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Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriolär aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und mögliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es während der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am stärksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen während der Mitose wird für Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten äußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 führte zur Ausbildung von überzähligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erhöhten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochauflösende Expansion Microscopy für das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den äußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in räumlicher Nähe zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als möglicher Interaktionspartner identifiziert werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und ermöglichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verständnis der Topologie des Centrosoms.
Innerhalb dieser Doktorarbeit wurde eine neuartige Mikromanipulationstechnik für die lokale Flüssigkeitsabgabe am komplexen Drüsengewebe der Schabe P. americana charakterisiert und für die damit verbundene gezielte Manipulation von einzelnen Zellen in einem Zellkomplex (Gewebe) angewandt. Bei dieser Mikromanipulationstechnik handelt es sich um die seit 2009 bekannte nanofluidische Rasterkraftmikroskopie (FluidFM = fluidic force microscopy). Dabei werden sehr kleine mikrokanälige Rasterkraftspitzen bzw. Mikro-/Nanopipetten mit einer Öffnung zwischen 300 nm und 2 µm verwendet, mit denen es möglich ist, sehr kleine Volumina im Pikoliter- bis Femtoliter-Bereich (10-12 L – 10-15 L) gezielt und ortsgenau abzugeben. Das Ziel dieser Arbeit war die Analyse zellulärer Prozesse, wie z. B. Zell-Zell-Kommunikation oder Signalweiterleitung, zwischen benachbarten Zellen unter Zuhilfenahme der Fluoreszenzmikroskopie. Mit dieser Methode können die Zellen und ihre Bestandteile mittels vorheriger Farbstoffbeladung unter einem Mikroskop mit hohem Kontrast optisch dargestellt werden. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sollten schlussendlich die zellulären Reaktionen innerhalb des Gewebes nach der lokalen Manipulation visualisiert werden.
Zunächst wurde die Anwendung des Systems an Luft und wässriger Umgebung beschrieben. In diesem Zusammenhang wurde eine Reinigungs- und Beladungsmethode entwickelt, mit der es möglich war, die kostspieligen Mikro-/Nanopipetten zu reinigen und anschließend mehrmals wiederzuverwenden. Hierzu wurde eine alternative Methode getestet, mit der das Diffusionsverhalten von Farbstoffmolekülen in unterschiedlichen Medien untersucht werden kann. Des Weiteren wurden die Systemparameter optimiert, welche nötig sind, um zwischen der Probenoberfläche und der Pipette einen guten Pipettenöffnungs-abschluss zu erhalten. Dieser Abschluss ist essentiell, damit die abgegebene Flüssigkeit ausschließlich in der Abgaberegion mit der Probe wechselwirkt und die darauffolgenden Reaktionen nur innerhalb des Gewebes erfolgen, da ansonsten die Zell-Zell-Signalweiterleitung zwischen den Zellen nicht eindeutig nachvollzogen werden kann. Diese interzelluläre Kommunikation wurde anhand zweier sekundärer Botenstoffe (Ca2+ und NO) untersucht. Hierbei war es möglich einzelne lokale Reaktionen zu detektieren, welche sich über weitere Zellen ausbreiteten. Schlussendlich wurde die Fertigung einer speziellen Injektionspipette beschrieben, welche an zwei biologischen Systemen getestet wurde.
Im Fokus dieser Arbeit stand der Aufbau einer auf DNA basierenden Nanostruktur. Der universelle Vier-Buchstaben-Code der DNA ermöglicht es, Bindungen auf molekularer Ebene zu adressieren. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der DNA prädestinieren dieses Makromolekül für den Einsatz und die Verwendung als Konstruktionselement zum Aufbau von Nanostrukturen. Das Ziel dieser Arbeit war das Aufspannen eines DNA-Stranges zwischen zwei Fixpunkten. Hierfür war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, welche es ermöglicht, Funktionsmoleküle als Ankerelemente ortsaufgelöst auf eine Oberfläche zu deponieren. Das Deponieren dieser Moleküle sollte dabei im unteren Mikrometermaßstab erfolgen, um den Abmaßen der DNA und der angestrebten Nanostruktur gerecht zu werden. Das eigens für diese Aufgabe entwickelte Verfahren zum ortsaufgelösten Deponieren von Funktionsmolekülen nutzt das Bindungspaar Biotin-Neutravidin. Mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops (AFM) wurde eine zu einem „Stift“ umfunktionierte Rasterkraftmikroskopspitze so mit der zu deponierenden „Tinte“ beladen, dass das Absetzen von Neutravidin im unteren Mikrometermaßstab möglich war. Dieses Neutravidinmolekül übernahm die Funktion als Bindeglied zwischen der biotinylierten Glasoberfläche und dem eigentlichen Adressmolekül. Das somit generierte Neutravidin-Feld konnte dann mit einem biotinylierten Adressmolekül durch Inkubation funktionalisiert werden. Namensgebend für dieses Verfahren war die Möglichkeit, Neutravidin mehrmals zu deponieren und zu adressieren. Somit ließ sich sequenziell ein Mehrkomponenten-Feld aufbauen. Die Einschränkung, mit einem AFM nur eine Substanz deponieren zu können, wurde so umgangen. Ferner mußten Ankerelemente geschaffen werden, um die DNA an definierten Punkten immobilisieren zu können. Die Bearbeitung der DNA erfolgte mit molekularbiologischen Methoden und zielte darauf ab, einen DNA-Strang zu generieren, welcher an seinen beiden Enden komplementäre Adressequenzen enthält, um gezielt mit den oberflächenständigen Ankerelementen binden zu können. Entsprechend der Geometrie der mit dem AFM erzeugten Fixpunkte und den oligonukleotidvermittelten Adressen kommt es zur Ausbildung einer definierten DNA-Struktur. Mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden wurde die aufgebaute DNA-Nanostruktur nachgewiesen. Der Nachweis der nanoskaligen Interaktion von DNA-bindenden Molekülen mit der generierten DNA-Struktur wurde durch die Bindung von PNA (peptide nucleic acid) an den DNA-Doppelstrang erbracht. Diese PNA-Bindung stellt ihrerseits ein funktionales Strukturelement im Nanometermaßstab dar und wird als Nanostrukturbaustein verstanden.