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This thesis covers the synthesis of conjugates of 2-Deoxy-D-ribose-5-phosphate aldolase (DERA) with suitable polymers and the subsequent immobilization of these conjugates in thin films via two different approaches.
2-Deoxy-D-ribose-5-phosphate aldolase (DERA) is a biocatalyst that is capable of converting acetaldehyde and a second aldehyde as acceptor into enantiomerically pure mono- and diyhydroxyaldehydes, which are important structural motifs in a number of pharmaceutically active compounds. Conjugation and immobilization renders the enzyme applicable for utilization in a continuously run biocatalytic process which avoids the common problem of product inhibition. Within this thesis, conjugates of DERA and poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAm) for immobilization via a self-assembly approach were synthesized and isolated, as well as conjugates with poly(N,N-dimethylacrylamide) (PDMAA) for a simplified and scalable spray-coating approach. For the DERA/PNIPAm-conjugates different synthesis routes were tested, including grafting-from and grafting-to, both being common methods for the conjugation. Furthermore, both lysines and cysteines were addressed for the conjugation in order to find optimum conjugation conditions. It turned out that conjugation via lysine causes severe activity loss as one lysine plays a key role in the catalyzing mechanism. The conjugation via the cysteines by a grafting-to approach using pyridyl disulfide (PDS) end-group functionalized polymers led to high conjugation efficiencies in the presence of polymer solubilizing NaSCN. The resulting conjugates maintained enzymatic activity and also gained high acetaldehyde tolerance which is necessary for their use later on in an industrial relevant process after their immobilization.
The resulting DERA/PNIPAm conjugates exhibited enhanced interfacial activity at the air/water interface compared to the single components, which is an important pre-requisite for the immobilization via the self-assembly approach. Conjugates with longer polymer chains formed homogeneous films on silicon wafers and glass slides while the ones with short chains could only form isolated aggregates. On top of that, long chain conjugates showed better activity maintenance upon the immobilization.
The crosslinking of conjugates, as well as their fixation on the support materials, are important for the mechanical stability of the films obtained from the self-assembly process. Therefore, in a second step, we introduced the UV-crosslinkable monomer DMMIBA to the PNIPAm polymers to be used for conjugation. The introduction of DMMIBA reduced the lower critical solution temperature (LCST) of the polymer and thus the water solubility at ambient conditions, resulting in lower conjugation efficiencies and in turn slightly poorer acetaldehyde tolerance of the resulting conjugates. Unlike the DERA/PNIPAm, the conjugates from the copolymer P(NIPAM-co-DMMIBA) formed continuous, homogenous films only after the crosslinking step via UV-treatment. For a firm binding of the crosslinked films, a functionalization protocol for the model support material cyclic olefin copolymer (COC) and the final target support, PAN based membranes, was developed that introduces analogue UV-reactive groups to the support surface. The conjugates immobilized on the modified COC films maintained enzymatic activity and showed good mechanical stability after several cycles of activity assessment. Conjugates with longer polymer chains, however, showed a higher degree of crosslinking after the UV-treatment leading to a pronounced loss of activity. A porous PAN membrane onto which the conjugates were immobilized as well, was finally transferred to a dead end filtration membrane module to catalyze the aldol reaction of the industrially relevant mixture of acetaldehyde and hexanal in a continuous mode. Mono aldol product was detectable, but yields were comparably low and the operational stability needs to be further improved
Another approach towards immobilization of DERA conjugates that was followed, was to generate the conjugates in situ by simply mixing enzyme and polymer and spray coat the mixture onto the membrane support. Compared to the previous approach, the focus was more put on simplicity and a possible scalability of the immobilization. Conjugates were thus only generated in-situ and not further isolated and characterized. For the conjugation, PDMAA equipped with N-2-thiolactone acrylamide (TlaAm) side chains was used, an amine-reactive comonomer that can react with the lysine residues of DERA, as well as with amino groups introduced to a desired support surface. Furthermore disulfide formation after hydrolysis of the Tla groups causes a crosslinking effect. The synthesized copolymer poly(N,N-Dimethylacrylamide-co-N-2-thiolactone acrylamide) (P(DMAA-co-TlaAm)) thus serves a multiple purpose including protein binding, crosslinking and binding to support materials. The mixture of DERA and polymer could be immobilized on the PAN support by spray-coating under partial maintenance of enzymatic activity. To improve the acetaldehyde tolerance, the polymer in used was further equipped with cysteine reactive PDS end-groups that had been used for the conjugation as described in the first part of the thesis. The generated conjugates indeed showed good acetaldehyde tolerance and were thus used to be coated onto PAN membrane supports. Post treatment with a basic aqueous solution of H2O2 was supposed to further crosslink the spray-coated film hydrolysis and oxidation of the thiolactone groups. However, a washing off of the material was observed. Optimization is thus still necessary.
Permettez à l’inventeur du manuscrit dont vous avez l’édition diplomatique sous les yeux d’exposer en exergue les principales étapes qui ont conduit en 2012 à la détermination de la langue et à l’identification de l’auteur.
Étant inscrit à la conférence de linguistique missionnaire à l’université de Brème en mars 2012 et conscient que maintes bibliothèques et archives renferment des trésors non identifiés ou mal catalogués, je suivis le conseil d’un collègue de la bibliothèque de l’université de Trèves, Hans-Ulrich Seiffert, d’inspecter le manuscrit 1136 / 2048 4° de la bibliothèque municipale de Trèves. Cette bibliothèque est riche de plus de 2.500 manuscrits et incunables provenant pour la plupart des saisies révolutionnaires françaises dans les bibliothèques des ci-devant couvents trévirois. Parmi ces trésors un manuscrit portugais des missions qui était rentré dans les fonds de la bibliothèque de Trèves dès 1799 et avait été exposé en 1991 dans le cadre d’une évocation des activités missionnaires globales des Jésuites. Michael Embach, alors directeur de la bibliothèque du séminaire épiscopal de Trèves, l’avait brièvement décrit dans une notice qui prétendait qu’il était rédigé en espagnol et en portugais et avait peut-être été composé par un auteur « Meirin » dans le cadre de ses préparations pour partir dans les missions… Dans ma copie du catalogue de 1991 se trouve inscrit « la langue reste à déterminer ».
J’allais résoudre le mystère en cette mémorable journée du jeudi 23 février 2012 quand je me résolus à l’autopsier dans la salle désormais historique de la Bibliothèque municipale de Trèves, dirigée depuis peu par le collègue Embach. Il parut à l’évidence que le manuscrit ne contenait aucun mot d’espagnol mais que dans la première partie, les entrées en portugais, strictement numérotées et arrangées dans l’ordre alphabétique, étaient suivies par leurs équivalences dans une langue inconnue qui, cependant, avait pour un linguiste une forte odeur de l’Amérique amazonienne. La partie postérieure du manuscrit présentait l’arrangement inverse. Les entrées dans la langue inconnue étaient suivies de leurs équivalences portugaises. Ce n’est que plus tard que nous avons compris le mystérieux ordre des lemmata dans cette partie, basée qu’elle est sur la rime finale des mots.
Deux facteurs ont grandement facilité l’identification de la langue inconnue : 1. la permission du directeur Embach de pouvoir prendre des photos de travail de tous les folios du manuscrit et 2. l’entrée dans le premier catalogue de la Bibliothèque de Trèves de 1802 : “Codex maxime memorabiblis est, cum nondum grammatica praeter Lusitani Anchieta nota sit, et nullum vocabularium huius linguae existet. Sine dubio scriptum est a quodam Missionario Jesuita”.
Rentrant de Trèves chez moi, je fis une brève halte dans mon bureau d’alors pour consulter Internet. L’entrée “Anchieta” dans l’encyclopédie électronique Wikipedia m’informait que ce jésuite portugais avait composé une grammaire du Vieux Tupi, publiée en 1595. Sous le vocable “Old Tupi” ensuite, j’appris que l’auto-désignation pour cette langue est ñeengatú (la bonne langue, le parler correct). De là à retrouver au folio 25 de mes photos la traduction du portugais linguagem par nheénga ne prit que quelques minutes. Dès ce premier soir donc, le mystère de la langue inconnue était résolu!
Un projet de recherche international, voire transcontinental allait se mettre peu à peu en place après. À la conférence de Brème, début mars 2012, je fis la connaissance du linguiste et romaniste, le professeur Wolf Dietrich de l’université de Münster en Westphalie, un des meilleurs connaisseurs des parlers amazoniens. Il rentrait avec une copie de mes photos de travail et confirma bientôt l’importance du manuscrit de Trèves pour la connaissance de la Lingua Geral, le parler qui s’était développé à partir du Vieux Tupi moribond.
Je communiquai également ma découverte au frère Karl-Heinz Arenz de la congrégation des pères de Steyl, originaire de l’Eifel allemande et enseignant d’histoire aux universités brésiliennes de Belém et de Santarém dans l’État du Pará. Arenz est l’auteur d’une étude sur le jésuite luxembourgeois Jean-Philippe Bettendorf, actif au Maranhão dans la seconde moitié du XVIIe siècle. Nous avions collaboré en 2007 à une exposition didactique consacrée à ce personnage. Arenz ne tarda pas à passer l’information sur le manuscrit de Trèves aux deux linguistes brésiliennes Cândida Barros et Ruth Monserrat, qui à leur tour présentaient un projet de recherche qui fut accepté par les autorités brésiliennes. Les reals de ce subside furent bien investis en effet : l’étudiant doctoral Gabriel Prudente réalisa une transcription intégrale du manuscrit de Trèves qui fit apparaître des couches dialectales et sociolectales dans le texte, et même quelques mots allemands. La bibliothèque municipale de Trèves, quant à elle, contribua « en nature » les images digitales qui sont consultables sur les pages de gauche de cette édition électronique.
Début avril 2014, nous fîmes tous connaissance personnellement dans le cadre d’un colloque à l’université de Belém où fut décidée la présente édition digitale et où furent prononcées la plupart des contributions scientifiques que vous pouvez lire en guise d’introduction. Restait à percer l’énigme du véritable auteur du manuscrit. Cândida Barros avait assez tôt proposé les noms de trois Jésuites allemands, actifs dans les années 1750 dans la région du fleuve Xingu et chassés par les mesures anti-jésuites du pouvoir portugais en 1756. L’étude paléographique des Quattuor vota des trois candidats, aux archives centrales des Jésuites à Rome, me permit début septembre 2015 d’éliminer les pères Eckart et Kaulen et de ne retenir que Antonius Meisterburg, originaire de Bernkastel sur la Moselle, comme le scribe du manuscrit de Trèves. Qu’il me soit permis d’exprimer ma GRATITUDE à toutes celles et à tous ceux qui ont contribué à cette belle aventure de découverte intellectuelle et scientifique et à rendre au Brésil une petite pierre de son histoire.