte Pflanzen für Fusarium und Mykotoxine anfälliger sind. Desweiteren konnten erste methodische Ansätze für ein auf EU-Ebene gefordertes, den Anbau von Bt-Mais begleitendes Monitoring, erarbeitet werden. So konnten Vorschläge für geeignete Methoden, deren Umfang sowie des Zeitpunktes der Durchführungen gemacht werden.
This thesis aimed to investigate several fundamental and perplexing questions relating to the phloem loading and transport mechanisms of Cucurbita maxima, by combining metabolomic analysis with cell biological techniques. This putative symplastic loading species has long been used for experiments on phloem anatomy, phloem biochemistry, phloem transport physiology and phloem signalling. Symplastic loading species have been proposed to use a polymer trapping mechanism to accumulate RFO (raffinose family oligosaccharides) sugars to build up high osmotic pressure in minor veins which sustains a concentration gradient that drives mass flow. However, extensive evidence indicating a low sugar concentration in their phloem exudates is a long-known problem that conflicts with this hypothesis. Previous metabolomic analysis shows the concentration of many small molecules in phloem exudates is higher than that of leaf tissues, which indicates an active apoplastic loading step. Therefore, in the view of the phloem metabolome, a symplastic loading mechanism cannot explain how small molecules other than RFO sugars are loaded into phloem. Most studies of phloem physiology using cucurbits have neglected the possible functions of vascular architecture in phloem transport. It is well known that there are two phloem systems in cucurbits with distinctly different anatomical features: central phloem and extrafascicular phloem. However, mistaken conclusions on sources of cucurbit phloem exudation from previous reports have hindered consideration of the idea that there may be important differences between these two phloem systems. The major results are summarized as below: 1) O-linked glycans in C.maxima were structurally identified as beta-1,3 linked glucose polymers, and the composition of glycans in cucurbits was found to be species-specific. Inter-species grafting experiments proved that these glycans are phloem mobile and transported uni-directionally from scion to stock. 2) As indicated by stable isotopic labelling experiments, a considerable amount of carbon is incorporated into small metabolites in phloem exudates. However, the incorporation of carbon into RFO sugars is much faster than for other metabolites. 3) Both CO2 labelling experiments and comparative metabolomic analysis of phloem exudates and leaf tissues indicated that metabolic processes other than RFO sugar metabolism play an important role in cucurbit phloem physiology. 4) The underlying assumption that the central phloem of cucurbits continuously releases exudates after physical incision was proved wrong by rigorous experiments including direct observation by normal microscopy and combined multiple-microscopic methods. Errors in previous experimental confirmation of phloem exudation in cucurbits are critically discussed. 5) Extrafascicular phloem was proved to be functional, as indicated by phloem-mobile carboxyfluorescein tracer studies. Commissural sieve tubes interconnect phloem bundles into a complete super-symplastic network. 6) Extrafascicular phloem represents the main source of exudates following physical incision. The major transported metabolites by these extrafacicular phloem are non-sugar compounds including amino acids, O-glycans, amines. 7) Central phloem contains almost exclusively RFO sugars, the estimated amount of which is up to 1 to 2 molar. The major RFO sugar present in central phloem is stachyose. 8) Cucurbits utilize two structurally different phloem systems for transporting different group of metabolites (RFO sugars and non-RFO sugar compounds). This implies that cucurbits may use spatially separated loading mechanisms (apoplastic loading for extrafascicular phloem and symplastic loading for central phloem) for supply of nutrients to sinks. 9) Along the transport systems, RFO sugars were mainly distributed within central phloem tissues. There were only small amounts of RFO sugars present in xylem tissues (millimolar range) and trace amounts of RFO sugars in cortex and pith. The composition of small molecules in external central phloem is very different from that in internal central phloem. 10) Aggregated P-proteins were manually dissected from central phloem and analysed by both SDS-PAGE and mass spectrometry. Partial sequences of peptides were obtained by QTOF de novo sequencing from trypsin digests of three SDS-PAGE bands. None of these partial sequences shows significant homology to known cucurbit phloem proteins or other plant proteins. This proves that these central phloem proteins are a completely new group of proteins different from those in extrafascicular phloem. The extensively analysed P-proteins reported in literature to date are therefore now shown to arise from extrafascicular phloem and not central phloem, and therefore do not appear to be involved in the occlusion processes in central phloem.
From its first use in the field of biochemistry, instrumental analysis offered a variety of invaluable tools for the comprehensive description of biological systems. Multi-selective methods that aim to cover as many endogenous compounds as possible in biological samples use different analytical platforms and include methods like gene expression profile and metabolite profile analysis. The enormous amount of data generated in application of profiling methods needs to be evaluated in a manner appropriate to the question under investigation. The new field of system biology rises to the challenge to develop strategies for collecting, processing, interpreting, and archiving this vast amount of data; to make those data available in form of databases, tools, models, and networks to the scientific community. On the background of this development a multi-selective method for the determination of phytohormones was developed and optimised, complementing the profile analyses which are already in use (Chapter I). The general feasibility of a simultaneous analysis of plant metabolites and phytohormones in one sample set-up was tested by studies on the analytical robustness of the metabolite profiling protocol. The recovery of plant metabolites proved to be satisfactory robust against variations in the extraction protocol by using common extraction procedures for phytohormones; a joint extraction of metabolites and hormones from plant tissue seems practicable (Chapter II). Quantification of compounds within the context of profiling methods requires particular scrutiny (Chapter II). In Chapter III, the potential of stable-isotope in vivo labelling as normalisation strategy for profiling data acquired with mass spectrometry is discussed. First promising results were obtained for a reproducible quantification by stable-isotope in vivo labelling, which was applied in metabolomic studies. In-parallel application of metabolite and phytohormone analysis to seedlings of the model plant Arabidopsis thaliana exposed to sulfate limitation was used to investigate the relationship between the endogenous concentration of signal elements and the ‘metabolic phenotype’ of a plant. An automated evaluation strategy was developed to process data of compounds with diverse physiological nature, such as signal elements, genes and metabolites – all which act in vivo in a conditional, time-resolved manner (Chapter IV). Final data analysis focussed on conditionality of signal-metabolome interactions.
Kaliumionen (K<sup>+) sind die am häufigsten vorkommenden anorganischen Kationen in Pflanzen. Gemessen am Trockengewicht kann ihr Anteil bis zu 10% ausmachen. Kaliumionen übernehmen wichtige Funktionen in verschiedenen Prozessen in der Pflanze. So sind sie z.B. essentiell für das Wachstum und für den Stoffwechsel. Viele wichtige Enzyme arbeiten optimal bei einer K<sup>+ Konzentration im Bereich von 100 mM. Aus diesem Grund halten Pflanzenzellen in ihren Kompartimenten, die am Stoffwechsel beteiligt sind, eine kontrollierte Kaliumkonzentration von etwa 100 mM aufrecht. Die Aufnahme von Kaliumionen aus dem Erdreich und deren Transport innerhalb der Pflanze und innerhalb einer Pflanzenzelle wird durch verschiedene Kaliumtransportproteine ermöglicht. Die Aufrechterhaltung einer stabilen K<sup>+ Konzentration ist jedoch nur möglich, wenn die Aktivität dieser Transportproteine einer strikten Kontrolle unterliegt. Die Prozesse, die die Transportproteine regulieren, sind bis heute nur ansatzweise verstanden. Detailliertere Kenntnisse auf diesem Gebiet sind aber von zentraler Bedeutung für das Verständnis der Integration der Transportproteine in das komplexe System des pflanzlichen Organismus. In dieser Habilitationsschrift werden eigene Publikationen zusammenfassend dargestellt, in denen die Untersuchungen verschiedener Regulationsmechanismen pflanzlicher Kaliumkanäle beschrieben werden. Diese Untersuchungen umfassen ein Spektrum aus verschiedenen proteinbiochemischen, biophysikalischen und pflanzenphysiologischen Analysen. Um die Regulationsmechanismen grundlegend zu verstehen, werden zum einen ihre strukturellen und molekularen Besonderheiten untersucht. Zum anderen werden die biophysikalischen und reaktionskinetischen Zusammenhänge der Regulationsmechanismen analysiert. Die gewonnenen Erkenntnisse erlauben eine neue, detailliertere Interpretation der physiologischen Rolle der Kaliumtransportproteine in der Pflanze.
Die Etablierung der Transkription von kompletten Genen auf planaren Oberflächen soll eine Verbindung zwischen der Mikroarraytechnologie und der Transkriptomforschung herstellen. Darüber hinaus kann mit diesem Verfahren ein Brückenschlag zwischen der Synthese der Gene und ihrer kodierenden Proteine auf einer Oberfläche erfolgen. Alle transkribierten RNAs wurden mittels RT-PCR in cDNA umgeschrieben und in einer genspezifischen PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden hierfür entweder per Hand oder maschinell auf die Oberfläche transferiert. Über eine Oberflächen-PCR war es möglich, die Gensequenz des Reportergens EGFP direkt auf der Oberfläche zu synthetisieren und anschließend zu transkribieren. Somit war eine Transkription mit weniger als 1 ng an Matrize möglich. Der Vorteil einer Oberflächen-Transkription gegenüber der in Lösung liegt in der mehrfachen Verwendung der immobilisierten Matrize, wie sie in dieser Arbeit dreimal erfolgreich absolviert wurde. Die Oberflächen-Translation des EGFP-Gens konnte ebenfalls zweimal an einer immobilisierten Matrize gezeigt werden, wobei Zweifel über eine echte Festphasen-Translation nicht ausgeräumt werden konnten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Transkription und Translation von immobilisierten Gensequenzen auf planaren Oberflächen möglich ist, wofür die linearen Matrizen direkt auf der Oberfläche synthetisiert werden können.
Bei konventionellen Mikroarray-Experimenten zur Genexpressionsanalyse wird fluoreszenz- oder radioaktiv-markierte cDNA oder RNA mit immobilisierten Proben hybridisiert. Für ein gut detektierbares und auswertbares Ergebnis werden jedoch pro Array mindestens 15 - 20 µg Hybridisierungstarget benötigt. Dazu müssen entweder 15 - 20 µg RNA direkt durch Reverse Transkription in markierte cDNA umgeschrieben werden oder bei Vorhandensein von weniger Startmaterial die RNA amplifiziert werden (Standard- Affymetrix-Protokolle, Klur et al. 2004). Oft sind damit zeit- und kostenintensive Probenpräparationen verbunden und das Ergebnis ist nicht immer reproduzierbar. Obwohl es inzwischen einige Protokolle gibt, die dieses Problem zu lösen versuchen (Zhang et al. 2001, Iscove et al. 2002, McClintick et al. 2003, Stirewalt et al. 2004), eine optimale, leicht handbare und reproduzierbare Methode gibt es weiterhin nicht, weshalb in dieser Arbeit ein weiterer Lösungsansatz gesucht wurde. In der vorgestellten Arbeit werden zwei einfache Methoden beschrieben, mit denen Gene aus geringen RNA-Mengen nachgewiesen werden können: erstens die On Chip- RT-PCR mit cDNA als Matrize und zweitens diese Methode als One-Step-Reaktion mit RNA als Matrize. Beide Methoden beruhen auf dem Prinzip der PCR an immobilisierten Primern auf einer Chipoberfläche. Diese Möglichkeit der exponentiellen Amplifikation ist reproduzierbar und sensitiv. In Experimenten zur Etablierung des On-Chip-PCR-Systems wurden für die Immobilisierung der Primer verschiedene Kopplungsmethoden verwendet. Die affine Kopplung über Biotin- Streptavidin erwies sich als geeignet. Die On-Chip-Reaktion an kovalent gebundenen Primern wurde für amino-modifizierte Primer auf Epoxy-Oberflächen sowie für EDC-Kopplung auf silanisierten Oberflächen gezeigt. Für die letztgenannte Methode wurde die On-Chip-PCR optimiert, dass Spottingkonzentrationen der Primer von 5 - 10µM schon ausreichend sind. Der Einsatz von fluoreszenz-markierten Primern während der PCR ermöglicht eine unmittelbare Auswertung nach der Synthese ohne zusätzliche Detektionsschritte. In dieser Arbeit konnte außerdem mit der vorgestellten Methode der simultane Nachweis zweier Gene gezeigt werden. Die Methode kann noch als Multiplex-Analyse ausgebaut werden, um so mehrere Gene in gleichzeitig einem Ansatz nachweisen zu können. Die Ergebnisse der Versuche mit Matrizen aus unterschiedlichen Zelltypen deuten darauf hin, dass die On-Chip-RT-PCR eine weitere optimale Methode für den Nachweis von gering exprimierten Genen bietet.