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Arachidonsäurelipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind Lipid-peroxidierenden Enzyme, die bei der Zelldifferenzierung und bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen bedeutsam sind. Im menschlichen Genom gibt es sechs funktionelle ALOX-Gene, die als Einzelkopiegene vorliegen. Für jedes humane ALOX-Gen gibt es ein orthologes Mausgen. Obwohl sich die sechs humanen ALOX-Isoformen strukturell sehr ähnlich sind, unterscheiden sich ihre funktionellen Eigenschaften deutlich voneinander. In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Fragestellungen zum Vorkommen, zur biologischen Rolle und zur Evolutionsabhängigkeit der enzymatischen Eigenschaften von Säugetier-ALOX-Isoformen untersucht:
1) Spitzhörnchen (Tupaiidae) sind evolutionär näher mit dem Menschen verwandt als Nagetiere und wurden deshalb als Alternativmodelle für die Untersuchung menschlicher Erkrankungen vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde erstmals der Arachidonsäurestoffwechsel von Spitzhörnchen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass im Genom von Tupaia belangeri vier unterschiedliche ALOX15-Gene vorkommen und die Enzyme sich hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften ähneln. Diese genomische Vielfalt, die weder beim Menschen noch bei Mäusen vorhanden ist, erschwert die funktionellen Untersuchungen zur biologischen Rolle des ALOX15-Weges. Damit scheint Tupaia belangeri kein geeigneteres Tiermodel für die Untersuchung des ALOX15-Weges des Menschen zu sein.
2) Entsprechend der Evolutionshypothese können Säugetier-ALOX15-Orthologe in Arachidonsäure-12-lipoxygenierende- und Arachidonsäure-15-lipoxygenierende Enzyme eingeteilt werden. Dabei exprimieren Säugetierspezies, die einen höheren Evolutionsgrad als Gibbons aufweisen, Arachidonsäure-15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, während evolutionär weniger weit entwickelte Säugetiere Arachidonsäure-12 lipoxygenierende Enzyme besitzen. In dieser Arbeit wurden elf neue ALOX15-Orthologe als rekombinante Proteine exprimiert und funktionell charakterisiert. Die erhaltenen Ergebnisse fügen sich widerspruchsfrei in die Evolutionshypothese ein und verbreitern deren experimentelle Basis. Die experimentellen Daten bestätigen auch das Triadenkonzept.
3) Da humane und murine ALOX15B-Orthologe unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen, können Ergebnisse aus murinen Krankheitsmodellen zur biologischen Rolle der ALOX15B nicht direkt auf den Menschen übertragen werden. Um die ALOX15B-Orthologen von Maus und Mensch funktionell einander anzugleichen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Knock-in Mäuse durch die In vivo Mutagenese mittels CRISPR/Cas9-Technik hergestellt. Diese exprimieren eine humanisierte Mutante (Doppelmutation von Tyrosin603Asparaginsäure+Histidin604Valin) der murinen Alox15b. Diese Mäuse waren lebens- und fortpflanzungsfähig, zeigten aber geschlechtsspezifische Unterschiede zu ausgekreuzten Wildtyp-Kontrolltieren im Rahmen ihre Individualentwicklung.
4) In vorhergehenden Untersuchungen zur Rolle der ALOX15B in Rahmen der Entzündungsreaktion wurde eine antiinflammatorische Wirkung des Enzyms postuliert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Humanisierung der murinen Alox15b die Entzündungsreaktion in zwei verschiedenen murinen Entzündungsmodellen beeinflusst. Eine Humanisierung der murinen Alox15b führte zu einer verstärkten Ausbildung von Entzündungssymptomen im induzierten Dextran-Natrium-Sulfat-Kolitismodell. Im Gegensatz dazu bewirkte die Humanisierung der Alox15b eine Abschwächung der Entzündungssymptome im Freund‘schen Adjuvans Pfotenödemmodell. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich die Rolle der ALOX15B in verschiedenen Entzündungsmodellen unterscheidet.
Die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode wird auch heute noch als gängige Methode verwendet, vor allem wegen der geringeren Kosten für das Wirkstoffscreening in der pharmazeutischen Forschung, wobei Ionenkanäle sowie einige der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Mehrzahl der Wirkstoffziele ansprechen. Die zellfreie Synthese eukaryotischer Proteine hat nicht die Nachteile, die bei der Überexpression dieser ionenpermeablen Proteine in Zellen auftreten können, wie z. B. Zelltoxizität, geringere Proteinexpression und die Beseitigung der exprimierten Proteine aufgrund veränderter Domänen sowie die zeitaufwändige Pflege von Zelllinien. Die Synthese von Ionenkanälen in zellfreien Proteinsyntheseplattformen für das künftige Wirkstoffscreening ist noch in der Grundlagenforschung. Obwohl die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode in zellbasierten Assays weit verbreitet ist, wurde diese Methode bisher noch nicht in zellfreien Proteinexpressionssystemen verwendet. Insgesamt ist die neue Anwendung der Calcium-Imaging-Methode in eukaryontischen zellfreien Systemen eine Voraussetzung für die schnelle pharmakologische Analyse von Wirkstoffen. Das erste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit bestand darin, die grundlegenden Prinzipien der Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung von Ionenkanälen in zellbasierten Systemen zu untersuchen. Hierfür wurden zwei Tumorzelllinien des Auges verwendet, und zwar benigne Pterygiumzellen und maligne Aderhautmelanom 92.1 Zellen. In diesen Studien wurde die Interaktion zwischen den nativ überexprimierten transient-receptor-potential-Ionenkanälen (TRPs) wie TRP Vanilliod 1 (TRPV1) (Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 (TRPM8) (Mentholrezeptor) in diesen Tumorzellen nach Zugabe von verschiedenen Medikamenten und Hormonen untersucht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Calcium-Mechanismus von GPCRs in den Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde Mas, ein GPCR und Angiotensin (1-7) -Hormonrezeptor, aus dem renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) in der Human Embryonic Kidney-293 (HEK293) Zelllinie überexprimiert. In dieser Studie wurden insbesondere die Aktivierung klassischer GPCR-Signalwege wie Phospholipase C und Proteinkinase C durch Angiotensin-(1-7) über Mas und die Beteiligung von TRP-Kanälen nachgewiesen. Die zellbasierte-Calcium-Imaging-Methode für chemische Calcium-Indikatoren ließ sich aufgrund der Anwesenheit einer großen Menge cytosolischer Carboxylesterasen gut anwenden. Carboxylesterase ist das wichtigste Enzym in der Calcium Imaging Methode, das die Verarbeitung chemischen Calcium-Farbstoffe behandelt. Dieses Enzym fehlt jedoch in Mikrosomen, die als Basismembran für die Integration synthetisierter Ionenkanäle in eukaryontischen zellfreien Systemen verwendet werden. Das dritte Ziel dieser Forschungsarbeit war die Umsetzung der zellbasierten Calcium-Imaging Methode und der Calcium-Signalwege in zellfreie Systeme. Hier wurde die zellfrei synthetisierte Carboxylesterase in Mikrosomen von Spodoptera frugiperda (Sf21) als praktikables Calcium-Imaging-Werkzeug etabliert, um sowohl native ionenpermeable Proteine als auch zellfrei-synthetisierte Ionenkanäle zu untersuchen. Die Enzymaktivität der zellfrei-synthetisierten Carboxylesterase in Mikrosomen wurde durch Esterase-Assays und den Calcium-Fluoreszenzfarbstoff Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) Belastungstests nachgewiesen. Das Calcium-Imaging der nativ vorhandenen Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und der Ryanodin-Rezeptoren (RyR) in den Mikrosomen sowie der zell-frei exprimierten TRP-Ionenkanäle wurden mit dem Fura-5N-AM- Fluoreszenzfarbstoff in mit Carboxylesterase vorsynthetisierten Mikrosomen nachgewiesen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Prinzip der zellbasierten Calcium-Imaging -Methode vielversprechend an das eukaryotische zellfreie Sf21-System angepasst werden konnte, um Ionenkanäle zu analysieren. Nach entsprechender Forschung könnte die etablierte Methode in Zukunft auch auf andere Membranproteine ausgeweitet werden. Dies umfasst die Untersuchung anderer zell-frei exprimierte GPCRs oder anderer Ionenkanäle wie Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionenkanäle.
Dielektrophorese ist die Manipulation polarisierbarer Partikel durch inhomogene elektrische Wechselfelder. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Enzyme durch Dielektrophorese immobilisiert und anschließend hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität untersucht: Meerrettichperoxidase, Cholinoxidase aus Alcaligenes sp. und Glucoseoxidase aus Aspergillus niger. Die Immobilisierung erfolgte durch Dielektrophorese auf nano-Elektrodenarrays aus Wolfram-Zylindern mit 500 nm Durchmesser oder aus Titannitrid-Ringen mit 20 nm Breite. Die Immobilisierung der Enzyme konnte fluoreszenzmikroskopisch entweder anhand der intrinsischen Fluoreszenz oder aufgrund einer Fluoreszenzmarkierung vor oder nach der Immobilisierung für alle getesteten Enzyme nachgewiesen werden. Die Messung der Enzymaktivität erfolgte quantitativ durch den direkten oder indirekten Nachweis des gebildeten Produktes oder, im Falle der Cholinoxidase, durch Beobachtung der intrinsischen Fluoreszenz des Cofaktors FAD, die vom Oxidationszustand dieses Enzyms abhängt. Für die Meerrettichperoxidase konnte so eine hohe erhaltene Enzymaktivität nach der Immobilisierung nachgewiesen werden. Die Aktivität der permanent immobilisierten Fraktion der Meerrettichperoxidase entsprach bis zu 47 % der höchstmöglichen Aktivität einer Monolage dieses Enzyms auf den Elektroden des Chips. Diese Aktivität kann als aktive, aber zufällig gegenüber der Oberfläche ausgerichtete Enzymschicht interpretiert werden. Für die permanent immobilisierte Glucoseoxidase wurde nur eine Aktivität entsprechend <1,3 % der Aktivität einer solchen Enzymschicht detektiert, während für die immobilisierte Cholinoxidase gar keine Aktivität nachgewiesen werden konnte. Die Aktivität der durch DEP immobilisierten Enzyme konnte somit quantitativ bestimmt werden. Der Anteil an erhaltener Aktivität hängt dabei stark vom verwendeten Enzym ab.
Monoklonale Antikörper (mAK) sind eines der wichtigsten Biomoleküle für die Umweltanalytik und die medizinische Diagnostik. Für die Detektion von Mikroorganismen bilden sie die Grundlage für ein schnelles und präzises Testverfahren. Bis heute gibt es, aufgrund des hohen zeitlichen und materiellen Aufwandes und der unspezifischen Immunisierungsstrategien, nur wenige mAK, die spezifisch Mikroorganismen erkennen.
Zu diesem Zweck sollte ein anwendbares Verfahren für die Generierung von mAK gegen Mikroorganismen entwickelt werden, welches anhand von Escherichia coli O157:H7 und Legionella pneumophila validiert wurde. In dieser Dissertation konnten neue Oberflächenstrukturen auf den Mikroorganismen mittels vergleichender Genomanalysen und in silico Epitopanalysen identifiziert werden. Diese wurden in das Virushüllprotein VP1 integriert und für eine gezielte Immunisierungsstrategie verwendet. Für die Bestimmung antigenspezifischer antikörperproduzierender Hybridome wurde ein Immunfärbeprotokoll entwickelt und etabliert, um die Hybridome im Durchflusszytometer zu sortieren.
In der vorliegenden Studie konnten für E. coli O157:H7 insgesamt 53 potenzielle Proteinkandidaten und für L. pneumophila 38 Proteine mithilfe der bioinformatischen Analyse identifiziert werden. Fünf verschiedene potenzielle Epitope wurden für E. coli O157:H7 und drei verschiedenen für L. pneumophila ausgewählt und für die Immunisierung mit chimären VP1 verwendet. Alle Immunseren zeigten eine antigenspezifische Immunantwort. Aus den nachfolgend generierten Hybridomzellen konnten mehrere Antikörperkandidaten gewonnen werden, welche in Charakterisierungsstudien eine starke Bindung zu E. coli O157:H7 bzw. L. pneumophila vorwiesen. Kreuzreaktivitäten zu anderen relevanten Mikroorganismen konnten keine bzw. nur in geringem Maße festgestellt werden.
Folglich konnte der hier beschriebene interdisziplinäre Ansatz zur Generierung spezifischer mAK gegen Mikroorganismen nachweislich spezifische mAK hervorbringen und ist als hocheffizienter Arbeitsablauf für die Herstellung von Antikörpern gegen Mikroorganismen einsetzbar.
Die aktuelle COVID-19-Pandemie zeigt deutlich, wie sich Infektionskrankheiten weltweit verbreiten können. Neben Viruserkrankungen breiten sich auch multiresistente bakterielle Erreger weltweit aus. Dementsprechend besteht ein hoher Bedarf, durch frühzeitige Erkennung Erkrankte zu finden und Infektionswege zu unterbrechen.
Herkömmliche kulturelle Verfahren benötigen minimalinvasive bzw. invasive Proben und dauern für Screeningmaßnahmen zu lange. Deshalb werden schnelle, nichtinvasive Verfahren benötigt.
Im klassischen Griechenland verließen sich die Ärzte unter anderem auf ihren Geruchssinn, um Infektionen und andere Krankheiten zu differenzieren. Diese charakteristischen Gerüche sind flüchtige organische Substanzen (VOC), die im Rahmen des Metabolismus eines Organismus entstehen. Tiere, die einen besseren Geruchssinn haben, werden trainiert, bestimmte Krankheitserreger am Geruch zu unterscheiden. Allerdings ist der Einsatz von Tieren im klinischen Alltag nicht praktikabel. Es bietet sich an, auf technischem Weg diese VOCs zu analysieren.
Ein technisches Verfahren, diese VOCs zu unterscheiden, ist die Ionenmobilitätsspektrometrie gekoppelt mit einer multikapillaren Gaschromatographiesäule (MCC-IMS). Hier zeigte sich, dass es sich bei dem Verfahren um eine schnelle, sensitive und verlässliche Methode handelt.
Es ist bekannt, dass verschiedene Bakterien aufgrund des Metabolismus unterschiedliche VOCs und damit eigene spezifische Gerüche produzieren. Im ersten Schritt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die verschiedenen Bakterien in-vitro nach einer kurzen Inkubationszeitzeit von 90 Minuten anhand der VOCs differenziert werden können. Hier konnte analog zur Diagnose in biochemischen Testreihen eine hierarchische Klassifikation der Bakterien erfolgen.
Im Gegensatz zu Bakterien haben Viren keinen eigenen Stoffwechsel. Ob virusinfizierte Zellen andere VOCs als nicht-infizierte Zellen freisetzen, wurde an Zellkulturen überprüft. Hier konnte gezeigt werden, dass sich die Fingerprints der VOCs in Zellkulturen infizierter Zellen mit Respiratorischen Synzytial-Viren (RSV) von nicht-infizierten Zellen unterscheiden.
Virusinfektionen im intakten Organismus unterscheiden sich von den Zellkulturen dadurch, dass hier neben Veränderungen im Zellstoffwechsel auch durch Abwehrmechanismen VOCs freigesetzt werden können.
Zur Überprüfung, inwiefern sich Infektionen im intakten Organismus ebenfalls anhand VOCs unterscheiden lassen, wurde bei Patienten mit und ohne Nachweis einer Influenza A Infektion als auch bei Patienten mit Verdacht auf SARS-CoV-2 (Schweres-akutes-Atemwegssyndrom-Coronavirus Typ 2) Infektion die Atemluft untersucht. Sowohl Influenza-infizierte als auch SARS-CoV-2 infizierte Patienten konnten untereinander und von nicht-infizierten Patienten mittels MCC-IMS Analyse der Atemluft unterschieden werden.
Zusammenfassend erbringt die MCC-IMS ermutigende Resultate in der schnellen nichtinvasiven Erkennung von Infektionen sowohl in vitro als auch in vivo.
Antikörper werden in verschiedensten Bereichen, sowohl zu therapeutischen als auch zu diagnostischen und forschungsorientierten Zwecken verwendet. Vor der Verwendung des Antikörpers bedarf es der Charakterisierung seiner Eigenschaften, in Bezug auf sein Epitop und sein Bindeverhalten gegenüber dem Paratop. Gleichzeitig muss, in Abhängigkeit des Einsatzes, der Antikörper, für den gewünschten Gebrauch, validiert werden. Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit Bead-basierte, multiplexe Testsysteme entworfen, ausgetestet und etabliert mit dem Ziel, eine einfache Screeningmethode zu entwickeln, um eine hohe Anzahl an Proben beziehungsweise Analyten gleichzeitig bestimmen zu können. Dafür wurden drei verschiedene Herangehensweisen etabliert.
So wurden ein phospho-PKA-Substrat Antikörper, welcher phosphorylierte Bindemotive der PKA der Form RRxpS erkennt, gleichzeitig mit einer Reihe an Peptide getestet, welche Punktmutationen im Vergleich zur Konsensussequenz enthielten, um den Einfluss einzelner Aminosäuren auf die Bindung des Antikörpers zu untersuchen. Es konnte im Multiplex gezeigt werden, dass die Unterschiede im Antikörperbindungsverhalten in Abhängigkeit der Aminosäure an verschiedenen P-Positionen detektierbar waren. Mit dem Bead-basierten Multiplexansatz konnten, durch Messungen von Konzentrationsreihen des Antikörpers, Bindungskinetiken aufgenommen und diese mit bereits etablierten Methoden verglichen werden.
Des Weiteren wurden verschiedene Antikörper, welche essenzielle Bestandteile von Bead-basierten Testsystemen darstellten, validiert. Es wurden dabei verschiedene Antikörper, welche spezifisch THC und CBD erkennen ausgetestet und anschließend ein kompetitiver Assay zur Detektion von THC und CBD in humanem Serum etabliert, und die Nachweisgrenzen bestimmt.
Ferner sollten Pferdeseren von Tieren, welche am Sommerekzem leiden, auf ihren IgE-Gehalt hin bestimmt werden. Dafür wurden relevante Proteine rekombinant hergestellt und durch Immobilisierung an Beads im Multiplex mit Serum inkubiert. Die spezifische Bindung des IgE an die Allergen sollte damit messbar gemacht werden können. Für die Gesamtvalidierung des Testsystems wurden zuvor sämtliche Einzelschritte einzeln validiert, um im Anschluss im multiplexen Screening zu vermessen.
Die Nutzung von Bead-basierten Multiplexmessungen als eine Plattformtechnologie erleichtert die Charakterisierung von Antikörpern sowie ihre Validierung für verschiedene Testsysteme.
Synthetische Transkriptionsfaktoren bestehen wie natürliche Transkriptionsfaktoren aus einer DNA-Bindedomäne, die sich spezifisch an die Bindestellensequenz vor dem Ziel-Gen anlagert, und einer Aktivierungsdomäne, die die Transkriptionsmaschinerie rekrutiert, sodass das Zielgen exprimiert wird. Der Unterschied zu den natürlichen Transkriptionsfaktoren ist, sowohl dass die DNA-Bindedomäne als auch die Aktivierungsdomäne wirtsfremd sein können und dadurch künstliche Stoffwechselwege im Wirt, größtenteils chemisch, induziert werden können. Optogenetische synthetische Transkriptionsfaktoren, die hier entwickelt wurden, gehen einen Schritt weiter. Dabei ist die DNA-Bindedomäne nicht mehr an die Aktivierungsdomäne, sondern mit dem Blaulicht-Photorezeptor CRY2 gekoppelt. Die Aktivierungsdomäne wurde mit dem Interaktionspartner CIB1 fusioniert. Unter Blaulichtbestrahlung dimerisieren CRY2 und CIB1 und damit einhergehend die beiden Domänen, sodass ein funktionsfähiger Transkriptionsfaktor entsteht. Dieses System wurde in die Saccharomyces cerevisiae genomisch integriert. Verifiziert wurde das konstruierte System mit Hilfe des Reporters yEGFP, welcher durchflusszytometrisch detektiert werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass die yEGFP Expression variabel gestaltet werden kann, indem unterschiedlich lange Blaulichtimpulse ausgesendet wurden, die DNA-Bindedomäne, die Aktivierungsdomäne oder die Anzahl der Bindestellen, an dem sich die DNA-Bindedomäne anlagert, verändert wurden. Um das System für industrielle Anwendungen attraktiv zu gestalten, wurde das System vom Deepwell-Maßstab auf Photobioreaktor-Maßstab hochskaliert. Außerdem erwies sich das Blaulichtsystem sowohl im Laborstamm YPH500 als auch im industriell oft verwendeten Hefestamm CEN.PK als funktional. Des Weiteren konnte ein industrierelevante Protein ebenso mit Hilfe des verifizierten Systems exprimiert werden. Schlussendlich konnte in dieser Arbeit das etablierte Blaulicht-System erfolgreich mit einem Rotlichtsystem kombiniert werden, was zuvor noch nicht beschrieben wurde.
Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriolär aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und mögliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es während der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am stärksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen während der Mitose wird für Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten äußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 führte zur Ausbildung von überzähligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erhöhten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochauflösende Expansion Microscopy für das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den äußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in räumlicher Nähe zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als möglicher Interaktionspartner identifiziert werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und ermöglichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verständnis der Topologie des Centrosoms.
Monoklonale Antikörper sind essenzielle Werkzeuge in der modernen Laboranalytik sowie in der medizinischen Therapie und Diagnostik. Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist ein zeit- und arbeitsintensiver Prozess. Herkömmliche Methoden beruhen auf der Immunisierung von Labortieren, die mitunter mehrere Monate in Anspruch nimmt. Anschließend werden die Antikörper-produzierenden B-Lymphozyten bzw. deren Antikörpergene isoliert und in Screening-Verfahren untersucht, um geeignete Binder zu identifizieren.
Der Transfer der humoralen Immunantwort in eine in vitro Umgebung erlaubt eine Verkürzung des Prozesses und umgeht die Notwendigkeit der in vivo Immunisierung. Das komplexe Zusammenspiel aller involvierten Immunzellen in vitro abzubilden, stellt sich allerdings als schwierig dar. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war deshalb die Realisierung einer vereinfachten In vitro Immunisierung, die sich auf die Protagonisten der Antikörper-Produktion konzentriert: die B-Lymphozyten. Darüber hinaus sollte eine permanente Zelllinie etabliert werden, die zur Antikörper-Herstellung eingesetzt werden und die Verwendung von Primärzellen ersetzen würde.
Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Protokoll zur In vitro Immunisierung muriner BLymphozyten etabliert. In Vorversuchen wurden die optimalen Konditionen für die Antigenspezifische Aktivierung gereinigter Milz-B-Lymphozyten aus nicht-immunisierten Mäusen
determiniert. Dazu wurde der Einfluss verschiedener Stimuli auf die Produktion unspezifischer und spezifischer Antikörper untersucht. Eine Kombination aus dem Modellantigen VP1 (Hamster Polyomavirus Hüllprotein 1), einem Anti-CD40-Antikörper, Interleukin 4 (IL 4) und Lipopolysaccharid (LPS) oder IL 7 induzierte nachweislich eine Antigen-spezifische Antikörper-Antwort in vitro. Als Indikatoren einer erfolgreichen Aktivierung der B-Lymphozyten infolge der in vitro Stimulation wurden die rapide Proliferation und die Expression charakteristischer Aktivierungsmarker auf der Zelloberfläche nachgewiesen. In einer Zeitreihe über zehn Tage wurde am zehnten Tag der In vitro Immunisierung die verhältnismäßig höchste Konzentration Antigen-spezifischer IgG-Antikörper im Kulturüberstand der stimulierten Zellen nachgewiesen.
Als nächster Schritt sollte eine permanente Zelllinie hergestellt werden, die statt primärer BLymphozyten für die zuvor etablierte In vitro Immunisierung eingesetzt werden könnte. Zu diesem Zweck wurden retrovirale Vektoren hergestellt, die durch den Transfer verschiedener Onkogene in murine B-Lymphozyten bzw. deren Vorläuferzellen das Proliferationsverhalten der Zellen manipulieren sollen. Es wurden Retroviren mit Doxycyclin-induzierbaren Expressionskassetten mit den Onkogenen cmyc, Bcl2, BclxL und dem Fusionsgen NUP98HOXB4 generiert. Eine Testzelllinie wurde erfolgreich mit den hergestellten Retroviren transduziert und die Funktionalität der hergestellten Viren anhand verschiedener Assays belegt. Die transferierten Gene konnten in der Testzelllinie auf DNAEbene nachgewiesen oder die Überexpression der entsprechenden Proteine im Western Blot detektiert werden. Es wurden schließlich B-Lymphozyten bzw. unreife Vorläuferzellen derselben mit den generierten Retroviren transduziert und mit Knochenmark-ähnlichen Stromazellen co-kultiviert. Aus keinem der transduzierten Ansätze konnte bisher eine Zelllinie oder eine Langzeit-Kultur etabliert werden.
Im letzten Teil der Arbeit wurde die Effektivität und Übertragbarkeit des zuvor etablierten Protokolls zur In vitro Immunisierung muriner B-Lymphozyten anhand verschiedener Antigene gezeigt. Es konnten in vitro spezifische IgG-Antworten gegen VP1, Legionella pneumophila und das Protein Mip, von dem ein Peptid in das zur Immunisierung eingesetzte VP1 integriert wurde, induziert werden. Die stimulierten B-Lymphozyten wurden durch Fusion mit Myelomzellen in permanente Antikörper-produzierende Zelllinien transformiert.
Dabei konnten mehrere Hybridomzelllinien generiert werden, die spezifische IgGAntikörper gegen VP1 oder Mip produzieren. Die generierten Antikörper konnten sowohl im Western Blot als auch im ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) das entsprechende Antigen spezifisch binden.
Die hier etablierte In vitro Immunisierung bietet eine effektive Alternative zu bisherigen Verfahren zur Herstellung spezifischer Antikörper. Sie ersetzt die Immunisierung von Versuchstieren und reduziert den Zeitaufwand erheblich. In Kombination mit der Hybridomtechnologie können die in vitro immunisierten Zellen, wie hier demonstriert, zur Generation von Hybridomzelllinien und zur Herstellung monoklonaler Antikörper genutzt werden. Um die Verwendung von Versuchstieren in dieser Methode durch eine adäquate permanente Zelllinie zu ersetzen, muss die genetische Veränderung von B-Lymphozyten und unreifen hämatopoetischen Zellen optimiert werden. Die Ergebnisse bieten eine Basis für eine universelle, Spezies-unabhängige Methodik zur Antikörperherstellung und für die
Etablierung einer idealen, tierfreien In vitro Immunisierung.
Angepasste Pathogene besitzen eine Reihe von Virulenzmechanismen, um pflanzliche Immunantworten unterhalb eines Schwellenwerts der effektiven Resistenz zu unterdrücken. Dadurch sind sie in der Lage sich zu vermehren und Krankheiten auf einem bestimmten Wirt zu verursachen. Eine essentielle Virulenzstrategie Gram-negativer Bakterien ist die Translokation von sogenannten Typ-III Effektorproteinen (T3Es) direkt in die Wirtszelle. Dort stören diese die Immunantwort des Wirts oder fördern die Etablierung einer für das Pathogen günstigen Umgebung. Eine kritische Komponente der Pflanzenimmunität gegen eindringende Pathogene ist die schnelle transkriptionelle Umprogrammierung der angegriffenen Zelle. Viele adaptierte bakterielle Pflanzenpathogene verwenden T3Es, um die Induktion Abwehr-assoziierter Gene zu stören. Die Aufklärung von Effektor-Funktionen, sowie die Identifikation ihrer pflanzlichen Zielproteine sind für das Verständnis der bakteriellen Pathogenese essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Typ-III Effektorprotein XopS aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) funktionell charakterisiert werden. Zudem lag hier ein besonderer Fokus auf der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen XopS und seinem in Vorarbeiten identifizierten pflanzlichen Interaktionspartner WRKY40, einem transkriptionellen Regulator der Abwehr-assoziierten Genexpression. Es konnte gezeigt werden, dass XopS ein essentieller Virulenzfaktor des Phytopathogens Xcv während der präinvasiven Immunantwort ist. So zeigten xopS-defiziente Xcv Bakterien bei einer Inokulation der Blattoberfläche suszeptibler Paprika Pflanzen eine deutlich reduzierte Virulenz im Vergleich zum Xcv Wildtyp. Die Translokation von XopS durch Xcv, sowie die ektopische Expression von XopS in Arabidopsis oder N. benthamiana verhinderte das Schließen von Stomata als Reaktion auf Bakterien bzw. einem Pathogen-assoziierten Stimulus, wobei zudem gezeigt werden konnte, dass dies in einer WRKY40-abhängigen Weise geschieht. Weiter konnte gezeigt werden, dass XopS in der Lage ist, die Expression Abwehr-assoziierter Gene zu manipulieren. Dies deutet darauf hin, dass XopS sowohl in die prä-als auch in die postinvasive, apoplastische Abwehr eingreift. Phytohormon-Signalnetzwerke spielen während des Aufbaus einer effizienten pflanzlichen Immunantwort eine wichtige Rolle. Hier konnte gezeigt werden, dass XopS mit genau diesen Signalnetzwerken zu interferieren scheint. Eine ektopische Expression des Effektors in Arabidopsis führte beispielsweise zu einer signifikanten Induktion des Phytohormons Jasmonsäure (JA), während eine Infektion von suszeptiblen Paprika Pflanzen mit einem xopS-defizienten Xcv Stamm zu einer ebenfalls signifikanten Akkumulation des Salicylsäure (SA)-Gehalts führte.
So kann zu diesem Zeitpunkt vermutet werden, dass XopS die Virulenz von Xcv fördert, indem JA-abhängige Signalwege induziert werden und es gleichzeitig zur Unterdrückung SA-abhängiger Signalwege kommt. Die Virus-induzierte Genstilllegung des XopS Interaktionspartners WRKY40a in Paprika erhöhte die Toleranz der Pflanze gegenüber einer Xcv Infektion, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesem Protein um einen transkriptionellen Repressor pflanzlicher Immunantworten handelt. Die Hypothese, dass WRKY40 die Abwehr-assoziierte Genexpression reprimiert, konnte hier über verschiedene experimentelle Ansätze bekräftigt werden. So wurde beispielsweise gezeigt, dass die Expression von verschiedenen Abwehrgenen einschließlich des SA-abhängigen Gens PR1 und die des Negativregulators des JA-Signalwegs JAZ8 von WRKY40 gehemmt wird. Um bei einem Pathogenangriff die Abwehr-assoziierte Genexpression zu gewährleisten, muss WRKY40 als Negativregulator abgebaut werden. Vorarbeiten zeigten, dass WRKY40 über das 26S Proteasom abgebaut wird. In der hier vorliegenden Studie konnte weiter bestätigt, dass der T3E XopS zu einer Stabilisierung des WRKY40 Proteins führt, indem er auf bislang ungeklärte Weise dessen Abbau über das 26S Proteasom verhindert. Die Ergebnisse aus der hier vorliegenden Arbeit lassen die Vermutung zu, dass die Stabilisierung des Negativregulators der Immunantwort WRKY40 seitens XopS dazu führt, dass eine darüber vermittelte Manipulation der Abwehr-assoziierten Genexpression, sowie eine Umsteuerung phytohormoneller Wechselwirkungen die Ausbreitung von Xcv auf suszeptiblen Paprikapflanzen fördert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, weitere potentielle in planta Interaktionspartner von XopS zu identifizieren die für seine Interaktion mit WRKY40 bzw. für die Aufschlüsselung seines Wirkmechanismus relevant sein könnten. So konnte die Deubiquitinase UBP12 als weiterer pflanzlicher Interaktionspartner sowohl von XopS als auch von WRKY40 gefunden werden. Dieses Enzym ist in der Lage, die Ubiquitinierung von Substratproteinen zu modifizieren und seine Funktion könnte somit ein Bindeglied zwischen XopS und dessen Interferenz mit dem proteasomalen Abbau von WRKY40 sein. Während einer kompatiblen Xcv-Wirtsinteraktion führte die Virus-induzierte Genstilllegung von UBP12 zu einer reduzierten Resistenz der Pflanze gegenüber des Pathogens Xcv, was auf dessen positiv-regulatorische Wirkung während der Immunantwort hindeutet. Zudem zeigten Western Blot Analysen, dass das Protein WRKY40 bei einer Herunterregulierung von UBP12 akkumuliert und dass diese Akkumulation von der Anwesenheit des T3Es XopS zusätzlich verstärkt wird. Weiterführende Analysen zur biochemischen Charakterisierung der XopS/WRKY40/UBP12 Interaktion sollten in Zukunft durchgeführt werden, um den genauen Wirkmechanismus des XopS T3Es weiter aufzuschlüsseln.
Das Fachwissen von Lehrkräften weist für die Ausprägung fachdidaktischer Expertise eine hohe Bedeutung auf. Welche Merkmale universitäre Lehrveranstaltungen aufweisen sollten, um Lehramtsstudierenden ein berufsspezifisches Fachwissen zu vermitteln, ist jedoch überwiegend noch unklar.
Innerhalb des Projekts PSI-Potsdam wurde auf theoretischer Grundlage das fachübergreifende Modell des erweiterten Fachwissens für den schulischen Kontext entwickelt. Als Ansatz zur Verbesserung des Biologie-Lehramtsstudiums diente dieses Modell als Konzeptionsgrundlage für eine additive Lehrveranstaltung. Hierbei werden Lerngelegenheiten geboten, um das universitär erworbene Fachwissen über zellbiologische Inhalte auf schulische Kontexte anzuwenden, z.B. durch die Dekonstruktion und anschließende Rekonstruktion von schulischen Lerntexten. Die Wirkung des Seminars wurde in mehreren Zyklen im Forschungsformat der Fachdidaktischen Entwicklungsforschung beforscht. Eine der zentralen Forschungsfragen lautet dabei: Wie kann eine Lerngelegenheit für Lehramtsstudierende der Biologie gestaltet sein, um ein erweitertes Fachwissen für den schulischen Kontext für den zellbiologischen Themenbereich „Struktur und Funktion der Biomembran“ zu fördern?
Anhand fallübergreifender Analysen (n = 29) wird im empirischen Teil aufgezeigt, welche Einstellungen zum Lehramtsstudium in der Stichprobe bestehen. Als ein wichtiges Ergebnis kann hierbei herausgestellt werden, dass sich das Fachinteresse hinsichtlich schulisch und universitär vermittelter Inhalte bei den untersuchten Studierenden auffallend unterscheidet, wobei dem Schulwissen ein deutlich höheres Interesse entgegengebracht wird. Die Berufsrelevanz fachlicher Inhalte wird seitens der Studierenden häufig am Schulwissen festgemacht.
Innerhalb konkreter Einzelfallanalysen (n = 6) wird anhand von Lernpfaden dargestellt, wie sich über mehrere Design-Experimente hinweg fachliche Konzepte entwickelt haben. Bei der Beschreibung wird vor allem auf Schlüsselstellen und Hürden im Lernprozess fokussiert. Aus diesen Ergebnissen folgend werden vorgenommene Iterationen für die einzelnen Zyklen beschrieben, die ebenfalls anhand der iterativen Entwicklung der Design-Prinzipien dargelegt werden.
Es konnte gezeigt werden, dass die Schlüsselstellen sehr individuell aufgrund der subjektiv fokussierten Inhalte zu Tage treten. Meist treten sie jedoch im Zusammenhang mit der Verknüpfung verschiedener fachlicher Konzepte oder durch kooperative Aufschlüsselungen von Konzepten auf. Fachliche Hürden konnten hingegen in Form von fachlich unangemessenen Vorstellungen fallübergreifend identifiziert werden. Dies betrifft unter anderem die Vorstellung der Biomembran als Wand, die mit den Vorstellungen einer Schutzfunktion und einer formgebenden Funktion der Biomembran einhergeht.
Weiterhin wird beleuchtet, wie das erweiterte Fachwissen für den schulischen Kontext zur Bearbeitung der Lernaufgaben angewendet wurde. Es hat sich gezeigt, dass sich bestimmte Lerngelegenheiten eigenen, um bestimmte Facetten des erweiterten Fachwissens zu fördern.
Insgesamt scheint das Modell des erweiterten Fachwissens für den schulischen Kontext äußerst geeignet zu sein, um anhand der Facetten und deren Beschreibungen Lerngelegenheiten oder Gestaltungsprinzipien für diese zu konzipieren. Für das untersuchte Lehr-Lernarrangement haben sich kleinere Adaptationen des Modells als sinnvoll erwiesen. Hinsichtlich der Methodologie konnten Ableitungen für die Anwendung der fachdidaktischen Entwicklungsforschung für additive fachliche Lehrveranstaltungen dieser Art herausgestellt werden.
Um den Professionsbezug der fachwissenschaftlichen Anteile im Lehramtsstudium zu verbessern, ist der weitere Einbezug des erweiterten Fachwissens für den schulischen Kontext in die fachwissenschaftlichen Studienanteile überaus wünschenswert.
Die funktionelle Charakterisierung von therapeutisch relevanten Proteinen kann bereits durch die Bereitstellung des Zielproteins in adäquaten Mengen limitierend sein. Dies trifft besonders auf Membranproteine zu, die aufgrund von zytotoxischen Effekten auf die Produktionszelllinie und der Tendenz Aggregate zu bilden, in niedrigen Ausbeuten an aktivem Protein resultieren können. Der lebende Organismus kann durch die Verwendung von translationsaktiven Zelllysaten umgangen werden- die Grundlage der zellfreien Proteinsynthese. Zu Beginn der Arbeit wurde die ATP-abhängige Translation eines Lysates auf der Basis von kultivierten Insektenzellen (Sf21) analysiert. Für diesen Zweck wurde ein ATP-bindendes Aptamer eingesetzt, durch welches die Translation der Nanoluziferase reguliert werden konnte. Durch die dargestellte Applizierung von Aptameren, könnten diese zukünftig in zellfreien Systemen für die Visualisierung der Transkription und Translation eingesetzt werden, wodurch zum Beispiel komplexe Prozesse validiert werden können.
Neben der reinen Proteinherstellung können Faktoren wie posttranslationale Modifikationen sowie eine Integration in eine lipidische Membran essentiell für die Funktionalität des Membranproteins sein. Im zweiten Abschnitt konnte, im zellfreien Sf21-System, für den G-Protein-gekoppelten Rezeptor Endothelin B sowohl eine Integration in die endogen vorhandenen Endoplasmatisch Retikulum-basierten Membranstrukturen als auch Glykosylierungen, identifiziert werden.
Auf der Grundlage der erfolgreichen Synthese des ET-B-Rezeptors wurden verschiedene Methoden zur Fluoreszenzmarkierung des Adenosin-Rezeptors A2a (Adora2a) angewandt und optimiert. Im dritten Abschnitt wurde der Adora2a mit Hilfe einer vorbeladenen tRNA, welche an eine fluoreszierende Aminosäure gekoppelt war, im zellfreien Chinesischen Zwerghamster Ovarien (CHO)-System markiert. Zusätzlich konnte durch den Einsatz eines modifizierten tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paares eine nicht-kanonische Aminosäure an Position eines integrierten Amber-Stopcodon in die Polypeptidkette eingebaut und die funktionelle Gruppe im Anschluss an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt werden. Aufgrund des offenen Charakters eignen sich zellfreie Proteinsynthesesysteme besonders für eine Integration von exogenen Komponenten in den Translationsprozess. Mit Hilfe der Fluoreszenzmarkierung wurde eine ligandvermittelte Konformationsänderung im Adora2a über einen Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer detektiert. Durch die Etablierung der Amber-Suppression wurde darüber hinaus das Hormon Erythropoetin pegyliert, wodurch Eigenschaften wie Stabilität und Halbwertszeit des Proteins verändert wurden.
Zu guter Letzt wurde ein neues tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paar auf Basis der Methanosarcina mazei Pyrrolysin-Synthetase etabliert, um das Repertoire an nicht-kanonischen Aminosäuren und den damit verbundenen Kopplungsreaktionen zu erweitern. Zusammenfassend wurden die Potenziale zellfreier Systeme in Bezug auf der Herstellung von komplexen Membranproteinen und der Charakterisierung dieser durch die Einbringung einer positionsspezifischen Fluoreszenzmarkierung verdeutlicht, wodurch neue Möglichkeiten für die Analyse und Funktionalisierung von komplexen Proteinen geschaffen wurden.
Thermoresponsive Zellkultursubstrate für zeitlich-räumlich gesteuertes Auswachsen neuronaler Zellen
(2019)
Ein wichtiges Ziel der Neurowissenschaften ist das Verständnis der komplexen und zugleich faszinierenden, hochgeordneten Vernetzung der Neurone im Gehirn, welche neuronalen Prozessen, wie zum Beispiel dem Wahrnehmen oder Lernen wie auch Neuropathologien zu Grunde liegt. Für verbesserte neuronale Zellkulturmodelle zur detaillierten Untersuchung dieser Prozesse ist daher die Rekonstruktion von geordneten neuronalen Verbindungen dringend erforderlich. Mit Oberflächenstrukturen aus zellattraktiven und zellabweisenden Beschichtungen können neuronale Zellen und ihre Neuriten in vitro strukturiert werden. Zur Kontrolle der neuronalen Verbindungsrichtung muss das Auswachsen der Axone zu benachbarten Zellen dynamisch gesteuert werden, zum Beispiel über eine veränderliche Zugänglichkeit der Oberfläche.
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob mit thermoresponsiven Polymeren (TRP) beschichtete Zellkultursubstrate für eine dynamische Kontrolle des Auswachsens neuronaler Zellen geeignet sind. TRP können über die Temperatur von einem zellabweisenden in einen zellattraktiven Zustand geschaltet werden, womit die Zugänglichkeit der Oberfläche für Zellen dynamisch gesteuert werden kann. Die TRP-Beschichtung wurde mikrostrukturiert, um einzelne oder wenige neuronale Zellen zunächst auf der Oberfläche anzuordnen und das Auswachsen der Zellen und Neuriten über definierte TRP-Bereiche in Abhängigkeit der Temperatur zeitlich und räumlich zu kontrollieren. Das Protokoll wurde mit der neuronalen Zelllinie SH-SY5Y etabliert und auf humane induzierte Neurone übertragen. Die Anordnung der Zellen konnte bei Kultivierung im zellabweisenden Zustand des TRPs für bis zu 7 Tage aufrecht erhalten werden. Durch Schalten des TRPs in den zellattraktiven Zustand konnte das Auswachsen der Neuriten und Zellen zeitlich und räumlich induziert werden. Immunozytochemische Färbungen und Patch-Clamp-Ableitungen der Neurone demonstrierten die einfache Anwendbarkeit und Zellkompatibilität der TRP-Substrate.
Eine präzisere räumliche Kontrolle des Auswachsens der Zellen sollte durch lokales Schalten der TRP-Beschichtung erreicht werden. Dafür wurden Mikroheizchips mit Mikroelektroden zur lokalen Jouleschen Erwärmung der Substratoberfläche entwickelt. Zur Evaluierung der generierten Temperaturprofile wurde eine Temperaturmessmethode entwickelt und die erhobenen Messwerte mit numerisch simulierten Werten abgeglichen. Die Temperaturmessmethode basiert auf einfach zu applizierenden Sol-Gel-Schichten, die den temperatursensitiven Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin B enthalten. Sie ermöglicht oberflächennahe Temperaturmessungen in trockener und wässriger Umgebung mit hoher Orts- und Temperaturauflösung. Numerische Simulationen der Temperaturprofile korrelierten gut mit den experimentellen Daten. Auf dieser Basis konnten Geometrie und Material der Mikroelektroden hinsichtlich einer lokal stark begrenzten Temperierung optimiert werden. Ferner wurden für die Kultvierung der Zellen auf den Mikroheizchips eine Zellkulturkammer und Kontaktboard für die elektrische Kontaktierung der Mikroelektroden geschaffen.
Die vorgestellten Ergebnisse demonstrieren erstmalig das enorme Potential thermoresponsiver Zellkultursubstrate für die zeitlich und räumlich gesteuerte Formation geordneter neuronaler Verbindungen in vitro. Zukünftig könnte dies detaillierte Studien zur neuronalen Informationsverarbeitung oder zu Neuropathologien an relevanten, humanen Zellmodellen ermöglichen.
Die Folgen einer lebensmittelbedingten Erkrankung sind zum Teil gravierend, insbesondere für Kinder und immunsupprimierte Menschen. Hierbei gehören Salmonella und Campylobacter zu den häufigsten Erregern, die verantwortlich für gastrointestinale Erkrankungen in Deutschland sind. Trotz umfassender Maßnahmen der EU zur Prävention und Bekämpfung von Salmonellen in Geflügelbeständen und der Lebensmittel-Industrie, wird von einem stagnierenden Trend von Infektionszahlen berichtet. Zoonose-Erreger wie Salmonellen können über Nutztiere in die Nahrungskette des Menschen gelangen, wodurch sich Infektionsherde schnell ausbreiten können. Dabei sind bestehende Präventionsstrategien für Geflügel vorhanden, die aber nicht auf den Menschen übertragbar sind. Folglich sind Diagnostik und Prävention in der Lebensmittelindustrie essentiell. Deshalb besteht ein hoher Bedarf für spezifische, sensitive und zuverlässige Nachweismethoden, die eine Point-of-care Diagnostik gewährleisten. Durch ein wachsendes Verständnis der wirtsspezifischen Faktoren von S. enterica Serovaren kann die Entwicklung sowohl neuartiger diagnostischer Methoden, als auch neuartiger Therapien und Impfstoffe maßgeblich vorangetrieben werden.
Infolgedessen wurde in dieser Arbeit ein infektionsähnliches in vitro Modell für S. Enteritidis etabliert und darauf basierend eine umfassende Untersuchung zur Identifizierung neuer Zielstrukturen für den Erreger durchgeführt. Während einer Salmonellen-Infektion ist die erste zelluläre Barriere im Wirt die Epithelschicht. Dementsprechend wurde eine humane Zelllinie (CaCo 2, Darmepithel) für die Pathogen-Wirt-Studie ausgewählt. Das Salmonellen-Transkriptom und morphologische Eigenschaften der Epithelzellen wurden in verschiedenen Phasen der Salmonellen-Infektion untersucht und mit bereits gut beschriebenen Virulenzfaktoren und Beobachtungen in Bezug gesetzt. Durch dieses Infektionsmodell konnte ein spezifischer Phänotyp für die intrazellulären Salmonellen in den Epithelzellen nachgewiesen werden. Zudem wurde aufgezeigt, dass bereits die Kultivierung in Flüssigmedium einen invasionsaktiven Zustand der Salmonellen erzeugt. Allerdings wurde durch die Kokultivierung mit Epithelzellen eine zusätzliche Expression relevanter Gene induziert, um eine effiziente Adhäsion und Transmembran-Transport zu gewährleisten. Letzterer ist charakteristisch für die intrazelluläre Limitierung von Nährstoffen und prägt den infektionsrelevanten Status. Unter Berücksichtigung dieser Faktoren ergab sich ein Phänotyp, der eindeutig Mechanismen zur Wirtsadaptation und möglicherweise auch Pathogenese aufzeigt. Die intrazellulären Bakterien müssen vom Wirt separiert werden, was ein wesentlicher Schritt für Pathogen-bestimmende Analysen ist. Hierbei wurde mithilfe einer Detergenz-basierten Lyse der eukaryotischen Zellmembran und differentieller Zentrifugation, der eukaryotische Eintrag minimal gehalten. Unter Verwendung der Virulenz-adaptierten Salmonellen wurden Untersuchungen in Hinblick auf die Identifizierung neuer Zielstrukturen für S. Enteritidis durchgeführt. Mithilfe eines immunologischen Screenings wurden neue potentielle Antigene entdeckt. Zu diesem Zweck wurden bakterielle cDNA-basierte Expressionsbibliotheken hergestellt, die durch eine vereinfachte Microarray-Anwendung ein Hochdurchsatzscreening von Proteinen als potentielle Binder ermöglichen. Folglich konnten neue unbeschriebene Proteine identifiziert werden, die sich durch eine Salmonella-Spezifität oder Membranständigkeit auszeichnen. Ebenso wurde ein Vergleich der im Screening identifizierten Proteine mit der Regulation der kodierenden Gene im infektionsähnlichen Modell durchgeführt. Dabei wurde deutlich, dass die Häufigkeit von Transkripten einen Einfluss auf die Verfügbarkeit in der cDNA-Bibliothek und folglich auch auf die Expressionsbibliothek nimmt. Angesichts eines Ungleichgewichts zwischen der Gesamtzahl protein-kodierender Gene in S. Enteritidis zu möglichen Klonen, die während des Microarray-Screenings untersucht werden können, besteht der Bedarf einer Anreicherung von Proteinen in der Expressionsbibliothek. Das infektionsähnliche Modell zeigte, dass nicht nur Virulenz-assoziierte, sondern auch Stress- und Metabolismus-relevante Gene hochreguliert werden. Durch die Konstruktion dieser spezifischen cDNA-Bibliotheken ist die Erkennung von charakteristischen molekularen Markern gegeben.
Weiterhin wurden anhand der Transkriptomanalyse spezifisch hochregulierte Gene identifiziert, die relevant für das intrazelluläre Überleben von S. Enteritidis in humanen Epithelzellen sind. Hiervon wurden drei Gene näher untersucht, indem ihr Einfluss im infektionsähnlichen Modell mittels entsprechender Gen-Knockout-Stämme analysiert wurde. Dabei wurde für eine dieser Mutanten ein reduziertes Wachstum in der späten intrazellulären Phase nachgewiesen. Weiterführende in vitro Analysen sind für die Charakterisierung des Knockout-Stamms notwendig, um den Einsatz als potenzielles Therapeutikum zu verifizieren.
Zusammenfassend wurde ein in vitro Infektionsmodell für S. Enteritidis etabliert, wodurch neue Zielstrukturen des Erregers identifiziert wurden. Diese sind für diagnostische oder therapeutische Anwendungen interessant. Das Modell lässt sich ebenso für andere intrazelluläre Pathogene übertragen und gewährleistet eine zuverlässige Identifizierung von potentiellen Antigenen.
Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleinsäure-basierte Methoden für den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchführbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleinsäure-basierten Diagnostik kann durch die Einführung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kostengünstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielfältige Detektionsmöglichkeiten, die sowohl für Schnelltest- als auch für Monitoring-Anwendungen geeignet sind.
Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode für den einfachen, schnellen und günstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abhängiger Detektionsverfahren. Hier wurden zunächst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe für die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden können. Als Alternative für die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe für den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus für die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt.
Ergebnisse: Für den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivität zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegenüber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zusätzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen für die Endpunktdetektion verwendet werden. Darüber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das für den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch für die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zusätzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abhängige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP über das Pyrophosphat identifiziert werden. Dafür wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilität und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden können. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabhängigkeit zwischen den einzelnen Komponenten für einen fluorimetrischen Verdrängungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verhältnis’ als Intensitätsmatrix (heatmap) konnten zunächst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als günstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abhängige Zunahme der Fluoreszenzintensität. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich für die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilität und Homogenität der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tröpfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S möglich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abhängige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gewährleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die Rückfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivität am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur möglich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification“ (HIP) konnte abschließend durch die Verkürzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-ähnlichen Primer verbessert werden.
Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsfähigen Alternative für die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsfähigkeit der qualitativen und quantitativen LAMP für die Feldanwendungen und für die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden können und so eine einfache Pathogendiagnostik ermöglichen. Die gezeigten Methoden können darüber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegenüber den herkömmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP für den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei können die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abhängigen Reaktionen ermöglicht darüber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zukünftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik möglich.
Molekulare Charakterisierung des Centrosom-assoziierten Proteins CP91 in Dictyostelium discoideum
(2016)
Das Dictyostelium-Centrosom ist ein Modell für acentrioläre Centrosomen. Es besteht aus einer dreischichtigen Kernstruktur und ist von einer Corona umgeben, welche Nukleationskomplexe für Mikrotubuli beinhaltet. Die Verdoppelung der Kernstruktur wird einmal pro Zellzyklus am Übergang der G2 zur M-Phase gestartet. Durch eine Proteomanalyse isolierter Centrosomen konnte CP91 identifiziert werden, ein 91 kDa großes Coiled-Coil Protein, das in der centrosomalen Kernstruktur lokalisiert. GFP-CP91 zeigte fast keine Mobilität in FRAP-Experimenten während der Interphase, was darauf hindeutet, dass es sich bei CP91 um eine Strukturkomponente des Centrosoms handelt. In der Mitose hingegen dissoziieren das GFP-CP91 als auch das endogene CP91 ab und fehlen an den Spindelpolen von der späten Prophase bis zur Anaphase. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verschwinden der zentralen Schicht der Kernstruktur zu Beginn der Centrosomenverdopplung. Somit ist CP91 mit großer Wahrscheinlichkeit ein Bestandteil dieser Schicht. CP91-Fragmente der N-terminalen bzw. C-terminalen Domäne (GFP-CP91 N-Terminus, GFP-CP91 C-Terminus) lokalisieren als GFP-Fusionsproteine exprimiert auch am Centrosom, zeigen aber nicht die gleiche mitotische Verteilung des Volllängenproteins. Das CP91-Fragment der zentralen Coiled-Coil Domäne (GFP-CP91cc) lokalisiert als GFP-Fusionsprotein exprimiert, als ein diffuser cytosolische Cluster, in der Nähe des Centrosoms. Es zeigt eine partiell ähnliche mitotische Verteilung wie das Volllängenprotein. Dies lässt eine regulatorische Domäne innerhalb der Coiled-Coil Domäne vermuten. Die Expression der GFP-Fusionsproteine unterdrückt die Expression des endogenen CP91 und bringt überzählige Centrosomen hervor. Dies war auch eine markante Eigenschaft nach der Unterexpression von CP91 durch RNAi. Zusätzlich zeigte sich in CP91-RNAi Zellen eine stark erhöhte Ploidie verursacht durch schwere Defekte in der Chromosomensegregation verbunden mit einer erhöhten Zellgröße und Defekten im Abschnürungsprozess während der Cytokinese. Die Unterexpression von CP91 durch RNAi hatte auch einen direkten Einfluss auf die Menge an den centrosomalen Proteinen CP39, CP55 und CEP192 und dem Centromerprotein Cenp68 in der Interphase. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CP91 eine zentrale centrosomale Kernkomponente ist und für den Zusammenhalt der beiden äußeren Schichten der Kernstruktur benötigt wird. Zudem spielt CP91 eine wichtige Rolle für eine ordnungsgemäße Centrosomenbiogenese und, unabhängig davon, bei dem Abschnürungsprozess der Tochterzellen während der Cytokinese.
Seit der Einführung von Antibiotika in die medizinische Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten existiert ein Wettlauf zwischen der Evolution von Bakterienresistenzen und der Entwicklung wirksamer Antibiotika. Während bis in die 80er Jahre verstärkt an neuen Antibiotika geforscht wurde, gewinnen multiresistente Keime heute zunehmend die Oberhand. Um einzelne Pathogene erfolgreich nachzuweisen und zu bekämpfen, ist ein grundlegendes Wissen über den Erreger unumgänglich. Bakterielle Proteine, die bei einer Infektion vorrangig vom Immunsystem prozessiert und präsentiert werden, könnten für die Entwicklung von Impfstoffen oder gezielten Therapeutika nützlich sein. Auch für die Diagnostik wären diese immundominanten Proteine interessant. Allerdings herrscht ein Mangel an Wissen über spezifische Antigene vieler pathogener Bakterien, die eine eindeutige Diagnostik eines einzelnen Erregers erlauben würden.
Daher wurden in dieser Arbeit vier verschiedene Humanpathogene mittels Phage Display untersucht: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Borrelia burgdorferi und Clostridium difficile. Hierfür wurden aus der genomischen DNA der vier Erreger Bibliotheken konstruiert und durch wiederholte Selektion und Amplifikation, dem sogenannten Panning, immunogene Proteine isoliert. Für alle Erreger bis auf C. difficile wurden immunogene Proteine aus den jeweiligen Bibliotheken isoliert. Die identifizierten Proteine von N. meningitidis und B. burgdorferi waren größtenteils bekannt, konnten aber in dieser Arbeit durch Phage Display verifiziert werden. Für N. gonorrhoeae wurden 21 potentiell immunogene Oligopeptide isoliert, von denen sechs Proteine als neue zuvor unbeschriebene Proteine mit immunogenem Charakter identifiziert wurden. Von den Phagen-präsentierten Oligopeptide der 21 immunogenen Proteine wurden Epitopmappings mit verschiedenen polyklonalen Antikörpern durchgeführt, um immunogene Bereiche näher zu identifizieren und zu charakterisieren. Bei zehn Proteinen wurden lineare Epitope eindeutig mit drei polyklonalen Antikörpern identifiziert, von fünf weiteren Proteinen waren Epitope mit mindestens einem Antikörper detektierbar. Für eine weitere Charakterisierung der ermittelten Epitope wurden Alaninscans durchgeführt, die eine detaillierte Auskunft über kritische Aminosäuren für die Bindung des Antikörpers an das Epitop geben.
Ausgehend von dem neu identifizierten Protein mit immunogenem Charakter NGO1634 wurden 26 weitere Proteine aufgrund ihrer funktionellen Ähnlichkeit ausgewählt und mithilfe bioinformatischer Analysen auf ihre Eignung zur Entwicklung einer diagnostischen Anwendung analysiert. Durch Ausschluss der meisten Proteine aufgrund ihrer Lokalisation, Membrantopologie oder unspezifischen Proteinsequenz wurden scFv-Antikörper gegen acht Proteine mittels Phage Display generiert und anschließend als scFv-Fc-Fusionsantikörper produziert und charakterisiert.
Die hier identifizierten Proteine und linearen Epitope könnten einen Ansatzpunkt für die Entwicklung einer diagnostischen oder therapeutischen Anwendung bieten. Lineare Epitopsequenzen werden häufig für die Impfstoffentwicklung eingesetzt, sodass vor allem die in dieser Arbeit bestimmten Epitope von Membranproteinen interessante Kandidaten für weitere Untersuchungen in diese Richtung sind. Durch weitere Untersuchungen könnten möglicherweise unbekannte Virulenzfaktoren entdeckt werden, deren Inhibierung einen entscheidenden Einfluss auf Infektionen haben könnten.
Für alle Organismen ist die Aufrechterhaltung ihres energetischen Gleichgewichts unter fluktuierenden Umweltbedingungen lebensnotwendig. In Eukaryoten steuern evolutionär konservierte Proteinkinasen, die in Pflanzen als SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) bezeichnet werden, die Adaption an Stresssignale aus der Umwelt und an die Limitierung von Nährstoffen und zellulärer Energie. Die Aktivierung von SnRK1 bedingt eine umfangreiche transkriptionelle Umprogrammierung, die allgemein zu einer Repression energiekonsumierender Prozesse wie beispielsweise Zellteilung und Proteinbiosynthese und zu einer Induktion energieerzeugender, katabolischer Stoffwechselwege führt. Wie unterschiedliche Signale zu einer generellen sowie teilweise gewebe- und stressspezifischen SnRK1-vermittelten Antwort führen ist bisher noch nicht ausreichend geklärt, auch weil bislang nur wenige Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion identifiziert wurden. In dieser Arbeit konnte ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk um die SnRK1αUntereinheiten aus Arabidopsis AKIN10/AKIN11 etabliert werden. Dadurch wurden zunächst Mitglieder der pflanzenspezifischen DUF581-Proteinfamilie als Interaktionspartner der SnRK1α-Untereinheiten identifiziert. Diese Proteine sind über ihre konservierte DUF581Domäne, in der ein Zinkfinger-Motiv lokalisiert ist, fähig mit AKIN10/AKIN11 zu interagieren. In planta Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass die DUF581-Proteine eine Verschiebung der nucleo-cytoplasmatischen Lokalisierung von AKIN10 hin zu einer nahezu ausschließlichen zellkernspezifischen Lokalisierung begünstigen sowie die Ko-Lokalisierung von AKIN10 und DUF581-Proteinen im Nucleus. In Bimolekularen Fluoreszenzkomplementations-Analysen konnte die zellkernspezifische Interaktion von DUF581-Proteinen mit SnRK1α-Untereinheiten in planta bestätigt werden. Außerhalb der DUF581-Domäne weisen die Proteine einander keine große Sequenzähnlichkeit auf. Aufgrund ihrer Fähigkeit mit SnRK1 zu interagieren, dem Fehlen von SnRK1Phosphorylierungsmotiven sowie ihrer untereinander sehr variabler gewebs-, entwicklungs- und stimulusspezifischer Expression wurde für DUF581-Proteine eine Funktion als Adaptoren postuliert, die unter bestimmten physiologischen Bedingungen spezifische Substratproteine in den SnRK1-Komplex rekrutieren. Auf diese Weise könnten DUF581Proteine die Interaktion von SnRK1 mit deren Zielproteinen modifizieren und eine Feinjustierung der SnRK1-Signalweiterleitung ermöglichen. Durch weiterführende Interaktionsstudien konnten DUF581-interagierende Proteine darunter Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen sowie regulatorische Proteine gefunden werden, die teilweise ebenfalls Wechselwirkungen mit SnRK1α-Untereinheiten aufzeigten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eines dieser Proteine für das eine Beteiligung an der SnRK1Signalweiterleitung als Transkriptionsregulator vermutet wurde näher charakterisiert. STKR1 (STOREKEEPER RELATED 1), ein spezifischer Interaktionspartner von DUF581-18, gehört zu einer pflanzenspezifischen Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktorfamilie und interagiert in Hefe sowie in planta mit SnRK1. Die zellkernspezifische Interaktion von STKR1 und AKIN10 in Pflanzen unterstützt die Vermutung der kooperativen Regulation von Zielgenen. Weiterhin stabilisierte die Anwesenheit von AKIN10 die Proteingehalte von STKR1, das wahrscheinlich über das 26S Proteasom abgebaut wird. Da es sich bei STKR1 um ein Phosphoprotein mit SnRK1-Phosphorylierungsmotiv handelt, stellt es sehr wahrscheinlich ein SnRK1-Substrat dar. Allerdings konnte eine SnRK1-vermittelte Phosphorylierung von STKR1 in dieser Arbeit nicht gezeigt werden. Der Verlust von einer Phosphorylierungsstelle beeinflusste die Homo- und Heterodimerisierungsfähigkeit von STKR1 in Hefeinteraktionsstudien, wodurch eine erhöhte Spezifität der Zielgenregulation ermöglicht werden könnte. Außerdem wurden Arabidopsis-Pflanzen mit einer veränderten STKR1-Expression phänotypisch, physiologisch und molekularbiologisch charakterisiert. Während der Verlust der STKR1-Expression zu Pflanzen führte, die sich kaum von Wildtyp-Pflanzen unterschieden, bedingte die konstitutive Überexpression von STKR1 ein stark vermindertes Pflanzenwachstum sowie Entwicklungsverzögerungen hinsichtlich der Blühinduktion und Seneszenz ähnlich wie sie auch bei SnRK1α-Überexpression beschrieben wurden. Pflanzen dieser Linien waren nicht in der Lage Anthocyane zu akkumulieren und enthielten geringere Gehalte an Chlorophyll und Carotinoiden. Neben einem erhöhten nächtlichen Stärkeumsatz waren die Pflanzen durch geringere Saccharosegehalte im Vergleich zum Wildtyp gekennzeichnet. Eine Transkriptomanalyse ergab, dass in den STKR1-überexprimierenden Pflanzen unter Energiemangelbedingungen, hervorgerufen durch eine verlängerte Dunkelphase, eine größere Anzahl an Genen im Vergleich zum Wildtyp differentiell reguliert war als während der Lichtphase. Dies spricht für eine Beteiligung von STKR1 an Prozessen, die während der verlängerten Dunkelphase aktiv sind. Ein solcher ist beispielsweise die SnRK1-Signaltransduktion, die unter energetischem Stress aktiviert wird. Die STKR1Überexpression führte zudem zu einer verstärkten transkriptionellen Induktion von Abwehrassoziierten Genen sowie NAC- und WRKY-Transkriptionsfaktoren nach verlängerter Dunkelphase. Die Transkriptomdaten deuteten auf eine stimulusunabhängige Induktion von Abwehrprozessen hin und konnten eine Erklärung für die phänotypischen und physiologischen Auffälligkeiten der STKR1-Überexprimierer liefern.
Das biogene Amin Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) agiert als wichtiger chemischer Botenstoff bei einer Vielzahl von Organismen. Das durch 5 HT vermittelte Signal wird dabei durch spezifische Rezeptoren wahrgenommen und in eine zelluläre Reaktion umgesetzt. Diese 5 HT Rezeptoren gehören überwiegend zur Familie der G Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Die Honigbiene Apis mellifera bietet unter anderem aufgrund ihrer eusozialen Lebensweise vielfältige Ansatzpunkte zur Erforschung der Funktionen des serotonergen Systems in Insekten. Bei A. mellifera wurden bereits vier 5-HT-Rezeptor-Subtypen beschrieben und molekular sowie pharmakologisch charakterisiert: Am5 HT1A, Am5 HT2α, Am5 HT2β und Am5 HT7. Ziel dieser Arbeit war es, gewebespezifische sowie alters- und tageszeitabhängige Expressionsmuster der 5 HT Rezeptor-Subtypen zu untersuchen, um zu einem umfassenden Verständnis des serotonergen Systems der Honigbiene beizutragen und eine Basis zur Hypothesenentwicklung für mögliche physiologische Funktionen zu schaffen.
Es wurde die Expression der 5 HT Rezeptorgene sowohl im zentralen Nervensystem, als auch in Teilen des Verdauungs-, Exkretions- und Speicheldrüsensystems gemessen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die untersuchten 5-HT-Rezeptor-Subtypen generell weit im Organismus der Honigbiene verbreitet sind. Interessanterweise unterschieden sich die untersuchten Gewebe hinsichtlich der mRNA-Expressionsmuster der untersuchten Rezeptoren. Während beispielsweise im Gehirn Am5 ht1A und Am5 ht7 stärker als Am5 ht2α und Am5 ht2β exprimiert wurden, zeigte sich in Darmgewebe ein umgekehrtes Muster.
Es war bereits bekannt, dass es bei der Expression der Am5-ht2-Gene zu alternativem Spleißen kommt. Dies führt zur Entstehung der verkürzten mRNA-Varianten Am5 ht2αΔIII und Am5 ht2βΔII. Die daraus resultierenden Proteine können nicht als funktionelle GPCRs agieren. Es konnte gezeigt werden, dass diese verkürzten Spleißvarianten dennoch ubiquitär in der Honigbiene exprimiert werden. Bemerkenswerterweise wurden gewebeübergreifende Ähnlichkeiten der Expressionsmuster der Spleißvarianten gegenüber deren zugehörigen Volllängenvarianten festgestellt, welche auf Funktionen der verkürzten Varianten in vivo hindeuten.
Im Hinblick auf die bei A. mellifera hauptsächlich altersbedingte Arbeitsteilung wurde die Expression der 5 HT Rezeptor-Subtypen in Gehirnen von unterschiedlich alten Arbeiterinnen mit unterschiedlichen sozialen Rollen verglichen. Während auf mRNA-Ebene keines der vier 5 HT Rezeptor-Subtypen eine altersabhängig unterschiedliche Expression zeigte, konnte für das Am5-HT1A-Protein eine höhere Konzentration in den Gehirnen älterer Tiere gefunden werden. Dies deutet auf eine posttranskriptionale Regulation der 5 HT1A Rezeptorexpression hin, welche im Zusammenhang mit der Arbeitsteilung stehen könnte.
Es erfolgte die Untersuchung tageszeitlicher Änderungen sowohl der Expression der 5 HT Rezeptor-Subtypen, als auch des biogenen Amins 5 HT selbst. Während es in den Gehirnen von Arbeiterinnen, welche unter natürlichen Bedingungen gehalten wurden, zu keiner tageszeitabhängigen Veränderung des 5 HT-Titers kam, zeigte die mRNA-Expression von Am5-ht2α und Am5-ht2β eine periodische Oszillation mit Zunahme während des Tages und Abnahme während der Nacht. Diese Regulation wird durch externe Faktoren hervorgerufen und ist nicht auf einen endogenen circadianen Rhythmus zurückzuführen. Dies ging aus der Wiederholung der Expressionsmessungen an Gehirnen von Bienen, welche unter konstanten Laborbedingungen gehalten wurden, hervor.
Weiterhin wurde die Beteiligung des serotonergen Systems an der Steuerung von Aspekten des circadianen lokomotorischen Aktivitätsrhythmus anhand von Verhaltensexperimenten untersucht. Mit 5 HT gefütterte Arbeiterinnen zeigten dabei unter konstanten Bedingungen eine längere Periode des Aktivitätsrhythmus als Kontrolltiere. Dies deutet auf einen Einfluss von 5 HT auf die Modulation der Synchronisation der inneren Uhr hin.
Die vorliegenden Ergebnisse tragen wesentlich zum tieferen Verständnis des serotonergen Systems der Honigbiene bei und bieten Ansatzpunkte für weitergehende Studien zur Funktion von 5 HT im Zusammenhang mit der Modulation von physiologischen Prozessen, Arbeitsteilung und circadianen Rhythmen.
Molekulare Charakterisierung von CP75, einem neuen centrosomalen Protein in Dictyostelium discoideum
(2016)
Das Centrosom ist ein Zellkern-assoziiertes Organell, das nicht von einer Membran umschlossen ist. Es spielt eine wichtige Rolle in vielen Mikrotubuli- abhängigen Prozessen wie Organellenpositionierung, Zellpolarität oder die Organisation der mitotischen Spindel. Das Centrosom von Dictyostelium besteht aus einer dreischichtigen Core-Struktur umgeben von einer Corona, die Mikrotubuli-nukleierende Komplexe enthält. Die Verdoppelung des Centrosoms in Dictyostelium findet zu Beginn der Mitose statt. In der Prophase vergrößert sich die geschichtete Core-Struktur und die Corona löst sich auf. Anschließend trennen sich die beiden äußeren Lagen der Core-Struktur und bilden in der Metaphase die beiden Spindelpole, die in der Telophase zu zwei vollständigen Centrosomen heranreifen. Das durch eine Proteom-Analyse identifizierte Protein CP75 lokalisiert am Centrosom abhängig von den Mitosephasen. Es dissoziiert von der Core-Struktur in der Prometaphase und erscheint an den Spindelpolen in der Telophase wieder. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verhalten der mittleren Lage der Core-Struktur in der Mitose, was darauf hinweist, dass CP75 eine Komponente dieser Schicht sein könnte. Die FRAP-Experimente am Interphase- Centrosom zeigen, dass GFP-CP75 dort nicht mobil ist. Das deutet darauf hin, dass das Protein wichtige Funktionen im Strukturerhalt der centrosomalen Core- Struktur übernehmen könnte. Sowohl die C- als auch die N-terminale Domäne von CP75 enthalten centrosomale Targeting-Domäne. Als GFP-Fusionsproteine (GFP-CP75-N und -C) lokalisieren die beiden Fragmente am Centrosom in der Interphase. Während GFP-CP75-C in der Mitose am Centrosom verbleibt, verschwindet GFP-CP75-N in der Metaphase und kehrt erst in der späten Telophase zurück. GFP-CP75-C und GFP-CP75O/E kolokalisieren mit F-Aktin am Zellcortex, zeigen aber keine Interaktion mit Aktin mit der BioID-Methode. Die N-terminale Domäne von CP75 enthält eine potentielle Plk1- Phosphorylierungssequenz. Die Überexpression der nichtphosphorylierbaren Punktmutante (GFP-CP75-Plk-S143A) ruft verschiedene Phänotypen wie verlängerte oder überzählige Centrosomen, vergrößerte Zellkerne und Anreicherung von detyrosinierten Mikrotubuli hervor. Die ähnlichen Phänotypen konnten auch bei GFP-CP75-N und CP75-RNAi beobachtet werden. Der
Phänotyp der detyrosinierten Mikrotubuli bringt erstmals den Beweis dafür, dass I
in Dictyostelium posttranslationale Modifikation an Tubulinen stattfindet. Außerdem zeigten CP75-RNAi-Zellen Defekte in der Organisation der mitotischen Spindel. Mittels BioID-Methode konnten drei potentielle Interaktionspartner von CP75 identifiziert werden. Diese drei Proteine CP39, CP91 und Cep192 sind ebenfalls Bestandteile des Centrosoms.
Im Hinblick auf die Problematik der Umweltverschmutzung durch die Nutzung fossiler Brennstoffe ist es nötig, eine langfristig stabile und umweltfreundliche Energieversorgung zu gewährleisten. Eine Möglichkeit, den Energiebedarf CO2-neutral zu decken, ist die Nutzung von Biogas. Hierbei spielt der Einsatz von biogenen Reststoffen, die durch einen hohen Anteil an Kohlenhydraten, Fetten und Proteinen gekennzeichnet sind und daher ein hohes Biogaspotential besitzen, eine wichtige Rolle. Voraussetzung für die Effizienz und Rentabilität solcher Anlagen ist u. a. ein stabiler Gasbildungsprozess. Da bisher noch nicht alle Aspekte der Biogasbildung vollständig verstanden sind, werden die Anlagen oft nicht optimal ausgelastet, um Prozessstörungen wie z. B. Übersäuerung zu vermeiden.
Um dennoch auftretende Prozessstörungen zu beheben, können unterschiedliche Maßnahmen durchgeführt werden. Neben der Senkung der Raumbelastung, ist es möglich, den pH-Wert durch die Zugabe von Natronlauge oder Calciumoxid anzuheben.
In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl Prozessstörungen als auch Prozessregenerierungen an einer großtechnischen Biogasanlage und in Laborversuchen untersucht. Dabei galt es, neben den physikalischen und chemischen Parametern, die mikrobielle Biozönose mit Hilfe des genetischen Fingerprintings zu charakterisieren und Änderungen zu detektieren.
Während der Prozessregenerierungen wurden nach der Zugabe von CaO Veränderungen des Gärrestes beobachtet. Es bildeten sich Pellets, die im Hinblick auf ihre Funktion für die Prozessregenerierung und die Prozessstabilität molekularbiologisch und mikroskopisch untersucht wurden. Es wurde weiterhin der Frage nachgegangen, welche Rolle die Mikroorganismen bei der Entstehung der Pellets spielen.
Die vor allem aus Calcium und Fettsäuren bestehenden Pellets dienten als Aufwuchsflächen für verschiedene Mikroorganismen. Die Bildung von Biofilmen, wie sie auf und in den Pellets nachgewiesen wurde, bot für Mikroorganismen einen Schutz vor negativen Umwelteinflüssen wie z. B. hohe Propionsäurekonzentrationen. Unter diesen günstigen Bedingungen war die Bildung von Biogas auch unter hohen Wasserstoffpartialdrücken, die den Abbau von Propionsäure hemmten, möglich. Als Indikator für bessere Lebensbedingungen wurde im Laborversuch ein Methanoculleus receptaculi-verwandter Organismus identifiziert. Dieses methanogene Archaeon wurde im Pellet nachgewiesen, während es im Gärrest erst nach der Prozessregenerierung detektiert wurde. Der Nachweis eines im Vergleich zum umgebenden Gärrest höheren Anteils an Archaeen im Kern der Pellets sowie von Biofilmen/EPS, verschiedenen Phosphatsalzen und schwerlöslichen Calciumsalzen zeigte, dass sowohl Präzipitation und Adsorption als auch Degradation von LCFA dazu führen, dass deren Konzentration im flüssigen Gärrest gesenkt wird. Dadurch nimmt die Hemmung auf die Biozönose ab und die Biogasbildungsrate steigt. Daher ist der Abbau der Fettsäuren auch bei einem niedrigen pH-Wert und unter hohen Wasserstoffpartialdrücken möglich und der Biogasbildungsprozess ist langfristig stabil. Die Bildung von Pellets unterstützt die Prozessstabilität, sofern diese nicht zu groß werden und dann u. a. die Durchmischung behindern und den Ablauf verstopfen.
Nach erfolgreicher Prozessstabilisierung wurden keine Pellets im Gärrest beobachtet. Der Abbau des organischen Materials wurde sowohl durch die steigende Calciumkonzentration als auch die steigende Gasproduktion angezeigt.
Der Na⁺-K⁺-2Cl⁻-Kotransporter (NKCC2) wird im distalen Nephron der Niere exprimiert. Seine Verteilung umfasst die Epithelien der medullären und kortikalen Teile der dicken aufsteigenden Henle-Schleife (Thick ascending limb, TAL) und die Macula densa. Resorptiver NaCl-Transport über den NKCC2 dient dem renalen Konzentrierungsmechanismus und reguliert systemisch auch Volumenstatus und Blutdruck. Die Aktivität des NKCC2 ist mit der Phosphorylierung seiner N-terminalen Aminosäurereste Serin 126 und Threonin 96/101 verbunden. Vermittelt wird diese durch die homologen Kinasen SPAK (SPS-related proline/alanine-rich kinase) und OSR1 (Oxidative stress responsive kinase 1), die hierzu ihrerseits phosphoryliert werden müssen. Der regulatorische Kontext dieser Kinasen ist mittlerweile gut charakterisiert. Über Mechanismen und Produkte, die den NKCC2 deaktivieren, war hingegen weniger bekannt. Ziel der Arbeit war daher zu untersuchen, welche Wege zur Deaktivierung des Transporters führen. Der intrazelluläre Sortierungsrezeptor SORLA (Sorting-protein-related receptor with A-type repeats) war zuvor in seiner Bedeutung für das Nephron charakterisiert worden. Ein SORLA-defizientes Mausmodell weist unter anderem eine stark verringerte NKCC2-Phosphorylierung auf. Unter osmotischem Stress können SORLA-defiziente Mäuse ihren Urin weniger effizient konzentrieren. Meine Resultate zeigen mit hochauflösender Technik, dass SORLA apikal im TAL lokalisiert ist und dass mit NKCC2 eine anteilige Kolokalisation besteht. Unter SORLA Defizienz war die für die NKCC2 Aktivität maßgebliche SPAK/OSR1-Phosphorylierung gegenüber dem Wildtyp nicht verändert. Jedoch war die ebenfalls im TAL exprimierte Phosphatase Calcineurin Aβ (CnAβ) per Western blot um das zweifache gesteigert. Parallel hierzu wurde immunhistochemisch die Kolokalisation von verstärktem CnAβ-Signal und NKCC2 bestätigt. Beide Befunde geben zusammen den Hinweis auf einen Bezug zwischen der reduzierten NKCC2-Phosphorylierung und der gesteigerten Präsenz von CnAβ bei SORLA Defizienz. Die parallel induzierte Überexpression von SORLA in HEK-Zellen zeigte entsprechend eine Halbierung der CnAβ Proteinmenge. SORLA steuert demzufolge sowohl die Abundanz als auch die zelluläre Verteilung der Phosphatase. Weiterhin ließ sich die Interaktion zwischen CnAβ und SORLA (intrazelluläre Domäne) mittels Co-Immunpräzipitation bzw. GST-pulldown assay nachweisen. Auch die Interaktion zwischen CnAβ und NKCC2 wurde auf diesem Weg belegt. Da allerdings weder SORLA noch NKCC2 ein spezifisches Bindungsmuster für CnAβ aufweisen, sind vermutlich intermediäre Adapterproteine bei ihrer Bindung involviert. Die pharmakologische Inhibition von CnAβ mittels Cyclosporin A (CsA; 1 h) führte bei SORLA Defizienz zur Normalisierung der NKCC2-Phosphorylierung. Entsprechend führte in vitro die Gabe von CsA bei TAL Zellen zu einer 7-fach gesteigerten NKCC2-Phosphorylierung. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Phosphatase CnAβ über ihre Assoziation mit NKCC2 diesen im adluminalen Zellkompartiment deaktivieren kann. Gesteuert wird dieser Vorgang durch die Eigenschaft von SORLA, CnAβ apikal zu reduzieren und damit die adluminale Phosphorylierung und Aktivität von NKCC2 zu unterstützen. Da Calcineurin-Inhibitoren derzeit die Grundlage der immunsupprimierenden Therapie darstellen, haben die Ergebnisse eine klinische Relevanz. Angesichts der Co-Expression von SORLA und CnAβ in verschiedenen anderen Organen können die Ergebnisse auch über die Niere hinaus Bedeutung erlangen.
Die Honigbiene Apis mellifera zeigt innerhalb einer Kolonie eine an das Alter gekoppelte Arbeitsteilung. Junge Honigbienen versorgen die Brut (Ammenbienen), während ältere Honigbienen (Sammlerinnen) außerhalb des Stocks Pollen und Nektar eintragen. Die biogenen Amine Octopamin und Tyramin sind an der Steuerung der Arbeitsteilung maßgeblich beteiligt. Sie interagieren mit Zielzellen über die Bindung an G Protein gekoppelte Rezeptoren. A. mellifera besitzt fünf charakterisierte Octopaminrezeptoren (AmOctαR1, AmOctβR1-4), einen charakterisierten Tyraminrezeptor (AmTyr1) sowie einen weiteren putativen Tyraminrezeptor.
In der vorliegenden Arbeit wurde dieser putative Aminrezeptor als zweiter Tyraminrezeptor (AmTyr2) identifiziert, lokalisiert und pharmakologisch charakterisiert.
Die von der cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz weist strukturelle Eigenschaften und konservierte Motive von G Protein gekoppelten Rezeptoren auf. Phylogenetisch ordnet sich der AmTyr2 Rezeptor bei den Tyramin 2 Rezeptoren anderer Insekten ein. Die funktionelle und pharmakologische Charakterisierung des putativen Tyraminrezeptors erfolgte in modifizierten HEK293 Zellen, die mit der Rezeptor cDNA transfiziert wurden. Die Applikation von Tyramin aktiviert Adenylylcyclasen in diesen Zellen und resultiert in einem Anstieg des intrazellulären cAMP Gehalts. Der AmTyr2 Rezeptor kann durch Tyramin in nanomolaren Konzentrationen halbmaximal aktiviert werden. Während es sich bei Octopamin um einen wirkungsvollen Agonisten des Rezeptors handelt, sind Mianserin und Yohimbin effektive Antagonisten. Für die Lokalisierung des Rezeptorproteins wurde ein polyklonaler Antikörper generiert. Eine AmTyr2-ähnliche Immunreaktivität zeigt sich im Gehirn in den optischen Loben, den Antennalloben, dem Zentralkomplex und in den Kenyon Zellen der Pilzkörper.
Des Weiteren wurde die Rolle der Octopamin- und Tyraminrezeptoren bei der Steuerung der altersabhängigen Arbeitsteilung analysiert.
Die Genexpression des AmOctαR1 in verschiedenen Gehirnteilen korreliert unabhängig vom Alter mit der sozialen Rolle, während sich die Genexpression von AmOctβR3/4 und den Tyraminrezeptoren AmTyr1 und AmTyr2 maximal mit dem Alter aber nicht der sozialen Rolle ändert. Sammlerinnen weisen einen höheren Octopamingehalt im Gesamtgehirn auf als Ammenbienen; bei Tyramin zeigen sich keine Unterschiede. Während Tyramin offensichtlich keine direkte Rolle spielt, werden durch Octopamin gesteuerte Prozesse der altersabhängigen Arbeitsteilung bei der Honigbiene vermutlich über den AmOctαR1 vermittelt.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen die wichtige Rolle von biogenen Aminen, insbesondere Octopamin bei der sozialen Organisation von Insektenstaaten.
Die Interaktionen von komplexen Kohlenhydraten und Proteinen sind ubiquitär. Sie spielen wichtige Rollen in vielen physiologischen Prozessen wie Zelladhäsion, Signaltransduktion sowie bei viralen Infektionen. Die molekularen Grundlagen der Interaktion sind noch nicht komplett verstanden. Ein Modellsystem für Kohlenhydrat-Protein-Interaktionen besteht aus Adhäsionsproteinen (Tailspikes) von Bakteriophagen, die komplexe Kohlenhydrate auf bakteriellen Oberflächen (O-Antigen) erkennen. Das Tailspike-Protein (TSP), das in dieser Arbeit betrachtet wurde, stammt aus dem Bakteriophagen 9NA (9NATSP). 9NATSP weist eine hohe strukturelle Homologie zum gut charakterisierten TSP des Phagen P22 (P22TSP) auf, bei einer niedriger sequenzieller Ähnlichkeit. Die Substratspezifitäten beider Tailspikes sind ähnlich mit Ausnahme der Toleranz gegenüber den glucosylierten Formen des O-Antigens. Die Struktur der beiden Tailspikes ist bekannt, sodass sie ein geeignetes System für vergleichende Bindungsstudien darstellen, um die strukturellen Grundlagen für die Unterschiede der Spezifität zu untersuchen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der ELISA-like tailspike adsorption assay (ELITA) etabliert, um Binderpaare aus TSPs und O-Antigen zu identifizieren. Dabei wurden 9NATSP und P22TSP als Sonden eingesetzt, deren Bindung an die intakten, an die Mikrotiterplatte adsorbierten Bakterien getestet wurde. Beim Test einer Sammlung aus 44 Salmonella-Stämmen wurden Stämme identifiziert, die bindendes O-Antigen exprimieren. Gleichzeitig wurden Unterschiede in der Bindung der beiden TSPs an Salmonella-Stämme mit gleichem O-Serotyp beobachtet. Die Ergebnisse der ELITA-Messung wurden qualitativ durch eine FACS-basierte Bindungsmessung bestätigt. Zusätzlich ermöglichte die FACS-Messung bei Stämmen, die teilweise modifizierte O-Antigene herstellen, den Anteil an Zellen mit und ohne Modifikation zu erfassen.
Die Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-basierten Interaktionsmessungen wurden eingesetzt, um Bindungsaffinitäten für eine TSP-O-Antigen Kombination zu quantifizieren. Dafür wurden zwei Methoden getestet, um die Oligosaccharide auf einem SPR-Chip zu immobilisieren. Zum einen wurden die enzymatisch hergestellten O-Antigenfragmente mit einem bifunktionalen Oxaminadapter derivatisiert, der eine primäre Aminogruppe für die Immobilisierung bereitstellt. Ein Versuch, diese Oligosaccharidfragmente zu immobilisieren, war jedoch nicht erfolgreich. Dagegen wurde das nicht derivatisierte Polysaccharid, bestehend aus repetitivem O-Antigen und einem konservierten Kernsaccharid, erfolgreich auf einem SPR-Chip immobilisiert. Die Immobilisierung wurde durch Interaktionsmessungen mit P22TSP bestätigt. Durch die Immobilisierung des Polysaccharids sind somit quantitative SPR-Bindungsmessungen mit einem polydispersen Interaktionspartner möglich.
Eine Auswahl von Salmonella-Stämmen mit einer ausgeprägt unterschiedlichen Bindung von 9NATSP und P22TSP im ELITA-Testsystem wurde hinsichtlich der Zusammensetzung des O-Antigens mittels HPLC, Kapillargelelektrophorese und MALDI-MS analysiert. Dabei wurden nicht-stöchiometrische Modifikationen der O-Antigene wie Acetylierung und Glucosylierung detektiert. Das Ausmaß der Glucosylierung korrelierte negativ mit der Effizienz der Bindung und des Verdaus durch die beiden TSPs, wobei der negative Effekt bei 9NATSP weniger stark ausgeprägt war als bei P22TSP. Dies stimmt mit den Literaturdaten zu Infektivitätsstudien mit 9NA und P22 überein, die mit Stämmen mit vergleichbaren O-Antigenvarianten durchgeführt wurden. Die Korrelation zwischen der Glucosylierung und Bindungseffizienz konnte strukturell interpretiert werden.
Auf Grundlage der O-Antigenanalysen sowie der Ergebnisse der ELITA- und FACS-Bindungstests wurden die Salmonella-Stämme Brancaster und Kalamu identifiziert, die annähernd quantitativ glucosyliertes O-Antigen exprimieren. Damit eignen sich diese Stämme für weiterführende Studien, um die Zusammenhänge zwischen der Spezifität und der Organisation der Bindestellen der beiden TSPs zu untersuchen.
Tierische und menschliche Fäkalien aus Landwirtschaft und Haushalten enthalten zahlreiche obligat und opportunistisch pathogene Mikroorganismen, deren Konzentration u. a. je nach Gesundheitszustand der betrachteten Gruppe schwankt. Neben den Krankheitserregern enthalten Fäkalien aber auch essentielle Pflanzennährstoffe (276) und dienen seit Jahrtausenden (63) als Dünger für Feldfrüchte. Mit der unbedarften Verwendung von pathogenbelastetem Fäkaldünger steigt jedoch auch das Risiko einer Infektion von Mensch und Tier. Diese Gefahr erhöht sich mit der globalen Vernetzung der Landwirtschaft, z. B. durch den Import von kontaminierten Futter- bzw. Lebensmitteln (29).
Die vorliegende Arbeit stellt die milchsaure Fermentation von Rindergülle und Klärschlamm als alternative Hygienisierungsmethode gegenüber der Pasteurisation in Biogasanlagen bzw. gebräuchlichen Kompostierung vor.
Dabei wird ein Abfall der Gram-negativen Bakterienflora sowie der Enterokokken, Schimmel- und Hefepilze unter die Nachweisgrenze von 3 log10KbE/g beobachtet, gleichzeitig steigt die Konzentration der Lactobacillaceae um das Tausendfache. Darüber hinaus wird gezeigt, dass pathogene Bakterien wie Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, EHEC O:157 und vegetative Clostridum perfringens-Zellen innerhalb von 3 Tagen inaktiviert werden. Die Inaktivierung von ECBO-Viren und Spulwurmeiern erfolgt innerhalb von 7 bzw. 56 Tagen. Zur Aufklärung der Ursache der beobachteten Hygienisierung wurde das fermentierte Material auf flüchtige Fettsäuren sowie pH-Wertänderungen untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die gemessenen Werte nicht die alleinige Ursache für das Absterben der Erreger sind, vielmehr wird eine zusätzliche bakterizide Wirkung durch eine mutmaßliche Bildung von Bakteriozinen in Betracht gezogen. Die parasitizide Wirkung wird auf die physikalischen Bedingungen der Fermentation zurückgeführt.
Die methodischen Grundlagen basieren auf Analysen mittels zahlreicher klassisch-kultureller Verfahren, wie z. B. der Lebendkeimzahlbestimmung. Darüber hinaus findet die MALDI-TOF-Massenspektrometrie und die klassische PCR in Kombination mit der Gradienten-Gelelektrophorese Anwendung, um kultivierbare Bakterienfloren zu beschreiben bzw. nicht kultivierbare Bakterienfloren stichprobenartig zu erfassen.
Neben den Aspekten der Hygienisierung wird zudem die Eignung der Methode für die landwirtschaftliche Nutzung berücksichtigt. Dies findet sich insbesondere in der Komposition des zu fermentierenden Materials wieder, welches für die verstärkte Humusakkumulation im Ackerboden optimiert wurde. Darüber hinaus wird die Masseverlustbilanz während der milchsauren Fermentation mit denen der Kompostierung sowie der Verarbeitung in der Biogasanlage verglichen und als positiv bewertet, da sie mit insgesamt 2,45 % sehr deutlich unter den bisherigen Alternativen liegt (73, 138, 458). Weniger Verluste an organischem Material während der Hygienisierung führen zu einer größeren verwendbaren Düngermenge, die auf Grund ihres organischen Ursprungs zu einer Verstärkung des Humusanteiles im Ackerboden beitragen kann (56, 132).
Viele klinische Schnelltestsysteme benötigen vorpräparierte oder aufgereinigte Analyte mit frisch hergestellten Lösungen. Fernab standardisierter Laborbedingungen wie z.B. in Entwicklungsländern oder Krisengebieten sind solche Voraussetzungen oft nur unter einem hohen Aufwand herstellbar.
Zusätzlich stellt die erforderliche Sensitivität die Entwicklung einfach zu handhabender Testsysteme vor große Herausforderungen.
Autokatalytische Reaktionen, die sich mit Hilfe sehr geringer Initiatorkonzentrationen auslösen lassen, können hier eine Perspektive für Signalverstärkungsprozesse bieten.
Aus diesem Grund wird im ersten Teil der vorliegenden Arbeit das Verhalten der autokatalytischen Arsenit-Jodat-Reaktion in einem mikrofluidischen Kanal untersucht. Dabei werden insbesondere die diffusiven und konvektiven Einflüsse auf die Reaktionskinetik im Vergleich zu makroskopischen Volumenmengen betrachtet.
Im zweiten Teil werden thermoresponsive Hydrogele mit einem kanalstrukturierten Papiernetzwerk zu einem neuartigen, kapillargetriebenen, extern steuerbaren Mikrofluidik-System kombiniert. Das hier vorgestellte Konzept durch Hydrogele ein papierbasiertes LOC-System zu steuern, ermöglicht zukünftig die Herstellung von komplexeren, steuerbaren Point-Of-Care Testsystemen (POCT). Durch z.B. einen thermischen Stimulus, wird das Lösungsverhalten eines Hydrogels so verändert, dass die gespeicherte Flüssigkeit freigesetzt und durch die Kapillarkraft des Papierkanals ins System transportiert wird. Die Eigenschaften dieses Gelnetzwerks können dabei so eingestellt werden, dass eine Freisetzung von Flüssigkeiten sogar bei Körpertemperatur möglich wäre und damit eine Anwendung gänzlich ohne weitere Hilfsmittel denkbar ist. Für die Anwendung notwendige Chemikalien oder Enzyme lassen sich hierbei bequem in getrocknetem Zustand im Papiersubstrat vorlagern und bei Bedarf in Lösung bringen.
Im abschließenden dritten Teil der Arbeit wird ein durch Hydrogele betriebener, Antikörper-basierter Mikroorganismenschnelltest für Escherichia coli präsentiert. Darüber hinaus wird weiterführend eine einfache Methode zur Funktionalisierung eines Hydrogels mit Biomolekülen über EDC/NHS-Kopplung vorgestellt.
Weltweit streben Anti-Doping Institute danach jene Sportler zu überführen, welche sich unerlaubter Mittel oder Methoden bedienen. Die hierfür notwendigen Testsysteme werden kontinuierlich weiterentwickelt und neue Methoden aufgrund neuer Wirkstoffe der Pharmaindustrie etabliert. Gegenstand dieser Arbeit war es, eine parallele Mehrkomponentenanalyse auf Basis von Antigen-Antikörper Reaktionen zu entwickeln, bei dem es primär um Verringerung des benötigten Probevolumens und der Versuchszeit im Vergleich zu einem Standard Nachweis-Verfahren ging. Neben der Verwendung eines Multiplex Ansatzes und der Mikroarraytechnologie stellten ebenfalls die Genauigkeit aller Messparameter, die Stabilität des Versuchsaufbaus sowie die Performance über einen Einfach-Blind-Ansatz Herausforderungen dar. Die Anforderung an den Multiplex Ansatz, keine falschen Signale trotz ähnlicher Strukturen zu messen, konnte durch die gezielte Kombination von spezifischen Antikörpern realisiert werden. Hierfür wurden neben Kreuzreaktivitätstests auf dem Mikroarray parallel erfolgreich Western Blot Versuche durchgeführt. Jene Antikörper, welche in diesen Versuchen die gesetzten Anforderungen erfüllten, wurden für das Ermitteln der kleinsten nachweisbaren Konzentration verwendet. Über das Optimieren der Versuchsbedingungen konnte unter Verwendung von Tween in der Waschlösung sowohl auf Glas als auch auf Kunststoff die Hintergrundfluoreszenz reduziert und somit eine Steigerung des Signal/Hintergrundverhältnisses erreicht werden. In den Versuchen zu Ermittlung der Bestimmungsgrenze wurde für das humane Choriongonadotropin (hCG-i) eine Konzentration von 10 mU/ml, für dessen beta-Untereinheit (hCG-beta) eine Konzentration von 3,6 mU/ml und für das luteinisierende Hormon (LH) eine Konzentration von 10 mU/ml bestimmt. Den ermittelten Wert im Serum für das hCG-i entspricht dem von der Welt-Anti-Dopin-Agentur (WADA) geforderten Wert in Urin von 5 mU/ml. Neben der Ermittlung von Bestimmungsgrenzen wurden diese hinsichtlich auftretender Matrixeffekte in Serum und Blut gemessen. Wie aus den Versuchen zur Ermittlung von Kreuzreaktivitäten auf dem Mikroarray zu entnehmen ist, lassen sich das LH, das hCG-i und hCG-β ebenfalls in Serum und Blut messen. Die Durchführung einer Performance-Analyse über einem Einfach-Blind-Ansatz mit 130 Serum Proben, wurde ebenfalls über dieses System realisiert. Die ausgewerteten Proben wurden anschließend über eine Grenzwertoptimierungskurve analysiert und die diagnostische Spezifität ermittelt. Für die Messungen des LH konnte eine Sensitivität und Spezifität von 100% erreicht werden. Demnach wurden alle negativen und positiven Proben eindeutig interpretiert. Für das hCG-β konnte ebenfalls eine Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 97% erreicht werden. Die hCG-i Proben wurden mit einer Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 97,5% gemessen. Um den Nachweis zu erbringen, dass dieser Versuchsaufbau über mehrere Wochen stabile Signale bei Vermessen von identischen Proben liefert, wurde ein über zwölf Wochen angesetzter Stabilitätstest für alle Parameter erfolgreich in Serum und Blut durchgeführt. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erfolgreich eine Mehrkomponentenanalyse als Multiplex Ansatz auf einem Mikroarray entwickelt werden. Die Durchführung der Performance-Analyse und des Stabilitätstests zeigen bereits die mögliche Einsatzfähigkeit dieses Tests im Kontext einer Dopinganalyse.
Der Bittergeschmack dient Säugern vermutlich zur Wahrnehmung und Vermeidung toxischer Substanzen. Bitterstoffe können jedoch auch gesund sein oder werden oft bereitwillig mit der Nahrung aufgenommen. Ob sie geschmacklich unterschieden werden können, ist allerdings umstritten. Detektiert werden Bitterstoffe von oralen Bittergeschmacksrezeptoren, den TAS2R (human) bzw. Tas2r (murin). In der Literatur gibt es aber immer mehr Hinweise darauf, dass überdies Tas2r nicht nur in extragustatorischen Organen exprimiert werden, sondern dort auch wichtige Aufgaben erfüllen könnten, was wiederum die Aufklärung ihrer noch nicht vollständig entschlüsselten Funktionsweisen erfordert. So ist noch unbekannt, ob alle bisher als funktionell identifizierten Tas2r wirklich gustatorische Funktionen erfüllen.
Im Rahmen der Charakterisierung neu generierter, im Locus des Bittergeschmacksrezeptors Tas2r131 genetisch modifizierter Mauslinien, wurde in vorliegender Arbeit die gustatorische sowie extragustatorische Expression von Tas2r131 untersucht. Dass Tas2r131 nicht nur in Pilzpapillen, Wall- und Blätterpapillen (VP+FoP), Gaumen, Ductus nasopalatinus, Vomeronasalorgan und Kehldeckel, sondern auch in Thymus, Testes und Nebenhodenkopf, in Gehirnarealen sowie im Ganglion geniculatum nachgewiesen wurde, bildete die Grundlage für weiterführende Studien. Die vorliegende Arbeit zeigt außerdem, dass Tas2r108, Tas2r126, Tas2r135, Tas2r137 und Tas2r143 in Blut exprimiert werden, was auf eine heterogene Funktion der Tas2r hindeutet. Dass zusätzlich erstmals die Expression aller 35 als funktionell beschriebenen Tas2r im gustatorischen VP+FoP-Epithel von C57BL/6-Mäusen nachgewiesen wurde, verweist auf deren Relevanz als funktionelle Geschmacksrezeptoren.
Weiter zeigten Untersuchungen zur Aufklärung eines möglichen Bitter-Unterscheidungsvermögens in Geschmackspapillen von Mäusen mit fluoreszenzmarkierten oder ablatierten Tas2r131-Zellen, dass Tas2r131 exprimierende Zellen eine Tas2r-Zellsubpopulation bilden. Darüber hinaus existieren innerhalb der Bitterzellen geordnete Tas2r-Expressionsmuster, die sich nach der chromosomalen Lage ihrer Gene richten. Isolierte Bitterzellen reagieren heterogen auf bekannte Bitterstoffe. Und Mäuse mit ablatierter Tas2r131-Zellpopulation besitzen noch andere Tas2r-Zellen und schmecken damit einige Bitterstoffe kaum noch, andere aber noch sehr gut. Diese Befunde belegen die Existenz verschiedener gustatorischer Tas2r-Zellpopulationen, welche die Voraussetzung bilden, Bitterstoffe heterogen zu detektieren. Ob dies die Grundlage für ein divergierendes Verhalten gegenüber unverträglichen und harmlosen oder gar nützlichen Bitterstoffen darstellt, kann mit Hilfe der dargelegten Tas2r-Expressionsmuster künftig in Verhaltensexperimenten geprüft werden.
Die Bittergeschmackswahrnehmung in Säugetieren stellt sich als ein hochkomplexer Mechanismus dar, dessen Vielschichtigkeit durch die hier neu aufgezeigten heterogenen Tas2r-Expressions- und Funktionsmuster erneut verdeutlicht wird.
Das Influenzavirus infiziert Säugetiere und Vögel. Der erste Schritt im Infektionszyklus ist die Anbindung des Viruses über sein Oberflächenprotein Hämagglutinin (HA) an Zuckerstrukturen auf Epithelzellen des respiratorischen Traktes im Wirtsorganismus. Aus den drei komplementaritätsbestimmenden Regionen (complementarity determining regions, CDRs) der schweren Kette eines monoklonalen Hämagglutinin-bindenden Antikörpers wurden drei lineare Peptide abgeleitet. Die Bindungseigenschaften der drei Peptide wurden experimentell mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie untersucht. Es zeigte sich, dass in Übereinstimmung mit begleitenden Molekulardynamik-Simulationen zwei der drei Peptide (PeB und PeC) analog zur Bindefähigkeit des Antikörpers in der Lage sind, Influenzaviren vom Stamm X31 (H3N2 A/Aichi/2/1968) zu binden. Die Interaktion des Peptids PeB, welches potentiell mit der konservierten Rezeptorbindestelle im HA interagiert, wurde anschließend näher charakterisiert. Die Detektion der Influenzaviren war unter geeigneten Immobilisationsbedingungen im diagnostisch relevanten Bereich möglich. Die Spezifität der PeB-Virus-Bindung wurde mittels geeigneter Kontrollen auf der Seite des Analyten und des Liganden nachgewiesen. Des Weiteren war das Peptid PeB in der Lage die Bindung von X31-Viren an Mimetika seines natürlichen Rezeptors zu inhibieren, was die spezifische Interaktion mit der Rezeptorbindungsstelle im Hämagglutinin belegt. Anschließend wurde die Primärsequenz von PeB durch eine vollständige Substitutionsanalyse im Microarray-Format hinsichtlich der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen charakterisiert. Dies führte außerdem zu verbesserten Peptidvarianten mit erhöhter Affinität und breiterer Spezifität gegen aktuelle Influenzastämme verschiedener Serotypen (z.B. H1N1/2009, H5N1/2004, H7N1/2013). Schließlich konnte durch Verwendung einer in der Primärsequenz angepassten höher affinen Peptidvariante die Influenzainfektion in vitro inhibiert werden. Damit stellen die vom ursprünglichen Peptid PeB abgeleiteten Varianten Rezeptormoleküle in biosensorischen Testsystemen sowie potentielle Wirkstoffe dar.
Internalin J (InlJ) gehört zu der Klasse der bakteriellen, cysteinhaltigen (leucine-rich repeat) LRR Proteine. Bei den Internalinen handelt es sich um meist invasions-assoziierte Proteine der Listerien. Die LRR-Domäne von InlJ ist aus 15 regelmäßig wiederkehrenden, stark konservierten Sequenzeinheiten (repeats, 21 Aminosäuren) aufgebaut. Ein interessantes Detail dieses Internalins ist das stark konservierte Cystein innerhalb der repeats. Daraus ergibt sich eine ungewöhnliche Anordnung von 12 Cysteinen in einem Stapel. Die Häufigkeit von Cysteinen in InlJ ist für ein extrazelluläres Protein von L. monocytogenes außergewöhnlich, und die Frage nach ihrer Funktion daher umso brennender. Im Vergleich zum ubiquitären Vorkommen der sogenannten repeat-Proteine in der Natur sind Studien zu ihrer Stabilität und Faltung nicht äquivalent vertreten. Die zentrale Eigenschaft der repeat-Proteine ist ihr modularer Aufbau, der durch einfache Topologie gekennzeichnet ist und auf kurzreichenden Wechselwirkungen basiert. Diese Topologie macht repeat-Proteine zu idealen Modellproteinen, um die stabilitätsrelevanten Wechselwirkungen zu separieren und zuzuordnen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Faltung und Entfaltung von InlJ umfassend charakterisiert und die Relevanz der Cysteine näher beleuchtet. Die spektroskopische Charakterisierung von InlJ zeigte, dass dessen Faltungszustand durch zwei Tryptophane im N- und C-Terminus fluoreszenzspektroskopisch gut zugänglich ist. Die thermodynamische Stabilität wurde mittels fluoreszenz-detektierten, Guanidiniumchlorid-induzierten Gleichgewichtsexperimenten bestimmt. Um die kinetischen Eigenschaften von InlJ zu erfassen, wurden die Faltungs- sowie die Entfaltungsreaktion spektroskopisch untersucht. Die Identifizierung der produktiven Faltungsreaktion war lediglich durch die Anwendung des reversen Doppelsprungexperiments möglich. Die Auswertung erfolgte nach dem Zweizustandsmodell, wonach die Faltung dem „Alles-oder-Nichts“ Prinzip folgt. Die Gültigkeit dieser Annahme wurde durch die kinetische Charakterisierung bestätigt. Es wurde sowohl in den Gleichgewichtsexperimenten als auch in den kinetisch erhaltenen Daten eine hohe freie Stabilisierungsenthalpie festgestellt. Die hohe Stabilität von InlJ geht mit hoher Kooperativität einher. Die kinetischen Daten zeigen zudem, dass die hohe Kooperativität hauptsächlich der Faltungsreaktion entstammt. Der Tanford-Wert von 0.93 impliziert, dass die Oberflächenänderung während der Faltung bereits zum größten Teil erfolgt ist, bevor der Übergangszustand ausgebildet wurde. Direkte strukturelle Informationen über den Übergangszustand wurden mit Hilfe von Mutationsstudien erhalten. Zu diesem Zweck wurden 12 der 14 Cysteine gegen ein Alanin ausgetauscht. Die repeats 1 bis 11 von InlJ beinhalten jeweils ein Cystein, deren Anordnung eine Leiter ergibt. Deren Substitutionen haben einen vergleichbar destabilisierenden Effekt auf InlJ von durchschnittlich 4.8 kJ/mol. Die Verlangsamung der Faltung deutet daraufhin, dass die Interaktionen der repeats 5 bis 11 im Übergangszustand bereits voll ausgebildet sind. Demnach liegt bei InlJ ein zentraler Faltungsnukleus vor. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurde eine hohe Stabilität und ein stark-kooperatives Verhalten für das extrazelluläre Protein InlJ beobachtet. Diese Erkenntnisse könnten wichtige Beiträge zur Entwicklung artifizieller repeat-Proteine leisten, deren Verwendung sich stetig ausweitet.
Die nichtproteinogene Aminosäure GABA (γ-Aminobuttersäure) gilt als der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im Zentralnervensystem von Vertebraten sowie Invertebraten und vermittelt ihre Wirkung u. a. über die metabotropen GABAB-Rezeptoren. Bisher sind diese Rezeptoren bei Insekten nur rudimentär untersucht. Für die Amerikanische Großschabe als etablierter Modellorganismus konnte pharmakologisch eine modulatorische Rolle der GABAB-Rezeptoren bei der Bildung von Primärspeichel nachgewiesen werden. Ziel dieser Arbeit war eine umfassende Charakterisierung der GABAB-Rezeptor-Subtypen 1 und 2 von Periplaneta americana. Unter Verwendung verschiedenster Klonierungsstrategien sowie der Kooperationsmöglichkeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. T. Miura (Hokkaido, Japan) in Hinsicht auf eine dort etablierte P. americana EST-Datenbank gelang die Klonierung von zwei Rezeptor-cDNAs. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen auf GB-spezifische Domänen und konservierte Aminosäure-Reste, sowie der Vergleich zu bekannten GB Sequenzen anderer Arten legen nahe, dass es sich bei den isolierten Sequenzen um die GABAB-Rezeptor-Subtypen 1 und 2 (PeaGB1 und PeaGB2) handelt. Für die funktionelle und pharmakologische Charakterisierung des Heteromers aus PeaGB1 und PeaGB2 wurden Expressionskonstrukte für die Transfektion in HEK-flpTM-Zellen hergestellt. Das Heteromer aus PeaGB1 und PeaGB2 hemmt bei steigenden GABA-Konzentrationen die cAMP-Produktion. Die Substanzen SKF97541 und 3-APPA konnten als Agonisten identifiziert werden. CGP55845 und CGP54626 wirken als vollwertige Antagonisten. Das in vitro ermittelte pharmakologische Profil im Vergleich zur Pharmakologie an der isolierten Drüse bestätigt, dass die GABA-Wirkung in der Speicheldrüse tatsächlich von GBs vermittelt wird. Für die immunhistochemische Charakterisierung konnte ein spezifischer polyklonaler Antikörper gegen die extrazelluläre Schleife 2 des PeaGB1 generiert werden. Ein weiterer Antikörper, welcher gegen den PeaGB2 gerichtet ist, erwies sich hingegen nicht als ausreichend spezifisch. Western-Blot-Analysen bestätigen das Vorkommen beider Subtypen im Zentralnervensystem von P. americana. Zudem wird der PeaGB1 in der Speicheldrüse und in den Geschlechtsdrüsen der Schabenmännchen exprimiert. Immunhistochemische Analysen zeigen eine PeaGB1-ähnliche Markierung in den GABAergen Fasern der Speicheldrüse auf. Demnach fungiert der PeaGB1 hier als Autorezeptor. Weiterhin konnte eine PeaGB1-ähnliche Markierung in nahezu allen Gehirnneuropilen festgestellt werden. Auch die akzessorischen Drüsen der Männchen, Pilzdrüse und Phallusdrüse, sind PeaGB1-immunreaktiv.
Escherichia (E.) coli ist als kommensales Bakterium ein wichtiger Bestandteil des Mikrobioms von Säugern, jedoch zudem der häufigste Infektionserreger des Menschen. Entsprechend des Infektionsortes werden intestinal (InPEC) und extraintestinal pathogene E. coli (ExPEC) unterschieden. Die Pathogenese von E. coli-Infektionen ist durch Virulenzfaktoren determiniert, welche von jeweils spezifischen virulenzassoziierten Genen (inVAGs und exVAGs) kodiert werden. Häufig werden exVAGs auch in E. coli-Isolaten aus dem Darm gesunder Wirte nachgewiesen. Dies führte zu der Vermutung, dass exVAGs die intestinale Kolonisierung des Wirtes durch E. coli unterstützen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, das Wissen über den Einfluss von exVAGs auf die Besiedlung und damit die Adhäsion von E. coli an Epithelzellen des Darmtraktes zu erweitern. Die Durchführung einer solch umfassenden E. coli-Populationsstudie erforderte die Etablierung neuer Screeningmethoden. Für die genotypische Charakterisierung wurden mikropartikelbasierte Multiplex-PCR-Assays zum Nachweis von 44 VAGs und der Phylogenie etabliert. Für die phänotypische Charakterisierung wurden Adhäsions- und Zytotoxizitätsassays etabliert. Die Screeningmethoden basieren auf der VideoScan-Technologie, einem automatisierten bildbasierten Multifluoreszenzdetektionssystem. Es wurden 398 E. coli-Isolate aus 13 Wildsäugerarten und 5 Wildvogelarten sowie aus gesunden und harnwegserkrankten Menschen und Hausschweinen charakterisiert. Die Adhäsionsassays hatten zum Ziel, sowohl die Adhäsionsraten als auch die Adhäsionsmuster der 317 nicht hämolytischen Isolate auf 5 Epithelzelllinien zu bestimmen. Die Zytotoxizität der 81 hämolytischen Isolate wurde in Abhängigkeit der Inkubationszeit auf 4 Epithelzelllinien geprüft. In den E. coli-Isolaten wurde eine Reihe von VAGs nachgewiesen. Potentielle InPEC, insbesondere shigatoxinproduzierende und enteropathogene E. coli wurden aus Menschen, Hausschweinen und Wildtieren, vor allem aus Rehen und Feldhasen isoliert. exVAGs wurden mit stark variierender Prävalenz in Isolaten aus allen Arten detektiert. Die größte Anzahl und das breiteste Spektrum an exVAGs wurde in Isolaten aus Urin harnwegserkrankter Menschen, gefolgt von Isolaten aus Dachsen und Rehen nachgewiesen. In Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 wurden mehr exVAGs detektiert als in den Isolaten der phylogenetischen Gruppen A, B1 und D. Die Ergebnisse der Adhäsionsassays zeigten, dass die meisten Isolate zelllinien-, gewebe- oder wirtsspezifisch adhärierten. Ein Drittel der Isolate adhärierte an keiner Zelllinie und nur zwei Isolate adhärierten stark an allen Zelllinien. Grundsätzlich adhärierten mehr Isolate an humanen sowie an intestinalen Zelllinien. Besonders Isolate aus Eichhörnchen und Amseln sowie aus Urin harnwegserkrankter Menschen und Hausschweine waren in der Lage, stark zu adhärieren. Hierbei bildeten die Isolate als Adhäsionsmuster diffuse Adhäsion, Mikrokolonien, Ketten und Agglomerationen. Mittels statistischer Analysen wurden Assoziationen zwischen exVAGs und einer hohen Adhäsionsrate ersichtlich. So war beispielsweise das Vorkommen von afa/dra mit einer höheren Adhäsionsrate auf Caco-2- und 5637-Zellen und von sfa/foc auf IPEC-J2-Zellen assoziiert. Die Ergebnisse der Zytotoxizitätsassays zeigten eine sehr starke und zeitabhängige Zerstörung der Monolayer aller Epithelzelllinien durch die α-Hämolysin-positiven Isolate. Auffallend war die hohe Toxizität hämolytischer Isolate aus Wildtieren gegenüber den humanen Zelllinien. Mit den innerhalb dieser Arbeit entwickelten Screeningmethoden war es möglich, große Mengen an Bakterien zu charakterisieren. Es konnte ein Überblick über die Verbreitung von VAGs in E. coli aus unterschiedlichen Wirten gewonnen werden. Besonders Wildtiere wurden sowohl durch den Nachweis von VAGs in den entsprechenden Isolaten, verbunden mit deren Adhäsionsfähigkeit und ausgeprägter Zytotoxizität als Reservoire pathogener E. coli identifiziert. Ebenso wurde eine zelllinienspezifische Adhäsion von Isolaten mit bestimmten exVAGs deutlich. Damit konnte der mögliche Einfluss von exVAGs auf die intestinale Kolonisierung bestätigt werden. In weiterführenden Arbeiten sind jedoch Expressions- und Funktionsanalysen der entsprechenden Proteine unerlässlich. Es wird anhand der Mikrokoloniebildung durch kommensale E. coli vermutet, dass Adhäsionsmuster und demzufolge Kolonisierungsstrategien, die bisher pathogenen E. coli zugeschrieben wurden, eher als generelle Kolonisierungsstrategien zu betrachten sind. Das E. coli-α-Hämolysin wirkt im Allgemeinen zytotoxisch auf Epithelzellen. Ein in der Fachliteratur diskutierter adhäsionsunterstützender Mechanismus dieses Toxins ist demnach fragwürdig. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Screeningmethoden umfassende Analysen einer großen Anzahl an E. coli-Isolaten ermöglichen.
Die Mykorrhiza (griechisch: mýkēs für „Pilz”; rhiza für „Wurzel”) stellt eine Symbiose zwischen Pilzen und einem Großteil der Landpflanzen dar. Der Pilz verbessert durch die Symbiose die Versorgung der Pflanze mit Nährstoffen, während die Pflanze den Pilz mit Kohlenhydraten versorgt. Die arbuskuläre Mykorrhiza (AM) stellt dabei einen beson-dere Form der Mykorrhiza dar. Der AM-Pilz bildet dabei während der Symbiose die namensgebenden Arbuskeln innerhalb der Wurzelzellen als Ort des primären Nährstoff- austausches aus. Die AM-Symbiose (AMS) ist der Forschungsschwerpunkt dieser Arbeit. Als Modellorganismen wurden Medicago truncatula und Glomus intraradices verwendet. Es wurden Transkriptionsanalysen durchgeführt um u.a. AMS regulierte Transkriptions- faktoren (TFs) zu identifizieren. Die Aktivität der Promotoren von drei der so identifizier-ten AMS-regulierten TFs (MtOFTN, MtNTS, MtDES) wurde mit Hilfe eine Reportergens visualisiert. Der Bereich der größten Promotoraktivität waren in einem Fall nur die ar- buskelhaltigen Zellen (MtOFTN). Im zweiten Fall war der Promotor auch aktiv in nicht arbuskelhaltigen Zellen, jedoch am stärksten aktiv in den arbuskelhaltigen Zellen (MtNTS). Ein weiterer Promotor war in arbuskelhaltigen Zellen und den diesen benach-barten Zellen gleich aktiv (MtDES). Zusätzlich wurden weitere Gene als AMS-reguliert identifiziert und es wurde für drei dieser Gene (MtPPK, MtAmT, MtMDRL) ebenfalls eine Promotor::Reporter-Aktivitäts- studie durchgeführt. Die Promotoren der Kinase (MtPPK) und des Ammoniumtrans-porters (MtAmt) waren dabei ausschließlich in arbuskelhaltigen Zellen aktiv, während die Aktivität des ABC-Transporters (MtMDRL) keinem bestimmten Zelltyp zuzuordnen war. Für zwei weitere identifizierte Gene, ein Kupfertransporter (MtCoT) und ein Zucker- bzw. Inositoltransporter (MtSuT), wurden RNA-Interferenz (RNAi)-Untersuchungen durchgeführt. Dabei stellte sich in beiden Fällen heraus, dass, sobald ein RNAi-Effekt in den transformierten Wurzeln vorlag, diese in einem deutlich geringerem Ausmaß wie in der Wurzelkontrolle von G. intraradices kolonisiert worden sind. Im Falle von MtCoT könnte das aus dem selben Grund geschehen, wie im Falle von MtPt4. Welche Rolle MtSuT genau in der Ausbildung der AMS spielt und welche Rolle Inositol in der Aus- bildung der AMS spielt müsste durch weitere Untersuchungen am Protein untersucht werden. Weitere Untersuchen an den in dieser Arbeit als spezifisch für arbuskelhaltige Zellen gezeigten Genen MtAmT, MtPPK und MtOFTN könnten ebenfalls aufschlussreich für das weitere Verständnis der AMS sein. Dies trifft auch auf die TFs MtNTS und MtDES zu, die zwar nicht ausschließlich arbuskelspezifisch transkribiert werden, aber auch eine Rolle in der Regulation der AMS innerhalb von M. truncatula Wurzeln zu spielen scheinen.
Mikroorganismen in geothermischen Aquiferen : Einfluss mikrobieller Prozesse auf den Anlagenbetrieb
(2012)
In Fluid-, Filter- und Sedimentproben von vier geothermischen Anlagen des Norddeutschen Beckens wurden mit molekulargenetischen Verfahren unterschiedliche mikrobielle Gemeinschaften nachgewiesen. Die mikrobielle Zusammensetzung in den Prozesswässern wurde dabei durch die Aquiferteufe, die Salinität, die Temperatur und den verfügbaren Elektronendonatoren und -akzeptoren beeinflusst. Die in den anoxischen Prozesswässern identifizierten Organismen zeichneten sich durch einen chemoheterotrophen oder chemoautotrophen Stoffwechsel aus, wobei Nitrat, Sulfat, Eisen (III) oder Bikarbonat als terminale Elektronenakzeptoren fungierten. Mikroorganismen beeinflussten den Betrieb von zwei Anlagen negativ. So reduzierten im Prozesswasser des Kältespeichers am Berliner Reichstag vorhandene Eisenoxidierer, nahe verwandt zu der Gattung Gallionella, die Injektivität der Bohrungen durch Eisenhydroxidausfällungen in den Filterschlitzen. Biofilme, die von schwefeloxidierenden Bakterien der Gattung Thiothrix in den Filtern der obertägigen Anlage gebildet wurden, führten ebenfalls zu Betriebsstörungen, indem sie die Injektion des Fluids in den Aquifer behinderten. Beim Wärmespeicher in Neubrandenburg waren Sulfatreduzierer vermutlich an der Bildung von Eisensulfidausfällungen in den obertägigen Filtern und im bohrlochnahen Bereich beteiligt und verstärkten Korrosionsprozesse an der Pumpe im Bohrloch der kalten Aquiferseite. Organische Säuren in den Fluiden sowie mineralische Ausfällungen in den Filtern der obertägigen Anlagen waren Belege für die Aktivität der in den verschiedenen Anlagen vorhandenen Mikroorganismen. Es wurde zudem deutlich, dass Mikroorganismen auf Grund der hohen Durchflussraten in den Anlagen chemische Veränderungen in den Prozesswässern deutlich sensitiver anzeigen als chemische Analyseverfahren. So deuteten Änderungen in der Zusammensetzung der mikrobiellen Biozönosen und speziell die Identifikation von Indikatororganismen wie Eisen- und Schwefeloxidierern, fermentativen Bakterien und Sulfatreduzierern auf eine erhöhte Verfügbarkeit von Elektronendonatoren oder akzeptoren in den Prozesswässern hin. Die Ursachen für die an den Geothermieanlagen auftretenden Betriebsstörungen konnten dadurch erkannt werden.
Die Strahlentherapie ist neben der Chemotherapie und einer operativen Entfernung die stärkste Waffe für die Bekämpfung bösartiger Tumore in der Krebsmedizin. Nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist Krebs die zweithäufigste Todesursache in der westlichen Welt, wobei Prostatakrebs heutzutage die häufigste, männliche Krebserkrankung darstellt. Trotz technologischer Fortschritte der radiologischen Verfahren kann es noch viele Jahre nach einer Radiotherapie zu einem Rezidiv kommen, was zum Teil auf die hohe Resistenzfähigkeit einzelner, entarteter Zellen des lokal vorkommenden Tumors zurückgeführt werden kann. Obwohl die moderne Strahlenbiologie viele Aspekte der Resistenzmechanismen näher beleuchtet hat, bleiben Fragestellungen, speziell über das zeitliche Ansprechen eines Tumors auf ionisierende Strahlung, größtenteils unbeantwortet, da systemweite Untersuchungen nur begrenzt vorliegen. Als Zellmodelle wurden vier Prostata-Krebszelllinien (PC3, DuCaP, DU-145, RWPE-1) mit unterschiedlichen Strahlungsempfindlichkeiten kultiviert und auf ihre Überlebensfähigkeit nach ionisierender Bestrahlung durch einen Trypanblau- und MTT-Vitalitätstest geprüft. Die proliferative Kapazität wurde mit einem Koloniebildungstest bestimmt. Die PC3 Zelllinie, als Strahlungsresistente, und die DuCaP Zelllinie, als Strahlungssensitive, zeigten dabei die größten Differenzen bezüglich der Strahlungsempfindlichkeit. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurden die beiden Zelllinien ausgewählt, um anhand ihrer transkriptomweiten Genexpressionen, eine Identifizierung potentieller Marker für die Prognose der Effizienz einer Strahlentherapie zu ermöglichen. Weiterhin wurde mit der PC3 Zelllinie ein Zeitreihenexperiment durchgeführt, wobei zu 8 verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 1 Gy die mRNA mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierung quantifiziert wurde, um das dynamisch zeitversetzte Genexpressionsverhalten auf Resistenzmechanismen untersuchen zu können. Durch das Setzen eines Fold Change Grenzwertes in Verbindung mit einem P-Wert < 0,01 konnten aus 10.966 aktiven Genen 730 signifikant differentiell exprimierte Gene bestimmt werden, von denen 305 stärker in der PC3 und 425 stärker in der DuCaP Zelllinie exprimiert werden. Innerhalb dieser 730 Gene sind viele stressassoziierte Gene wiederzufinden, wie bspw. die beiden Transmembranproteingene CA9 und CA12. Durch Berechnung eines Netzwerk-Scores konnten aus den GO- und KEGG-Datenbanken interessante Kategorien und Netzwerke abgeleitet werden, wobei insbesondere die GO-Kategorien Aldehyd-Dehydrogenase [NAD(P)+] Aktivität (GO:0004030) und der KEGG-Stoffwechselweg der O-Glykan Biosynthese (hsa00512) als relevante Netzwerke auffällig wurden. Durch eine weitere Interaktionsanalyse konnten zwei vielversprechende Netzwerke mit den Transkriptionsfaktoren JUN und FOS als zentrale Elemente identifiziert werden. Zum besseren Verständnis des dynamisch zeitversetzten Ansprechens der strahlungsresistenten PC3 Zelllinie auf ionisierende Strahlung, konnten anhand der 10.840 exprimierten Gene und ihrer Expressionsprofile über 8 Zeitpunkte interessante Einblicke erzielt werden. Während es innerhalb von 30 min (00:00 - 00:30) nach Bestrahlung zu einer schnellen Runterregulierung der globalen Genexpression kommt, folgen in den drei darauffolgenden Zeitabschnitten (00:30 - 01:03; 01:03 - 02:12; 02:12 - 04:38) spezifische Expressionserhöhungen, die eine Aktivierung schützender Netzwerke, wie die Hochregulierung der DNA-Reparatursysteme oder die Arretierung des Zellzyklus, auslösen. In den abschließenden drei Zeitbereichen (04:38 - 09:43; 09:43 - 20:25; 20:25 - 42:35) liegt wiederum eine Ausgewogenheit zwischen Induzierung und Supprimierung vor, wobei die absoluten Genexpressionsveränderungen ansteigen. Beim Vergleich der Genexpressionen kurz vor der Bestrahlung mit dem letzten Zeitpunkt (00:00 - 42:53) liegen mit 2.670 die meisten verändert exprimierten Gene vor, was einer massiven, systemweiten Genexpressionsänderung entspricht. Signalwege wie die ATM-Regulierung des Zellzyklus und der Apoptose, des NRF2-Signalwegs nach oxidativer Stresseinwirkung und die DNA-Reparaturmechanismen der homologen Rekombination, des nicht-homologen End Joinings, der MisMatch-, der Basen-Exzision- und der Strang-Exzision-Reparatur spielen bei der zellulären Antwort eine tragende Rolle. Äußerst interessant sind weiterhin die hohen Aktivitäten RNA-gesteuerter Ereignisse, insbesondere von small nucleolar RNAs und Pseudouridin-Prozessen. Demnach scheinen diese RNA-modifizierenden Netzwerke einen bisher unbekannten funktionalen und schützenden Einfluss auf das Zellüberleben nach ionisierender Bestrahlung zu haben. All diese schützenden Netzwerke mit ihren zeitspezifischen Interaktionen sind essentiell für das Zellüberleben nach Einwirkung von oxidativem Stress und zeigen ein komplexes aber im Einklang befindliches Zusammenspiel vieler Einzelkomponenten zu einem systemweit ablaufenden Programm.
Der Einfluss unterschiedlich aggressiver Fusarium culmorum- und F. graminearum-Isolate auf die Schadbildausprägung bei Winterweizen sowie die Möglichkeit der Befallskontrolle mit Mykorrhiza Die durch Pilzarten der Gattung Fusarium spp. hervorgerufene partielle Taubährigkeit ist ein ernstes Problem im weltweiten Weizenanbau. Eine für die Schaderreger günstige feuchte Witterung zum Zeitpunkt der Weizenblüte in Kombination mit befallsfördernden agrotechnischen Maßnahmen löst immer wieder Epidemien aus. Hauptsächlich verursacht durch F. culmorum und F. graminearum führt eine Erkrankung zu Ertrags- und Qualitätseinbußen sowie zu einer Belastung des Ernteguts mit Mykotoxinen, die bereits in niedrigen Konzentrationen toxisch auf den tierischen und menschlichen Organismus wirken. Die am häufigsten vorkommenden Fusarium-Toxine in Weizen sind Deoxynivalenol (DON) und Zearalenon (ZEA). Isolate von F. graminearum- und F. culmorum können in ihrem DON- und ZEA-Bildungsvermögen und ihrem Potential, Nekrosen zu verursachen, stark variieren. In Laborversuchen (in vitro) wurden F. graminearum- und F. culmorum-Isolate hinsichtlich dieser Eigenschaften (hier als Aggressivität bezeichnet) charakterisiert und anschließend wurde im Feldversuch überprüft, ob die in vitro-ermittelte Aggressivität die Schadbildausprägung bei Weizenpflanzen beeinflusst. Nur im ersten Versuchsjahr, das durch hohe Niederschläge gekennzeichnet war, konnte ein Einfluss der Aggressivität und einer zusätzlichen Beregnung im Feldversuch nachgewiesen werden. Die als hoch-aggressiv eingestuften Fusarium-Isolate reduzierten unter dem Einfluss der Beregnung den Ertrag und das Tausendkorngewicht. Die Beregnung führte zu einer Erhöhung des Pilzwachstums und der DON- und ZEA-Produktion. Ein extrem trockener Sommer verhinderte die Infektion der Weizenpflanzen durch die beimpften Fusarium-Isolate und ein anschließendes Pilzwachstum in den Ähren im zweiten Versuchsjahr. Um den Befall von Weizenpflanzen mit Fusarium spp. vorzubeugen, stehen verschiedene pflanzenbauliche Maßnahmen zur Verfügung. Eine Möglichkeit stellen in diesem Zusammenhang die symbiotischen Mykorrhizapilze (MP) dar. Die Pilze sind in der Lage, Pflanzen zu stärken und antagonistisch auf pilzliche Schaderreger zu wirken. Um zu überprüfen, ob MP dazu beitragen könnten, den Befall von Weizenpflanzen mit Fusarium spp. niedrig zu halten, wurden Weizenpflanzen mit MP und Fusarium spp. beimpft und die Auswirkungen der Interaktionen auf die Weizenpflanzen in einem Klimakammer- und einem Feldversuch getestet. In der Klimakammer wurde eine Reduzierung des Fusarium-Befalls nachgewiesen. Die mykorrhizierten Weizenpflanzen wiesen außerdem höhere Photosyntheseraten, höhere Sprosstrockenmassen und mehr Ähren im Vergleich zu den nicht-mykorrhizierten und mit Fusarium-beimpften Weizenpflanzen auf. Insgesamt wurde durch die Mykorrhizierung der negative Einfluss von Fusarium spp. kompensiert. Im Freiland konnte kein Einfluss der MP auf Fusarium spp. beobachtet werden. Im ersten Versuchsjahr führte das Beimpfen der Weizenpflanzen mit MP zu höheren Wurzel- und Sprosstrockenmassen sowie zu höheren Tausendkorngewichten im Vergleich zu den mit Fusarium spp.-beimpften Weizenpflanzen. Im zweiten Versuchsjahr konnte dieses Ergebnis nicht wiederholt werden.
Chemische und physikalische Eigenschaften von Polymeren können verschiedene Zelltypen unterschiedlich, z. B. hinsichtlich Adhärenz oder Funktionalität, beeinflussen. Die Elastizität eines Polymers beeinflusst vor allem, welche Zugkräfte eine Zelle gegenüber ihrem Substrat entwickeln kann. Das Zellverhalten wird dann über intrazelluläre Rückkopplungsmechanismen reguliert. Die Oberflächenladung und/oder Hydrophilie eines Polymers beeinflusst zunächst die Adsorption von Ionen, Proteinen und anderen Molekülen. Vor allem über die Zusammensetzung, Dichte und Konformation der adsorbierten Komponenten werden anschließend die Wechselwirkungen mit den Zellen vermittelt. Des Weiteren können verschiedene Zelltypen unterschiedliche membranassoziierte Proteine, Zucker und Lipide aufweisen, so dass Polymereigenschaften zellspezifische Effekte bewirken können. Für biotechnologische Anwendungen und für den Einsatz in der regenerativen Medizin gewinnen Polymere, die spezifische Zellreaktionen regulieren können, immer weiter an Bedeutung. Die Isolierung und Kultur von primären Keratinozyten ist noch immer anspruchsvoll und die adäquate Heilung von Hautwunden stellt eine fortwährende medizinische Herausforderung dar. Ein Polymer, das eine bevorzugte Adhärenz von Keratinozyten bei gleichzeitig verminderter Anheftung dermaler Fibroblasten ermöglicht, würde erhebliche Vorteile für den Einsatz in der Keratinozyten-Zellkultur und als Wundauflage bieten. Um den potentiell spezifischen Einfluss bestimmter Polymereigenschaften auf primäre humane Keratinozyten und dermale Fibroblasten zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein Zellkultursystem für die Mono- und Cokultur beider Zelltypen entwickelt. Das Testsystem wurde als Screening konzipiert, um den Einfluss unterschiedlicher Polymereigenschaften in mehreren Abstufungen auf die Zellen zu untersuchen. Folgende Parameter wurden untersucht: 1. Vitalität und Dichte adhärenter und nicht-adhärierter Zellen, 2. Schädigung der Zellmembran, 3. selektive Adhärenz von Keratinozyten in Cokultur durch die spezifische immunzytochemische Färbung von Keratin14 und Vimentin. Für die Polymere mit variabler Elastizität wurden zusätzlich die Ablagerung extrazellulärer Matrixkomponenten und die Sekretion löslicher Faktoren durch die Zellen untersucht. Als Modellpolymere für die Variation der Elastizität wurden vernetzte Poly(n-butylacrylate) (cPnBA) verwendet, da deren Elastizität durch den Anteil des Vernetzers eingestellt werden kann. Auf dem weniger elastischen cPnBA zeigte sich in der Cokultur ein doppelt so hohes Verhältnis von Keratinozyten zu Fibroblasten wie auf dem elastischeren cPnBA, so dass ein leichter zellselektiver Effekt angenommen werden kann. Acrylnitril-basierte Copolymere wurden als Modellpolymere für die Variation der Oberflächenladung und Hydrophilie verwendet, da die Eigenschaften durch Art und molaren Anteil des Comonomers eingestellt werden können. Durch Variation des molaren Anteils der Comonomere mit positiver bzw. negativer Ladung, Methacrylsäure-2-aminoethylester-hydrochhlorid (AEMA) und N-3-Aminopropyl-methacrylamid-hydro-chlorid (APMA) bzw. Natriumsalz der 2-Methyl-2-propen-1-sulfonsäure (NaMAS), wurde der Anteil der positiven bzw. negativen Ladung im Copolymer variiert. Durch die Erhöhung des molaren Anteils des hydrophilen Comonomers N-Vinylpyrrolidon (NVP) wurde die Hydrophilie des Copolymers gesteigert. Die Erhöhung des molaren Anteils an positiv geladenem Comonomer AEMA im Copolymer führte tendenziell zu einer höheren Keratinozytendichte, wobei die Fibroblastendichte unverändert blieb. Durch die Erhöhung des molaren Anteils des positiv geladenen Comonomers APMA ergaben sich keine deutlichen Unterschiede in Dichte, Vitalität oder Selektivität der Zellen. Durch die stufenweise Erhöhung des molaren Anteils des negativ geladenen Comonomers NaMAS konnte, wie im Falle von AEMA, eine Tendenz zur verbesserten Keratinozytenadhärenz beobachtet werden. Die Steigerung der Hydrophilie der Copolymere führte sowohl für Keratinozyten als auch für Fibroblasten zu einer reduzierten Adhärenz und Vitalität. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde ein Testverfahren etabliert, das die Untersuchung von primären humanen Keratinozyten und primären humanen Fibroblasten in Monokultur und Cokultur auf verschiedenen Polymeren ermöglicht. Die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass sich durch die gezielte Modifizierung verschiedener Polymereigenschaften die Adhärenz und Vitalität beider Zelltypen beeinflussen lässt. Die Reduktion der Elastizität sowie die Erhöhung des molaren Anteils geladener Comonomere führten zu einer Zunahme der Keratinozytenadhärenz. Da die Fibroblasten unbeeinflusst blieben, zeigte sich für einige der untersuchten Polymere eine leichte Zellselektivität. Diese könnte durch die weitere Erhöhung der Steifigkeit oder des Anteils geladener Comonomere möglicherweise weiter gesteigert werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Auswirkungen von Glucose- und Lipidtoxizität auf die Funktion der β-Zellen von Langerhans-Inseln in einem diabetesresistenten (B6.V-Lepob/ob, ob/ob) sowie diabetessuszeptiblen (New Zealand Obese, NZO) Mausmodell zu untersuchen. Es sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zum Untergang der β-Zellen in der NZO-Maus führen bzw. zum Schutz der β-Zellen der ob/ob-Maus beitragen. Zunächst wurde durch ein geeignetes diätetisches Regime in beiden Modellen durch kohlenhydratrestriktive Ernährung eine Adipositas(Lipidtoxizität) induziert und anschließend durch Fütterung einer kohlenhydrathaltigen Diät ein Zustand von Glucolipotoxizität erzeugt. Dieses Vorgehen erlaubte es, in der NZO-Maus in einem kurzen Zeitfenster eine Hyperglykämie sowie einen β-Zelluntergang durch Apoptose auszulösen. Im Vergleich dazu blieben ob/ob-Mäuse längerfristig normoglykämisch und wiesen keinen β-Zelluntergang auf. Die Ursache für den β-Zellverlust war die Inaktivierung des Insulin/IGF-1-Rezeptor-Signalwegs, wie durch Abnahme von phospho-AKT, phospho-FoxO1 sowie des β-zellspezifischen Transkriptionsfaktors PDX1 gezeigt wurde. Mit Ausnahme des Effekts einer Dephosphorylierung von FoxO1, konnten ob/ob-Mäuse diesen Signalweg aufrechterhalten und dadurch einen Verlust von β-Zellen abwenden. Die glucolipotoxischen Effekte wurden in vitro an isolierten Inseln beider Stämme und der β-Zelllinie MIN6 bestätigt und zeigten, dass ausschließlich die Kombination hoher Glucose und Palmitatkonzentrationen (Glucolipotoxizität) negative Auswirkungen auf die NZO-Inseln und MIN6-Zellen hatte, während ob/ob-Inseln davor geschützt blieben. Die Untersuchung isolierter Inseln ergab, dass beide Stämme unter glucolipotoxischen Bedingungen keine Steigerung der Insulinexpression aufweisen und sich bezüglich ihrer Glucose-stimulierten Insulinsekretion nicht unterscheiden. Mit Hilfe von Microarray- sowie immunhistologischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass ausschließlich ob/ob-Mäuse nach Kohlenhydratfütterung eine kompensatorische transiente Induktion der β-Zellproliferation aufwiesen, die in einer nahezu Verdreifachung der Inselmasse nach 32 Tagen mündete. Die hier erzielten Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass der β-Zelluntergang der NZO-Maus auf eine Beeinträchtigung des Insulin/IGF-1-Rezeptor-Signalwegs sowie auf die Unfähigkeit zur β- Zellproliferation zurückgeführt werden kann. Umgekehrt ermöglichen der Erhalt des Insulin/IGF-1-Rezeptor-Signalwegs und die Induktion der β-Zellproliferation in der ob/ob-Maus den Schutz vor einer Hyperglykämie und einem Diabetes.
Im Rahmen des ersten Teils der vorliegenden Doktorarbeit konnten zwei nicht-essentielle (rps15, rpl36) und fünf essentielle (rps3, rps16, rpl22, rpl23, rpl32) im Plastom von Nicotiana tabacum kodierte Proteine des plastidären Ribosoms bezüglich ihrer Essentialität charakterisiert werden. Diese Gene wurden durch gezielte Knockout-Experimente inaktiviert und die resultierenden Effekte untersucht. Die Ergebnisse lassen einen Rückschluss auf die Lokalisation der Gene der insgesamt sieben untersuchten ribosomalen Proteine zu, die im Plastom mehrerer parasitischer, Plastiden-besitzender Spezies nicht mehr nachweisbar sind. Im Fall von rps15 könnte tatsächlich ein Verlust des Genes stattgefunden haben, im Fall der restlichen Gene ist eher mit einem Transfer in den Nukleus zu rechnen (rpl36 ausgenommen). Dies würde bedeuten, dass die Geschwindigkeit der erfolgreichen Etablierung eines Gentransfers in vielen parasitischen Spezies gegenüber grünen Pflanzen stark erhöht ist. Alle in E. coli nicht-essentiellen Proteine mit Homologen in Plastiden (rps15, rpl33, rpl36) sind auch dort, trotz ~1,5 Milliarden Jahren getrennter Evolution, nicht essentiell. Dieses Ergebnis bestätigt den schon früher festgestellten hohen Konservierungsgrad der bakteriellen und plastidären Translationsmaschinerien. Die Phänotypen der KO-Pflanzen der nicht-essentiellen Gene (rps15, rpl36) weisen auf eine interessante Rolle von S15 während der Ribosomenassemblierung hin und im Fall von L36 auf eine wichtige funktionelle Rolle im Plastiden-Ribosomen sowie auf eine Involvierung der Plastidentranslation in der Generierung eines retrograden Signals, welches die Blattform zu beeinflussen im Stande ist. Des Weiteren konnte eine Verbindung der Translationsaktivität mit der Ausbildung von Seitentrieben hergestellt werden, die vermutlich auf veränderte Auxinsynthese im Chloroplast zurückzuführen ist. Aus dem Folgeprojekt, bei dem Doppel-KO-Pflanzen nicht-essentieller ribosomaler Proteine erzeugt wurden, lässt sich auf eine relativ große Plastizität der Architektur von Plastidenribosomen schließen. Im zweiten Teil der Arbeit konnte erfolgreich ein Hochdurchsatz-Screeningsystem zur semiquantitativen Analyse von 192 verschiedenen miRNAs aus Chlamydomonas reinhardtii etabliert werden. Es gelang durch die Untersuchung von 23 verschiedenen Wachstums- und Stressbedingungen sowie Entwicklungsstadien mehrere miRNAs zu identifizieren, die eine differenzielle Expression zeigen sowie unter allen untersuchten Bedingungen konstant bleibende miRNAs nachzuweisen. Dadurch konnten mehrere vielversprechende Kandidaten-miRNAs ausgemacht werden, die nun eingehender untersucht werden können.
Im Fokus dieser Arbeit stand der Aufbau einer auf DNA basierenden Nanostruktur. Der universelle Vier-Buchstaben-Code der DNA ermöglicht es, Bindungen auf molekularer Ebene zu adressieren. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der DNA prädestinieren dieses Makromolekül für den Einsatz und die Verwendung als Konstruktionselement zum Aufbau von Nanostrukturen. Das Ziel dieser Arbeit war das Aufspannen eines DNA-Stranges zwischen zwei Fixpunkten. Hierfür war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, welche es ermöglicht, Funktionsmoleküle als Ankerelemente ortsaufgelöst auf eine Oberfläche zu deponieren. Das Deponieren dieser Moleküle sollte dabei im unteren Mikrometermaßstab erfolgen, um den Abmaßen der DNA und der angestrebten Nanostruktur gerecht zu werden. Das eigens für diese Aufgabe entwickelte Verfahren zum ortsaufgelösten Deponieren von Funktionsmolekülen nutzt das Bindungspaar Biotin-Neutravidin. Mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops (AFM) wurde eine zu einem „Stift“ umfunktionierte Rasterkraftmikroskopspitze so mit der zu deponierenden „Tinte“ beladen, dass das Absetzen von Neutravidin im unteren Mikrometermaßstab möglich war. Dieses Neutravidinmolekül übernahm die Funktion als Bindeglied zwischen der biotinylierten Glasoberfläche und dem eigentlichen Adressmolekül. Das somit generierte Neutravidin-Feld konnte dann mit einem biotinylierten Adressmolekül durch Inkubation funktionalisiert werden. Namensgebend für dieses Verfahren war die Möglichkeit, Neutravidin mehrmals zu deponieren und zu adressieren. Somit ließ sich sequenziell ein Mehrkomponenten-Feld aufbauen. Die Einschränkung, mit einem AFM nur eine Substanz deponieren zu können, wurde so umgangen. Ferner mußten Ankerelemente geschaffen werden, um die DNA an definierten Punkten immobilisieren zu können. Die Bearbeitung der DNA erfolgte mit molekularbiologischen Methoden und zielte darauf ab, einen DNA-Strang zu generieren, welcher an seinen beiden Enden komplementäre Adressequenzen enthält, um gezielt mit den oberflächenständigen Ankerelementen binden zu können. Entsprechend der Geometrie der mit dem AFM erzeugten Fixpunkte und den oligonukleotidvermittelten Adressen kommt es zur Ausbildung einer definierten DNA-Struktur. Mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden wurde die aufgebaute DNA-Nanostruktur nachgewiesen. Der Nachweis der nanoskaligen Interaktion von DNA-bindenden Molekülen mit der generierten DNA-Struktur wurde durch die Bindung von PNA (peptide nucleic acid) an den DNA-Doppelstrang erbracht. Diese PNA-Bindung stellt ihrerseits ein funktionales Strukturelement im Nanometermaßstab dar und wird als Nanostrukturbaustein verstanden.
Die Fähigkeit, mit anderen Zellen zu kommunizieren, ist eine grundlegende Eigenschaft aller lebenden Zellen und essentiell für die normale Funktionsweise vielzelliger Organismen. Die Speicheldrüsen der Schmeißfliege Calliphora vicina bilden ein ausgezeichnetes physiologisches Modellsystem um zelluläre Signaltransduktionsprozesse an einem intakten Organ zu untersuchen. Die Speichelsekretion wird dabei hormonell durch das biogene Amin Serotonin (5-Hydroxytryptamin; 5-HT) reguliert. 5-HT aktiviert in den sekretorischen Zellen der Drüsen über die Bindung an mindestens zwei membranständige G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) zwei separate Signalwege, den IP3/Ca2+- und den cAMP-Signalweg. Zur Identifizierung und Charakterisierung der 5-HT-Rezeptoren in den Speicheldrüsen von Calliphora wurden unter Anwendung verschiedener Klonierungsstrategien zwei cDNAs (Cv5-ht2α und Cv5-ht7) isoliert, die große Ähnlichkeit zu 5-HT2- und 5-HT7-Rezeptoren aus Säugetieren aufweisen. Die Hydropathieprofile der abgeleiteten Aminosäuresequenzen postulieren die für GPCRs charakteristische heptahelikale Architektur. Alle Aminosäuremotive, die für die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an G-Proteine essentiell sind, liegen konserviert vor. Interessanterweise wurde für den Cv5-HT7-Rezeptor eine zusätzliche hydrophobe Domäne im N Terminus vorhergesagt. Die Cv5-HT2α-mRNA liegt in zwei alternativ gespleißten Varianten vor. Mittels RT-PCR-Experimenten konnte die Expression beider Rezeptoren in Gehirn und Speicheldrüsen adulter Fliegen nachgewiesen werden. Ein Antiserum gegen den Cv5-HT7 Rezeptor markiert in den Speicheldrüsen die basolaterale Plasmamembran. Die Expression der Rezeptoren in einem heterologen System (HEK 293-Zellen) bestätigte diese als funktionelle 5-HT Rezeptoren. So führte die Stimulation mit Serotonin für den Cv5-HT2α zu einer dosis-abhängigen Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration ([Ca2+]i, EC50 = 24 nM). In Cv5-HT7-exprimierenden Zellen löste 5-HT dosisabhängig (EC50 = 4,1 nM) einen Anstieg der intrazellulären cAMP Konzentration ([cAMP]i) aus. Für beide heterolog exprimierten Rezeptoren wurden pharmakologische Profile erstellt. Liganden, die eine Rezeptorsubtyp-spezifische Wirkung vermuten ließen, wurden daraufhin auf ihre Wirkung auf das transepitheliale Potential (TEP) intakter Speicheldrüsenpräparate getestet. Drei 5-HT-Rezeptoragonisten: AS 19, R-(+)-Lisurid und 5-Carboxamidotryptamin führten zu einer cAMP-abhängigen Positivierung des TEP durch eine selektive Aktivierung der 5 HT7-Rezeptoren. Eine selektive Aktivierung des Ca2+-Signalweges durch den Cv5-HT2 Rezeptor ist mit Hilfe von 5-Methoxytryptamin möglich. Dagegen konnte Clozapin im TEP als selektiver Cv5-HT7-Rezeptorantagonist bestätigt werden. Die Kombination eines molekularen Ansatzes mit physiologischen Messungen ermöglichte somit die Identifikation selektiver Liganden für 5-HT2- bzw. 5-HT7-Rezeptoren aus Calliphora vicina. Dies ermöglicht zukünftig eine separate Aktivierung der 5-HT-gesteuerten Signalwege und erleichtert dadurch die weitere Erforschung der intrazellulären Signalwege und ihrer Wechselwirkungen.
Die Erkennung komplexer Kohlenhydrate durch das Tailspike Protein aus dem Bakteriophagen HK620
(2012)
Kohlenhydrate stellen aufgrund der strukturellen Vielfalt und ihrer oft exponierten Lage auf Zelloberflächen wichtige Erkennungsstrukturen dar. Die Wechselwirkungen von Proteinen mit diesen Kohlenhydraten vermitteln einen spezifischen Informationsaustausch. Protein-Kohlenhydrat-Interaktionen und ihre Triebkräfte sind bislang nur teilweise verstanden, da nur wenig strukturelle Daten von Proteinen im Komplex mit vorwiegend kleinen Kohlenhydraten erhältlich sind. Mit der vorliegenden Promotionsarbeit soll ein Beitrag zum Verständnis von Protein-Kohlenhydrat-Wechselwirkungen durch Analysen struktureller Thermodynamik geleistet werden, um zukünftig Vorhersagen mit zuverlässigen Algorithmen zu erlauben. Als Modellsystem zur Erkennung komplexer Kohlenhydrate diente dabei das Tailspike Protein (TSP) aus dem Bakteriophagen HK620. Dieser Phage erkennt spezifisch seinen E. coli-Wirt anhand der Oberflächenzucker, der sogenannten O-Antigene. Dabei binden die TSP des Phagen das O-Antigen des Lipopolysaccharids (LPS) und weisen zudem eine hydrolytische Aktivität gegenüber dem Polysaccharid (PS) auf. Anhand von isolierten Oligosacchariden des Antigens (Typ O18A1) wurde die Bindung an HK620TSP und verschiedener Varianten davon systematisch analysiert. Die Bindung der komplexen Kohlenhydrate durch HK620TSP zeichnet sich durch große Interaktionsflächen aus. Durch einzelne Aminosäureaustausche im aktiven Zentrum wurden Varianten generiert, die eine tausendfach erhöhte Affinität (KD ~ 100 nM) im Vergleich zum Wildtyp-Protein (KD ~ 130 μM) aufweisen. Dabei zeichnet sich das System dadurch aus, dass die Bindung bei Raumtemperatur nicht nur enthalpisch, sondern auch entropisch getrieben wird. Ursache für den günstigen Entropiebeitrag ist die große Anzahl an Wassermolekülen, die bei der Bindung des Hexasaccharids verdrängt werden. Röntgenstrukturanalysen zeigten für alle TSP-Komplexe außer für Variante D339N unabhängig von der Hexasaccharid-Affinität analoge Protein- und Kohlenhydrat-Konformationen. Dabei kann die Bindestelle in zwei Regionen unterteilt werden: Zum einen befindet sich am reduzierenden Ende eine hydrophobe Tasche mit geringen Beiträgen zur Affinitätsgenerierung. Der Zugang zu dieser Tasche kann ohne große Affinitätseinbuße durch einen einzelnen Aminosäureaustausch (D339N) blockiert werden. In der zweiten Region kann durch den Austausch eines Glutamats durch ein Glutamin (E372Q) eine Bindestelle für ein zusätzliches Wassermolekül generiert werden. Die Rotation einiger Aminosäuren bei Kohlenhydratbindung führt zur Desolvatisierung und zur Ausbildung von zusätzlichen Wasserstoffbrücken, wodurch ein starker Affinitätsgewinn erzielt wird. HK620TSP ist nicht nur spezifisch für das O18A1-Antigen, sondern erkennt zudem das um eine Glucose verkürzte Oligosaccharid des Typs O18A und hydrolysiert polymere Strukturen davon. Studien zur Bindung von O18A-Pentasaccharid zeigten, dass sich die Triebkräfte der Bindung im Vergleich zu dem zuvor beschriebenen O18A1-Hexasaccharid verschoben haben. Durch Fehlen der Seitenkettenglucose ist die Bindung im Vergleich zu dem O18A1-Hexasaccharid weniger stark entropisch getrieben (Δ(-TΔS) ~ 10 kJ/mol), während der Enthalpiebeitrag zu der Bindung günstiger ist (ΔΔH ~ -10 kJ/mol). Insgesamt gleichen sich diese Effekte aus, wodurch sehr ähnliche Affinitäten der TSP-Varianten zu O18A1-Hexasaccharid und O18A-Pentasaccharid gemessen wurden. Durch die Bindung der Glucose werden aus einer hydrophoben Tasche vier Wassermoleküle verdrängt, was entropisch stark begünstigt ist. Unter enthalpischen Aspekten ist dies ebenso wie einige Kontakte zwischen der Glucose und einigen Resten in der Tasche eher ungünstig. Die Bindung der Glucose in die hydrophobe Tasche an HK620TSP trägt somit nicht zur Affinitätsgenerierung bei und es bleibt zu vermuten, dass sich das O18A1-Antigen-bindende HK620TSP aus einem O18A-Antigen-bindenden TSP evolutionär herleitet. In dem dritten Teilprojekt der Dissertation wurde der Infektionsmechanismus des Phagen HK620 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass analog zu dem verwandten Phagen P22 die Ejektion der DNA aus HK620 allein durch das Lipopolysaccharid (LPS) des Wirts in vitro induziert werden kann. Die Morphologie und Kettenlänge des LPS sowie die Aktivität von HK620TSP gegenüber dem LPS erwiesen sich dabei als essentiell. So konnte die DNA-Ejektion in vitro auch durch LPS aus Bakterien der Serogruppe O18A induziert werden, welches ebenfalls von dem TSP des Phagen gebunden und hydrolysiert wird. Diese Ergebnisse betonen die Rolle von TSP für die Erkennung der LPS-Rezeptoren als wichtigen Schritt für die Infektion durch die Podoviren HK620 und P22.
Charakterisierung der neuen centrosomalen Proteine CP148 und CP55 in Dictyostelium discoideum
(2012)
Das im Cytosol liegende Dictyostelium Centrosom ist aus einer geschichteten Core-Region aufgebaut, die von einer Mikrotubuli-nukleierenden Corona umgeben ist. Zudem ist es über eine spezifische Verbindung eng an den Kern geknüpft und durch die Kernmembran hindurch mit den geclusterten Centromeren verbunden. Beim G2/M Übergang dissoziiert die Corona vom Centrosom und der Core verdoppelt sich so dass zwei Spindelpole entstehen. CP55 und CP148 wurden in einer Proteom-Analyse des Centrosoms identifiziert. CP148 ist ein neues coiled-coil Protein der centrosomalen Corona. Es zeigt eine zellzyklusabhängige An- und Abwesenheit am Centrosom, die mit der Dissoziation der Corona in der Prophase und ihrer Neubildung in der Telophase korreliert. Während der Telophase erschienen in GFP-CP148 exprimierenden Zellen viele, kleine GFP-CP148-Foci im Cytoplasma, die zum Teil miteinander fusionierten und zum Centrosom wanderten. Daraus resultierte eine hypertrophe Corona in Zellen mit starker GFP-CP148 Überexpression. Ein Knockdown von CP148 durch RNAi führte zu einem Verlust der Corona und einem ungeordneten Interphase Mikrotubuli-Cytoskelett. Die Bildung der mitotischen Spindel und der astralen Mikrotubuli blieb davon unbeeinflusst. Das bedeutet, dass die Mikrotubuli-Nukleationskomplexe während der Interphase und Mitose über verschiedene Wege mit dem Core assoziiert sind. Des Weiteren bewirkte der Knockdown eine Dispersion der Centromere sowie eine veränderte Sun1 Lokalisation in der Kernhülle. Somit spielt CP148 ebenso eine Rolle in der Centrosomen-Centromer-Verbindung. Zusammengefasst ist CP148 ein essentielles Protein für die Bildung und Organisation der Corona, welche wiederum für die Centrosom/Centromer Verbindung benötigt wird. CP55 wurde als Protein der Core-Region identifiziert und verbleibt während des Zellzyklus am Centrosom. Dort besitzt es strukturelle Aufgaben, da die Mehrheit der GFP-CP55 Moleküle in der Interphase keine Mobilität zeigten. Die GFP-CP55 Überexpression führte zur Bildung von überzähligen Centrosomen mit der üblichen Ausstattung an Markerproteinen der Corona und des Cores. CP55 Knockout-Zellen waren durch eine erhöhte Ploidie, eine weniger strukturierte und leicht vergrößerte Corona sowie zusätzliche cytosolische Mikrotubuli-organisierende Zentren charakterisiert. Letztere entstanden in der Telophase und enthielten nur Corona- aber keine Core-Proteine. In CP55 k/o Zellen erfolgte die Rekrutierung des Corona-Organisators CP148 an den Spindelpol bereits in der frühen Metaphase anstatt, wie üblich, erst in der Telophase. Außerdem zeigten die Knockout-Zellen Wachstumsdefekte, deren Grund vermutlich Schwierigkeiten bei der Centrosomenverdopplung in der Prophase durch das Fehlen von CP55 waren. Darüber hinaus konnten die Knockout-Zellen phagozytiertes Material nicht verwerten, obwohl der Vorgang der Phagozytose nicht beeinträchtigt war. Dieser Defekt kann dem im CP55 k/o auftretenden dispergierten Golgi-Apparat zugeschrieben werden.
Die Natur unterliegt ständigen Veränderungen und befindet sich nur vermeintlich in einem Gleichgewicht. Umweltparameter wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit oder Sonneneinstrahlung schwanken auf einer Zeitskala von Sekunden bis Jahrmillionen und beinhalten teils beträchtliche Unterschiede. Mit diesen Umweltveränderungen müssen sich Arten als Teil eines Ökosystems auseinandersetzen. Für Ökologen ist interessant, wie sich individuelle Reaktionen auf die Umweltveränderungen im dynamischen Verhalten einer ganzen Population bemerkbar machen und ob deren Verhalten vorhersagbar ist. Der Demografie einer Population kommt hierbei eine entscheidende Rolle zu, da sie das Resultat von Wachstums- und Sterbeprozessen darstellt. Eben jene Prozesse werden von der Umwelt maßgeblich beeinflusst. Doch wie genau beeinflussen Umweltveränderungen das Verhalten ganzer Populationen? Wie sieht das vorübergehende, transiente Verhalten aus? Als Resultat von Umwelteinflüssen bilden sich in Populationen sogenannte Kohorten, hinsichtlich der Zahl an Individuen überproportional stark vertretene Alters- oder Größenklassen. Sterben z.B. aufgrund eines außergewöhnlich harten Winters, die alten und jungen Individuen einer Population, so besteht diese anschließend hauptsächlich aus Individuen mittleren Alters. Sie wurde sozusagen synchronisiert. Eine solche Populationen neigt zu regelmäßigen Schwankungen (Oszillationen) in ihrer Dichte, da die sich abwechselnden Phasen der individuellen Entwicklung und der Reproduktion nun von einem Großteil der Individuen synchron durchschritten werden. D.h., mal wächst die Population und mal nimmt sie entsprechend der Sterblichkeit ab. In Experimenten mit Phytoplankton-Populationen konnte ich zeigen, dass dieses oszillierende Verhalten mit dem in der Physik gebräuchlichen Konzept der Synchronisation beschrieben werden kann. Synchrones Verhalten ist eines der verbreitetsten Phänomene in der Natur und kann z.B. in synchron schwingenden Brücken, als auch bei der Erzeugung von Lasern oder in Form von rhythmischem Applaus auf einem Konzert beobachtet werden. Wie stark die Schwankungen sind, hängt dabei sowohl von der Stärke der Umweltveränderung als auch vom demografischen Zustand der Population vor der Veränderung ab. Zwei Populationen, die sich in verschiedenen Habitaten aufhalten, können zwar gleich stark von einer Umweltveränderung beeinflusst werden. Die Reaktionen im anschließenden Verhalten können jedoch äußerst unterschiedlich ausfallen, wenn sich die Populationen zuvor in stark unterschiedlichen demografischen Zuständen befanden. Darüber hinaus treten bestimmte, für das Verhalten einer Population relevante Mechanismen überhaupt erst in Erscheinung, wenn sich die Umweltbedingungen ändern. So fiel in Experimenten beispielsweise die Populationsdichte um rund 50 Prozent ab nachdem sich die Ressourcenverfügbarkeit verdoppelte. Der Grund für dieses gegenintuitive Verhalten konnte mit der erhöhten Aufnahme von Ressourcen erklärt werden. Damit verbessert eine Algenzelle zwar die eigene Konstitution, jedoch verzögert sich dadurch die auch die Reproduktion und die Populationsdichte nimmt gemäß ihrer Verluste bzw. Sterblichkeit ab. Zwei oder mehr räumlich getrennte Populationen können darüber hinaus durch Umwelteinflüsse synchronisiert werden. Dies wird als Moran-Effekt bezeichnet. Angenommen auf zwei weit voneinander entfernten Inseln lebt jeweils eine Population. Zwischen beiden findet kein Austausch statt – und doch zeigt sich beim Vergleich ihrer Zeitreihen eine große Ähnlichkeit. Das überregionale Klima synchronisiert hierbei die lokalen Umwelteinflüsse. Diese wiederum bestimmen das Verhalten der jeweiligen Population. Der Moran-Effekt besagt nun, dass die Ähnlichkeit zwischen den Populationen jener zwischen den Umwelteinflüssen entspricht, oder geringer ist. Meine Ergebnisse bestätigen dies und zeigen darüber hinaus, dass sich die Populationen sogar ähnlicher sein können als die Umwelteinflüsse, wenn man von unterschiedlich stark schwankenden Einflüssen ausgeht.
Lamine bilden zusammen mit laminassoziierten Proteinen die nukleäre Lamina. Diese ist notwendig für die mechanische Stabilität von Zellen, die Organisation des Chromatins, der Genexpression, dem Fortgang des Zellzyklus und der Zellmigration. Die vielfältigen Funktionen der Lamine werden durch die Pathogenese von Laminopathien belegt. Zu diesen Erkrankungen, welche ihre Ursache in Mutationen innerhalb der laminkodierenden Gene, oder der Gene laminassoziierter bzw. laminprozessierender Proteine haben, zählen unter anderem das „Hutchinson-Gilford Progerie Syndrom“, die „Emery-Dreifuss“ Muskeldystrophie und die dilatierte Kardiomyopathie. Trotz der fundamentalen Bedeutung der Lamine, wurden diese bisher nur in Metazoen und nicht in einzelligen Organismen detektiert. Der amöbide Organismus Dictyostelium discoideum ist ein haploider Eukaryot, der häufig als Modellorganismus in den verschiedensten Bereichen der Zellbiologie eingesetzt wird. Mit der Entdeckung von NE81, einem Protein das mit der inneren Kernhülle von Dictyostelium discoideum assoziiert ist, wurde erstmals ein Protein identifiziert, dass man aufgrund seiner Eigenschaften als laminähnliches Protein in einem niederen Eukaryoten bezeichnen kann. Diese Merkmale umfassen die Existenz lamintypischer Sequenzen, wie die CDK1-Phosphorylierungsstelle, direkt gefolgt von einer zentralen „Rod“-Domäne, sowie eine typische NLS und die hoch konservierte CaaX-Box. Für die Etablierung des NE81 als „primitives“ Lamin, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Experimente durchgeführt, die strukturelle und funktionelle Gemeinsamkeiten zu den Laminen in anderen Organismen aufzeigen konnten. Die Herstellung eines polyklonalen Antikörpers ermöglichte die Verifizierung der subzellulären Lokalisation des NE81 durch Elektronenmikroskopie und gab Einblicke in das Verhalten des endogenen Proteins innerhalb des Zellzyklus. Mit der Generierung von NE81-Nullmutanten konnte demonstriert werden, dass NE81 eine wichtige Rolle bei der nukleären Integrität und der Chromatinorganisation von Zellen spielt. Des Weiteren führte die Expression von zwei CaaX-Box deletierten NE81 - Varianten dazu, den Einfluss des Proteins auf die mechanische Stabilität der Zellen nachweisen zu können. Auch die Bedeutung der hochkonservierten CaaX-Box für die Lokalisation des Proteins wurde durch die erhaltenen Ergebnisse deutlich. Mit der Durchführung von FRAP-Experimente konnte außerdem die strukturgebende Funktion von NE81 innerhalb des Zellkerns bekräftigt werden. Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit damit begonnen, den Einfluss der Isoprenylcysteincarboxylmethyltransferase auf die Lokalisation des Proteins aufzuklären. Die Entdeckung eines laminähnlichen Proteins in einem einzelligen Organismus, der an der Schwelle zu den Metazoen steht, ist für die evolutionäre Betrachtung der Entwicklung der sozialen Amöbe und für die Erforschung der molekularen Basis von Laminopathien in einem einfachen Modellorganismus sehr interessant. Die Arbeit mit Dictyostelium discoideum könnte daher Wege aufzeigen, dass Studium der Laminopathien am Tiermodell drastisch zu reduzieren. In den letzten Jahren hat die Erforschung unbekannter Bestandteile des Centrosoms in Dictyostelium discoideum große Fortschritte gemacht. Eine zu diesem Zwecke von unserer Arbeitsgruppe durchgeführte Proteomstudie, führte zur Identifizierung weiterer, potentiell centrosomaler Kandidatenproteine. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung eines solchen Kandidatenproteins, dem CP75. Es konnte gezeigt werden, dass CP75 einen echten, centrosomalen Bestandteil darstellt, der mikrotubuli-unabhängig mit der Core Struktur des Zellorganells assoziiert ist. Weiterhin wurde deutlich, dass die Lokalisation am Centrosom in Abhängigkeit vom Zellzyklus erfolgt und CP75 vermutlich mit CP39, einem weiteren centrosomalen Core Protein, interagiert.
Die Qualität von Nutzpflanzen ist von zahlreichen Einflussfaktoren wie beispielsweise Lagerbedingungen und Sorteneigenschaften abhängig. Um Qualitätsmängel zu minimieren und Absatzchancen von Nutzpflanzen zu steigern sind umfangreiche Analysen hinsichtlich ihrer stofflichen Zusammensetzung notwendig. Chromatographische Techniken gekoppelt an ein Massenspektrometer und die Kernspinresonanzspektroskopie wurden dafür bislang verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Gaschromatograph an ein Flugzeitmassenspektrometer (GC-TOF-MS) gekoppelt, um physiologische Prozesse bzw. Eigenschaften (die Schwarzfleckigkeit, die Chipsbräunung, das Physiologische Alter und die Keimhemmung) von Nutzpflanzen aufzuklären. Als Pflanzenmodell wurde dafür die Kartoffelknolle verwendet. Dazu wurden neue analytische Lösungsansätze entwickelt, die eine zielgerichtete Auswertung einer Vielzahl von Proben, die Etablierung einer umfangreichen Referenzspektrenbibliothek und die sichere Archivierung aller experimentellen Daten umfassen. Das Verfahren der Probenvorbereitung wurde soweit modifiziert, dass gering konzentrierte Substanzen mittels GC-TOF-MS analysiert werden können. Dadurch wurde das durch die Probenvorbereitung limitierte Substanzspektrum erweitert. Anhand dieser Lösungsansätze wurden physiologisch relevante Stoffwechselprodukte identifiziert, welche indikativ (klassifizierend) bzw. prädiktiv (vorhersagend) für die physiologischen Prozesse sind. Für die Schwarzfleckigkeitsneigung und die Chipseignung wurde jeweils ein biochemisches Modell zur Vorhersage dieser Prozesse aufgestellt und auf eine Züchtungspopulation übertragen. Ferner wurden für die Schwarzfleckigkeit Stoffwechselprodukte des Respirationsstoffwechsels identifiziert sowie Aminosäuren, Glycerollipide und Phenylpropanoide für das Physiologische Alter als relevant erachtet. Das physiologische Altern konnte durch die Anwendung höherer Temperaturen beschleunigt werden. Durch Anwendung von Keimhemmern (Kümmelöl, Chlorpropham) wurde eine Verzögerung des physiologischen Alterns beobachtet. Die Applikation von Kümmelöl erwies sich dabei als besonders vorteilhaft. Kümmelöl behandelte Knollen wiesen im Vergleich zu unbehandelten Knollen nur Veränderungen im Aminosäure-, Zucker- und Sekundärstoffwechsel auf. Chlorpropham behandelte Knollen wiesen einen ähnlichen Stoffwechsel wie die unbehandelten Knollen auf. Für die bislang noch nicht identifizierten Stoffwechselprodukte wurden im Rahmen dieser Arbeit das Verfahren der „gezielten An-/Abreicherung“, der „gepaarten NMR/GC-TOF-MS Analyse“ und das „Entscheidungsbaumverfahren“ entwickelt. Diese ermöglichen eine Klassifizierung von GC-MS Signalen im Hinblick auf ihre chemische Funktionalität. Das Verfahren der gekoppelten NMR/GC-TOF-MS Analyse erwies sich dabei als besonders erfolgversprechend, da es eine Aufklärung bislang unbekannter gaschromatographischer Signale ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurden neue Stoffwechselprodukte in der Kartoffelknolle identifiziert, wodurch ein wertvoller Beitrag zur Analytik der Metabolomik geleistet wurde.
Bei der Entdeckung der Glutathionperoxidase-2 (GPx2) wurde zunächst davon ausgegangen, dass die Funktion dieses Enzyms im Kryptengrund des Colons einzig in der Reduktion von H2O2 besteht. Im Laufe der weiteren Erforschung zeigte sich, dass GPx2 auch in verschiedenen Tumorgeweben vermehrt exprimiert wird. Dabei wird diskutiert, ob die Wirkung von GPx2 im Tumor eher als pro- oder als antikarzinogen einzustufen ist. Mehrere Experimente in vitro und in vivo zeigten antiinflammatorische Eigenschaften der GPx2. Aufgrund dieser Befunde wird derzeit über weitere Funktionen der GPx2 spekuliert. In dieser Arbeit wurde die physiologische Funktion von GPx2 näher erforscht, dazu wurden Wildtyp- und GPx2-Knockout-Mäuse in Hinblick auf Veränderungen der Enzymexpression und der Colonmorphologie untersucht. Es wurden drei verschiedene Selendiäten verfüttert: selenarmes, selenadäquates und selensupplementiertes Futter. Unter physiologischen Bedingungen ist am Kryptengrund des Colons, innerhalb der proliferierenden Zone, die Mitoserate am höchsten. Der Großteil der apoptotischen Zellen ist hingegen an der Kryptenspitze vorzufinden. Durch den Knockout von GPx2 kam es zu einer signifikanten Erhöhung der Apoptoserate am Kryptengrund. Dabei war der größte Effekt auf selenarmem Futter zu verzeichnen. Hierbei wurde sogar eine Veränderung der Colonmorphologie dokumentiert, da die Verschiebung der Proliferationszone in Richtung Kryptenspitze eine Verlängerung der Krypten nach sich zog. Im Wildtyp wurden keine Apoptosen im Kryptengrund detektiert. GPx1 wird unter physiologischen Bedingungen im Gegensatz zur GPx2 in der Kryptenspitze exprimiert und ist im Selenmangel nicht mehr detektierbar. Der Knockout von GPx2 erhöhte die GPx1-Expression im Kryptengrund auf allen drei Selendiäten. Diese Überexpression von GPx1 am Kryptengrund soll vermutlich den Verlust von GPx2 an dieser Stelle kompensieren. Da jedoch dort die massive Apoptoserate detektiert wurde, kann die GPx1 nicht die komplette Funktion von GPx2 kompensieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Funktion von GPx2 nicht nur in der Reduktion von H2O2 liegt. Vielmehr kann eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase von Zellen postuliert werden. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Klärung der Frage, welchen Einfluss GPx2 auf die entzündungsassoziierte Colonkarzinogenese ausübt. In dem hierfür verwendeten AOM/DSS-Model wird der karzinogene Prozess durch Entzündung vorangetrieben. Es erfolgte sowohl im Wildtyp als auch im GPx2-Knockout zum einen die Bewertung des Entzündungsstatus des Colons und zum anderen wurde die Anzahl von ACF und Tumoren verglichen. Das Colon im GPx2-Knockout war wesentlich stärker entzündet als im Wildtyp. Diese Ergebnisse bestätigen die für die GPx2 postulierte antiinflammatorische Funktion. Normalerweise führt eine Erhöhung der Mitoseanzahl zur Regeneration des entzündeten Gewebes. Jedoch beeinflusst der Verlust von GPx2 vermutlich den Ablauf der Entzündung, indem beispielsweise die Regeneration des Gewebes durch die enorm hohe Apoptoserate am Kryptengrund verlangsamt wird. Des Weiteren hatten sich im GPx2-Knockout tendenziell mehr Tumore entwickelt. Somit korrelierte die Entzündung des Colons mit der Entwicklung von Tumoren. Der Verlust von GPx2 begünstigte vermutlich sowohl die Tumorinitiation als auch die Tumorprogression. Allerdings stimulierte die Expression von GPx2 ebenfalls das Tumorwachstum. Es kann geschlussfolgert werden, dass eine adäquate GPx2-Expression vor Entzündung schützt und somit das Risiko für Colonkrebs senkt. Ob GPx2 aber insgesamt pro- oder antikarzinogen wirkt, hängt vermutlich vom Stadium des Colonkarzinogenese ab.
Untersuchungen PEG-basierter thermo-responsiver Polymeroberflächen zur Steuerung der Zelladhäsion
(2010)
Moderne Methoden für die Einzelzellanalyse werden dank der fortschreitenden Weiterentwicklung immer sensitiver. Dabei steigen jedoch auch die Anforderungen an das Probenmaterial. Viele Aufbereitungsprotokolle adhärenter Zellen beinhalten eine enzymatische Spaltung der Oberflächenproteine, um die Ablösung vom Zellkultursubstrat zu ermöglichen. Verschiedene Methoden, wie die Patch-Clamp-Technik oder eine auf der Markierung extrazellulärer Domänen von Membranproteinen basierende Durchflusszytometrie können dann nur noch eingeschränkt eingesetzt werden. Daher ist die Etablierung neuer Zellablösemethoden dringend notwendig. In der vorliegenden Arbeit werden erstmals PEG-basierte thermo-responsive Oberflächen erfolgreich für die Zellkultur eingesetzt. Dabei wird das zerstörungsfreie Ablösen verschiedener Zelllinien von den Oberflächen durch Temperatursenkung realisiert. Die Funktionalität der Oberflächen wird durch Variation der Polymerstruktur, sowie der Konzentration der Beschichtungslösung, durch Beschichtung der Oberflächen mit einem zelladhäsionsfördernden Protein (Fibronektin) und durch Adsorption zelladhäsionsvermittelnder Peptide (RGD) optimiert. Um den Zellablösungsprozess detaillierter zu untersuchen, wird hier zum ersten Mal der direkte Zellkontakt mit thermo-responsiven Oberflächen mittels oberflächensensitiver Mikroskopie (TIRAF) sichtbar gemacht. Mit dieser Technik sind die exakte Quantifizierung und die Analyse der Reduktion der Zelladhäsionsfläche während des Abkühlens möglich. Hierbei werden in Abhängigkeit von der Zelllinie Unterschiede im Zellverhalten während des Ablösens festgestellt: Zellen, wie eine Brustkrebszelllinie und eine Ovarzelllinie, die bekanntermaßen stärker mit ihrer Umgebung in Kontakt treten, vergrößern im Verlauf des Beobachtungszeitraumes den Abstand zwischen Zellmembran und Oberfläche, reduzieren jedoch ihre Zell-Substratkontaktfläche kaum. Mausfibroblasten hingegen verkleinern drastisch die Zelladhäsionsfläche. Der Ablösungsprozess wird vermutlich aktiv von den Zellen gesteuert. Diese Annahme wird durch zwei Beobachtungen gestützt: Erstens verläuft die Reduktion der Zelladhäsionsfläche bei Einschränkung des Zellmetabolismus durch eine Temperatursenkung auf 4 °C verzögert. Zweitens hinterlassen die Zellen Spuren, die nach dem Ablösen der Zellen auf den Oberflächen zurückbleiben. Mittels Kombination von TIRAF- und TIRF-Mikroskopie werden die Zelladhäsionsfläche und die Aktinstruktur gleichzeitig beobachtet. Die Verknüpfung beider Methoden stellt eine neue Möglichkeit dar, intrazelluläre Prozesse mit der Zellablösung von thermo-responsiven Oberflächen zu korrelieren.
Pektatlyase (Pel-15) aus dem alkalophilen Bodenbakterium Bacillus spec. KSM-P15 ist mit 197 Aminosäuren eines der kleinsten, bekannten β-3-Solenoidproteine. Sie spaltet Polygalakturonsäurederivate in einem Ca2+-abhängigen β-Eliminierungsprozess. Wie bei allen Proteinen dieser Enzymfamilie ist auch die Polypeptidkette von Pel-15 zu einer einsträngigen, rechtsgängigen, parallelen β-Helix aufgewunden. In diesem Strukturmotiv enthält jede Windung drei β-Stränge, die jeweils durch flexible Schleifenbereiche miteinander verbunden sind. Insgesamt acht Windungen stapeln sich in Pel-15 übereinander und bilden entlang der Helixachse flächige, parallele β-Faltblätter aus. Im Bereich dieser β-Faltblätter existiert ein ausgedehntes Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen, durch das der hydrophobe Kern, der sich im Inneren der β-Helix befindet, vom umgebenden Lösungsmittel abgeschirmt wird. Besondere Abschlussstrukturen an beiden Enden der β-Helix, wie sie typischerweise bei anderen Ver-tretern dieser Strukturklasse ausgeprägt werden, sind in Pel-15 nicht zu beobachten. Stattdessen sind die terminalen Bereiche der β-Helix über Salzbrücken und hydrophobe Seitenkettenkontakte stabilisiert. In der vorliegenden Dissertation wurde die Pektatlyase Pel-15 hinsichtlich ihres Faltungsgleichgewichtes, ihrer enzymatischen Aktivität und der Kinetik ihrer Strukturbildung charakterisiert. In eine evolutionär konservierte Helixwindung wurden destabilisierende Mutationen eingeführt, und deren Auswirkungen mittels spektroskopischer Methoden analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Pel-15 in Gegenwart des Denaturierungsmittels Guanidiniumhydrochlorid einen hyperfluoreszenten Gleichgewichtsustand (HF) populiert, der nach Messungen von Faltungs- und Entfaltungskinetiken ein konformationelles Ensemble aus den Zuständen HFslow und HFfast darstellt. Diese HF-Zustände sind durch eine hohe Aktivierungsbarriere voneinander getrennt. In Rückfaltungsexperimenten populieren nur etwa 80 % der faltenden Moleküle den Zwischenzustand HFslow, der mit einer Zeitkonstante von ca. 100 s zu HFfast weiterreagiert. Die Denaturierungsmittelabhängigkeit dieser Reaktion ist sehr gering, was eine trans-/cis-Prolylisomerisierung als geschwindigkeitslimitierenden Schritt nahelegt. Die Existenz eines cis-Peptides in der nativen Struktur macht es erforderlich, den denaturierten Zustand als ein Ensemble kinetisch separierter Konformationen, kurz: DSE, zu betrachten, das durch die Spezies Ufast und Uslow populiert wird. Nach dem in dieser Arbeit aufgestellten „Minimalmodell der Pel-15 Faltung“ stehen die HF-Spezies (HFslow, HFfast) mit den Konformationen des DSE in einem thermodynamischen Kreisprozess. Das Modell positioniert HFfast und die native Konformation N auf die „native Seite“ der Aktivierungsbarriere und trägt damit der Tatsache Rechnung, dass die Gleichgewichtseinstellung zwischen diesen Spezies zu schnell ist, um mit manuellen Techniken erfasst zu werden. Die hochaffine Bindung von Ca2+ (Kd = 10 μM) verschiebt sich das Faltungsgleichgewicht bereits in Gegenwart von 1 mM CaCl2 soweit auf die Seite des nativen Zustandes, das HFfast nicht länger nachweisbar ist. Entgegen anfänglicher Vermutungen kommt einer lokalen, evolutionär konservierten Disulfidbrücke im Zentrum der β-Helix eine wichtige Stabilisierungsfunktion zu. Die Disulfidbrücke befindet sich in einem kurzen Schleifenbereich der β-Helix nahe dem aktiven Zentrum. Obwohl ihr Austausch gegen die Reste Val und Ala die freie Stabilisierungsenthalpie des Proteins um ca. 10 kJ/mol reduziert, lässt die Struktur im Bereich der Mutationsstelle keine gravierende Veränderung erkennen. Auch die katalytisch relevante Ca2+-Bindungsaffinität bleibt unbeeinflusst; dennoch zeigen Enzymaktivitätstests für VA-Mutanten eine Reduktion der enzymatischen Aktivität um fast 50 % an. Die evolutionär konservierte Helixwindung im Allgemeinen und die in ihr enthaltene Disulfidbrücke im Besonderen müssen nach den vorliegenden Ergebnissen also eine zentrale Funktion sowohl für die Struktur des katalytischen Zentrums als auch für die Strukturbildung der β-Helix während der Faltungsreaktion besitzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit finden in mehreren Punkten Anklang an Faltungseigenschaften, die für andere β -Helixproteine beschrieben wurden. Vor allem aber prädestinieren sie Pel-15 als ein neues, β-helikales Modellprotein. Aufgrund seiner einfachen Topologie, seiner niedrigen Windungszahl und seiner hohen thermodynamischen Stabilität ist Pel-15 sehr gut geeignet, die Determinanten von Stabilität und Strukturbildung des parallelen β-Helix-Motivs in einer Auflösung zu studieren, die aufgrund der Komplexität bestehender β-helikaler Modellsysteme bislang nicht zur Verfügung stand.
In dieser Arbeit wurden die Möglichkeiten und Grenzen für Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung untersucht. Dazu wurde ein Messaufbau für Zirkulardichroismus-Messungen an zwei Strahlrohren am Berliner Elektronenspeicherring für Synchrotronstrahlung eingesetzt, die für Messungen im Bereich des ultravioletten Lichts geeignet sind. Eigenschaften der Strahlrohre und des Messaufbau wurden in einigen wichtigen Punkten mit kommerziellen Zirkulardichroismus-Spektrometern verglichen. Der Schwerpunkt lag auf der Ausdehnung des zugänglichen Wellenlängenbereichs unterhalb von 180 nm zur Untersuchung des Zirkulardichroismus von Proteinen in diesem Bereich. In diesem Bereich ist es nicht nur die Lichtquelle sondern vor allem die Absorption des Lichts durch Wasser, die den Messbereich bei der Messung biologischer Proben in wässriger Lösung einschränkt. Es wurden Bedingungen gefunden, unter denen der Messbereich auf etwa 160 nm, in einigen Fällen bis auf 130 nm ausgedehnt werden konnte. Dazu musste die Pfadlänge deutlich reduziert werden und verschieden Probenküvetten wurden getestet. Der Einfluss der dabei auftretenden Spannungsdoppelbrechung in den Probenküvetten auf das Messsignal konnte mit einem alternativen Messaufbau deutlich reduziert werden. Systematische Fehler im Messsignal und auftretende Strahlenschäden begrenzen jedoch die Zuverlässigkeit der gemessenen Spektren. Bei Proteinfilmen schränkt die Absorption von Wasser den Messbereich kaum ein. Es wurden jedoch meist deutliche Unterschiede zwischen den Spektren von Proteinfilmen und den Spektren von Proteinen in wässriger Lösung festgestellt. Solange diese Unterschiede nicht minimiert werden können, stellen Proteinfilme keine praktikable Alternative zu Messungen in wässriger Lösung dar.
Die Ca2+/Calmodulin-aktivierte Serin/Threonin-Phosphatase Calcineurin ist ein Schlüsselmolekül des T-Zell-Rezeptorabhängigen Signalnetzwerkes. Calcineurin aktiviert die Transkriptionsfaktoren der NFATc-Familie durch Dephosphorylierung und reguliert darüber die Expression wichtiger Zytokine und Oberflächenproteine. Die Aktivität von Calcineurin wird durch zahlreiche endogene Proteine moduliert und ist Angriffspunkt der immunsuppressiven Substanzen Cyclosporin A und FK506. In dieser Arbeit wurde der alternative niedermolekulare Calcineurin-NFATc-Inhibitor NCI3 hinsichtlich seiner Effekte auf T-Zell-Rezeptor-abhängige Signalwege charakterisiert. Die Ergebnisse zeigen, daß das Pyrazolopyrimidinderivat NCI3 nichttoxisch und zellmembranpermeabel ist. In T-Zell-Rezeptor-stimulierten primären humanen TH-Zellen unterdrückt NCI3 die Proliferation und IL-2-Produktion (IC50-Wert ~4 µM), da die Dephosphorylierung von NFATc und die anschließende nukleäre Translokation gehemmt wird. NCI3 inhibiert die calcineurinabhängige NFAT- und NF-κB-, aber nicht die AP-1-kontrollierte Reprtergenexpression, in mikromolaren Konzentrationen (IC50-Werte 2 bzw. 7 µM). Im Gegensatz zu Cyclosporin A stört NCI3 nicht die Phosphataseaktivität von Calcineurin, sondern interferiert mit der Calcineurin-NFATc-Bindung. Ein wichtiges endogenes Modulatorprotein für die Calcineurinaktivität ist RCAN1, das vermutlich den Calcineurin-NFATc-Signalweg über einen negativen Rückkopplungsmechanismus reguliert. Hier wurde gezeigt, daß RCAN1 in humanen TH-Zellen exprimiert wird. Die Spleißvariante RCAN1-1 ist in ruhenden T-Zellen basal exprimiert und wird nicht durch T-Zell-Rezeptor-Stimulierung in seiner Expression verändert. RCAN1-4 dagegen ist in ruhenden Zellen kaum zu detektieren und wird stimulierungsabhängig induziert. Durch die Verwendung Calcineurin-NFATc-spezifischer Inhibitoren wie NCI3 wurde gezeigt, daß die RCAN1-4-Induktion durch diesen Signalweg limitiert ist. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten und Erkenntnisse tragen dazu bei, das Verständnis der Funktion und Regulation von Calcineurin in T-Zellen zu vertiefen.
Die Xanthin-Dehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus ist ein cytoplasmatisches Enzym, welches ein (αβ)₂ Heterotetramer mit einer Größe von 275 kDa bildet. Die drei Kofaktoren (Moco, 2[2Fe2S], FAD) sind auf zwei unterschiedlichen Polypeptidketten gebunden. So sind die beiden spektroskopisch unterscheidbaren Eisen-Schwefel-Zentren und das FAD in der XdhA-Untereinheit und der Moco in der XdhB-Untereinheit gebunden. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte untersucht werden, warum die R. capsulatus XDH ein Dimer bildet und ob ein intramolekularer Elektronentransfer existiert. Dafür wurde eine chimäre XDH-Variante [(α)₂(β₁wt/β₂E730A)] erzeugt, welche eine aktive und eine inaktive XdhB-Untereinheit trägt. Mit Hilfe von Reduktionsspektren sowie mit der Bestimmung der kinetischen Parameter für die Substrate Xanthin und NAD+ konnte gezeigt werden, dass die chimäre XDH-Variante katalytisch halb so aktiv war, wie der auf gleiche Weise gereinigte XDH-Wildtyp. Dies verdeutlicht, dass die noch aktive Untereinheit der Chimären selbstständig und unabhängig Substrat binden und hydroxylieren kann und ein intramolekularer Elektronentransfer zwischen den beiden XdhB-Untereinheiten nicht stattfindet. Ein weiteres Ziel war die funktionelle Charakterisierung der Mus musculus AOX1 sowie der humanen AOX1 hinsichtlich ihrer Substratspezifitäten und ihrer biophysikalischen Eigenschaften sowie der Charakterisierung der konservierten Aminosäuren im aktiven Zentrum der mAOX1. Da bislang noch kein heterologes Expressionssystem für ein aktives und stabiles rekombinantes AO-Protein existierte, wurde ein E. coli Expressionssystem mit der gleichzeitigen Expression der entsprechenden Mocosulfurase für mAOX1 und hAOX1 in dieser Arbeit etabliert. Mit Hilfe dieser Koexpression konnte die Aktivität der rekombinanten mAOX1 um 50 % gesteigert werden, wenn gleich auch der sulfurierte Moco-Anteil nur 20 % betrug. Um die konservierten Aminosäuren im aktiven Zentrum hinsichtlich ihrer Funktion der Substratbindung zu charakterisieren, wurden folgende Varianten erzeugt: V806E, M884R, V806/M884R sowie E1265Q. Mit Hilfe von kinetischen Substratuntersuchungen konnte gezeigt werden, dass die beiden Aminosäuren Val806 und Met884 für die Erkennung und die Stabilisierung von Aldehyden und N-Heterozyklen essentiell sind. Ein Austausch dieser beiden gegen Glutamat bzw. Arginin (wie bei R. capsulatus XDH) zeigte jedoch keine Xanthin- oder Hypoxanthinumsetzung. Für das Glu1265 wurde ebenfalls die Rolle als die Katalyse initiierende Aminosäure belegt.
Der Streifenkiwi (Apteryx mantelli) kommt im Freiland nur auf der Nordinsel Neuseelands vor. Aufgrund des gefährdeten Bestands ist eine sich selbst erhaltene Zoopopulation wichtig. Kenntnisse des Verhaltens helfen, die Ansprüche der Tiere zu verstehen. Zudem können sie darüber Auskunft geben, inwiefern das Wohlbefinden eines Tieres gegeben ist. Durch die Untersuchung der Brutaktivität sollte ein Überblick über den allgemeinen Verlauf der Brut gegeben und Aktivitätsmuster für den Berliner Hahn erarbeitet werden, um den Verlauf zukünftiger Bruten einschätzen und eventuell positiv beeinflussen zu können. Dazu kamen die Untersuchung der täglichen Aktivität einer Henne sowie Beobachtungen des Verhaltens der Tiere. Diese dienten der Bestandsaufnahme der gezeigten Verhaltensweisen und sollten zusammen mit der Aktivität die Grundlage zur Einschätzung bilden, ob die Ansprüche der Kiwis im Zoo Berlin erfüllt werden, und Hinweise zur Verbesserung der Haltung geben. Die Brutaktivität des Hahnes konnte über drei Brutperioden hinweg detailliert dargestellt werden und zeigte, dass nicht nur innerhalb der Art sondern bei einem einzigen Tier unter ähnlichen Bedingungen die Variabilität so groß sein kann, dass sie für Vorhersagen über den Erfolg einer Brut nicht geeignet ist. Im Zusammenhang mit der Aktivität der Henne ließen sich keine Auffälligkeiten erkennen, die auf eine allgemeine Störung der Tiere schließen lassen oder für eine Beeinträchtigung der Brut verantwortlich gemacht werden könnten. Soweit aus den Beobachtungen im Freiland geschlossen werden kann, scheinen die Kiwis im Zoo ein weitgehend natürliches Verhalten zu zeigen. Die Haltungsbedingungen scheinen den Ansprüchen der Tiere zu entsprechen. Es ließen sich nur bedingt Strategien entwickeln, um die Bedingungen für die Brut und damit für die Nachzucht zu verbessern, da sich die Aktivität des Hahnes während der Brut von Jahr zu Jahr als unerwartet variabel erwies. Für ein weiteres Verständnis des Brutverhaltens und eine mögliche Verbesserung der Bedingungen wäre eine Untersuchung zum Einfluss verschiedener Umweltfaktoren auf die Brutaktivität des Hahnes wünschenswert.
Das homotrimere Tailspikeadhäsin des Bakteriophagen P22 ist ein etabliertes Modellsystem, dessen Faltung, Assemblierung und Stabilität in vivo und in vitro umfassend charakterisiert ist. Das zentrale Strukturmotiv des Proteins ist eine parallele beta-Helix mit 13 Windungen, die von einer N‑terminalen Kapsidbindedomäne und einer C‑terminalen Trimerisierungsdomäne flankiert wird. Jede Windung beinhaltet drei kurze beta-Stränge, die durch turns und loops unterschiedlicher Länge verbunden sind. Durch den sich strukturell wiederholenden, spulenförmigen Aufbau formen beta-Stränge benachbarter Windungen elongierte beta-Faltblätter. Das Lumen der beta-Helix beinhaltet größtenteils hydrophobe Seitenketten, welche linear und sehr regelmäßig entlang der Längsachse gestapelt sind. Eine hoch repetitive Struktur, ausgedehnte beta-Faltblätter und die regelmäßige Anordnung von ähnlichen oder identischen Seitenketten entlang der beta-Faltblattachse sind ebenfalls typische Kennzeichen von Amyloidfibrillen, die bei Proteinfaltungskrankheiten wie Alzheimer, der Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Chorea Huntington und Typ-II-Diabetes gebildet werden. Es wird vermutet, dass die hohe Stabilität des Tailspikeproteins und auch die der Amyloidfibrille durch Seitenkettenstapelung, einem geordneten Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen und den rigiden, oligomeren Verbund bedingt ist. Um den Einfluss der Seitenkettenstapelung auf die Stabilität, Faltung und Struktur des P22 Tailspikeproteins zu untersuchen, wurden sieben Valine in einem im Lumen der beta-Helix begrabenen Seitenkettenstapel gegen das kleinere und weniger hydrophobe Alanin und das voluminösere Leucin substituiert. Der Einfluss der Mutationen wurde anhand zweier Tailspikevarianten, dem trimeren, N‑terminal verkürzten TSPdeltaN‑Konstrukt und der monomeren, isolierten beta-Helix Domäne analysiert. Generell wurde in den Experimenten deutlich, dass Mutationen zu Alanin stärkere Effekte auslösen als Mutationen zu Leucin. Die dichte und hydrophobe Packung im Kern der beta-Helix bildet somit die Basis für Stabilität und Faltung des Proteins. Anhand hoch aufgelöster Kristallstrukturen jeweils zweier Alanin‑ und Leucin‑Mutanten konnte verdeutlicht werden, dass das Strukturmotiv der parallelen beta-Helix stark formbar ist und mutationsbedingte Änderungen des Seitenkettenvolumens durch kleine und lokale Verschiebung der Haupt‑ und Seitenketten ausgeglichen werden, sodass mögliche Kavitäten gefüllt und sterische Spannung abgebaut werden können. Viele Mutanten zeigten in vivo und in vitro einen temperatursensitiven Faltungsphänotyp (temperature sensitive for folding, tsf), d.h. bei Temperaturerhöhung waren die Ausbeuten des N‑terminal verkürzten Trimers im Vergleich zum Wildtyp deutlich verringert. Weiterführende Experimente zeigten, dass der tsf‑Phänotyp durch die Beeinflussung unterschiedlicher Stadien des Reifungsprozesses oder auch durch die Verminderung der kinetischen Stabilität des nativen Trimers ausgelöst wurde. Durch Untersuchungen am vollständigen und am N‑terminal verkürzten Wildtypprotein wurde gezeigt, dass die Entfaltungsreaktion des Tailspiketrimers komplex ist. Die Verläufe der Kinetiken folgen zwar einem apparenten Zweizustandsverhalten, jedoch sind bei Darstellung der Entfaltungsäste im Chevronplot die Abhängigkeiten der Geschwindigkeitskonstanten vom Denaturierungsmittel nicht linear, sondern in unterschiedliche Richtungen gewölbt. Dieses Verhalten könnte durch ein hoch energetisches Entfaltungsintermediat, einen breiten Übergangsbereich oder parallele Entfaltungswege hervorgerufen sein. Mit Hilfe der monomeren, isolierten beta-Helix Domäne, bei der die N‑terminale Capsidbindedomäne und die C‑terminale Trimerisierungsdomäne deletiert sind und welche als unabhängige Faltungseinheit fungiert, wurde gezeigt, dass alle Mutanten im Harnstoff‑induzierten Gleichgewicht analog zum Wildtypprotein einem Zweizustandsverhalten mit vergleichbaren Kooperativitäten folgen. Die konformationellen Stabilitäten von in der beta-Helix zentral gelegenen Alanin‑ und Leucin‑Mutanten sind stark vermindert, während Mutationen in äußeren Bereichen der Domäne keinen Einfluss auf die Stabilität der beta-Helix haben. Bei Verlängerung der Inkubationszeiten der Gleichgewichtsexperimente konnte die langsame Bildung von Aggregaten im Übergangsbereich der destabilisierten Mutanten detektiert werden. Die in der Arbeit erlangten Erkenntnisse lassen vermuten, dass die isolierte beta-Helix einem für die Reifung des Tailspikeproteins entscheidenden thermolabilen Faltungsintermediat auf Monomerebene sehr ähnlich ist. Im Intermediat ist ein zentraler Kern, der die Windungen 4 bis 7 und die „Rückenflosse“ beinhaltet, stabilitätsbestimmend. Dieser Kern könnte als Faltungsnukleus dienen, an den sich sequenziell weitere Helixwindungen anlagern und im Zuge der „Monomerreifung“ kompaktieren.
Sehzellen von Insekten sind epitheliale Zellen mit einer charakteristischen, hochpolaren Morphologie und Organisation. Die molekularen Komponenten der Sehkaskade befinden sich im Rhabdomer, einem Saum dicht gepackter Mikrovilli entlang der Sehzelle. Bereits in den 70er Jahren des letzten Jahrhunderts wurde beschrieben, dass die Mikrovilli entlang einer Sehzelle eine unterschiedliche Ausrichtung besitzen, oder in anderen Worten, die Rhabdomere entlang der Sehzell-Längsachse verdreht sind. So sind in den Sehzellen R1-R6 bei dipteren Fliegen (Calliphora, Drosophila) die Mikrovilli im distalen und proximalen Bereich eines Rhabdomers etwa rechtwinkelig zueinander angeordnet. Dieses Phänomen wird in der Fachliteratur als rhabdomere twisting bezeichnet und reduziert die Empfindlichkeit für polarisiertes Licht. Es wurde für das Drosophila-Auge gezeigt, dass diese strukturelle Asymmetrie der Sehzellen mit einer molekularen Asymmetrie in der Verteilung phosphotyrosinierter Proteine an die Stielmembran (einem nicht-mikrovillären Bereich der apikalen Plasmamembran) einhergeht. Zudem wurde gezeigt, dass die immuncytochemische Markierung mit anti-Phosphotyrosin (anti-PY) als lichtmikroskopischer Marker für das rhabdomere twisting verwendet werden kann. Bisher wurde hauptsächlich die physiologische Bedeutung der Rhabdomerverdrehung untersucht. Es ist wenig über die entwicklungs- und zellbiologischen Grundlagen bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Identität der phosphotyrosinierten Proteine an der Stielmembran zu klären und ihre funktionelle Bedeutung für die Entwicklung des rhabdomere twisting zu analysieren. Zudem sollte untersucht werden, welchen Einfluss die inneren Sehzellen R7 und R8 auf die Verdrehung der Rhabdomere von R1-R6 haben. Für die zwei Proteinkinasen Rolled (ERK) und Basket (JNK) vom Typ der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) konnte ich zeigen, dass sie in ihrer aktivierten (= phosphorylierten) Form (pERK bzw. pJNK) eine asymmetrische Verteilung an der Stielmembran aufweisen vergleichbar der Markierung mit anti-PY. Weiterhin wurde diese asymmetrische Verteilung von pERK und pJNK ebenso wie die von PY erst kurz vor Schlupf der Fliegen (bei ca. 90% pupaler Entwicklung) etabliert. Durch Präinkubationsexperimente mit anti-PY wurde die Markierung mit anti-pERK bzw. anti-pJNK unterbunden. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass pERK und pJNK zu den Proteinen gehören, die von anti-PY an der Stielmembran erkannt werden. Da es sich bei ERK und JNK um Kinasen handelt, ist es naheliegend, dass diese an der Entwicklung des rhabdomere twisting beteiligt sein könnten. Diese Hypothese wurde durch die Analyse von hypermorphen (rl SEM)und hypomorphen (rl 1/rl 10a) Rolled-Mutanten überprüft. In der rl SEM-Mutante mit erhöhter Aktivität der Proteinkinase erfolgte die asymmetrische Positionierung von pERK an der Stielmembran sowie die Mikrovillikippung schon zu einem früheren Zeitpunkt in der pupalen Entwicklung. Im adulten Auge war die anti-PY-Markierung im distalen Bereich der Sehzellen intensiver sowie der Kippwinkel vergrößert. In der rl 1/rl 10a-Mutanten mit reduzierter Kinaseaktivität waren die anti-PY-Markierung und der Kippwinkel im proximalen Bereich der Sehzellen verringert. Die Proteinkinase ERK hat somit einen Einfluss auf die zeitliche Etablierung des rhabdomere twisting wie auch auf dessen Ausprägung im Adulttier. Die Rhabdomerverdrehung sowie die Änderung im anti-PY-Markierungsmuster erfolgen an den Sehzellen R1-R6 relativ abrupt auf halber Ommatidienlänge, dort wo das Rhabdomer von R7 endet und das von R8 beginnt. Es stellte sich deshalb die Frage, ob die Rhabdomerverdrehung an R1-R6 durch die Sehzelle R7 und/oder R8 beeinflusst wird. Um dieser Frage nachzugehen wurden Mutanten analysiert, denen die R7- oder die R8-Photorezeptoren bzw. R7 und R8 fehlten. Das wichtigste Ergebnis dieser Untersuchungen war, dass bei Fehlen von R8 die Rhabdomerverdrehung bei R1-R6 nach keinen erkennbaren Regeln erfolgt. R8 ist somit Voraussetzung für die Etablierung der Rhabdomerverdrehung in R1-R6. Folgendes Modell wurde auf Grundlage dieses und weiterer Ergebnisse erarbeitet: Im dritten Larvenstadium rekrutiert R8 die Sehzellpaare R2/R5, R3/R4 und R1/R6. Dabei werden R1-R6 durch den Kontakt zu R8 „polarisiert“. Abschließend wird R7 durch R8 rekrutiert. Dies führt zu einer Fixierung der Polarität von R1-R6 durch R7. Die Ausführung der Mikrovillikippung anhand der festgelegten Polarität erfolgt in der späten Puppenphase. Die Proteinkinase ERK ist an diesem letzten Morphogeneseprozess beteiligt.
Zum Erhalt vom Aussterben bedrohter Papageienvögel (Psittaciformes) ist die Nachzucht in Menschenobhut neben dem Erhalt freilebender Populationen von großer Bedeutung, die Reproduktion bestimmter Arten gelingt allerdings nur unzureichend. Als Hauptgrund dafür gilt die Zwangsverpaarung im Rahmen von Zuchtprogrammen (Beispiel: Europäisches Erhaltungszuchtprogramm, EEP), hier werden Brutpaare hauptsächlich nach genetischen Aspekten zusammengestellt. Der reproduktive Erfolg ist bei den meisten Papageienarten, die in dauerhaften Paarbindungen leben (perennial monogamy), eng der Paarbindung korreliert. Eine freie Partnerwahl ist demnach von großer Bedeutung für die Zucht in Menschenobhut, im Rahmen von Erhaltungszuchtprogrammen jedoch nur selten möglich. Das Ziel der Untersuchung war, eine wissenschaftlich begründete Methode zu entwickeln, durch die es möglich sein soll, das Fortpflanzungspotential von Brutpaaren der Gattung Ara anhand der Paarbindung zu bestimmen. Dafür wurde die Bedeutung der Qualität der Paarbindung der Brutpaare für den Lebens-Reproduktionserfolg (Lifetime-reproductive success, LRS) untersucht. Die Datenaufnahme erfolgte in dem Zuchtzentrum 'La Vera' der Loro Parque Fundación auf Teneriffa/ Spanien. Hier wurden in den Jahren 2006 und 2007 21 Brutpaare der Gattung Ara untersucht. Die Paarbindung wurde zum Einen durch typisches Paarbindungsverhalten und zum Anderen durch die physiologische Abstimmung der einzelnen Brutpaare anhand der Ausschüttung des Steroidhormons Testosteron dargestellt. Das Paarbindungsverhalten setzte sich aus der ‚Abstimmung der Tagesaktivität’, dem ‚Kontaktverhalten’ und den ‚sozialen Interaktionen’ zusammen. Zur Abstimmung der Tagesaktivität zählten die Verhaltensweisen Ruhen, Sitzen, Nahrungsaufnahme, Gefiederpflege, Beschäftigung und Lokomotion. Unter Kontaktverhalten wurden das Überschreiten der Individualdistanz bei bestimmten Verhaltensweisen und die Rollenverteilung der Geschlechter untersucht. Unter ‚sozialen Interaktionen’ wurden die Dauer und der Häufigkeit der sozialen Gefiederpflege und der Sozialen Index zusammengefasst. Bei der sozialen Gefiederpflege wurde die Dauer und die Häufigkeit der Phasen erhoben, sowie der jeweilige Initiator dieser Interaktion. Zusätzlich wurde untersucht, welches Geschlecht, wie häufig und mit welcher Dauer aktiv an der sozialen Gefiederpflege beteiligt war. Aus den Beobachtungen wurde der soziale Index berechnet, der angibt, wie das Verhältnis sozio-positiver zu agonistischen Interaktionen für jedes Individuum, sowie das Paar an sich ist. Zur Messung der Testosteron-Ausschüttung der Partnertiere wurden von September bis November 2007 über einen Zeitraum von 9 Wochen jede Woche einmal für jedes Individuum Kotproben gesammelt. Mit der Analyse der Proben wurde das Veterinär-Physiologisch-Chemische-Institut der Universität Leipzig unter der Leitung von Prof. Dr. Almuth Einspanier beauftragt. Zur Ermittlung des Hormongehalts in den gewonnenen Kotproben diente ein kompetitiver Doppelantikörper-Enzymimmunoassay (EIA). Das Fortpflanzungspotential wurde über die Anzahl der Eier, Gelege und Jungtiere, sowie über die Gelegegröße dargestellt. Diese Daten geben, bezogen auf die Dauer der Paarbindung, Auskunft über die Produktivität eines Brutpaares, anhand dessen zusätzlich ein Produktivitäts-Koeffizient berechnet wurde. Des weiteren sollte die Anzahl der von einem Brutpaar selbständig großgezogenen Jungtiere Auskunft über die Fähigkeit zur kooperativen Jungenaufzucht geben. Zur Untersuchung der Bedeutung der Paarbindungsqualität wurden Diskriminanzfunktionsanalysen und Regressionsanalysen durchgeführt, wozu die untersuchten Brutpaare anhand ihres Fortpflanzungspotentials in verschiedene Gruppen eingeteilt wurden. Anhand der Ergebnisse der Studie konnte gezeigt werden, dass das Fortpflanzungspotential von Brutpaaren von verschiedenen Kriterien, die die Paarbindungsqualität charakterisieren, abhängt. Dabei ist zwischen der Produktivität und der Fähigkeit zur kooperativen Jungenaufzucht zu unterscheiden. Die Produktivität eines Paares wurde hinsichtlich der abgestimmten Tagesaktivität positiv vom synchronen Ruhen mit dem Partner beeinflusst, sowie von der Häufigkeit und Dauer der vom Weibchen ausgehenden sozialen Gefiederpflege. Brutpaare mit hoher Produktivität waren zudem über eine hohe ‚intra-Paar Fluktuation’ des Steroidhormons Testosteron gekennzeichnet. Die Brutpaare, die in der Lage sind, ihre Jungtiere in Kooperation großzuziehen, zeigten ebenfalls einen hohen Anteil zeitlich mit dem Partner abgestimmter Ruhephasen, zudem häufiges Ruheverhalten in Körperkontakt zum Partner und ein hohes zeitliches Investment der Männchen bei der Initiierung und Durchführung sozialer Gefiederpflege. Darüber hinaus zeigten Männchen, die einen Beitrag zur kooperativen Jungenaufzucht leisten, eine wesentlich geringere durchschnittliche Testosteron-Konzentration – bezogen auf den Untersuchungszeitraum, als Männchen, die Brutpaaren angehören, die nicht zur selbständigen Jungenaufzucht fähig sind. Dieses Ergebnis spiegelt die Bedeutung von Testosteron bei der elterlichen Fürsorge wider und bietet einen Anhaltspunkt für weitere Untersuchungen. Die Untersuchung konnte zeigen, dass es möglich und sinnvoll ist, das individuelle Verhalten von Tieren in Menschenobhut für den Erhalt bedrohter Tierarten einzusetzen. Weitere, auf dieser Studie aufbauende Untersuchungen sollten zum Ziel haben, zuverlässig die Brutpaare erkennbar zu machen, die über ein gutes Fortpflanzungspotential verfügen. Auf diese Weise kann unzureichender Reproduktionserfolg bedrohter Papageienarten in Menschenobhut infolge von Zwangsverpaarung minimiert werden.
In dieser Arbeit wird die Entwicklung und Charakterisierung neuer „smarter“ Redoxhydrogele mit drei verschiedenen funktionellen Eigenschaften und deren erfolgreicher Einsatz zur elektrochemischen Kontaktierung von Oxidoreduktasen beschrieben. Diese neuen Redoxpolymere 1. tragen kovalent integrierte Redoxzentren umgeben von einer hydrophilen Polymermatrix, 2. reaktive Kopplungsgruppen für den Aufbau selbstassemblierter Polymerschichten auf Elektrodenoberflächen und 3. lassen sich in ihrer Redoxaktivität durch Verwendung „intelligenter“ Polymere über externe Stimuli kontrollieren. Die Redoxhydrogele wurden nach dem Vorbild eines Baukastensystems in einfachen Ein-Stufen-Synthesen synthetisiert. Dazu wurden verschiedene Redoxzentren (Ferrocen, 1,10-Phenanthrolin-5,6-dion und 4-Carboxy-2,5,7-Trinitro-9-fluorenon), reaktive Kopplungsgruppen (Epoxy-, Amino-, Thiol- oder Disulfidfunktionen) und Polymermatrices (Poly-(N-Isopropylacrylamid) (PNIPAM) und Poly(ethylenglykolmethacrylat) (PEGMA)) in unterschiedlichen Zusammensetzungen miteinander copolymerisiert. Die Polymere wurden in Form von dünnen Polymerfilmen über die wiederholenden Funktionalitäten auf Elektrodenoberflächen aufgebracht und physiko- und elektrochemisch charakterisiert. Durch die erstmals gezeigte, derartige Ankopplung der Polymere, entstehen dreidimensionale, hydrophile selbstassemblierte Polymerschichten. Die Elektronentransferwege sind kurz und der Elektronentransfer effizient. Diese Polymer-modifizierten Elektroden wurden für die Kontaktierung von zwei exemplarisch ausgewählten Oxidoreduktasen eingesetzt, die Nicotinsäureamid-adenin-dinucleotid-abhängige Glucosedehydrogenase (NAD-GDH), welche ein freibewegliches Coenzym und die Pyrrolochinolinchinon-abhängige Glucosedehydrogenase (PQQ-GDH), welche ein prosthetisches Coenzym verwenden. Die Redoxaktivitäten des PNIPAMFoxy- und PEGMA-Fc-Polymers ließen sich durch externe Stimuli in Form von Temperatur und Calciumkonzentrationen kontrollieren. Ein Modell für die Komplexierung der Calciumionen durch die PEG-Seitenketten unter Ausbildung Kronenether-ähnlicher Strukturen und der daraus resultierenden Steigerung des Elektronentransfers wurde gezeigt.
Das serotonerge System besitzt sowohl bei Invertebraten als auch bei Vertebraten eine große Bedeutung für die Kontrolle und Modulation vieler physiologischer Prozesse und Verhaltensleistungen. Bei der Honigbiene Apis mellifera spielt Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) eine wichtige Rolle bei der Arbeitsteilung und dem Lernen. Die 5-HT-Rezeptoren, die überwiegend zur Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gehören, besitzen eine Schlüsselstellung für das Verständnis der molekularen Mechanismen der serotonergen Signalweiterleitung. Ziel dieser Arbeit war es, 5-HT-Rezeptoren der Honigbiene zu charakterisieren. Dazu zählt die Identifizierung der molekularen Struktur, die Ermittlung der intrazellulären Signalwege, die Erstellung von pharmakologischen Profilen, die Ermittlung der Expressionsmuster und die Ermittlung der physiologischen Funktionen der Rezeptoren. Mit Hilfe der Informationen aus dem Honey Bee Genome Project, konnten drei RezeptorcDNAs kloniert werden. Vergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit den Aminosäuresequenzen bereits charakterisierter Rezeptoren legten nahe, dass es sich dabei um einen 5-HT1- (Am5-HT1) und zwei 5-HT2-Rezeptoren (Am5-HT2α und Am5-HT2β) handelt. Die strukturelle Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz dieser Rezeptoren postuliert das Vorhandensein der charakteristischen heptahelikalen Architektur von GPCRs und zeigt starkkonservierte Motive, die bedeutend für die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an G-Proteine sind. Für die beiden 5 HT2-Rezeptoren konnte zudem alternatives Spleißen nachgewiesen werden. Mit den cDNAs des Am5-HT1- und des Am5-HT2α-Rezeptors wurden HEK293-Zellen stabil transfiziert und anschließend die Rezeptoren funktionell und pharmakologisch analysiert. Am5-HT1 hemmt bei Aktivierung abhängig von der 5-HT-Konzentration die cAMPProduktion.Die Substanzen 5-Methoxytryptamin (5-MT) und 5-Carboxamidotryptamin konnten als Agonisten identifiziert werden. Methiothepin dagegen blockiert die 5-HTWirkung vollständig. Prazosin und WAY100635 stellen partielle Antagonisten des Am5-HT1-Rezeptors dar. Der Am5-HT2_-Rezeptor stimuliert bei Aktivierung die Synthese des sekundären Botenstoffs Inositoltrisphosphat, was wiederum zu einer messbaren Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration führt. 5-MT und 8-OH-DPAT zeigen eine deutliche agonistische Wirkung auf Am5-HT2α. Dagegen besitzen Clozapin, Methiothepin, Mianserin und Cyproheptadin die Fähigkeit, die 5-HT-Wirkung um 51-64 % zu vermindern. Die bereits erwähnte alternative Spleißvariante von Am5-HT2α wurde ebenfalls in HEK293-Zellen exprimiert und analysiert, scheint jedoch eigenständig nicht funktionell zu sein. Gegen die dritte cytoplasmatische Schleife (CPL3) wurde ein polyklonales Antiserum generiert. Dieses erkennt in Western-Blot-Analysen ein Protein mit einer Masse von ca. 50 kDa. Durch immunhistochemische Analysen am Bienengehirn wurde die Verteilung des Rezeptors genauer untersucht. Dabei zeigten die optischen Neuropile, besonders die Lamina und die Ocellarnerven, stets eine starke Markierung. Außerdem wird der Rezeptor in den α- und β-Loben sowie der Lippe, dem Basalring und dem Pedunculus der Pilzkörper exprimiert. Doppelmarkierungen zeigen stets eine enge Nachbarschaft von serotonergen Fasern und dem Am5-HT1-Rezeptor. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Am5-HT1-Rezeptor sehr wahrscheinlich an der Regulation des phototaktischen Verhalten der Honigbiene beteiligt ist. Verfütterung von 5-HT hat eine deutlich negative Wirkung auf das phototaktischen Verhalten. Diese kann durch den Am5-HT1-Rezeptor-Agonisten 5-CT imitiert werden. Schließlich konnte gezeigt werden, dass der Am5-HT1-Antagonist Prazosin die 5-HT-Wirkung deutlich vermindern kann.
Die acinösen Speicheldrüsen der Schabe Periplaneta americana sind reich durch serotonerge, dopaminerge und GABAerge Fasern innerviert. Die biogenen Amine Serotonin (5-HT) und Dopamin (DA) induzieren die Sekretion eines NaCl-haltigen Primärspeichels. Die physiologische Rolle der GABAergen Innervation des Drüsenkomplexes war bislang unbekannt. Weiterhin wurde vermutet, dass Tyramin (TA) und Octopamin (OA) an der Speichelbildung beteiligt sind. Mittels intrazellulärer Ableitungen von sekretorischen Acinuszellen mit und ohne Stimulierung des Speicheldrüsennervs (SDN) sollte daher die Wirkung von GABA, TA und OA im Speicheldrüsenkomplex untersucht werden. Intrazelluläre Ableitungen aus Acinuszellen zeigten, dass sowohl DA als auch 5 HT biphasische Änderungen des Membranpotentials induzierten. Diese bestanden aus einer initialen Hyperpolarisation und einer darauf folgenden transienten Depolarisation. Stimulierung des SDN mittels einer Saugelektrode verursachte ebenfalls biphasische Änderungen des Membranpotentials der Acinuszellen, die mit den DA- bzw. 5-HT-induzierten Änderungen kinetisch identisch waren. Dieses Ergebnis zeigte, dass die elektrische Stimulierung des SDN im Nerv-Speicheldrüsenpräparat eine verlässliche Methode zur Untersuchung der Wirkungen von Neuromodulatoren auf die dopaminerge und/oder sertotonerge Neurotransmission ist. Die Hyperpolarisation der DA-induzierten Potentialänderungen wurde durch eine intrazelluläre Ca2+-Freisetzung und die Öffnung basolateral lokalisierter Ca2+-gesteuerter K+-Kanäle verur-sacht. Die DA- und 5-HT-induzierte Depolarisation hing kritisch von der Aktivität eines basolateral lokalisierten Na+-K+-2Cl--Symporters ab. GABA, TA und OA potenzierten die elektrischen Antworten der Acinuszellen, wenn diese durch SDN-Stimulierung hervorgerufen wurden. Dabei war OA wirksamer als TA. Dieses Ergebnis zeigte, dass diese Substanzen als im Drüsenkomplex präsynaptisch und erregend als Neuromodulatoren wirken. Pharmakologische Untersuchungen ergaben, dass die erregende Wirkung von GABA durch einen G-Protein-gekoppelten GABAB-Rezeptor vermittelt wurde. Messungen der durch SDN-Stimulierung induzierten Flüssigkeits- und Proteinsekretionsraten zeigten, dass beide Parameter in Anwesenheit von GABA verstärkt waren. Dies ließ auf eine verstärkte serotonerge Neurotransmission schließen, da nur 5-HT die Bildung eines Protein-haltigen Speichels verursacht. Immuncytochemische Untersuchungen zeigten, dass die Drüsen tyraminerge und octopaminerge Innervation empfangen. Weiterhin wurde der erste charakterisierte TA-Rezeptor (PeaTYR1) der Schabe auf einem paarigen, lateral zur Drüse ziehenden Nerv markiert, der auch tyraminerge Fasern enthielt. Die vorliegende Arbeit trug zum Verständnis der komplexen Funktionsweise der Speicheldrüse der Schabe bei und erweiterte das lückenhafte Wissen über die neuronale Kontrolle exokriner Drüsen in Insekten.
In der molekularen Diagnostik besteht ein Bedarf an schnellen und spezifischen Testsystemen, die entweder für die Labordiagnostik oder in Point of Care-Umgebungen eingesetzt werden können. Um dieses Ziel zu erreichen, stehen die Miniaturisierung und Parallelisierung im Mittelpunkt des Forschungsinteresses. Die führende Methode im Bereich der DNA-Analytik ist derzeit die Realtime-PCR. Dieser Technologie sind hinsichtlich der Multiplexfähigkeit technologischen Hürden gesetzt, da derzeit nur eine Analyse von maximal vier Parametern parallel in einem Versuchsansatz erfolgen kann. Microarrays stellen hingegen die benötigten Voraussetzungen zur Verfügung, um als Werkzeuge für die Multiparameteranalyse in verschiedensten Anwendungsbereichen zu dienen. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war es, Multiplex-PCRs und diagnostische Microarrays zu entwickeln, die für analytische Fragestellungen eine schnelle und zuverlässige Multiparameteranalytik ermöglichen, um die bisherigen Einschränkungen aktueller Nachweisverfahren zu vermeiden. Als Anwendungen wurden zum einen ein Nachweissystem für acht relevante Geflügelpathogene zur Überwachung in der Geflügelzucht, zum anderen ein Nachweissystem zur Identifikation potentiell allergener Lebensmittelinhaltstoffe entwickelt. Neben der Entwicklung geeigneter PCR und Multiplex-PCR-Verfahren sowie spezifischer Microarrays für die Detektion der gesuchten Zielsequenzen stand auch die weiterführende Integration von DNA-Amplifikation und Microarray-Technologie im Fokus dieser Arbeit. Die OnChip-Amplifikation stellt eine Möglichkeit dar, um DNA-Analytik und Detektion in einem Reaktionsschritt zu integrieren. Entsprechend wurden die in der Arbeit entwickelten PCR- und Multiplex-PCR-Verfahren zum Nachweis potentieller allergener Lebensmittelinhaltsstoffe für die OnChip-Amplifikation adaptiert und Reaktionsbedingungen getestet, die eine Multiparameteranalyse auf dem Chip ermöglichen. Die entwickelten OnChip-PCR-Verfahren zeigten eine hohe Spezifität sowohl in Single- als auch in der Multiplex-OnChip-PCR. Eine Sensitivität von 10 Kopien bzw. <10ppm konnte in Single-OnChip-PCRs für den Nachweis allergener Lebensmittelinhaltsstoffe gezeigt werden. In Multiplex-OnChip-PCRs konnten 10-100ppm allergene Verunreinigungen spezifisch in unterschiedlichen Lebensmitteln nachgewiesen werden. Ein weiterer Schritt in Richtung einer möglichen Verwendung im Point of Care-Bereich stellt der Einsatz eines isothermalen Amplifikationsverfahrens dar. Vorteil eines solchen Verfahrens ist die Möglichkeit, auf das ansonsten benötigte Thermocycling zu verzichten. Dies vereinfacht eine Integration der OnChip-Amplifikation in mobile Analysegeräte oder Lab on Chip-Systeme und qualifiziert das Verfahren für den Einsatz in Point of Care-Umgebungen. In dieser Arbeit wurde eine noch junge isothermale Amplifikationsmethode, die helikase-abhängige Amplifikation (HDA), hinsichtlich ihrer Eignung für die Integration auf einem Microarray getestet. Hierfür konnte die bislang erste OnChip-HDA für Einzel- und Duplex-Nachweise von Pathogenen entwickelt werden.
Biogene Amine sind kleine organische Verbindungen, die sowohl bei Vertebraten als auch bei Invertebraten als Neurotransmitter, Neuromodulatoren und/oder Neurohormone wirken. Sie bilden eine bedeutende Gruppe von Botenstoffen und entfalten ihre Wirkungen vornehmlich über die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Bei Insekten wurde eine Vielzahl von Wirkungen biogener Amine beschrieben. Das führte schon frühzeitig zur Vermutung, dass Insekten (u. a. Invertebraten) wie die Wirbeltiere ein diverses Repertoire an aminergen Rezeptoren besitzen. Für ein umfassendes Verständnis der komplexen physiologischen Wirkungen biogener Amine fehlten jedoch wichtige Informationen über die molekulare Identität der entsprechenden Rezeptorproteine und ihrer pharmakologischen Eigenschaften, ihre Lokalisation und ihre intrazellulären Reaktionspartner. Viele bei Schaben gut untersuchte (neuro)physiologische Prozesse sowie Verhaltensweisen werden durch Serotonin und Dopamin gesteuert bzw. moduliert. Über die beteiligten Rezeptoren ist jedoch bisher vergleichsweise wenig bekannt. Die Klonierung und Charakterisierung von Serotonin- und Dopaminrezeptoren der Amerikanischen Schabe P. americana ist damit ein längst überfälliger Schritt auf dem Weg zu einem umfassenden Verständnis der vielfältigen Wirkungen biogener Amine bei Insekten. Durch die Anwendung verschiedener Klonierungsstrategien konnten cDNAs isoliert werden, die für potentielle Serotoninrezeptoren und einen Dopaminrezeptor kodieren. Die Sequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu Mitgliedern der 5-HT1- und 5-HT7-Rezeptorklassen bzw. den Invertebratentyp-Dopaminrezeptoren auf. Die isolierten Rezeptoren der Amerikanischen Schabe wurden dementsprechend Pea(Periplaneta americana)5-HT1, Pea5-HT7 und PeaDop2 benannt. Das Hydropathieprofil dieser Rezeptoren postuliert das Vorhandensein der charakteristischen heptahelikalen Architektur G-Protein-gekoppelter Rezeptoren. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen typische Merkmale aminerger Rezeptoren. So sind Aminosäuren, die bedeutend für die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an GProteine sind, in den Rezeptoren konserviert. Expressionsstudien zeigten eine auffallend hohe Expression aller drei Rezeptor-mRNAs im Gehirn sowie in den Speicheldrüsen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden polyklonale Antikörper gegen den Pea5-HT1-Rezeptor sowie den PeaDop2-Rezeptor hergestellt. Der anti-Pea5-HT1-Antikörper detektiert im Homogenat von Schabengehirnen, Speicheldrüsen und Pea5-HT1-exprimierenden HEK 293-Zellen die glykosylierte Form des Rezeptors. In Gehirnschnitten markiert der anti-Pea5-HT1-Antikörper spezifisch einige Zellkörper in der Pars intercerebralis und deren Axone, welche in den Corpora cardiaca Nerv I projizieren. Der PeaDop2-Rezeptor wurde durch den spezifischen anti-PeaDop2-Antikörper in Neuronen mit Somata im anterioren Randbereich der Medulla nachgewiesen. Diese Neurone innervieren die optischen Loben und projizieren in das ventrolaterale Protocerebrum. Die intrazellulären Signalwege der heterolog exprimierten Pea5-HT1- und PeaDop2-Rezeptoren wurden in HEK 293-Zellen untersucht. Die Aktivierung des Pea5-HT1-Rezeptors durch Serotonin führt zur Hemmung der cAMP-Synthese. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der Rezeptor konstitutive Aktivität besitzt. WAY 100635, ein hoch selektiver 5-HT1A-Rezeptorantagonist, wurde als wirksamer inverser Agonist am Pea5-HT1-Rezeptor identifiziert. Der stabil exprimierte PeaDop2-Rezeptor antwortet auf eine Aktivierung durch Dopamin mit einer Erhöhung der cAMP-Konzentration. Eine C-terminal trunkierte Variante dieses Rezeptors ist eigenständig nicht funktional. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit indizieren, dass die untersuchten aminergen Rezeptoren im zentralen Nervensystems der Schabe an der Informationsverarbeitung beteiligt sind und verschiedene physiologische Prozesse in peripheren Organen regulieren. Mit der Klonierung und funktionellen Charakterisierung der ersten Serotoninrezeptoren und eines Dopaminrezeptors ist damit eine wichtige Grundlage für die Untersuchung ihrer Funktionen geschaffen worden.
In den Chloroplasten von höheren Pflanzen sind die Galaktolipide Monogalaktosyldiacylglycerol (MGDG) und Digalaktosyldiacylglycerol (DGDG) die am weitesten verbreiteten Lipide. In dieser Forschungsarbeit wurde die Funktion der DGDG Synthase DGD1, und insbesondere die Funktion des N-terminalen Bereichs dieses Enzyms in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana untersucht. Die Überexpression des N-terminalen Bereichs von DGD1 in WT-Col2 resultierte in einem reduzierten Wachstum, welches sich jedoch von der dgd1-1 Mutante unterschied. Dies legte bereits nahe, dass die Expression von N-DGD1 einen negativen Einfluss auf das Wachstum hat. Durch Studien in einem heterologen E.coli Expressionssystem konnte diese These bestätigt werden. Zellen, die ausschließlich N-DGD1 zusammen mit einer MGD Synthase aus Gurke exprimierten, waren im Wachstum stark beeinträchtigt. Nicht nur der N-terminale Bereich von DGD1, auch der N-terminale Bereich von MGD1 besitzt eine Funktion als Transitpeptid und ist somit ein wichtiger Faktor zur korrekten Lokalisierung des MGD1 Proteins. In dieser Arbeit ist es gelungen, ein Fusionskonstrukt aus N-MGD1 und DGD2 in die dgd1-1 Mutante zu transferieren und damit das reduzierte Wachstum zu komplementieren. Frühere Versuche, ein reduziertes dgd1-1 Wachstum mit DGD2 allein zu komplementieren, scheiterten. Somit gibt dies einen Hinweis darauf, dass N-MGD1 als Transitpeptid fungieren kann. Bindungsstudien zur Interaktion von DGD1 und N-DGD1 Protein zeigten, dass die polaren Lipide MGDG und DGDG in Wechselwirkung mit dem N-terminalen Bereich von DGD1 treten. Bis zum heutigen Zeitpunkt ist nicht erforscht, wie der Transport von DGDG und MGDG zwischen den Hüllmembranen des Chloroplasten erfolgt. Die in dieser Arbeit angefertigen Bindungsstudien konnten Hinweise darauf geben, dass N-DGD1 als eine Art „Antiporter“ fungiert, um MGDG und DGDG zwischen den Hüllmembranen zu transportieren. Weiterhin wurden Bindungsstudien zur Erforschung von Interaktionen der Glykosyltransferasen DGD1, DGD2, MGD1, MGD2 und MGD3 angefertigt. Dabei wurden Wechselwirkungen zwischen den Glykosyltransferasen DGD1, DGD2 und MGD2 detektiert. Interessant ist, dass Hinweise auf eine Dimerbildung bestimmter Enzyme gefunden wurden, so für DGD1 und MGD2. Ein weiterer Ansatz zur Erforschung von Wechselwirkungen von DGD1 Protein mit bis jetzt unbekannten Proteinen war die Expression von DGD1-StrepIITag und DGD1-CTAPTag Fusionsproteinen in dgd1-1 Mutanten. Es wurden für beide Tags transgene Linien generiert, die im Wachstum komplementiert waren und wildtypähnliche Mengen an DGDG akkumulierten. Die Expression der verschiedenen Tags in den Pflanzen war sehr unterschiedlich, wobei der DGD1-CTAP-Tag am stärksten exprimiert war. Mit Pflanzenmaterial dieser Linien kann nun eine Aufreinigung des getaggten Proteins und eventueller Interaktionspartner erfolgen.
Nob1 (New Zealand obese 1) bezeichnet einen Adipositas-QTL auf Chr. 5 der Maus (LODBMI >3,3), der in einem Rückkreuzungsexperiment der Mausstämme NZO (adipös) und SJL (schlank) identifiziert wurde. Um Kandidatengene für Adipositas zu finden, wurden mehr als 300 Nob1-Transkripte mit Hilfe von Genexpressionsanalysen auf Unterschiede in stoffwechselrelevanten Geweben zwischen beiden Mausstämmen untersucht. Sieben Gene zeigten eine differentielle Expression: 2310045A20Rik, Tbc1d1, Ppp1cb, Mll5, Insig1, Abhd1 und Alox5ap. Die codierenden Bereiche dieser Gene wurden anschließend auf Sequenzunterschiede zwischen NZO und SJL untersucht. Nur im Gen Tbc1d1, das im Peak-Bereich des Nob1 lokalisiert ist, wurde eine SJL-spezifische Deletion von sieben Basen detektiert, die zu einer Leserasterverschiebung und einem vorzeitigen Abbruch des Proteins in der funktionellen Rab-GAP-Domäne führt (Loss-of-Function-Mutation). Interessanterweise wurde eine Variante von TBC1D1 (R125W) in Kopplungsanalysen mit Adipositas beim Menschen assoziiert (Stone et al., 2006). TBC1D1 zeigt eine hohe Homologie zu TBC1D4 (AS160), das im Insulinsignalweg eine wichtige Rolle spielt. In 17 weiteren Genen im Peak-Bereich des Nob1 wurde keine weitere SJL-spezifischen Mutation detektiert. Bei NZO-Tieren erfolgte die Tbc1d1-mRNA-Expression vorwiegend in glycolytischen Fasern des Skelettmuskels. Zudem wurden zwei gewebsspezifisch exprimierte Tbc1d1-Isoformen identifiziert, die sich durch alternatives Splicen der Exone 12 und 13 unterscheiden. Die im Rahmen dieser Arbeit gefundenen Ergebnisse machen Tbc1d1 zu einem plausiblen Kandidatengen für den Nob1-QTL. Welche Funktion Tbc1d1 im Glucose- und Fettstoffwechsel des Skelettmuskels hat, muss in weiteren Analysen untersucht werden.
Die 11beta-HSD1 reguliert intrazellulär die Cortisolkonzentration durch Regeneration von Cortison z.B. aus dem Blutkreislauf, zu Cortisol. Daher stellt diese ein wichtiges Element in der Glucocorticoid-vermittelten Genregulation dar. Die 11beta-HSD1 wird ubiquitär exprimiert, auf hohem Niveau besonders in Leber, Fettgewebe und glatten Muskelzellen. Insbesondere die Bedeutung der 11beta-HSD1 in Leber und Fettgewebe konnte mehrfach nachgewiesen werden. In der Leber führte eine erhöhte Aktivität aufgrund einer Überexpression in Mäusen zu einer verstärkten Gluconeogeneserate. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression und erhöhte Enzymaktivität der 11beta-HSD1 im subkutanen und viszeralen Fettgewebe assoziiert ist mit Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Dyslipidämie. Über die Regulation ist jedoch noch wenig bekannt. Zur Untersuchung der Promotoraktivität wurde der Promotorbereich von -3034 bis +188, vor und nach dem Translations- und Transkriptionsstart, der 11beta-HSD1 kloniert. 8 Promotorfragmente wurden mittels Dual-Luciferase-Assay in humanen HepG2-Zellen sowie undifferenzierten und differenzierten murinen 3T3-L1-Zellen untersucht. Anschließend wurde mittels nicht-radioaktiven EMSA die Bindung des TATA-Binding Proteins (TBP) sowie von CCAAT/Enhancer-Binding-Proteinen (C/EBP) an ausgewählte Promotorregionen analysiert. Nach der Charakterisierung des Promotors wurden spezifische endogene und exogene Regulatoren untersucht. Fettsäuren modifizieren die Entstehung von Adipositas und Insulinresistenz. Ihre Wirkung wird u.a. PPARgamma-abhängig vermittelt und kann durch das Inkretin (Glucose-dependent insulinotropic Peptide) GIP modifiziert werden. So wurden die Effekte von unterschiedlichen Fettsäuren, vom PPARgamma Agonisten Rosiglitazon sowie dem Inkretin GIP auf die Expression und Enzymaktivität der 11beta-HSD1 untersucht. Dies wurde in-vitro-, tierexperimentell und in humanen in-vivo-Studien realisiert. Zuletzt wurden 2 Single Nucleotide Polymorphismen (SNP) im Promotorbereich der 11beta-HSD1 in der Zellkultur im Hinblick auf potentielle Funktionalität analysiert sowie die Assoziation mit Diabetes mellitus Typ 2 und Körpergewicht in der MeSyBePo-Kohorte bei rund 1.800 Personen untersucht. Die Luciferase-Assays zeigten basal eine zell-spezifische Regulation der 11beta-HSD1, wobei in allen 3 untersuchten Zelltypen die Bindung eines Repressors nachgewiesen werden konnte. Zudem konnte eine mögliche Bindung des TBPs sowie von C/EBP-Proteinen an verschiedene Positionen gezeigt werden. Die Transaktivierungsassays mit den C/EBP-Proteinen -alpha, -beta und -delta zeigten eben-falls eine zellspezifische Regulation des 11beta-HSD1-Promotors. Die Aktivität und Expression der 11beta-HSD1 wurde durch die hier untersuchten endogenen und exogenen Faktoren spezifisch modifiziert, was sowohl in-vitro als auch in-vivo in unterschiedlichen Modellsystemen dargestellt werden konnte. Die Charakterisierung der MeSyBePo-Kohorte ergab keine direkten Assoziationen zwischen Polymorphismus und klinischem Phänotyp, jedoch Tendenzen für eine erhöhtes Körper-gewicht und Typ 2 Diabetes mellitus in Abhängigkeit des Genotyps. Der Promotor der 11beta-HSD1 konnte aufgrund der Daten aus den Luciferaseassays sowie den Daten aus den EMSA-Analysen näher charakterisiert werden. Dieser zeigt eine variable und zell-spezifische Regulation. Ein wichtiger Regulator stellen insbesondere in den HepG2-Zellen die C/EBP-Proteine -alpha, -beta und -delta dar. Aus den in-vivo-Studien ergab sich eine Regulation der 11beta-HSD1 durch endogene, exogene und pharmakologische Substanzen, die durch die Zellkulturversuche bestätigt und näher charakterisiert werden konnten.
Ein genereller Ansatz zur Charakterisierung von biologischen Systemen bietet die Untersuchung des Metaboloms, dessen Analyse als „Metabolomics“ bezeichnet wird. “Omics”- Technologien haben das Ziel, ohne Selektionskriterien möglichst alle Bestandteile einer biologischen Probe zu detektieren (identifizieren und quantifizieren), um daraus Rückschlüsse auf nicht vorhersehbare und somit neuartige Korrelationen in biologischen Systemen zu ziehen. Ein zentrales Dogma in der Biologie besteht in der Kausalität zwischen Gen – Enzym – Metabolite. Perturbationen auf einer Ebene rufen systemische Antworten hervor, die in einem veränderten Phänotyp münden können. Metabolite sind die Endprodukte von zellulären regulatorischen Prozessen, deren Abundanz durch die Resonanz auf genetische Modifikationen oder Umwelteinflüsse zurückzuführen ist. Zudem repräsentieren Metabolite ultimativ den Phänotyp eines Organismus und haben die Fähigkeit als Biomarker zu fungieren. Die integrale Analyse verschiedenster Stoffwechselwegen wie Krebszyklus, Pentosephosphatzyklus oder Calvinzyklus offeriert die Identifikation von metabolischen Mustern. In dieser Arbeit wurden sowohl das targeted Profiling via GC-TOF-MS als auch das untargeted Profiling via GC-TOF-MS und LC-FT-MS als analytische Strategien genutzt, um biologische Systeme anhand ihrer Metabolite zu charakterisieren und um physiologische Muster als Resonanz auf endogene oder exogene Stimuli zu erkennen. Dabei standen die metabolische, phänotypische und genotypische Plastizität von Pflanzen im Fokus der Untersuchungen. Metabolische Varianzen eines Phänotyps reflektieren die genotyp-abhängige Resonanz des Organismus auf umweltbedingte Parameter (abiotischer und biotischer Stress, Entwicklung) und können mit sensitiven Metabolite Profiling Methoden determiniert werden. Diese Anwendungen haben unter anderem auch zum Begriff des „Environmental Metabolomics“ geführt. In Kapitel 2 wurde der Einfluss biotischer Interaktionen von endophytischen Bakterien auf den Metabolismus von Pappelklonen untersucht; Kapitel 3 betrachtet die metabolische Plastizität von Pflanzen im Freiland auf veränderte biotische Interaktionsmuster (Konkurrenz/Diversität/Artenzusammensetzung); Abschließend wurde in Kapitel 4 der Einfluss von spezifischen genetischen Modifikationen an Peroxisomen und den daraus resultierenden veränderten metabolischen Fluss der Photorespiration dargestellt. Aufgrund der sensitiven Analyse- Technik konnten metabolische Phänotypen, die nicht zwingend in einen morphologischen Phänotyp mündeten, in drei biologischen Systemen identifiziert und in einen stoffwechselphysiologischen Kontext gestellt werden. Die drei untersuchten biologischen Systeme – in vitro- Pappeln, Grünland- Arten (Arrhenatherion-Gesellschaft) und der Modellorganismus (Arabidopsis) – belegten anschaulich die Plastizität des Metabolismus der Arten, welche durch endogene oder exogene Faktoren erzeugt wurden.
Übergewicht und Adipositas führen zu Insulinresistenz und erhöhen deutlich das Risiko für die Entwicklung von Typ-2-Diabetes und kardiovaskulären Erkrankungen. Sowohl Adipositas als auch die Suszeptibilität gegenüber Diabetes sind zu einem erheblichen Teil genetisch determiniert. Die relevanten Risikogene, deren Interaktion mit der Umwelt, insbesondere mit Bestandteilen der Nahrung, und die Pathomechanismen, die zur Insulinresistenz und Diabetes führen, sind nicht vollständig aufgeklärt. In der vorliegenden Arbeit sollte durch Genexpressionsanalysen des weißen Fettgewebes (WAT) und der Langerhansschen Inseln die Entstehung und Progression von Adipositas und Typ-2-Diabetes untersucht werden, um relevante Pathomechanismen und neue Kandidatengene zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurden Diät-Interventionsstudien mit NZO- und verwandten NZL-Mäusen, zwei polygenen Mausmodellen für das humane metabolische Syndrom, durchgeführt. Eine kohlenhydrathaltige Hochfett-Diät (HF: 14,6 % Fettanteil) führte in beiden Mausmodellen zu früher Adipositas, Insulinresistenz und Typ 2 Diabetes. Eine fettreduzierte Standarddiät (SD: 3,3 % Fettanteil), welche die Entstehung von Adipositas und Diabetes stark verzögert, sowie eine diabetesprotektive kohlenhydratfreie Hochfett-Diät (CHF: 30,2 % Fettanteil) dienten als Kontrolldiäten. Mit Hilfe der Microarray-Technologie wurden genomweite Expressionsprofile des WAT erstellt. Pankreatische Inseln wurden durch laserbasierte Mikropräparation (Laser Capture Microdissection; LCM) isoliert und ebenfalls hinsichtlich ihres Expressionsprofils analysiert. Differenziell exprimierte Gene wurden durch Real-Time-PCR validiert. Im WAT der NZO-Maus bewirkte die HF-Diät eine reduzierte Expression nukleärer Gene der oxidativen Phosphorylierung und von lipogenen Enzymen. Dies deutet auf eine inadäquate Fettspeicherung und -verwertung in diesen Tieren hin. Die Reduktion in der Fettspeicherung und -oxidation ist spezifisch für das adipöse NZO-Modell und konnte bei der schlanken SJL Maus nicht beobachtet werden, was auf eine mögliche Beteiligung an der Entstehung der Insulinresistenz hinweist. Zusätzlich wurde bestätigt, dass die Expansion des Fettgewebes bei der adipösen NZO-Maus eine zeitlich verzögerte Infiltration von Makrophagen in das WAT und dort eine lokale Immunantwort auslöst. Darüber hinaus wurde die Methode der LCM etabliert und zur Gewinnung hochangereicherter RNA aus den Langerhansschen Inseln eingesetzt. In erstmalig durchgeführten genomweiten Expressionsanalysen wurde zu einem frühen Zeitpunkt in der Diabetesentwicklung der Einfluss einer diabetogenen HF-Diät und einer diabetesprotektiven CHF-Diät auf das Expressionsprofil von pankreatischen Inselzellen verglichen. Im Gegensatz zum WAT bewirkt die diabetogene HF-Diät in Inselzellen einerseits, eine erhöhte Expression von nukleären Genen für die oxidative Phosphorylierung und andererseits von Genen, die mit Zellproliferation assoziiert sind. Zudem wurden 37 bereits annotierte Gene identifiziert, deren differenzielle Expression mit der Diabetesentwicklung korreliert. Das Peptidhormon Cholecystokinin (Cck, 11,8-fach erhöht durch die HF) stellt eines der am stärksten herauf regulierten Gene dar. Die hohe Anreicherung der Cck-mRNA in Inselzellen deutet auf eine bisher unbekannte Funktion des Hormons in der Regulation der Inselzellproliferation hin. Der Transkriptionsfaktor Mlxipl (ChREBP; 3,8-fach erniedrigt durch die HF) stellt in Langerhansschen Inseln eines der am stärksten herunter regulierten Gene dar. Ferner wurde ChREBP, dessen Funktion als glucoseregulierter Transkriptionsfaktor für lipogene Enzyme bislang in der Leber, aber nicht in Inselzellen nachgewiesen werden konnte, erstmals immunhistochemisch in Inselzellen detektiert. Dies deutet auf eine neue, bisher unbekannte regulatorische Funktion von ChREBP im Glucosesensor-Mechanismus der Inselzellen hin. Eine durchgeführte Korrelation der mit der Diabetesentwicklung assoziierten, differenziell exprimierten Inselzellgene mit Genvarianten aus humanen genomweiten Assoziationsstudien für Typ-2-Diabetes (WTCCC, Broad-DGI-T2D-Studie) ermöglichte die Identifizierung von 24 neuartigen Diabetes-Kandidatengenen. Die Ergebnisse der erstmals am polygenen NZO-Mausmodell durchgeführten genomweiten Expressionsuntersuchungen bestätigen bisherige Befunde aus Mausmodellen für Adipositas und Diabetes (z.B. ob/ob- und db/db-Mäuse), zeigen in einigen Fällen aber auch Unterschiede auf. Insbesondere in der oxidativen Phosphorylierung könnten die Ergebnisse relevant sein für das Verständnis der Pathogenese des polygen-bedingten humanen metabolischen Syndroms.
Auf dem Weg der genetischen Information stellt die Translation der RNA in eine Aminosäuresequenz den letzten Schritt dar. In Chloroplasten, den grünen Organellen der Pflanzenzellen, findet ein Großteil der Regulation der Genexpression auf Ebene der Initiation dieses Schrittes statt. Eine Vielzahl von Eigenschaften der RNA und von Faktoren, die an die RNA binden, entfalten einen Einfluss auf diesen Schritt. Bisher unvollständig aufgeklärt ist die Rolle einer konservierten Nukleotidsequenz in der untranslatierten Region der RNA -- der Shine-Dalgarno-Sequenz. Diese stellt in Bakterien, wie z.B. E. coli als Ribosomenbindestelle sicher, dass Ribosomen den Anfang der zu translatierenden Sequenz zuverlässig erkennen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diverse DNA-Konstrukte in Plastiden von Tabak eingebracht. Hierzu zählten Konstrukte, die sowohl eine erhöhte Anzahl von Ribosomenbindestellen enthielten als auch vermehrte Startpunkte der Translation. Zusätzlich wurden Konstrukte hergestellt, die die Situation von mehreren zu translatierenden Regionen in der RNA nachstellten. Es konnte festgestellt werden, dass plastidäre Ribosomen die strangaufwärts gelegenen Translationsstartpunkte bevorzugen -- im Gegensatz zu E. coli, wo alle Startpunkte gleichmäßig genutzt wurden. Hierdurch zeigten die prokaryotischen Ribosomen aus Chloroplasten, die sich aus bakteriellen Systemen ableiten, Eigenschaften von eukaryotischen Ribosomen. Ein zweites Teilprojekt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Inkompatibilität von Chloroplasten mit dem Kerngenom. In Kreuzungen von Arten der Gattung Pelargonium fielen Kombinationen auf, bei denen die Tochterpflanzen bleiche Blattbereiche bis hin zu vollständig weißen Pflanzen zeigten. Dieses Phänomen wird als Bastardbleichheit bezeichnet. In der Gattung Pelargonium werden Chloroplasten von beiden Elternteilen an die Tochterpflanzen vererbt. Da das Phänomen der Bastardbleichheit nur in einem der Plastiden vorkommt, nicht jedoch im anderen in der gleichen Pflanze, muss von einem Effekt ausgegangen werden, der von Plastiden ausgeht. Die Interaktionen zwischen Zellkern und Chloroplasten sind offensichtlich stark gestört. Zur detaillierten Untersuchung dieses Effekts wurde die Nukleotidsequenz von drei Chloroplastengenomen aufgeklärt. Es konnte eine Reihe von Sequenzunterschieden der Genome ermittelt werden. Aus diesen wurde eine Reihe von Unterschieden beobachtet, die einen solchen Effekt zur Folge haben können. Aus diesen Unterschieden wurde eine Reihe von potentiellen Kandidatengenen zusammengestellt, die in weiteren Arbeiten auf ihre Rolle in der Entstehung der Bastardbleichheit untersucht werden.
Die ergonomische Anpassung von Produkten der körpernahen Umwelt an den menschlichen Körper in seiner gesamten Variabilität erfordert anthropometrische Grundlagen. Die vorliegende Arbeit beschreibt und analysiert die Körpermasse, 17 Längenmaße, 5 Skelettrobustizitätsmaße, 6 Korpulenzmaße, 3 Kopfmaße, 5 Handmaße, 3 Fußmaße, sowie 10 Beweglichkeitsmaße der Wirbelsäule, 8 Beweglichkeitsmaße der Hand, 2 Beweglichkeitsmaße des Beines und 7 Handkräfte von 295 Probanden der drei Altersgruppen 20 bis 29 Jahre, 50 bis 59 Jahre und 60 bis 69 Jahre. Die Untersuchungen wurden im Zeitraum von September 2006 bis April 2007 durchgeführt. Ziel der Arbeit ist es, für den überwiegenden Teil der untersuchten körperlichen Merkmale erstmals für die deutsche Bevölkerung geschlechts- und altersspezifische Mittelwerte und Variabilitätsbereiche bis zum vollendeten 70. Lebensjahr zur Verfügung zu stellen. Das gilt insbesondere für die untersuchten Beweglichkeitsmaße und Handkräfte. Erstmals werden Korrelationen zwischen der Körperform, wie sie sich im Maßzusammenhang der unterschiedlichen Körperbautypen darstellt, der Gelenkbeweglichkeit und den Handkräften vorgestellt. Darüber hinaus wird durch den Vergleich der Ergebnisse der jungen und der beiden älteren Erwachsenengruppen untersucht, welche Unterschiede zwischen den verschiedenen Altersgruppen bestehen. Im Hinblick auf die zeitliche Gültigkeit der aktuellen Untersuchungsergebnisse werden der Einfluss des säkularen Trends und der Einfluss der ontogenetischen Alternsprozesse auf Längenmaße und Korpulenzmaße diskutiert. Die Arbeit zeigt auf, dass innerhalb der untersuchten Probanden eine große Variationsbreite in den Körpermaßen auftritt. Es lassen sich typische Altersunterschiede erkennen. Die Älteren sind im Mittel kleiner, weisen jedoch größere Skelettrobustizitäts- und Korpulenzmaße auf. Die dynamischen Maße weisen auf eine geringere Beweglichkeit der Wirbelsäule, teilweise auch der Hand hin. Die Handkräfte der Frauen werden mit zunehmendem Alter geringer, bei den Männern sind die Älteren kräftiger als die jungen Erwachsenen. Die Ergebnisse deuten auf einen gegenüber früheren Generationen verzögerten Beginn von körperlichen Alterserscheinungen hin, der im Hinblick auf die steigende Lebenserwartung der Bevölkerung eingehender untersucht werden sollte.
Die Enzyme der Sulfotransferase-Gensuperfamilie (SULT) konjugieren nukleophile Gruppen von kleinen endogenen Verbindungen und Fremdstoffen mit der negativ geladenen Sulfo-Gruppe. Dadurch wird die Polarität dieser Verbindungen erhöht, ihre passive Permeation von Zellmembranen verhindert und somit ihre Ausscheidung erleichtert. Jedoch stellt die Sulfo-Gruppe in bestimmten chemischen Verbindungen eine gute Abgangsgruppen dar. Aus der Spaltung resultierende Carbenium- oder Nitreniumionen können mit DNA oder anderen zellulären Nukleophilen reagieren. In Testsystemen für Mutagenität wurden zahlreiche Verbindungen, darunter Nahrungsinhaltsstoffe und Umweltkontaminanten, durch SULT zu Mutagenen aktiviert. Dabei zeigten sich zum einen eine ausgeprägte Substratspezifität selbst orthologer SULT-Formen unterschiedlicher Spezies und zum anderen Interspezies-Unterschiede in der SULT-Gewebeverteilung. Daher könnten sich die Zielgewebe einer SULT-induzierten Krebsentstehung bei Mensch und Nager unterscheiden. Um die Beteiligung von humanen SULT an der Bioaktivierung von Fremdstoffen im Tiermodell untersuchen zu können, wurden transgene Mauslinien für den Cluster der humanen SULT1A1- und -1A2-Gene sowie für die humane SULT1B1 generiert. Zur Herstellung der transgenen Linien wurden große genomische Konstrukte verwendet, die die SULT-Gene sowie – zum Erreichen einer der Humansituation entsprechenden Gewebeverteilung der Proteinexpression – deren potentielle regulatorische Sequenzen enthielten. Es wurden je drei transgene Linien für hSULT1A1/hSULT1A2 und drei transgene Linien für hSULT1B1 etabliert. Die Expression der humanen Proteine konnte in allen Linien gezeigt werden und fünf der sechs Linien konnten zur Homozygotie bezüglich der Transgene gezüchtet werden. In der molekularbiologischen Charakterisierung der transgenen Linien wurde der chromosomale Integrationsort der Konstrukte bestimmt und die Kopienzahl pro Genom untersucht. Mit Ausnahme einer hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linie, bei der Kopien des Konstrukts in zwei unterschiedliche Chromosomen integriert vorliegen, wiesen alle Linien nur einen Transgen-Integrationsort auf. Die Untersuchung der Transgen-Kopienzahl ergab, dass die Mauslinien zwischen einer und etwa 20 Kopien des Transgen-Konstrukts pro Genom trugen. In der proteinbiochemischen Charakterisierung wurde gezeigt, dass die transgenen Linien die humanen Proteine mit einer weitgehend der des Menschen entsprechenden Gewebeverteilung exprimieren. Die Intensität der im Immunblot nachgewiesenen Expression korrelierte mit der Kopienzahl der Transgene. Die zelluläre und subzelluläre Verteilung der Transgen-Expression wurden bei einer der hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linien in Leber, Niere, Lunge, Pankreas, Dünndarm und Kolon und bei einer der hSULT1B1-transgenen Linien im Kolon untersucht. Sie stimmte ebenfalls mit der Verteilung der entsprechenden SULT-Formen im Menschen überein. Da sich die erzeugten transgenen Linien aufgrund ihrer mit dem Menschen vergleichbaren Gewebeverteilung der SULT-Expression als Modellsystem zur Untersuchung der menschlichen SULT-vermittelten metabolischen Aktivierung eigneten, wurde eine der hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linien für zwei erste toxikologische Untersuchungen eingesetzt. Den Mäusen wurden chemische Verbindungen verabreicht, für die in in-vitro-Versuchen eine hSULT1A1/hSULT1A2-vermittelte Bioaktivierung zu Mutagenen gezeigt worden war. In beiden Untersuchungen wurde die Gewebeverteilung der entstandenen DNA-Addukte als Endpunkt einer gewebespezifischen genotoxischen Wirkung ermittelt. In der ersten Untersuchung wurden 90 mg/kg Körpergewicht 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin – ein in gebratenem Fleisch gebildetes heterozyklisches aromatisches Amin – transgenen sowie Wildtyp-Mäusen oral verabreicht. Acht Stunden nach Applikation wiesen die transgenen Mäuse signifikant höhere Adduktniveaus als die Wildtyp-Mäuse in Leber, Lunge, Niere, Milz und Kolon auf. In der Leber der transgen Mäuse war das Adduktniveau 17fach höher als in der Leber der Wildtyp-Mäuse. Die Leber war bei den transgenen Tieren das Organ mit dem höchsten, bei den Wildtyp-Tieren hingegen mit dem niedrigsten DNA-Adduktniveau. In der zweiten Untersuchung (Pilotstudie mit geringer Tierzahl) wurde transgenen und Wildtyp-Mäusen 19 mg/kg Körpergewicht des polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffs 1-Hydroxymethylpyren – ein Metabolit der Nahrungs- und Umweltkontaminante 1-Methylpyren – intraperitoneal verabreicht. Nach 30 Minuten wurden, verglichen mit den Wildtyp-Mäusen, bis zu 25fach erhöhte Adduktniveaus bei den transgenen Mäusen in Leber, Niere, Lunge und Jejunum nachgewiesen. Somit konnte anhand einer in dieser Arbeit generierten transgenen Mauslinie erstmals gezeigt werden, dass die Expression der humanen SULT1A1/hSULT1A2 tatsächlich sowohl auf die Stärke als auch die Zielgewebe der DNA-Adduktbildung in vivo eine Auswirkung hat.
Die ubiquitär verbreitete Molybdänkofaktorbiosynthese ist in Escherichia coli (E. coli) bisher am umfassendsten untersucht. Bislang war jedoch nicht bekannt, welche physiologische Schwefelquelle im zweiten Schritt dieses Syntheseweges zur Bildung der charakteristischen Dithiolengruppe genutzt wird. Erste Untersuchungen deuteten auf eine der Cysteindesulfurasen E. colis hin, welche in Verbindung mit einem rhodaneseähnlichen Protein den Schwefel in Form eines Persulfids übertragen. Ähnliche Mechanismen wurden bereits in der humanen Moco-Biosynthese und der Thiaminbiosynthese identifiziert. In dieser Arbeit wurde das E. coli Protein YnjE näher charakterisiert. Es handelt sich bei YnjE um ein rhodaneseähnliches Protein aus drei Rhodanesedomänen. Durch Proteinkristallisation und anschliessender Röntgenstrukturanalyse wurde die Tertiärstruktur des YnjE-Proteins analysiert. Die hergestellten Kristalle konnten zur Gewinnung von Strukturdaten vermessen und eine Proteinkristallstruktur für YnjE berechnet werden. Desweiteren besitzt YnjE ein N-terminales Typ I Sekretionssystem abhängiges Sipnalpeptid. Durch Lokalisieungsexperimente wurde die Bedeutung des Signalpeptids für das YnjE-Protein untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass endogenes YnjE sowohl im peri- als auch im cytoplasmatischen Raum lokalisiert ist. Auf Grund von vorhergehenden Studien, wurde eine Funktion des YnjE-Proteins innerhalb der Molybdänkofaktorbiosynthese in der Schwefelübertragung auf das Protein MoaD in E. coli vermutet und deshalb in dieser Arbeit näher untersucht. Es wurde eine Interaktion des YnjE-Proteins mit dem MoeB-Protein, welches für die Thiocarboxylierung des MoaD-Proteins essentiell ist, durch Tandem-Affinitätsreinigung und Antikörper-basierte Affinitätsreinigung nachgewiesen und ein signifikanter positiver Einfluss YnjEs auf die Bildung von Molybdopterin, einer Vorstufe des Molybdänkofaktors, bestätigt. Dabei wurde sowohl der Sulfurierungsgrad des MoaD-Proteins in YnjE und Cysteindesulfurase-knock-out Mutanten untersucht, als auch die Bildung von Molybdopterin in einem in vitro Ansatz in Abhängigkeit von steigenden YnjE-Konzentrationen analysiert. Im Ergebnis kann man daraus schließen, dass der Mechanismus der Schwefelübertragung ähnlich der Thiaminbiosynthese, über eine der drei Cysteindesulfurasen CsdA, SufS oder IscS geschieht, welche Schwefel in Form eines Persulfids auf YnjE übertragen können. Thiosulfat und Mercaptopyruvat, die Substrate für die beiden Familien der rhodaneseähnlichen Proteine, Thiosulfat-Sulfurtransferasen und Mercaptopyruvat-Sulfurtransferasen, dienen nicht als Substrate für eine Persulfurierung YnjEs. Durch eine Austauschmutante des Cysteinrestes der aktiven Schleife von YnjE konnte nicht bestätigt werden, dass dieser Aminosäurerest und damit die Bildung eines YnjE-gebundenen Persulfids für die positive Beeinflussung der MPT-Synthese essentiell ist. Vielmehr kann durch diese Arbeit von einer Vermittlung der Interaktionen zwischen MoeB, IscS und der MPT-Synthase durch YnjE ausgegangen werden wobei die Cysteindesulfurase IscS den Schwefel für die Thiocarboxylierung des MoaD-Proteins liefert.
Zur Detektion neuer IgE- reaktiver Proteine wurde in dieser Arbeit ein zweidimensionales Proteintrennverfahren verwendet. Resultierende Proteinfraktionen wurden mithilfe von 18 tomatensensibiliesierten Patientenseren im Immunoblot getestet. Detektierte Proteine in der SDS-PAGE wurden mittels LC-MS/MS identifiziert. Dadurch konnten 2 Tomatensamenproteine, die im Immunoblot ein IgE- reaktives Signal zeigten eindeutig mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. Diese Proteine sind Legumin und Vicilin. Durch Sequenzabgleich und Proteinstrukturmodellierung im Vergleich zu bereits bekannten Allergenen (Erdnuss und Cashewnuss), konnte eine hohe Homologie gezeigt werden.
Die Speicheldrüsen der Schmeißfliege Calliphora vicina produzieren bei Stimulierung mit dem Neurohormon Serotonin (5-Hydroxytryptamine, 5-HT) einen KCl-reichen Primärspeichel. Der transepitheliale K+-Transport wird durch eine apikal lokalisierte vakuoläre H+-ATPase (V-ATPase) energetisiert. Stimulierung der Speicheldrüsen mit 5-HT aktiviert die apikale V-ATPase, die Protonen aus der Zelle in das Drüsenlumen transportiert. Trotz des auswärts gerichteten Protonentransportes führt die 5-HT-Stimulierung kurioserweise zu einer intrazellulären Ansäuerung. Die Ursachen dieser 5-HT-induzierten Ansäuerung waren unzureichend untersucht. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit die Identifikation aller Transporter, die an der intrazellulären pH-(pHi)-Regulation in unstimulierten Speicheldrüsen von Calliphora vicina beteiligt sind und an der Entstehung und Regulation der 5-HT-induzierten pHi-Änderungen mitwirken. Von besonderem Interesse war hierbei die funktionelle Mitwirkung der V-ATPase, deren Beteiligung an der pHi-Regulation in tierischen Zellen bisher wenig untersucht war. Wesentliche Ergebnisse dieser Arbeit waren: • Messungen des pHi-Wertes in der unstimulierten Drüse zeigten, dass vor allem die V-ATPase und mindestens ein Na+-abhängiger HCO3--Transporter an der Aufrechterhaltung des Ruhe-pHi beteiligt sind. • Zur Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Ansäuerung (NH4Cl-Vorpuls) tragen ebenfalls im Wesentlichen die V-ATPase und mindestens ein Na+-abhängiger HCO3--Transporter bei. Der Na+/H+-Antiporter hat in der unstimulierten Drüse keinen messbaren Einfluss auf den Ruhe-pHi. • Die Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Alkalisierung (Na-acetat-Vorpuls) ist Cl--abhängig, aber auch unter extremen Bedingungen waren die Zellen noch in der Lage sich vollständig von einer intrazellullären Alkalisierung zu erholen. Einen entscheidenden Anteil daran hat offenbar die hohe intrazelluläre Pufferkapazität. • Ein Na+-abhängiger Glutamat-Transporter ist per se kein pHi-regulierender Transporter, seine Aktivität hat jedoch Einfluss auf den Ruhe-pHi in der unstimulierten Speicheldrüse von Calliphora vicina. • 10 nM 5-HT induzieren in den Calliphora Speicheldrüsen eine intrazelluläre Ansäuerung. An dieser Ansäuerung ist der Na+/H+-Antiporter entscheidend beteiligt. Auch eine klare Cl--Abhängigkeit der 5-HT-induzierten Ansäuerung konnte beobachtet werden. Wahrscheinlich ist eine gekoppelte Aktivität von Na+/H+-Antiporter und Cl-/HCO3--Antiporter. • Messungen mit einem O2-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff zeigten, dass Stimulierung der Speicheldrüsen mit 5-HT die Zellatmung aktivierte. Der cAMP- und der IP3/Ca2+-Weg tragen auf komplexe Weise zu der 5-HT-induzierten Aktivierung der Zellatmung und damit auch zu den 5-HT-induzierten pHi-Änderungen bei. • Mit molekularbiologischen Untersuchungen ist es gelungen den Na+-abhängigen Glutamat-Transporter, den Na+/H+-Antiporter, die Carboanhydrase und die Untereinheit C der V-ATPase in den Calliphora Speicheldrüsen direkt nachzuweisen. Zudem konnte erstmals der direkte Nachweis für die Expression eines nH+/K+-Antiporters in den Speicheldrüsen von Calliphora vicina erbracht werden. Diese Arbeit trug ganz wesentlich zum Verständnis der pHi-Regulation in der unstimulierten und stimulierten Speicheldrüse von Calliphora vicina bei. Mechanismen die zur Aufrechterhaltung und Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Ansäuerung bzw. Alkalisierung beitragen, konnten mit pHi-Messungen und auch molekularbiologisch nachgewiesen werden. Die Mechanismen, welche die 5-HT-induzierte intrazelluläre Ansäuerung verursachen, konnten ebenfalls aufgeklärt werden. Zudem wurde an den Calliphora Speicheldrüsen eine neue optische Methode zur Messung des O2-Verbrauchs in tierischen Geweben etabliert.
In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines bifunktionellen Biosensors nach dem Vorbild eines Baukastensystems beschrieben. Das Ziel wird durch die Kombination verschiedenster molekularer Erkennungselemente erreicht. Solche molekularen Erkennungselemente im verwendeten System sind: • Propidium und die periphere anionische Bindungsstelle der Acetylcholinesterase (AChE) • Organophosphate und das aktive Zentrum der AChE • ein an die AChE gekoppeltes Hapten und das Epitop eines Antikörpers • ein an die AChE gekoppeltes Hapten, das als Ligand ein weiteres Enzym bindet Neben dem molekularen Erkennungselement wird ein Biosensor ebenso durch die Art des Transducers charakterisiert. Hier werden Quarzplättchen mit Goldelektroden zur Signalumwandlung eingesetzt. Die Verwendung solcher Sensoren mit einem EQCM-Gerät (electrochemical quartz crystal microbalance) ermöglicht es zwei Messsignale gleichzeitig aufzunehmen: die piezoelektrische Bestimmung einer Massebeladung und die amperometrische Detektion von Enzymaktivität auf der Sensoroberfläche. Für die Analytik stehen somit zwei verschiedene Assay-Varianten zur Verfügung: die Bestimmung der Inhibition der ACHE-Aktivität und ein Bindungstest über das Hapten. Die Basis beider Tests ist die Modifizierung der piezoelektrischen Kristalle mit Propidium – einem reversiblen Inhibitor der Acetylcholinesterase. Dies ermöglicht die Beladung des Sensors mit AChE über die Wechselwirkung mit der peripheren anionischen Bindungsstelle des Enzyms. Die Aktivität der so immobilisierten AChE und die Inhibition durch Organophosphate (Pestizide) werden amperometrisch bestimmt. Durch die chemische Kopplung eines Hapten an die Cholinesterase wird ein weiteres Erkennungselement eingeführt. Das eröffnet die Möglichkeit, an die auf dem Propidium-modifizierten Sensor immobilisierte, haptenisierte Cholinesterase einen Antikörper zu binden. Als Voraussetzung für elektrochemische Bestimmung der AChE-Aktivität wurde zunächst die Optimierung der amperometrischen Messmethode vorgenommen. Die Oxidatationspotentiale für die Detektion von Thiocholin wurden im Bereich von 150 mV bis 300 mV variiert. Dabei wurde für die nachfolgenden Untersuchungen eine Arbeitspotential von 200 mV (vs. Ag/AgCl) festgelegt, da hier das beste Verhältnis von gemessenem Oxidationsstrom und Langzeitstabilität der Propidium-modifizierten Sensoren erzielt wurde. Dieses Potential war deutlich geringer als die bisher publizierten Mediator-freien AChE-Biosensoren. Es wurde ein Vergleich verschiedener Organophosphate über ihre Inhibitionskonstanten durchgeführt, um diejenigen herauszufinden, die möglichst schnell mit dem aktiven Zentrum der Acetylcholinesterase reagieren. Das verwendete Messsystem beruht nicht auf der Vorinkubation der AChE und damit einer Einstellung des Inhibitionsgleichgewichts. Stattdessen wurde die Inhibition der AChE direkt im Fließsystem verfolgt. Daher war eine schnelle Inhibitionskinetik für einen empfindlichen Organophosphat-Nachweis erforderlich. Da einige Inhibitoren nur als Phosphothionat vorlagen, wurde die Überführung dieser Substanzen in die entsprechenden Oxo-Formen mittels N-Bromsuccinimid untersucht. Die NBS-Aktivierung wurde erfolgreich durchgeführt, die erwartete Inhibitionsstärke konnte jedoch aufgrund hydrolytischer Vorgänge nicht erreicht werden. Untersuchungen mit Diisopropylfluorophosphat (DFP) und Chlorpyriphos-oxon (CPO) konnten die Voruntersuchungen über die Inhibitionskinetik in Bezug auf die erreichten Nachweisgrenzen von 2E-06 M für DFP und 5E-08 M für CPO bestätigen. Für die chemische Modifizierung der Acetylcholinesterase wurde zunächst 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) als Hapten ausgewählt. 2,4-D wird als Herbizid eingesetzt und in der EU über die Gewässerschutzrichtlinie reguliert. 2,4-D konnte in unterschiedlichen molaren Verhältnissen von 2,6 : 1 bis 260 : 1 (2,4-D : AChE) nach Aktivierung mit einem Norbornendicarboximido-Derivat an die AChE gekoppelt werden. Dabei konnte die spezifische Aktivität der Acetylcholinesterase erhalten und die Bindung eines anti-2,4-D-Antikörpers ermöglicht werden. Zur Verstärkung des piezolelektrischen Signals der Antikörperbindung wurden die Immunoglobuline zunächst an Goldnanopartikel gekoppelt. Damit konnte eine Verstärkung um den Faktor 10 erreicht werden. Allerdings waren die Antikörper-modifizierten Goldnanopartikel nicht langzeitstabil. Daher wurden auch Silica-Nanopartikel als Matrix für die Antikörperkopplung getestet. Mit diesem System konnte eine Verstärkung um den Faktor von 5 bis 13 je nach Grad der Beladung den Nanopartikel mit Antikörper bestimmt werden. Die hohe unspezifische Bindung der Antikörper-Nanopartikel-Konjugate an den Propidium-modifizierten QCM-Sensor konnte keinen empfindlichen 2,4-D-Nachweis ermöglichen. Als Alternative wurde Kokain (Benzoylecgonin, BZE) als Hapten an die Aceytlcholinesterase gekoppelt. Da Kokain selbst auch als Inhibitor im aktiven Zentrum der AChE binden kann, wurden zwei verschiedene Strategien zur Konjugatsynthese verfolgt. Durch Zugabe von Kokain während der Kopplung sollte die kovalente Fixierung des Kokain-Derivats BZE-DADOO im aktiven Zentrum verhindert werden (Konjugat B). In der Tat konnten mit dieser Synthesestrategie 67% der spezifischen Cholinesterase-Aktivität erhalten werden, während im Kokain-freien Ansatz (Konjugat A) nur 2% der Ausgangsaktivität wiedergefunden wurden. Das BZE-AChE-Konjugat ermöglichte auch die Untersuchung der Bindungskinetik der anti-BZE-Antikörper. Dabei konnte eine Assoziationsgeschwindigkeitskonstante ka von 12911 l/(mol•s) berechnet werden. Dieser Wert ist trotz der vergleichsweise geringen Oberflächenbeladung vergleichbar mit den in der Literatur angegebenen Werten. Die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante ist mit 2,89E−3 1/s um den Faktor 30 höher als der Literaturwert. Diese Abweichung ist auf Unterschiede im Bindungsmodell zurückzuführen. Mit beiden BZE-AChE-Konjugaten konnte ein kompetetiver Immunoassay mit Kokain im Fließsystem durchgeführt werden. Dabei zeigte sich für beide Konjugate ein ähnlicher Testmittelpunkt: IC50 = 4,40E−8 mol/l für Konjugat A bzw. IC50 = 1,77E−8 mol/l für Konjugat B. Diese Werte sind vergleichbar zu bereits publizierten Kokainassays im Fließsystem. Wie vorstehend beschrieben, bindet Kokain als Inhibitor auch im aktiven Zentrum von Cholinesterasen. Diese Eigenschaft wurde genutzt, um ein zweites Enzym – Butyrylcholinesterase (BChE) – an die BZE-AChE zu binden. Die Spezifität dieser Bindung konnte durch die Abwesenheit einer Affinität der BChE zum Propidium und durch die Blockierbarkeit der Bindung von BChE und BZE-AChE durch Kokain nachgewiesen werden. Damit konnte erfolgreich die Kombination mehrere molekularer Erkennungselemente demonstriert werden. Die Propidium-Plattform ermöglicht den Aufbau einer Architektur aus verschiedenen Cholinesterasen, die über unterschiedliche Bindungsstellen wechselwirken. Sowohl freie als auch BZE-modifizierte AChE können über die Affinität zum Propidium auf dem EQCM-Sensor immobilisiert werden. Mit Kokain als Substrat der Butyrylcholinesterase kann Benzoylecgonin nicht nur als Epitop für die Bindung eines Antikörpers, sondern auch als Erkennungselement für die BChE genutzt werden. Auf der anderen Seite erschwert die geringe Affinität der BChE im Gegensatz zum anti-BZE-Antikörper den Einsatz dieses Systems für analytische Zwecke. Durch die Verwendung anderer Ligand-Enzym-Kombinationen läßt sich das in dieser Arbeit vorgestellte Konzept noch weiter ausbauen und ermöglicht damit eine Entwicklung ausgehend von „einfachen“ molekularen Erkennungselementen (MRE) hin zu „multifunktionellen“ Erkennungselementsystemen. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass der Aufbau solch komplexe Systeme möglich ist, ohne Abstriche in Bezug auf die Empfindlichkeit der einzelnen Assays hinzunehmen.
Die vakuoläre Protonen-ATPase, kurz V-ATPase, ist ein multimerer Enzymkomplex, der in fast jeder eukaryotischen Zelle zu finden ist und den aktiven elektrogenen Transport von Protonen über Membranen katalysiert. Die Aktivität der V-ATPase ist essentiell für eine Vielzahl physiologischer Prozesse. Ein grundlegender Mechanismus zur Regulation der V-ATPase-Aktivität ist die reversible Dissoziation des Holoenzyms in den integralen VO-Komplex, der als Protonenkanal dient, und den cytosolischen V1-Komplex, der ATP hydrolysiert und somit den Protonentransport energetisiert. Die Untereinheit C, die im dissoziierten Zustand der V-ATPase als einzige Untereinheit isoliert im Cytoplasma vorliegt, scheint bei der Bildung des aktiven Holoenzyms eine Schlüsselrolle zu übernehmen. In den Speicheldrüsen der Schmeißfliege Calliphora vicina ist die V-ATPase an der Speichelsekretion beteiligt. In den sekretorischen Zellen wird die Bildung des V-ATPase-Holoenzyms in der apikalen Plasmamembran durch das Neurohormon Serotonin (5-HT) stimuliert. Der Effekt von 5-HT auf die V-ATPase wird intrazellulär durch die Proteinkinase A (PKA) vermittelt und hält nur für die Dauer der Stimulierung an. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels Phosphoproteinfärbungen und 2D-Elektrophorese nachgewiesen, dass infolge einer Stimulierung der Drüsenzellen mit 5-HT die Untereinheit C der V-ATPase durch die PKA reversibel phosphoryliert wird. Die Phosphorylierung geht einher mit einer Umverteilung der Untereinheit C aus dem Cytoplasma zur apikalen Plasmamembran und der Bildung des aktiven Holoenzyms. Immuncytochemische Untersuchungen zeigten, dass die katalytische Untereinheit der PKA ebenfalls umverteilt wird und in stimulierten Zellen im Bereich der apikalen Plasmamembran konzentriert vorliegt. Um herauszufinden welche Proteinphosphatase der PKA entgegenwirkt, wurden luminale pH-Messungen durchgeführt und der Effekt von spezifischen Proteinphosphatase-Inhibitoren und veresterten Komplexbildnern zweiwertiger Kationen auf die V-ATPase-Aktivität untersucht. Diese Messungen führten zu der Schlussfolgerung, dass eine Proteinphosphatase des Typs 2C an der Inaktivierung der V-ATPase beteiligt ist. Mit weiteren Phosphoproteinfärbungen konnte gezeigt werden, dass die Dephosphorylierung der Untereinheit C ebenfalls durch eine Proteinphosphatase 2C katalysiert wird und dies vermutlich die Dissoziation des VO- und V1-Komplexes begünstigt. Darüber hinaus konnte durch luminale pH-Messungen und ergänzende biochemische Untersuchungen eine Calcineurin-vermittelte Modulation des cAMP/PKA-Signalweges durch den parallel aktivierten IP3/Ca2+-Signalweg und damit einhergehend eine Beeinflussung der V-ATPase-Aktivität durch den [Ca2+]-Spiegel nachgewiesen werden.
Biosensoren werden oft für die Messung einzelner Substanzen in komplexen Medien verwendet, wie z.B. bei der Blutzuckerbestimmung. Sie bestehen aus einem physikochemischen Sensor, dem Transduktionselement, und einer darauf immobilisierten biologischen Komponente, dem Erkennungselement. In dieser Arbeit wurde als Transduktionselement eine Elektrode und als Biokomponente das Enzym „Meerrettich Peroxidase“ (engl. horseradish peroxidase, HRP) verwendet. Solche HRP-Elektroden werden für die Messung von Wasserstoffperoxid (H2O2) eingesetzt. H2O2 wird im Körper von weißen Blutkörperchen produziert, um Bakterien abzutöten, wird teilweise ausgeatmet und kann in kondensierter Atemluft nachgewiesen werden. Da viele weiße Blutkörperchen bei einer Chemotherapie abgetötet und dadurch die Patienten anfälliger für Infektionen werden, muss ihre Anzahl regelmäßig überwacht werden. Dazu wird zurzeit Blut abgenommen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine Überwachung der Anzahl an weißen Blutkörperchen ohne Blutabnahme durch eine H2O2-Messung erfolgen kann. Ein direkter Zusammenhang zwischen der ausgeatmeten H2O2-Menge und der Zahl der weißen Blutkörperchen konnte dabei nicht festgestellt werden. Für empfindliche H2O2-Messungen mit einer HRP-Elektrode ist ein schneller Austausch von Elektronen zwischen der Elektrode und dem Enzym notwendig. Eine Vorraussetzung dafür ist eine kurze Distanz zwischen dem aktiven Zentrum des Enzyms und der Elektrodenoberfläche. Um einen kurzen Abstand zu erreichen wurden im zweiten Teil dieser Arbeit verschiedene poröse graphitähnliche Materialien aus pyrolysierten Kobalt-Porphyrinen für die Elektrodenherstellung verwendet. Dabei stellte sich heraus, dass eines der untersuchten Materialien, welches Poren von etwa der Größe eines Enzyms hat, Elektronen etwa 200mal schneller mit dem Enzym austauscht als festes Graphit. Die HRP selbst enthält in seinem aktiven Zentrum ein Eisen-Protoporphyrin, also ein aus vier Ringen bestehendes flaches Molekül mit einem Eisenatom im Zentrum. Reagiert die HRP mit H2O2, so entzieht es dem Peroxid zwei Elektronen. Eines dieser Elektronen wird am Eisen, das andere im Ringsystem zwischengespeichert, bevor sie an ein anderes Molekül oder an die Elektrode weitergegeben werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Eisen durch Osmium ausgetauscht. Das so veränderte Enzym entzieht Peroxiden nur noch ein Elektron. Dadurch reagiert es zwar langsamer mit Wasserstoffperoxid, dafür aber schneller mit tert-Butylhydroperoxid, einem organischen Vertreter der Peroxid-Familie.
Die vorliegende Dissertation behandelt die Ökologie von Cnidium dubium (Schkuhr) Thell. (Sumpf-Brenndolde), Gratiola officinalis L. (Gottes-Gnadenkraut) und Juncus atratus Krocker (Schwarze Binse), drei gefährdeten Arten, die als sogenannte Stromtalpflanzen in Mitteleuropa in ihrem Vorkommen eng an die Flussauen gebunden sind. Die Arbeit basiert auf verschiedenen Simulationsexperimenten und Feldstudien in der Unteren Havelniederung, einem „Feuchtgebiet von internationaler Bedeutung“. Sie behandelt Themenkomplexe wie das Samenbankverhalten, die Samenkeimung, die Stickstofflimitierung, die Konkurrenzkraft, das Verhalten der Pflanzen nach einer Sommertrockenheit und nach einer Winter/Frühjahrsüberflutung. Ferner widmet sie sich der Populationsbiologie der Arten und dem Verhalten der Pflanzen nach besonderen Störungsereignissen wie Mahd, Herbivorie und der Sommerflut 2002. Der Leser erfährt, wie die Pflanzen in verschiedenen Lebensphasen auf die auentypische Umwelt reagieren und erhält umfassende Einblicke in physiologische Mechanismen, die der Anpassung an die typischen Bedingungen einer mitteleuropäischen Flussaue dienen. Eine Interpretation der Ergebnisse zeigt auf, welche der spezifischen Eigenschaften zur Gefährdung der drei Stromtalarten beitragen. Die Arbeit ist für den Arten-, Biotop- und Landschaftsschutz interessant. Darüber hinaus bietet sie zahlreiche Anknüpfungspunkte zur ökophysiologischen Grundlagenforschung. Die verstärkte Nutzung physiologischer Methoden bei der Klärung ökologischer Fragestellungen wird angeregt.
Homogene Immunoassays sind immunologische Testverfahren, bei deren Durchführung vollständig auf Separations- und Waschschritte verzichtet werden kann. Der Substrate Channeling Immunoassay beruht auf der Weitergabe eines Substrates in einem immunologischen Komplex aus zwei Enzymen. Das Produkt des ersten Enzyms dient dem zweiten Enzym als Substrat zur Generierung eines photometrisch nachweisbaren Produktes. Voraussetzung für diese Weitergabe ist die enge räumliche Nähe beider Enzyme. Diese Nähe wird durch eine Bindung zwischen Analyt und anti-Analyt Antikörper vermittelt. Ein solcher Substrate Channeling Immunoassay wurde unter Verwendung der Enzyme Glucoseoxidase und Peroxidase aufgebaut. Das so etablierte System war funktionstüchtig, jedoch blieb seine Sensitivität hinter der normaler, heterogener Immunoassays zurück. Die Grundlage eines Fluorescence Quenching Immunoassays ist der gegenseitige Ausschluß zweier Antikörper bei der Bindung eines Dihapten-Konjugates. Das Konjugat besteht dabei aus dem Analyten und einem Fluorophor. Die beiden um die Konjugatbindung konkurrierenden Antikörper sind ein anti-Analyt Antikörper und ein anti-Fluorophor Antikörper, der zudem über die Eigenschaft verfügt, bei Bindung des Fluorophors dessen Fluoreszenz zu löschen. Externe Gaben des freien Analyten verschieben das eingestellte Gleichgewicht in Richtung Fluorophor-Bindung und damit Fluoreszenz-Löschung. Die Änderung der Fluoreszenz ist direkt an die Konzentration des freien Analyten gekoppelt und dient zu deren Bestimmung. Ein solcher Fluorescence Quenching Immunoassays wurde für die Konzentrationsbestimmung des Herbizides Diuron etabliert. Die erreichten Sensitivitäten erlauben die praktische, immundiagnostische Anwendung des Systems. Ein Dihapten-Konjugat wurde ebenfalls zum Aufbau eines Verfahrens zur Selektion Antikörper produzierender Zellen eingesetzt. Die Selektion der Antikörper produzierenden Zellen erfolgt unter Verwendung eines Toxinkonjugates. Dieses Konjugat besteht aus einem Liganden und einem Toxin. Die Antikörperbindung des Liganden behindert sterisch die Wechselwirkung der Toxinkomponente im Konjugat mit deren Zielstruktur in oder auf der Zelle. Nur Zellen die einen geeigneten Antikörper sezernieren, überleben die Selektion und reichern sich in der Kultur an. Das Selektionsverfahren wurde erfolgreich für die Selektion von E.coli Zellen eingesetzt, die einen rekombinanten, Fluorescein bindenden Antikörper produzierten. Das hierfür synthetisierte Toxinkonjugat bestand aus Fluorescein (Ligand) und Ampicillin (Toxinkomponente). Eine Ablösung der bisher für diese Aufgabe gebräuchlichen, außerordentlich kostenintensiven, Screening Methoden wird damit möglich.
Phytol aus dem Chlorophyllabbau ist limitierend für die Tocopherol (Vitamin E)-Synthese Als Bestandteil von Chlorophyll ist Phytol das am häufigsten vorkommende Isoprenoid in der Biosphäre. Große Mengen an Chlorophyll werden jährlich degradiert und dabei wird Phytol freigesetzt, über dessen Verbleib jedoch wenig bekannt ist. Es sollte der Nachweis erbracht werden, dass im Zuge des Chlorophyllabbaus hydrolysiertes Phytol Eingang in die Synthese anderer Phytylderivate findet. Während der Gehalt an Tocopherol, Chlorophyll und Fettsäurephytylester entwicklungs- bzw. seneszenzabhängig ist, bleibt der Gehalt an Phyllochinon etwa gleich. Auch in Samen ist der Gehalt von Tocopherol, Chlorophyll und Fettsäurephytylester entwicklungsabhängig. Es wurde gefolgert, dass nur die Synthesen von Tocopherol und Fettsäurephytylester während des Chlorophyllabbaus stimuliert werden. Daher sollten Mutanten analysiert werden, welche im Chlorophyllabbau inhibiert sind. Da Chlorophyllase den ersten Schritt des Chlorophyllabbaus katalysiert, wurden zwei unabhängige T-DNA-Insertionsmutanten für Chlorophyllase1 (CHL1) und eine T-DNA-Insertionsmutante für Chlorophyllase2 (CHL2) identifiziert und eine chl1-1chl2-Doppelmutante erzeugt. Die Analyse der Chlorophyllidanteile ergab eine im Vergleich zum Wildtyp starke Reduktion in den chl1-Mutanten, während der Chlorophyllidanteil von chl2 ähnlich hoch dem Wildtyp ist. Der Chlorophyllidanteil sich entwickelnder chl1-1chl2-Pflanzen nahm in der Seneszenz zu. Die Chlorophyllasemutanten zeigten kein verändertes Seneszenzverhalten im Vergleich zu den Wildtypen. Ferner konnte in den chl1-Linien nur geringfügig weniger Tocopherol und Fettsäurephytylester als in den Wildtypen nachgewiesen werden. Auch der Tocopherolgehalt der Samen war in den Chlorophyllasemutanten unverändert zu den Wildtypen. Aufgrund dessen wurde gefolgert, dass neben den Chorophyllasen CHL1 und CHL2 weitere Chlorophyllhydrolasen in Samen und Blättern von Arabidopsis existieren. Daher wurde auf andere Mutanten zurückgegriffen, in denen der Chlorophyllabbau stark inhibiert ist und die Seneszenz nach Dunkelinkubation im Vergleich zum Wildtyp deutlich verzögert ist. Eine deutliche Korrelation zwischen vermindertem Chlorophyllabbau und Gehalt an Tocopherol und Fettsäurephytylester konnte in den staygreen-Mutanten pao1 und zwei unabhängigen SGR (staygreen)-RNAi-Linien nachgewiesen werden. Damit konnte eindeutig gezeigt werden, dass die Synthese von Tocopherol und der Fettsäurephytylester durch die Chlorophyllhydrolyse induziert wird. Es wurde gefolgert, dass vor allem unter Seneszenz- bzw. Stressbedingungen dieser alternative Syntheseweg von Phytol eine Rolle spielt. Dennoch kommt der Phytylsynthese durch die de novo-Isoprenoidsynthese auch eine Bedeutung zu. Nach Behandlung von stickstoffmangelgestressten Wildtyppflanzen mit dem Inhibitor Fosmidomycin, welcher die plastidäre de novo-Isoprenoidsynthese hemmt, war der Tocopherolgehalt gegenüber stickstoffmangelgestressten Kontrollpflanzen stark reduziert. Ferner konnte eine T-DNA-Insertionsmutante der Geranylgeranylreduktase (GGR) identifiziert werden. Diese Mutante kann nur auf Nährmedium überleben, hat nur wenige grüne Blätter und bildet keine Samen. Es konnte kein Phyllochinon, Chlorophyll und keine Fettsäurephytylester, jedoch geringe Mengen Tocopherol nachgewiesen werden. Der Resttocopherolgehalt wird auf die Nebenaktivität einer anderen Reduktase zurückgeführt. Weiterhin wurde nur das Geranylgeranylderivat des Chlorophylls identifiziert. Diese Ergebnisse erlauben den Schluss, dass die phytylgruppenübertragenen Enzyme der Tocopherol-, Phyllochinon- und Fettsäurephytylestersynthese eine hohe Substratspezifität für die Phytylgruppe aufweisen. Nach Fütterung von Phytol konnte in ggr Tocopherol und Chlorophyll bestimmt werden. Aufgrund dessen kann gefolgert werden, dass Chlorophyllsynthetase aus Arabidopsis sowohl Geranylgeranyl-, als auch Phytylpyrophosphat als Substrat nutzen kann und damit ein breiteres Substratspektrum aufweist.
Effekte einer reduzierten Dosis von Pflanzenschutzmitteln auf tritrophische Systeme im Ackerbau
(2007)
Chemische Pflanzenschutzmittel (PSM) bekämpfen nicht nur Schadorganismen, sondern haben aufgrund ihrer hohen Toxizität auch negative Auswirkungen auf Nicht-Ziel-Organismen. Die Fragestellung der Arbeit war es, ob mit reduzierten Anwendungen von PSM ihr Gefährdungspotenzial für Prädatoren von Schädlingen verringert und dadurch das Potenzial der natürlichen Schädlingsregulation erhöht wird. In dreijährigen Freilanduntersuchungen wurden die Effekte einer dauerhaft reduzierten Dosis von chemischen PSM auf die ökologische Situation im Ackerbau anhand von drei Fallbeispielen in einem konventionell bewirtschafteten Betrieb in der Magdeburger Börde untersucht. Drei über 15 ha große Felder wurden dauerhaft in zwei Teilflächen geteilt, wobei eine Teilfläche mit der vom Landwirt gewünschten Dosis (100 %-Variante) und die andere mit jeweils genau der halben Dosis (50 %-Variante) behandelt wurde. Mittels dieser Halbfelder-Vergleiche wurden die ökologischen Situationen bezüglich des Auftretens von Blattläusen und ihren Prädatoren sowie Unkräutern vor und nach der jeweiligen PSM-Behandlung aufgenommen und ökonomische Parameter ermittelt. Ergänzend wurden im Labor Modellgefäßversuche mit abgestuften Dosierungen von Insektiziden und Herbiziden durchgeführt. Die Insektizidbehandlung übte einen großen Einfluss auf die Blattläuse und ihre Prädatoren aus, während alle vorherigen Herbizid- und Fungizidbehandlungen zu keinen Unterschieden in der Abundanz der Blattläuse und ihrer Prädatoren zwischen beiden Varianten hervorriefen. Die reduzierte Insektiziddosis führte zu keiner guten Blattlauskontrolle, während die Abundanz der blattlausspezifischen Prädatoren positiv beeinflusst wurde. Die Araneae reagierten auf die reduzierte Dosis mit einer teilweise erhöhten Aktivitätsdichte und Artendiversität. Dagegen waren diesbezüglich keine eindeutigen Effekte auf die Carabidae festzustellen. Es traten keine strukturellen Veränderungen in Form einer erhöhten Unkrautdichte durch die reduzierte Herbiziddosis auf. Erste Hinweise auf mögliche langfristige Auswirkungen einer dauerhaft reduzierten PSM-Anwendung konnten nur bei der Verunkrautung und der Aktivitätsdichte der Araneae beobachtet werden. Blattläuse profitierten demnach mehr von der reduzierten Anwendung der PSM als ihre Prädatoren, so dass zwar das Potenzial der natürlichen Blattlausregulation erhöht, die Selbstregulation aber nicht verbessert wurde. Die geschonten Prädatoren schafften es nicht, die vorhandene Restpopulation der Blattläuse zu reduzieren. Dagegen konnte in den Laborversuchen gezeigt werden, das schon bei deutlich reduzierten Insektiziddosen eine ausreichende Blattlausbekämpfung möglich ist und eine weitere Einsparung durch Ausnutzung der natürlichen Regulation durch Prädatoren erreicht werden kann. Allerdings ist eine Übertragung der Ergebnisse von Laboruntersuchungen auf Freilandbedingungen schwierig. Es kann zu einer Überschätzung der Prädatorleistung führen.
Biogene Amine sind eine Substanzklasse, die bei Vertebraten und Invertebraten eine wichtige Komponente des endokrinen Systems darstellen. Sie binden an spezifische Rezeptoren der Gruppe der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. In dieser Arbeit wurden zwei neue Rezeptoren aus der Schabe Periplaneta americana kloniert. Durch verschiedene Ansätze konnten zwei vollständige cDNA-Sequenzen isoliert werden. Die Aminosäuresequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu bereits bekannten Tyraminrezeptoren aus Locusta/Bombyx bzw. zu Dopaminrezeptoren aus Apis/Drosophila auf. Entsprechend wurden diese Rezeptoren Pea (P. americana) TYR1 und PeaDOP2 genannt. Deutliche Hinweise auf ihre Funktion lassen sich an den abgeleiteten Aminosäuresequenzen ablesen. Aminosäuren, die wichtig bei der Bildung der Bindungstasche, der Rezeptoraktivierung und der Kopplung eines G-Proteins sind, treten bei beiden Rezeptoren auf. Sequenzalignments stellen die Rezeptoren in die Gruppe anderer Tyraminrezeptoren bzw. der Invertebraten-Typ Dopaminrezeptoren. Das Transkript der beiden Rezeptoren konnte durch RT-PCR in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden. Ein Ziel der Arbeit war die Gewinnung eines polyklonalen Antiserums gegen PeaTYR1. Dieses Serum detektiert im Homogenat von Gehirnen mehrere Banden, darunter auch eine mit der kalkulierten Masse von PeaTYR1. Präabsorption des Serums mit dem Peptid, welches zur Reinigung verwendet wurde, zeigt dessen Spezifität. An Gehirnschnitten markiert das Serum große Teile des Protocerebrums aber auch feinere Strukturen der Antennalloben, der optischen Loben und des Zentralkomplexes. Ein weiteres Serum gegen Tyramin führte zu einer Markierung von mehreren Neuronengruppen, welche sich in die optischen Loben und den Zentralkomplex verzweigen. Der αPeaTYR1-CPL3 Antikörper markierte die Plasmamembran von transfizierten HEK293-Zellen. Die Lokalisierung von Rezeptor und Ligand deuten darauf hin, dass Tyramin die optische und olfaktorische Wahrnehmung beeinflussen könnte.
Im Rahmen der Untersuchung zur Entwicklung der pelagischen Gemeinschaft des ehemals sauren Tagebauseenkomplexes Goitsche (pH~3) während dessen Flutung und Neutralisierung wurden Wechselwirkungen zwischen der Zusammensetzung von Organismengemeinschaften und der Variabilität des abiotischen Umfeldes untersucht.Im Mittelpunkt standen zwei von ihrer Kausalität her unterschiedliche Aspekte: • Der erste Aspekt betraf die Reifung von Ökosystemen: War der Reifungsprozess von pelagischen Gemeinschaften anhand der von Odum (1969) formulierten Kriterien zur Energetik der Gemeinschaft, zu den Nährstoffkreisläufen sowie zu strukturellen Merkmalen auf Ökosystem- und Individuenebene zu erfassen? Führten der physiologische Stress durch den niedrigen pH und physikalische Störungen der Schichtung durch das einströmende Flutungswasser zu einer Umkehr des Reifungsprozesses? Auf welchen Organisationsebenen der Lebensgemeinschaften waren die Auswirkungen dieser Stressoren erkennbar? • Der zweite Aspekt behandelte die Entwicklung der Artenzahl, die Gleichverteilung der Dominanz von Arten (Eveness) und die Diversität von Planktongemeinschaften entlang des Produktivitätsgradienten. Speziell wurde untersucht, ob die Artenzahl und die Diversität eine monoton positive oder eine unimodale Funktion der Produktivität waren und ob die Eveness eine monoton abnehmende Funktion der Produktivität war. Zur besseren Vorhersagbarkeit der Entwicklung dieser Indizes wurden in einem nächsten Schritt zusätzliche biotische und abiotische Faktoren (z.B. Konsumenteneffekte, physikalische Störung, Immigration) berücksichtigt. Zuletzt wurde die Hypothese getestet, dass unter dem Einfluss von extremem physiologischem Stress keine Abhängigkeit zwischen den betrachteten Indizes und der Produktivität von Ökosystemen besteht. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit führten zu folgenden Ergebnissen und Schlussfolgerungen: 1) Der Reifungsprozess der Planktongemeinschaft war unter neutralen Bedingungen nicht eindeutig an einzelnen Kriterien festzumachen. Vielmehr schienen idiosynkratische Effekte einzelner Arten auf die Zusammensetzung und Funktion der Organismengemeinschaft von Bedeutung. Coenobiumbildende Kieselalgen sowie größere Cladoceren und Copepoden dominierten sehr rasch die Planktongemeinschaft und vermittelten den Eindruck eines reifen Ökosystems fast unmittelbar nach der Neutralisierung des Tagebausees. 2) Der Einfluss von physiologischem Säurestress und physikalischer Störung der Schichtung durch das eintretende Flutungswasser war gegenüber einem neutralen, ungestörten Teilbecken des Tagebausees (Referenzzustand) eindeutig zu erkennen. Die isolierte Betrachtung der Wirkung der Stressoren lieferte hinsichtlich fast aller Kriterien Anzeichen einer Verjüngung des Systems sensu Odum (1969, 1985). 3) Im betrachteten Ökosystem existierte eine Hierarchie innerhalb der Stressoren. Der Einfluss des Säurestresses dominierte gegenüber dem Einfluss der physikalischen Störung, wahrscheinlich indem er die Reaktionsmöglichkeiten der Planktongemeinschaft einschränkte. 4) Für Primärproduzenten war die Artenzahl eine monoton positive Funktion der realisierten Biomasse (einem Surrogatparameter für die Produktivität des Systems). Die Eveness war eine monoton negative Funktion der Produktivität. Die beobachtete unimodale Beziehung zwischen der Diversität und der Produktivität der Primärproduzenten muss als eine Folge der mathematischen Formulierung dieser Indizes betrachtet werden. 5) Die Ergebnisse multivariater Modelle zur Vorhersage der Artenzahl und der Eveness der Primärproduzenten in Abhängigkeit zusätzlicher erfassbarer biotischer und abiotischer Faktoren ermöglichten eine differenziertere Betrachtung der Ergebnisse: • Im Tagebausee Goitsche war die Eveness hauptsächlich von dichteabhängigen Prozessen gesteuert (negative Abhängigkeit zum Quadrat der Biomassen und zu den Lichtverhältnissen). • Die Entwicklung der Artenzahl war neben dem primären Einfluss der zunehmenden Biomasse auch durch qualitative und quantitative Aspekte der Konsumentengemeinschaft (Diversität und Biomasse des Zooplanktons) beeinflusst. Der Einfluss einer erhöhten Immigration auf die Artenzahl wurde nur zu Beginn der Flutung des Tagebausees beobachtet. 6) Auf Ebene der Konsumenten war die einzige eindeutig feststellbare Abhängigkeit ein Anstieg der Artenzahl mit steigender Biomasse. Das Fehlen von weiteren Beziehungen zwischen Diversitätsindizes und dem Produktivitätsgradienten wird darauf zurückgeführt, dass auf den unteren trophischen Ebenen der Primärproduzenten Ressourceneffekte (Bottom-Up) stärker ausgeprägt sind, wohingegen auf höheren trophischen Ebenen Konsumenteneffekte (Top-Down) dominieren. 7) In durch physiologischen Stress beeinflussten Systemen bestand keine Abhängigkeit zwischen den Diversitätsindizes (Artenzahl, Eveness und Diversität) und der Produktivität.
Biomakromoleküle sind in der Natur für viele Abläufe in lebenden Organismen verantwortlich. Dies reicht vom Aufbau der extrazellulären Matrix und dem Cytoskelett über die Erkennung von Botenstoffen durch Rezeptoren bis hin zur Katalyse der verschiedensten Reaktionen in den Zellen selbst. Diese Aufgaben werden zum größten Teil von Proteinen übernommen, und besonders das spezifische Erkennen der Interaktionspartner ist für alle diese Moleküle äußerst wichtig, um eine fehlerfreie Funktion zu gewährleisten. Als Alternative zur evolutiven Erzeugung von optimalen Bindern und Katalysatoren auf der Basis von Aminosäuren und Nukleotiden wurden von Wulff, Shea und Mosbach synthetische molekular geprägte Polymere (molecularly imprinted polymers, MIPs) konzipiert. Das Prinzip dieser künstlichen Erkennungselemente beruht auf der Tatsache, dass sich funktionelle Monomere spezifisch um eine Schablone (Templat) anordnen. Werden diese Monomere dann vernetzend polymerisiert, entsteht ein Polymer mit molekularen Kavitäten, in denen die Funktionalitäten komplementär zum Templat fixiert sind. Dadurch ist die selektive Bindung des Templats in diese Kavitäten möglich. Aufgrund ihrer hohen chemischen und thermischen Stabilität und ihrer geringen Kosten haben “bio-inspirierte” molekular geprägte Polymere das Potential, biologische Erkennungselemente in der Affinitätschromatographie sowie in Biosensoren und Biochips zu ersetzen. Trotz einiger publizierter Sensorkonfigurationen steht der große Durchbruch noch aus. Ein Hindernis für Routineanwendungen ist die Signalgenerierung bei Bindung des Analyten an das Polymer. Eine Möglichkeit für die markerfreie Detektion ist die Benutzung von Kalorimetern, die Bindungs- oder Reaktionswärmen direkt messen können. In der Enzymtechnologie wird der Enzym-Thermistor für diesen Zweck eingesetzt, da enzymatische Reaktionen eine Enthalpie in einer Größenordnung von 5 – 100 kJ/mol besitzen. In dieser Arbeit wird die Herstellung von katalytisch geprägten Polymeren nach dem Verfahren des Oberflächenprägens erstmalig beschrieben. Die Methode zur Immobilisierung des Templats auf der Oberfläche von porösem Kieselgel sowie die Polymerzusammensetzung wurden optimiert. Weiter wird die Evaluation der katalytischen Eigenschaften über einen optischen Test, sowie das erste Mal die Kombination eines kalorimetrischen Transduktors – des Thermistors – mit der Analyterkennung durch ein katalytisch aktives MIP gezeigt. Bei diesen Messungen konnte zum ersten Mal gleichzeitig die Bindung/Desorption, sowie die katalytische Umwandlung des Substrats durch konzentrationsabhängige Wärmesignale nachgewiesen werden.
Alle Organismen sind für ihr Überleben auf Metalle angewiesen. Hierbei gibt es für jedes Metall einen Konzentrationsbereich, der das Optimum zwischen Metallmangel, -bedarf und -toxizität darstellt. Es gilt mittlerweile als erwiesen, dass alle Organismen zur Aufrechterhaltung des Metallgleichgewichts ein komplexes Netzwerk von Proteinen und niedermolekularen Verbindungen entwickelt haben. Die molekularen Komponenten dieses Netzwerks sind nur zu einem Teil bekannt und charakterisiert: In den letzten Jahren wurden einige Proteinfamilien identifiziert, deren Mitglieder Metalle durch Lipidmembranen transportieren. Eine dieser Metalltransporterfamilien ist die Cation Diffusion Facilitator (CDF)-Familie: Alle charakterisierten Mitglieder exportieren Metalle aus dem Zytoplasma – entweder in zelluläre Kompartimente oder aus der Zelle heraus. Von den zwölf Mitgliedern dieser Familie in Arabidopsis thaliana (A. thaliana) – Metall Toleranz Protein (MTP)-1 bis -12 – wurden bisher AtMTP1 und AtMTP3 charakterisiert. In dieser Arbeit wird die Charakterisierung von AtMTP2 beschrieben. Wie die homologen Proteine AtMTP1 und AtMTP3 führt AtMTP2 zu Zn-Toleranz, wenn es heterolog in Zn-sensitiven Hefemutanten exprimiert wird. Mit AtMTP2 transformierte Hefemutanten zeigten darüber hinaus erhöhte Co-Toleranz. Expression von chimären AtMTP2/GFP Fusionsproteinen in Hefe, A.thaliana protoplasten und in stabil transformierten A.thalinana Planzenlinien deutet auf Lokalisation of AtMTP2 in Membranen des Endoplasmatischen Retikulums (ER) hin, wenn GFP an den C-Terminus von MTP2 fusioniert wird. Fusion of GFP an den N-Terminus von AtMTP2 führte zu Lokalisation in der vakuolären Membran, was wahrscheinlichsten auf Fehllokalisierung durch Maskierung eines ER-Retentionsmotivs (XXRR) am N-Terminus von AtMTP2 zurückgeht. Dies legt nahe, dass AtMTP2 die erwähnten Metalle in das Endomembransystem der Zelle transportieren kann. Eine gewebespezifische Lokalisierung wurde mit Pflanzen durchgeführt, die das β-Glucuronidase (GUS)-Reporterprotein bzw. chimäre Fusionsproteine aus EGFP und AtMTP2 unter Kontrolle des nativen pMTP2-Promotors exprimierten. Diese Experimente bestätigten zum einen, dass der pMTP2-Promotor nur unter Zn-Defizienz aktiv ist. GUS-Aktivität wurde unter diesen Bedingungen in zwei Zonen der Wurzelspitze beobachtet: in den isodiametrischen Zellen der meristematischen Zone und in der beginnenden Wurzelhaarzone. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die EGFP-Fusionsproteine unter Kontrolle des nativen pMTP2-Promotors nur in epidermalen Zellen exprimiert werden. Für eine homozygote Knockout- Linie, mtp2-S3, konnte bisher kein eindeutiger Phänotyp identifiziert werden. Auf Grundlage der bisher durchgeführten Charakterisierung von AtMTP2 erscheinen zwei Modelle der Funktion von AtMTP2 in der Pflanze möglich: AtMTP2 könnte essentiell für die Versorgung des ER mit Zn unter Zn-Mangelbedingungen sein. Hierfür spricht, dass AtMTP2 in jungen, teilungsaktiven und damit Zn-benötigenden Wurzelzonen exprimiert wird. Die auf die Epidermis beschränkte Lokalisation könnte bei diesem Modell auf die Möglichkeit der zwischenzellulären Zn-Verteilung innerhalb des ER über Desmotubules hindeuten. Alternativ könnte AtMTP2 eine Funktion bei der Detoxifizierung von Zn unter Zn-Schock Bedingungen haben: Es ist bekannt, dass unter Zn- Mangelbedingungen die Expression der zellulären Zn-Aufnahmesysteme hochreguliert wird. Wenn nun die Zn-Verfügbarkeit im Boden z. B durch eine pH-Änderung innerhalb kurzer Zeit stark ansteigt, besteht die Notwendigkeit der Entgiftung von Zn innerhalb der Zelle, bis der starke Einstrom von Zn ins Zytoplasma durch die Deaktivierung der Zn-Aufnahmesysteme und einer geringeren Expression in der Pflanze gedrosselt ist. Ein ähnlicher Mechanismus wurde in der Bäckerhefe S. cerevisae beschrieben, in der darüber hinaus ein Zn-Transporter verstärkt exprimiert wird, der Zn durch Transport in die Vakuole entgiften kann. Es ist durchaus möglich, dass in Arabidopsis AtMTP2 die Zn-Detoxifizierung unter diesen speziellen Bedingungen durch Zn-Transport in das ER oder die Vakuole vermittelt. Zur Identifikation weiterer Komponenten des Metallhomöostasenetzwerks sind verschiedene Ansätze denkbar. In dieser Arbeit wurde in Hefe ein heterologer Screen durchgeführt, um Interaktoren für vier Mitglieder der Arabidopsis-CDF-Familie zu identifizieren. Unter den 11 im Hefesystem bestätigten Kandidaten befindet sich mit AtSPL1 ein AtMTP1-Interaktionskandidat, der möglicherweise eine Rolle bei der Cu-,Zn-Homöostase spielt. Als wahrscheinliche AtMTP3-Interaktionskandidaten wurde die c”-Untereinheit der vakuolären H+-ATPase AtVHA identifiziert sowie mit AtNPSN13 ein Protein, das vermutlich eine Rolle bei Fusionen von Vesikeln mit Zielmembranen spielt. Ein anderer Ansatz zur Identifikation neuer Metallhomöostasegene ist die vergleichende Elementanalyse von natürlichen oder mutagenisierten Pflanzenpopulationen. Voraussetzung für diesen Ansatz ist die schnelle und genaue Analyse des Elementgehalts von Pflanzen. Eine etablierte Methode zur simultanen Bestimmung von bis zu 65 Elementen in einer Probe ist die Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (ICP OES). Der limitierende Faktor für einen hohen Probendurchsatz ist die Notwendigkeit, Proben für die Analyse zu verflüssigen. Eine alternative Methode der Probenzuführung zum Analysegerät ist die elektrothermale Verdampfung (ETV) der Probe. Zur weitgehend automatisierten Analyse von Pflanzenmaterial mit minimiertem Arbeitsaufwand wurde eine Methode entwickelt, die auf der Kopplung der ETV mit der ICP OES basiert.
Es ist bekannt, dass Änderungen im Kohlenstoff- bzw. Stickstoffstaus der Pflanzen zu einer parallelen statt reziproken Änderung der kohlenstoff- und stickstoffhaltigen Primärmetabolite führen. Unter diesem Gesichtspunkt wurden in der vorliegenden Arbeit der Aminosäurestoffwechsel und der Sekundärstoffwechsel unter reduzierten Stickstoffbedingungen untersucht. Zur Beeinflussung des Stickstoffstoffwechsels wurden nitratmangelernährte Tabakwildtyppflanzen und Genotypen mit unterschiedlich stark reduzierter Nitratreduktase-Aktivität verwendet. Dieses experimentelle System erlaubt zusätzlich durch den Vergleich Nitrat defizienter Wildtyppflanzen mit Nitrat akkumulierenden NIA-Transformanten Prozesse zu identifizieren, die durch Nitrat gesteuert werden. Die Analysen der Primär- und Sekundärmetabolite wurde in allen Genotypen diurnal durchgeführt, um auch tageszeitlich abhängige Prozesse zu identifizieren. Die Analyse der absoluten Gehalte aller individuellen Aminosäuren enthüllte bei den meisten erstaunlich stabile diurnale Muster mit einem Anstieg während des Tages und einem Abfall in der Nacht in Wildtyppflanzen gewachsen mit ausreichend Nitrat. Dieses Ergebnis legt die Schlussfolgerung nahe, dass die Biosynthese der Aminosäuren koordiniert abläuft. In Pflanzen mit reduziertem Stickstoffstatus haben diese diurnalen Muster jedoch keinen Bestand. Die Kombination des erzeugten stickstoffbasierten Aminosäuredatensatz in Kombination mit einem bereits erzeugten Aminosäuredatensatz unter kohlenstofflimitierten Bedingungen von Matt et al. (2002) führte durch Hauptkomponentenanalyse (PCA) und Korrelationsanalyse zu dem Ergebnis, dass die Hypothese nach einer koordinierten Aminosäurebiosynthese nicht allgemeine Gültigkeit hat. Die PCA identifizierte Glutamin, Glutamat, Aspartat, Glycin, Pheny-lalanin und Threonin als Faktoren, die den Datensätzen ihre charakteristische Eigenschaft und deren Varianz verleihen. Die Korrelationsanalyse zeigte, dass die sehr guten Korrelationen der individuellen Aminosäuren untereinander in reduzierten Stickstoff- und Kohlenstoffbedingungen sich verschlechtern. Das Verhältnis einer einzelnen Aminosäure relativ zu den anderen führte zur Identifizierung einiger Aminosäuren, die individuelle Antworten auf Stickstoff- und/oder Kohlenstoffstatus zeigen, und/oder speziell auf Nitrat, Licht und/oder den E-nergiestatus der Thylakoidmembran. Glutamat beispielsweise verhält sich in den meisten Situationen stabil, Phenylalanin dagegen zeigt in jeder physiologischen Situation eine individuelle Antwort. Die Ergebnisse dieser Arbeit führen zu einer Erweiterung der Hypothese einer koordinierten Synthese der Aminosäuren dahingehend, dass diese nicht generell für alle Aminosäuren angenommen werden kann. Es gibt einige Aminosäuren deren, Anteile sich situationsbedingt anpassen. Die Reduktion des Stickstoffstatus in nitratmangelernährten Tabakwildtyppflanzen führte zu der, nach der „Carbon-Nutrient-Balance“ Hypothese erwarteten Verlagerung der kohlenstoffreichen Phenylpropanoide und des stickstoffreichen Nikotins. Die Erhöhung der Phenylpropanoidgehalte war nicht in der Nitrat akkumulierenden NIA-Transformante zu beobachten und somit konnte Nitrat als regulatorisches Element identifiziert werden. Ein Einfluss der Vorläufermetabolite konnte ausgeschlossen werden, da sowohl nitratmangelernährter Wildtyp als auch die Nitrat akkumulierende NIA-Transformante ähnliche Gehalte dieser aufwiesen. Genexpressionsanalysen über Mikroarray-Hybridisierung und quantitative RT-PCR zeigten, dass Nitrat durch noch nicht geklärte Mechanismen Einfluss auf die Expression einiger Gene nimmt, die dem Phenylpropanoidstoffwechsels zugeordnet sind. Aus der Arbeit hervorgegangene Veröffentlichungen: Christina Fritz, Natalia Palacios-Rojas, Regina Feil und Mark Stitt (2006) Regulation of Secondary Metabolism by the Carbon-Nitrogen Status in Tobacco: Nitrate Inhibits Large Sectors of Phenylpropanoid Metabolism. Plant Journal 46, 533 - 548 Christina Fritz, Petra Matt, Cathrin Müller, Regina Feil und Mark Stitt (2006) Impact of the Carbon-Nitrogen Status on the Amino Acid Profile in Tobacco Source Leaves. Plant, Cell and Environment 29 (11), 2009 - 2111
In der vorliegenden Arbeit wurden cDNAs, kodierend für bisher unbekannte stärkeabbauende Enzyme, aus Kartoffel isoliert und funktionell analysiert. Die Isolation der cDNAs erfolgte mit Hilfe eines Systems, welches sich der funktionellen Expression von cDNA-Bibliotheken in E. coli bediente. Die mit diesem System zur Expression gebrachten cDNA-Bibliotheken wurden im Rahmen dieser Arbeit hergestellt. Zum einen handelte es sich um eine blattspezifische Phagen-cDNA-Bibliothek (Proben wurden während des Tag/Nacht Übergangs genommen), zum anderen um eine knollenspezifische cDNA-Bibliothek aus kaltgelagerten Knollen. Nach der Überführung der Phagen-Bibliotheken in Plasmid-Bibliotheken wurden diese funktionell in dem E. coli Stamm KV832 exprimiert. Der Stamm KV832 wurde aufgrund seiner Fähigkeit, lineare Glucane zu akkumulieren, ausgewählt. Werden Glucan akkumulierende KV832 Kolonien mit Jod bedampft, so zeigen diese eine typische Blaufärbung. Nach der Expression der Plasmid-Bibliotheken in KV832 wurden solche Kolonien weiter untersucht, welche in ihrer Färbung von den blauen Kolonien abwichen. Mittels eines zweiten E. coli Stamms, PGM −, welcher ebenfalls in der Lage ist, lineare Glucane zu akkumulieren, wurden die Ergebnisse für KV832 bestätigt. Die funktionelle Expression der Bibliotheken führte zur Isolation einer Reihe von unbekannten cDNAs. Zwei dieser cDNAs wurden im Rahmen dieser Arbeit weiterführend untersucht. Zum einen handelte es sich um eine cDNA, die für eine bis dahin unbekannte β-Amylase aus Kartoffel kodierte und deren Homolog aus Arabidopsis (CT-BMY) im Laufe dieser Arbeit von Lao et al. (1999) veröffentlicht wurde, zum anderen um eine cDNA, die für ein unbekanntes Enzym kodierte (DSD10). Das Arabidopsis Homolog zu DSD10 wurde im Zuge der Arabidopsis Genominitiative Ende 2000 publiziert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die isolierte β-Amylase cDNA für eine funktionelle β-Amylase kodiert und dieses Enzym in der Lage ist, neben löslicher auch rohe Stärke anzugreifen. Lokalisationsexperimente zeigten, dass das Enzym in isolierte Erbsenchloroplasten importiert wurde und dass die 100 N-terminalen Aminosäuren für den Import in die Plastiden ausreichten. Die β-Amylase wurde als PCT-BMYI bezeichnet. Die »antisense«-Inhibierung von PCT-BMYI führte zu einem Hochstärke-Phänotyp der Blätter, sowie zu einem Anstieg der Trockenmasse. Der Hochstärke-Phänotyp ist auf eine Reduktion der Stärkemobilisierung und die daraus folgende Akkumulation der Stärke während der Vegetationsperiode zurückzuführen. Damit konnte erstmals die physiologische Bedeutung einer β-Amylase für den Abbau der transitorischen Stärke gezeigt werden. Kein Einfluss zeigte die »antisense« Inhibierung von PCT-BMYI auf den kälteinduzierten Abbau der Speicherstärke in Knollen. Es konnte auch kein Unterschied im Keimverhalten oder der Entwicklung der neuen Pflanze beobachtet werden. Ein Teil der Ergebnisse zu PCT-BMYI wurde bereits publiziert (Scheidig et al., 2002). Die isolierten cDNAs dsd10, sgeI (die Volllängen cDNA zu dsd10) und das Arabidopsis Homolog asgeI kodieren für Enzyme, welche α-Amylase-Aktivität besitzen, aber keine Homologie zu bekannten α-Amylasen aufweisen. Ein mögliches Glucoamylase Motiv erwies sich für die Aktivität des Proteins als essentiell. Lokalisationsexperimente deuteten auf den Import des SGEI Proteins in isolierte Erbsenchloroplasten hin. Die »antisense«-Inhibierung von sgeI führte in den entsprechenden Linien zu einem Hochstärke-Phänotyp in Blättern, einem Anstieg der Trockenmasse in Blättern, sowie zu größeren Stärkekörnern in einer der untersuchten Linien. Ein nicht erwarteter Effekt zeigte sich in Blättern der entsprechenden Linien, welche für längere Zeit dunkel gehalten wurden. Die Blätter der untransformierten Kontrolle waren abgestorben, wohingegen die Blätter der SGEI »antisense« Linien grün und vital erschienen. Die α- und β-Amylase-Aktivität war in Blättern der SGEI »antisense« Linien reduziert, weshalb eine genaue Zuordnung der Funktion von SGEI nicht möglich war. Die vorliegenden Ergebnisse zu den SGEI »antisense« Linien deuten aber darauf hin, dass der beobachtete Hochstärke-Phänotyp nicht alleine auf die Reduktion der β-Amylase-Aktivität zurückzuführen ist. Ein Einfluss von SGEI auf den kälteinduzierten Abbau der Speicherstärke konnte nicht beobachtet werden. Es konnte auch hier kein Unterschied im Keimverhalten oder der Entwicklung der neuen Pflanze beobachtet werden.
Apoptose, der programmierte Zelltod, spielt eine wichtige Rolle für das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Sterben von Zellen und ist außerdem an der Beseitigung von infizierten und geschädigten Zellen beteiligt. Apoptose kann durch Stimulation von Rezeptoren aus der Familie der TNF-Rezeptoren wie CD95, ausgelöst werden. Nach Liganden-induzierter Trimerisierung der Rezeptoren bindet FADD an den zytoplasmatischen Teil des Rezeptors und rekrutiert Caspase-8 und/oder -10. Die räumliche Nähe der Caspasen in diesem als DISC bezeichneten Komplex führt zu ihrer auto- und transkatalytischen Spaltung und damit Aktivierung. Dadurch wird das apoptotische Programm gestartet, welches zum Tod der Zelle führt. Kontrolliert wird dieser Vorgang von einer Vielzahl anti-apoptotischer Proteine. Störungen in diesem System sind an der Entstehung einer Reihe von Krankheiten beteiligt. Die Blockade der Apoptoseinduktion kann zur Entstehung von Tumoren beitragen. Das klassische Hodgkin Lymphom ist eine maligne Erkrankung des lymphatischen Systems. Die Tumorzellen sind große, einkernige Hodgkin- oder mehrkernige Reed/Sternbergzellen (HRS-Zellen). Sie leiten sich von Keimzentrum-B-Zellen ab. In HRS-Zellen fehlt die Expression einer Vielzahl von typischen B-Zellmarkern, darunter die des B-Zellrezeptors. Solche B-Zellen sterben normalerweise während der Keimzentrumsreaktion durch Apoptose. An diesem Prozess ist CD95 beteiligt. In einer Reihe von malignen Erkrankungen wurden eine Herunterregulation der CD95-Expression oder Mutationen im CD95-Gen beobachtet. Es wird daher vermutet, dass CD95-induzierte Apoptose zur Entfernung von Tumorzellen beiträgt. Im Gegensatz dazu exprimieren sowohl primäre HRS-Zellen als auch etablierte HRS-Zelllinien in der Regel Wildtyp-CD95, sind aber trotzdem CD95-resistent. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Komponenten des CD95-Systems, im Gegensatz zu anderen malignen Erkrankungen, in den HRS-Zellen hochreguliert sind, darunter CD95 selbst. In immunpräzipitierten DISCs von CD95-stimulierten HRS-Zellen wurde neben FADD und Caspase-8/-10 auch c-FLIP nachgewiesen. c-FLIP ist ein Caspase-8/-10-Homolog, das ebenfalls an FADD bindet, aber aufgrund fehlender katalytischer Aktivität die Aktivierung der Caspasen im DISC und damit die Apoptoseinduktion verhindert. Eine starke c-FLIP-Expression konnte in allen HRS-Zelllinien und in den HRS-Zellen nahezu aller untersuchter primärer Hodgkinfälle (55/59) gezeigt werden. Durch siRNA-vermittelte Herunterregulation von c-FLIP war es möglich, HRS-Zelllinien gegenüber CD95-induzierter Apoptose zu sensitivieren. Dies zeigt, dass die CD95-Rezeptor-induzierte Apoptose in den HRS-Zellen nicht strukturell, sondern funktionell inhibiert ist und c-FLIP stark zu dieser Inhibition beiträgt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die c-FLIP-Expression in den HRS-Zellen von der konstitutiven Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB abhängt, die charakteristisch für diese Zellen ist. Normalerweise wird NF-κB von Inhibitorproteinen, den IκBs, im Zytoplasma zurückgehalten. Diverse Stimuli können den IKK-Komplex aktivieren, der die IκBs an bestimmten Serinresten phosphoryliert. Dies hat die Ubiquitinylierung und den Abbau der IκBs zur Folge, wodurch NF-κB frei wird, in den Kern wandert und dort seine Zielgene aktiviert. Es wird angenommen, dass in HRS-Zellen ein konstitutiv aktiver IKK-Komplex und teilweise Mutationen der IκB-Proteine zur konstitutiven NF-κB-Aktivität beitragen. Zu den NF-κB-abhängigen Genen in den HRS-Zellen gehören solche mit anti-apoptotischer und Zellzyklus-treibender Wirkung. Die Inhibition der NF-κB-Aktivität in den HRS-Zellen führt zu Apoptose und eingeschränkter Proliferation. Von dreiwertigem Arsen ist bekannt, dass es die Induzierbarkeit des IKK-Komplexes inhibieren kann und damit letztendlich die Aktivierung von NF-κB. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Arsen in HRS-Zellen den konstitutiv aktiven IKK-Komplex inhibiert. In Zelllinien mit intakten IκB-Proteinen führte dies zur NF-κB-Inhibition und Apoptoseinduktion. Die Reduktion der NF-κB-Aktivität ging mit der Herunterregulation von anti-apoptotischen und Proliferations-fördernden Zielgenen einher. Die ektope Überexpression von NF-κB hob die Apoptose-induzierende Wirkung von Arsen teilweise auf. Durch Arsen-Behandlung von Mäusen konnte das Tumorwachstum xenotransplantierter HRS-Zellen stark verlangsamt werden. In explantierten Tumorzellen konnte ebenfalls eine NF-κB-Inhibition nachgewiesen werden. Die NF-κB-Inhibition durch Arsen trägt also stark zur Apoptoseinduktion in den HRS-Zellen bei. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Modulation der Apoptoseresistenz neue therapeutische Ansätze für die Behandlung des Hodgkin Lymphoms bieten könnte. Der Einsatz von Arsen ist dabei besonders interessant, da Arsen schon für die Behandlung anderer maligner Erkrankungen eingesetzt wird.
Die Etablierung der Transkription von kompletten Genen auf planaren Oberflächen soll eine Verbindung zwischen der Mikroarraytechnologie und der Transkriptomforschung herstellen. Darüber hinaus kann mit diesem Verfahren ein Brückenschlag zwischen der Synthese der Gene und ihrer kodierenden Proteine auf einer Oberfläche erfolgen. Alle transkribierten RNAs wurden mittels RT-PCR in cDNA umgeschrieben und in einer genspezifischen PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden hierfür entweder per Hand oder maschinell auf die Oberfläche transferiert. Über eine Oberflächen-PCR war es möglich, die Gensequenz des Reportergens EGFP direkt auf der Oberfläche zu synthetisieren und anschließend zu transkribieren. Somit war eine Transkription mit weniger als 1 ng an Matrize möglich. Der Vorteil einer Oberflächen-Transkription gegenüber der in Lösung liegt in der mehrfachen Verwendung der immobilisierten Matrize, wie sie in dieser Arbeit dreimal erfolgreich absolviert wurde. Die Oberflächen-Translation des EGFP-Gens konnte ebenfalls zweimal an einer immobilisierten Matrize gezeigt werden, wobei Zweifel über eine echte Festphasen-Translation nicht ausgeräumt werden konnten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Transkription und Translation von immobilisierten Gensequenzen auf planaren Oberflächen möglich ist, wofür die linearen Matrizen direkt auf der Oberfläche synthetisiert werden können.
Charakterisierung von Transportmechanismen in der Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana
(2006)
Die Aktivierung der Speichelsekretion erfolgt in der innervierten Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana durch die biogenen Amine Dopamin (DA) und Serotonin (5-HT). Die Acini der Speicheldrüse sezernieren einen Primärspeichel, der in den Ausführgängen modifiziert wird. Die durch DA und 5-HT aktivierten Signalwege sowie die an der Elektrolyt- und Flüssigkeitssekretion bzw. Speichel-modifikation beteiligten Transportmechanismen sind weitgehend unbekannt. Mikrofluorometrische Ca<sup>2+-, Na<sup>+- und pH-Messungen in Kombination mit pharmakologischen Experimenten, biochemische Messungen der Aktivitäten von Ionentransport-ATPasen sowie videomikroskopische Analysen zu transepithelialen Wasserbewegungen wurden in dieser Arbeit durchgeführt. Sie sollten Informationen über die an der Speichelbildung und -modifikation beteiligten Transportmechanismen und die Signalwege liefern, welche durch DA und/oder 5-HT aktiviert werden. Wesentliche Ergebnisse dieser Arbeit waren: <ul> <li>Messungen des intrazellulären pH (pHi) in Gangzellen zeigten, dass isolierte Ausführgänge mit Acini bei Stimulierung mit DA und 5-HT stark ansäuerten. In isolierten Ausführgängen ohne Acini verursachte nur DA eine schwache Ansäuerung. Da nur die Ausführgänge dopaminerg innerviert sind, die Acini jedoch dopaminerg und serotonerg, zeigt dieses Ergebnis, dass die DA- und/oder 5-HT-induzierte Primärspeichelbildung die Ursache für die pHi-Änderungen in den Gangzellen ist. pHi-Messungen in den Gangzellen geben also auch Hinweise auf Transportvorgänge in den Acini.</li> <li> Der Na<sup>+-K<sup>+-2Cl<sup>--Symporter und der Cl<sup>--HCO3<sup>--Antiporter, gekoppelt mit dem Na<sup>+ H<sup>+-Antiporter (NHE) waren an der NaCl-Aufnahme in die peripheren Zellen der Acini zur Bildung des NaCl-reichen Primärspeichels beteiligt. Die Aktivität dieser Transporter hing von der CO2/HCO3<sup>--Verfügbarkeit ab und war Ca<sup>2+-abhängig.</li> <li>Die starke Ansäuerung in den Gangzellen hing nicht von der Aktivität der apikalen vakuolären Protonen-ATPase (V-H<sup>+-ATPase), aber von der Aktivität der basolateralen Na<sup>+-K<sup>+-ATPase ab, die anscheinend in den Ausführgängen die Speichelmodifikation energetisiert.</li> <li>In isolierten Ausführgängen mit Acini waren die V-H<sup>+-ATPase und Na<sup>+-abhängige Transporter (u. a. NHE) an der Erholung von einer DA-induzierten oder einer NH4Cl-Vorpuls-induzierten Ansäuerung in den Gangzellen beteiligt. Bei der Regulation des pHi in unstimulierten Gangzellen spielten diese Transporter keine Rolle.</li> <li>In isolierten Ausführgängen mit Acini induzierte DA in den Gangzellen einen Anstieg der [Na<sup>+]i und, zeitlich verzögert, auch der [Ca<sup>2+]i. Der [Na<sup>+]i-Anstieg war von der Aktivität der Acini abhängig und erfolgte möglicherweise über apikale Na+-Kanäle. Der [Ca<sup>2+]i-Anstieg war graduiert und tonisch. Der DA-induzierte [Na<sup>+]i-Anstieg in den Gangzellen und deren Depolarisation führten dazu, dass der basolaterale Na<sup>+-Ca<sup>2+-Antiporter in den Ca<sup>2+-Influx-Modus umkehrte. Die daraus resultierende tonische [Ca<sup>2+]i-Erhöhung könnte an der Regulation der Na<sup>+-Rückresorption beteiligt sein.</li> <li>Zum Nachweis transepithelialer Flüssigkeitsbewegungen in isolierten Ausführgängen wurde eine videomikroskopische Methode entwickelt. Isolierte Ausführgänge ohne Acini resorbierten im unstimulierten Zustand Flüssigkeit aus dem Ausführganglumen. Möglicherweise sezernieren die Acini auch im unstimulierten Zustand mit geringerer Rate einen Primärspeichel, der in den Ausführgängen resorbiert wird. Die Resorption war ATP-abhängig. Der ATP-verbrauchende Transportmechanismus konnte nicht identifiziert werden. Weder die Na<sup>+-K<sup>+-ATPase noch die V-H<sup>+-ATPase waren an der Resorption beteiligt.</li> </ul> Diese Arbeit trug zur Kenntnis der komplexen Funktionsweise von Speicheldrüsen in Insekten bei und erweiterte das lückenhafte Wissen über die zellulären Wirkungen biogener Amine in Insekten. Zudem wurden in dieser Arbeit viele Parallelen zu Funktionsweisen der Speicheldrüsen in Vertebraten deutlich.
Die Enzymsuperfamilie der löslichen Sulfotransferasen (SULT) spielt eine wichtige Rolle in der Phase II des Fremdstoffmetabolismus. Sie katalysieren den Transfer einer Sulfonylgruppe auf nucleophile Gruppen endogener und exogener Substrate. Die Sulfokonjugation von Fremdstoffen erhöht deren Wasserlöslichkeit und behindert die passive Permeation von Zellmembranen. Dadurch wird die Ausscheidung dieser konjugierten Substanzen erleichtert. In Abhängigkeit von der Struktur des Zielmoleküls kann die Sulfokonjugation aber auch zur metabolischen Aktivierung von Fremdstoffen durch die Bildung instabiler Metabolite führen. Die SULT-vermittelte Aktivierung promutagener Substanzen ist somit von toxikologischem Interesse. Für die Detektion SULT-vermittelter Mutagenität mittels bakterieller in-vitro Testsysteme ist die heterologe Expression der fremdstoffmetabolisierenden Enzyme direkt in den Indikatorzellen notwendig. S. typhimurium exprimieren selbst keine SULT, und externe Metabolisierungssysteme sind problematisch, weil die negativ geladenen, kurzlebigen Metabolite nur schlecht die Zellmembran penetrieren können. Die Expression humaner Enyme in Bakterien ist jedoch zum Teil sehr kritisch. So zeigen z.B. sehr ähnliche Enzyme (SULT1A2*1 und *2) deutliche Unterschiede im Expressionsniveau bei exakt gleichen äußeren Bedingungen. Dies erschwert den Vergleich der enzymatischen Aktivitäten dieser Enzyme im in-vitro Testsystem. Andere Enzyme (z.B. SULT2B1b) werden unter Verwendung ihrer Wildtyp-cDNA zum Teil nicht detektierbar exprimiert. Deshalb sollte in dieser Arbeit eine Methode zur Optimierung der heterologen Expression fremdstoffmetabolisierender Enzyme für Genotoxizitätsuntersuchungen etabliert werden. Es wurde bereits gezeigt dass synonyme Codonaustausche am 5’-Ende der humanen SULT1A2-cDNA zu einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Enzyms in S. typhimurium führten. Dementsprechend wurden in dieser Arbeit Codonaustausche am 5’-Ende der cDNA verschiedener SULT (1A1*1, 1A2*1, 2B1b) sowie der Ratten Glutathion-S-Transferase Theta 2 (rGSTT2) und dem Reportergen Luciferase durchgeführt. Die Expression der so generierten Konstrukte wurde in verschiedenen S. typhimurium und E. coli Stämmen quantifiziert und die Aktivität der überexprimierten Enzyme im Ames-Test bzw. im Enzym-Aktivitätsassay überprüft. Durch das Einführen seltener Codons in die cDNA konnte die Proteinexpression von SULT1A1*1, SULT1A2*1 und SULT2B1b maximal 7-fach, 18-fach und 100-fach im Vergleich zur Wildtyp-cDNA gesteigert werden. Die Expression der rGSTT2 wurde ebenfalls durch das Einführen seltener Codons erhöht (maximal 5-fach). Bei dem Reportergen Luciferase jedoch führte das Austauschen häufiger Codons gegen seltene Codons zu einer Reduktion der Proteinexpression um 80 %. Die Expression von Fusionsproteinen aus 2B1b (5’-Ende) und Luciferase (3’-Ende) wurde durch das Einführen seltener Codons ebenfalls um 50 % reduziert. Die S. typhimurium Stämme mit optimierter SULT 1A1*1- bzw. 1A2*1-Expression wurden im Ames-Test eingesetzt und zeigten im Vergleich zu den geringer exprimierenden Stämmen eine höhere Sensitivität. Für SULT2B1b konnte keine Mutagenaktivierung im Ames-Test nachgewiesen werden. Allerdings zeigte ein Enzym-Aktivitätsassay mit Dehydroepiandosteron, dass das bakteriell exprimierte Enzym funktionell war. Da in der Literatur der Effekt seltener Codons auf die Expression in Bakterien bisher fast ausschließlich als inhibitorisch beschrieben wurde, sollte die Wirkungsweise der hier beobachteten Expressionserhöhung durch seltene Codons genauer untersucht werden. Dazu wurden verschiedene Konstrukte der SULT1A2*1 und der SULT2B1b, die unterschiedlich viele seltene Codons in verschiedenen Kombinationen besaßen, hergestellt. Es konnten jedoch keine einzelnen Codons, die für die Expressionssteigerung allein verantwortlich waren, identifiziert werden. Die Plasmidkopienzahl in den verschiedenen SULT2B1b-Klonen war konstant und die SULT2B1b-mRNA-Konzentration zeigte nur moderate Schwankungen, die nicht als Ursache für die dramatische Erhöhung der SULT2B1b-Expression in Frage kommen. Die berechnete Stabilität der potentiellen mRNA-Sekundärstrukturen wurde durch die seltenen Codons häufig stark gesenkt und ist als eine mögliche Ursache für die Expressionssteigerung anzusehen. Zusätzlich erhöhten die seltenen Codons den Consensus der Downstream Box zur 16S rRNA, was ebenfalls eine Ursache für die Expressionssteigerung sein kann. In dieser Arbeit konnte somit die Expression der humanen SULT1A1*1, 1A2*1 und der 2B1b sowie der rGSTT2 erfolgreich mittels synonymer Codonaustausche erhöht werden. Die so optimierten S. typhimurium Stämme zeigten im Ames-Test eine erhöhte Sensitivität gegenüber SULT aktivierten Promutagenen bzw. erhöhte Aktivität in spezifischen Enymaktivitätsassays.
Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Oktober 2002 bis November 2005 an dem Institut für Biochemie und Biologie der Universität Potsdam in Kooperation mit dem Institut für Chemie des GKSS Forschungszentrums in Teltow unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. B. Micheel und Herrn Prof. Dr. Th. Groth angefertigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Wechselwirkungen von Immunzellen mit verschiedenen Kultursubstraten untersucht. Dafür wurden drei verschiedene Hybridomzelllinien eingesetzt. Eine Hybridomzelllinie (K2) ist im Laufe dieser Arbeit hergestellt und etabliert worden. Der Einsatz von synthetischen und proteinbeschichteten Kulturoberflächen führte bei Hybridomzellen zu einer deutlich gesteigerten Antikörpersynthese im Vergleich zu herkömmlichen Zellkulturmaterialien. Obwohl diese Zellen in der Regel als Suspensionszellen kultiviert werden, führten die eingesetzten Polymermembranen (PAN, NVP) zu einer verbesserten Antikörpersynthese (um 30%) gegenüber Polystyrol als Referenz. Es konnte gezeigt werden, dass es einen Zusammenhang zwischen der Produktivität und dem Adh asionsverhalten der Hybridomzellen gibt. Um den Einfluss von Proteinen der extrazellulären Matrix auf Zellwachstum und Antikörpersynthese von Hybridomzellen zu untersuchen, wurden proteinbeschichtete Polystyrol-Oberflächen eingesetzt. Für die Modifikationen wurden Fibronektin, Kollagen I, Laminin und BSA ausgewählt. Die Modifikation der Polystyrol-Oberfläche mit geringen Mengen Fibronektin (0,2-0,4 µg/ml) führte zu einer beträchtlichen Steigerung der Antikörpersynthese um 70-120%. Für Kollagen I- und BSA-Beschichtungen konnten Steigerungen von 40% beobachtet werden. Modifikationen der Polystyrol-Oberfläche mit Laminin zeigten nur marginale Effekte. Durch weitere Versuche wurde bestätigt, dass die Adhäsion der Zellen an Kollagen I- und Laminin-beschichteten Oberflächen verringert ist. Die alpha2-Kette des alpha2beta1-Integrins konnte auf der Zelloberfläche nicht nachgewiesen werden. Durch ihr Fehlen wird wahrscheinlich die Bindungsfähigkeit der Zellen an Kollagen I und Laminin beeinflusst. Durch die Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass Hybridomzellen nicht nur Suspensionszellen sind und das Kultursubstrate das Zellwachstum und die Produktivität dieser Zellen stark beeinflussen können. Der Einsatz von synthetischen und proteinbeschichteten Kultursubstraten zur Steigerung der Antikörpersynthese kann damit für die industrielle Anwendung von großer Relevanz sein. Für die Modellierung einer Lymphknotenmatrix wurden Fibronektin, Kollagen I, Heparansulfat und N-Acetylglucosamin-mannose in verschiedenen Kombinationen an Glasoberflächen adsorbiert und für Versuche zur In-vitro-Immunisierung eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Modifikation der Oberflächen die Aktivierung und Interaktion von dendritischen Zellen, T- und B-Lymphozyten begünstigt, was durch den Nachweis spezifischer Interleukine (IL12, IL6) und durch die Synthese spezifischer Antikörper bestätigt wurde. Eine spezifische Immunreaktion gegen das Antigen Ovalbumin konnte mit den eingesetzten Zellpopulationen aus Ovalbumin-T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen nachgewiesen werden. Die In-vitro-Immunantwort wurde dabei am stärksten durch eine Kombination von Kollagen I, Heparansulfat und N-Acetylglucosamin-mannose auf einer Glasoberfläche gefördert. Die Etablierung einer künstlichen Immunreaktion kann eine gesteuerte Aktivierung bzw. Inaktivierung von körpereigenen dendritischen Zellen gegen bestehende Krankheitsmerkmale in vitro ermöglichen. Durch die Versuche wurden Grundlagen für spezifische Immunantworten erarbeitet, die u.a. für die Herstellung von humanen Antikörpern eingesetzt werden können.
Flüssigkeitssekretion und Proteinsekretion werden in Speicheldrüsen von Insekten über Hormone und Neurotransmitter gesteuert. Diese entfalten ihre physiologische Wirkung in den sekretorischen Drüsenzellen hauptsächlich über den zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Signalweg und den Inositoltrisphosphat (IP<SUB>3</SUB>) / Ca<sup>2+-Signalweg. Die Mechanismen möglicher Wechselwirkungen zwischen diesen Signalwegen und ihre physiologischen Auswirkungen sind unzureichend bekannt. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Frage, ob und wie sich der Ca<sup>2+-Signalweg und der cAMP-Signalweg in der Speicheldrüse der Diptere Calliphora vicina beeinflussen. Substanzen wie 5-Fluoro-α-Methyltryptamin und Histamin wurden in früheren Arbei-ten als Agonisten genutzt, um in den Speicheldrüsen von C. vicina selektiv den cAMP-Signalweg (getrennt vom IP<SUB>3</SUB>/Ca<sup>2+-Signalweg) zu aktivieren. Es zeigte sich in transepithelialen Potentialmessungen und mikrofluorometrischen Ca<sup>2+-Untersuchungen, dass beide Substanzen sowohl den cAMP-Weg als auch den Ca<sup>2+-Signalweg aktivierten. Die physiologischen Ursachen der Histamin-induzierten Ca<sup>2+-Erhöhung wurden genauer untersucht. Zusammengefasst zeigten diese Untersuchungen, dass Histamin wie 5-HT den cAMP-Weg und die Phosphoinositidkaskade aktivierte. Im Gegensatz zu den 5-HT-induzierten Ca<sup>2+-Oszillationen, welche durch interzelluläre Ca<sup>2+-Wellen synchronisiert werden, verursachte Histamin bei niedrigen Konzentrationen lokale Ca<sup>2+-Oszillationen in einzelnen Zellen (keine Wellen). Bei höheren Histamin-Konzentrationen war eine anhaltende Ca<sup>2+-Erhöhung oder ein synchrones <quote>Ca<sup>2+-beating</quote> in der gesamten Drüse zu beobachten. Des Weiteren wurde die Frage untersucht, ob eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration den IP<SUB>3</SUB> Ca<sup>2+-Signalweg in den Epithelzellen der Speicheldrüse beeinflussen kann. Es zeigte sich, dass cAMP den durch schwellennahe 5-HT-Konzentrationen induzierten Ca<sup>2+-Anstieg verstärkte. Diese Verstärkung wurde durch eine PKA-vermittelte Sensitivierung des IP<SUB>3</SUB>-Rezeptor/Ca<sup>2+-Kanals für IP<SUB>3</SUB> verursacht. Immunzytochemische Untersuchungen deuten dar-auf hin, dass die Proteinkinase A eng mit dem IP<SUB>3</SUB>-Rezeptor/Ca<sup>2+-Kanal assoziiert ist. Diese Messungen zeigen erstmals, dass auch bei Invertebraten der Botenstoff cAMP, PKA-vermittelt, den IP<SUB>3</SUB>-Rezeptor/Ca<sup>2+-Kanal des ER für IP<SUB>3</SUB> sensitiviert.
Weltweit versuchen Wissenschaftler, künstliche Viren für den Gentransfer zu konstruieren, die nicht reproduktionsfähig sind. Diese sollen die Vorteile der natürlichen Viren besitzen (effizienter Transport von genetischem Material), jedoch keine Antigene auf ihrer Oberfläche tragen, die Immunreaktionen auslösen. Ziel dieses Projektes ist es, einen künstlichen Viruspartikel herzustellen, dessen Basis eine Polyelektrolytenhohlkugel bildet, die mit einer Lipiddoppelschicht bedeckt ist. Um intakte Doppelschichten zu erzeugen, muss die Wechselwirkung zwischen Lipid und Polyelektrolyt (z.B. DNA) verstanden und optimiert werden. Dazu ist es notwendig, die strukturelle Grundlage der Interaktion aufzuklären. Positiv geladene Lipide gehen zwar starke Wechselwirkungen mit der negativ geladenen DNA ein, sie wirken jedoch toxisch auf biologische Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die durch zweiwertige Kationen vermittelte Kopplung von genomischer oder Plasmid-DNA an zwitterionische oder negativ geladene Phospholipide an zwei Modellsystemen untersucht. 1. Modellsystem: Lipidmonoschicht an der Wasser/Luft-Grenzfläche Methoden: Filmwaagentechnik in Kombination mit IR-Spektroskopie (IRRAS), Röntgenreflexion (XR), Röntgendiffraktion (GIXD), Brewsterwinkel-Mikroskopie (BAM), Röntgenfluoreszenz (XRF) und Oberflächenpotentialmessungen Resultate: A) Die Anwesenheit der zweiwertigen Kationen Ba2+, Mg2+, Ca2+ oder Mn2+ in der Subphase hat keinen nachweisbaren Einfluss auf die Struktur der zwitterionischen DMPE- (1,2-Dimyristoyl-phosphatidyl-ethanolamin) Monoschicht. B) In der Subphase gelöste DNA adsorbiert nur in Gegenwart dieser Kationen an der DMPE-Monoschicht. C) Sowohl die Adsorption genomischer Kalbsthymus-DNA als auch der Plasmid-DNA pGL3 bewirkt eine Reduktion des Neigungswinkels der Alkylketten, die auf einen veränderten Platzbedarf der Kopfgruppe zurückzuführen ist. Durch die Umorientierung der Kopfgruppe wird die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Stickstoffatomen der Lipidkopfgruppen und den negativ geladenen DNA-Phosphaten erhöht. D) Die adsorbierte DNA weist eine geordnete Struktur auf, wenn sie durch Barium-, Magnesium-, Calcium- oder Manganionen komplexiert ist. Der Abstand zwischen parallelen DNA-Strängen hängt dabei von der Größe der DNA-Fragmente sowie von der Art des Kations ab. Die größten Abstände ergeben sich mit Bariumionen, gefolgt von Magnesium- und Calciumionen. Die kleinsten DNA-Abstände werden durch Komplexierung mit Manganionen erhalten. Diese Ionenreihenfolge stellt sich sowohl für genomische DNA als auch für Plasmid-DNA ein. E) Die DNA-Abstände werden durch die Kompression des Lipidfilms nicht beeinflusst. Zwischen der Lipidmonoschicht und der adsorbierten DNA besteht demnach nur eine schwache Wechselwirkung. Offensichtlich befindet sich die durch zweiwertige Kationen komplexierte DNA als weitgehend eigenständige Schicht unter dem Lipidfilm. 2. Modellsystem: Lipiddoppelschicht an der fest/flüssig-Grenzfläche Methoden: Neutronenreflexion (NR) und Quarzmikrowaage (QCM-D) Resultate: A) Das zwitterionische Phospholipid DMPC (1,2-Dimyristoyl-phosphatidylcholin) bildet keine Lipiddoppelschicht auf planaren Polyelektrolytmultischichten aus, deren letzte Lage das positiv geladene PAH (Polyallylamin) ist. B) Hingegen bildet DMPC auf dem negativ geladenen PSS (Polystyrolsulfonat) eine Doppelschicht aus, die jedoch Defekte aufweist. C) Eine Adsorption von genomischer Kalbsthymus-DNA auf dieser Lipidschicht findet nur in Gegenwart von Calciumionen statt. Andere zweiwertige Kationen wurden nicht untersucht. D) Das negativ geladene Phospholipid DLPA (1,2-Dilauryl-phosphatidsäure) bildet auf dem positiv geladenen PAH eine Lipiddoppelschicht aus, die Defekte aufweist. E) DNA adsorbiert ebenfalls erst in Anwesenheit von Calciumionen in der Lösung an die DLPA-Schicht. F) Durch die Zugabe von EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) werden die Calciumionen dem DLPA/DNA-Komplex entzogen, wodurch dieser dissoziiert. Demnach ist die calciuminduzierte Bildung dieser Komplexe reversibel.
Die Honigbiene Apis mellifera gilt seit langem als Modell-Organismus zur Untersuchung von Lern- und Gedächtnisvorgängen sowie zum Studium des Sozialverhaltens und der Arbeitsteilung. Bei der Steuerung und Regulation dieser Verhaltensweisen spielt das Indolalkylamin Serotonin eine wesentliche Rolle. Serotonin entfaltet seine Wirkung durch die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). In der vorliegenden Arbeit wird der erste Serotonin-Rezeptor aus der Honigbiene molekular charakterisiert. Durch die Anwendung zwei verschiedener Klonierungsstrategien konnten drei cDNA-Sequenzen isoliert werden, die für potentielle Serotonin-Rezeptoren kodieren. Die Sequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu dem 5-HT7- und 5-HT2-Rezeptor von Drosophila melanogaster bzw. dem 5-HT1-Rezeptor von Panulirus interruptus auf. Die isolierten Serotonin-Rezeptoren der Honigbiene wurden dementsprechend Am(Apis mellifera)5-HT1, Am5-HT2 und Am5-HT7 benannt. Das Hydropathieprofil des Am5-HT1-, Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptors deutet auf das Vorhandensein des charakteristischen heptahelikalen Aufbaus G-Protein-gekoppelter Rezeptoren hin. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen typische Merkmale biogener Amin-Rezeptoren. Aminosäuren, die eine Bedeutung bei der Bildung der Liganden-Bindungstasche, der Rezeptor-Aktivierung und der Kopplung eines G-Proteins an den Rezeptor haben, sind in allen drei Rezeptoren konserviert. Interessanterweise ist jedoch das in den meisten biogenen Amin-Rezeptoren vorhandene DRY-Motiv in dem Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptor nicht konserviert. Das Vorhandensein einer PDZ-Domäne in dem Am5-HT1- und Am5-HT7-Rezeptor lässt vermuten, dass diese Rezeptoren als Adapterproteine fungieren, die Signalmoleküle zu einem Signaltransduktionskomplex vereinigen. RT-PCR-Experimente zeigen die Expression der Rezeptoren in verschiedenen Geweben der Honigbiene. Auffallend ist die hohe Expression im Zentralgehirn. Des Weiteren konnte die Expression der Serotonin-Rezeptoren in den optischen Loben, Antennalloben sowie in der Peripherie, d.h. in der Flugmuskulatur und den Malpighischen Gefäßen nachgewiesen werden. Durch in situ Hybridisierungen wurde die Expression in Gefrierschnitten von Gehirnen adulter Sammlerinnen im Detail untersucht. Transkripte der Rezeptoren sind in den Somata von intrinsischen Pilzkörperzellen, Neuronen der optischen Loben und Neuronen der Antennalloben vorhanden. In einem heterologen Expressionssystem wurde der intrazelluläre Signalweg des Am5-HT7-Rezeptors untersucht. Die Aktivierung des stabil exprimierten Rezeptors durch Serotonin führt zur Bildung von cAMP. Der 5-HT7-Rezeptor spezifische Agonist 5-CT zeigt eine mit Serotonin vergleichbare Fähigkeit, die intrazelluläre cAMP-Konzentration zu erhöhen. Am5-HT7 gehört daher funktionell zu der Gruppe der 5-HT7-Rezeptoren. Der EC50-Wert von 1,06~nM (5-HT), ist im Vergleich zu anderen 5-HT7-Rezeptoren äußert niedrig. Des Weiteren wurde gezeigt, dass das basale cAMP-Niveau in den transfizierten Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen deutlich erhöht ist. Das heißt, dass der Rezeptor auch in der Abwesenheit eines Liganden aktiv ist. Diese konstitutive Aktivität ist auch von anderen biogenen Amin-Rezeptoren bekannt. Methiothepin wurde als wirksamer inverser Agonist des Am5-HT7-Rezeptors identifiziert, da es in der Lage ist, der konstitutiven Aktivität entgegenzuwirken. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass die Serotonin-Rezeptoren in verschiedenen Regionen des ZNS der Honigbiene an der Informationsverarbeitung beteiligt sind. Es kann eine Beeinflussung von Lern- und Gedächtnisprozessen sowie des olfaktorischen und visuellen Systems durch diese Rezeptoren vermutet werden. Mit der Klonierung und funktionellen Charakterisierung des ersten Serotonin-Rezeptors der Honigbiene ist eine Grundlage für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der serotonergen Signaltransduktion geschaffen worden.
Das Borna Disease Virus (BDV, Bornavirus) besitzt ein einzelsträngiges RNA-Genom negativer Polarität und ist innerhalb der Ordnung Mononegavirales der Prototyp einer eigenen Virusfamilie, die der Bornaviridae. Eine außergewöhnliche Eigenschaft des Virus ist seine nukleäre Transkription und Replikation, eine weitere besteht in seiner Fähigkeit, als neurotropes Virus sowohl in vivo als auch in vitro persistente Infektionen zu etablieren. Die zugrunde liegenden Mechanismen sowohl der Replikation als auch der Persistenz sind derzeit noch unzureichend verstanden, auch deshalb, weil das Virus noch relativ „jung“ ist: Erste komplette Sequenzen des RNA-Genoms wurden 1994 publiziert und erst vor einigen Monaten gelang die Generierung rekombinanter Viren auf der Basis klonierter cDNA. Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen das p10 Protein und das Phosphoprotein (P), die von der gemeinsamen Transkriptionseinheit II in überlappenden Leserahmen kodiert werden. Als im Kern der Wirtszelle replizierendes Virus ist das Bornavirus auf zelluläre Importmechanismen angewiesen, um den Kernimport aller an der Replikation beteiligten viralen Proteine zu gewährleisten. Das p10 Protein ist ein negativer Regulator der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (L). In vitro Importexperimente zeigten, dass p10 über den klassischen Importin alpha/beta abhängigen Kernimportweg in den Nukleus transportiert wird. Dies war unerwartet, da p10 kein vorhersagbares klassisches Kernlokalisierungssignal (NLS) besitzt und weist darauf hin, dass der zelluläre Importapparat offensichtlich flexibler ist als allgemein angenommen. Die ersten 20 N-terminalen AS vermitteln sowohl Kernimport als auch die Bindung an den Importrezeptor Importin alpha. Durch Di-Alanin-Austauschmutagenese wurden die für diesen Transportprozess essentiellen AS identifiziert und die Bedeutung hydrophober und polarer AS-Reste demonstriert. Die Fähigkeit des Bornavirus, persistente Infektionen zu etablieren, wirft die Frage auf, wie das Virus die zellulären antiviralen Abwehrmechanismen, insbesondere das Typ I Interferon (IFN)-System, unterwandert. Das virale P Protein wurde in dieser Arbeit als potenter Antagonist der IFN-Induktion charakterisiert. Es verhindert die Phosphorylierung des zentralen Transkriptionsfaktors IRF3 durch die zelluläre Kinase TBK1 und somit dessen Aktivierung. Der Befund, dass P mit TBK1 Komplexe bildet und zudem auch als Substrat für die zelluläre Kinase fungiert, erlaubt es, erstmalig einen Mechanismus zu postulieren, in dem ein virales Protein (BDV-P) als putatives TBK1-Pseudosubstrat die IRF3-Aktivierung kompetitiv hemmt.
Die Tailspike Proteine (TSP) der Bakteriophagen P22, Sf6 und HK620 dienen der Erkennung von Kohlenhydratstrukturen auf ihren gram-negativen Wirtsbakterien und zeigen, von den ersten 110 Aminosäuren des N-Terminus abgesehen, keine Sequenzübereinstimmung. Mit Röntgenkristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, dass HK620TSP und Sf6TSP ebenfalls zu einer parallelen, rechtsgängigen beta-Helix falten, wie dies schon für P22TSP bekannt war. Die Kohlenhydratbindestelle ist bei Sf6TSP im Vergleich zu P22TSP zwischen die Untereinheiten verschoben.
In den letzten 20 Jahren hat sich der Maiszünsler (Ostrinia nubilalis HÜBNER), aus der Schmetterlingsfamilie der Pyralidae oder Zünsler, zum bedeutendsten tierischen Schädling des Maises (Zea mays) entwickelt. Eine Möglichkeit den Befall des Maiszünslers abzuwenden, bietet der Anbau von Bacillus thuringiensis-Mais (Bt-Mais). Mit Hilfe der Gentechnik wurden Gene des Bakteriums Bacillus thuringiensis übertragen, die einen für Fraßinsekten giftigen Wirkstoff bilden, wodurch die Pflanzen während der kompletten Vegetation vor den Larven des Maiszünslers geschützt sind. Ziel des vorliegenden Projektes war es, in einer 3-jährigen Studie die Auswirkungen des großflächigen Anbaus von Bt-Mais auf die ökologische Situation und den Handlungsrahmen des integrierten Pflanzenschutzes komplex zu untersuchen. Dazu wurden in Betrieben im Oderbruch, das als permanentes Befallsgebiet des Maiszünslers gilt, in den Jahren 2002 bis 2004 jährlich zwei Felder mit jeweils einer Bt-Sorte und einer konventionellen Sorte angelegt. Zusätzlich wurden biologische und chemische Maiszünsler-Bekämpfungsvarianten geprüft. Durch verschiedene Methoden wie Bonituren, Ganzpflanzenernten, Bodenfallenfänge und Beobachtungen des Wahlverhaltens von (Flug-)insekten konnten Aussagen zum Vorkommen von Insekten und Spinnentieren getroffen werden, wobei hierfür Daten aus Untersuchungen der Jahre 2000 und 2001 im Oderbruch ergänzend herangezogen werden konnten. Durch Ertragsmessungen, Energie- und Qualitätsermittlungen, sowie Fusarium- und Mykotoxinanalysen konnte der Anbau von Bt-Mais als neue Alternative zur Bekämpfung des Maiszünslers bewertet werden. Bezüglich des Auftretens von Insekten und Spinnentieren wurden im Mittel der fünfjährigen Datenerhebung beim Vergleich der Bt-Sorte zur konventionellen Sorte, mit Ausnahme der fast 100 %igen Bekämpfung des Maiszünslers, keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Hierfür wurde ein besonderes Augenmerk auf Thripse, Wanzen, Blattläuse und deren Fraßfeinde, sowie mittels Bodenfallenfängen auf Laufkäfer und Spinnen gerichtet. Die erwarteten ökonomischen Vorteile wie etwa Ertragsplus oder bessere Nährstoff- und Energiegehalte durch geringeren Schaden beim Anbau von Bt-Mais als Silomais blieben in den Untersuchungsjahren aus. Allerdings zeigten Fusarium- und Mykotoxinanalysen eine geringere Belastung des Bt-Maises, was möglicherweise auf den geringeren Schaden zurückzuführen ist, da beschädigte Pflanzen für Fusarium und Mykotoxine anfälliger sind. Desweiteren konnten erste methodische Ansätze für ein auf EU-Ebene gefordertes, den Anbau von Bt-Mais begleitendes Monitoring, erarbeitet werden. So konnten Vorschläge für geeignete Methoden, deren Umfang sowie des Zeitpunktes der Durchführungen gemacht werden.
Das Superoxidradikal kann mit fast allen Bestandteilen von Zellen reagieren und diese schädigen. Die medizinische Forschung stellte eine Beteiligung des Radikals an Krebs, Herzinfarkten und neuraler Degeneration fest. Ein empfindlicher Superoxidnachweis ist daher zum besseren Verständnis von Krankheitsverläufen wichtig. Dabei stellen die geringen typischen Konzentrationen und seine kurze Lebensdauer große Anforderungen. Ziel dieser Arbeit war es zum einen, zwei neuartige Proteinarchitekturen auf Metallelektroden zu entwickeln und deren elektrochemisches Ansprechverhalten zu charakterisieren. Zum anderen waren diese Elektroden zur empfindlichen quantitativen Superoxiddetektion einzusetzen. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Protein-Multischichtelektrode aus Cytochrom c und dem Polyelektrolyten Poly(anilinsulfonsäure) nach dem Layer-by-layer-Verfahren aufgebaut. Für zwei bis 15 Schichten an Protein wurde eine deutliche Zunahme an elektrodenaktivem Cytochrom c mit jedem zusätzlichen Aufbringungsschritt nachgewiesen. Die Zunahme verlief linear und ergab bei 15 Schichten eine Zunahme der redoxaktiven Proteinmenge um deutlich mehr als eine Größenordnung. Während das formale Potential im Multischichtsystem sich im Vergleich zur Monoschichtelektrode nicht veränderte, wurde für die Kinetik eine Abhängigkeit der Geschwindigkeit des Elektronentransfers von der Zahl der Proteinschichten beobachtet. Mit zunehmender Scangeschwindigkeit trat ein reversibler Kontaktverlust zu den äußeren Schichten auf. Die lineare Zunahme an elektroaktivem Protein mit steigender Zahl an Depositionsschritten unterscheidet sich deutlich von in der Literatur beschriebenen Protein/Polyelektrolyt-Multischichtelektroden, bei denen ab etwa 6-8 Schichten keine Zunahme an elektroaktivem Protein mehr festgestelltwurde. Auch ist bei diesen die Zunahme an kontaktierbaren Proteinmolekülen auf das Zwei- bis Fünffache limitiert. Diese Unterschiede des neu vorgestellten Systems zu bisherigen Multischichtassemblaten erklärt sich aus einem in dieser Arbeit für derartige Systeme erstmals beschriebenen Elektronentransfermechanismus. Der Transport von Elektronen zwischen der Elektrodenoberfläche und den Proteinmolekülen in den Schichten verläuft über einen Protein-Protein-Elektronenaustausch. Dieser Mechanismus beruht auf dem schnellen Selbstaustausch von Cytochrom c-Molekülen und einer verbleibenden Rotationsflexibilität des Proteins im Multischichtsystem. Die Reduzierung des Proteins durch das Superoxidradikal und eine anschließende Reoxidation durch die Elektrode konnten nachgewiesen werden. In einem amperometrischen Messansatz wurde das durch Superoxidradikale hervorgerufene elektrochemische Signal in Abhängigkeit von der Zahl an Proteinschichten gemessen. Ein maximales Ansprechverhalten auf das Radikal wurde mit 6-Schichtelektroden erzielt. Die Empfindlichkeit der 6-Schichtelektroden wurde im Vergleich zum Literaturwert der Monoschichtelektrode um Faktor 14, also mehr als eine Größenordnung, verbessert. Somit konnte eine Elektrode mit 6 Schichten aus Cytochrom c und Poly(anilinsulfonsäure) als neuartiger Superoxidsensor mit einer 14-fachen Verbesserung der Empfindlichkeit im Vergleich zum bislang benutzten System entwickelt werden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt die Auswahl, Gewinnung und Charakterisierung von Mutanten des Proteins Cu,Zn-Superoxiddismutase zur elektrochemischen Quantifizierung von Superoxidradikalen. Monomere Mutanten des humanen dimeren Enzyms wurden entworfen, die durch Austausch von Aminosäuren ein oder zwei zusätzliche Cysteinreste besaßen, mit welchem sie direkt auf der Goldelektrodenoberfläche chemisorbieren sollten. 6 derartige Mutanten konnten in ausreichender Menge und Reinheit in aktiver Form gewonnen werden. Die Bindung der Superoxiddismutase-Mutanten an Goldoberflächen konnte durch Oberflächen-plasmonresonanz und Impedanzspektroskopie nachgewiesen werden. Alle Mutanten wiesen einen quasi-reversiblen Elektronentransfer zwischen SOD und Elektrode auf. Durch Untersuchung von kupferfreien SOD-Mutanten sowie des Wildtyps konnte nachgewiesen werden, das die Mutanten über die eingefügten Cysteinreste auf der Elektrode chemisorptiv gebunden wurden und der Elektronentransfer zwischen der Elektrode und dem Kupfer im aktiven Zentrum der SOD erfolgte. Die Superoxiddismutase katalysiert die Zersetzung von Superoxidmolekülen durch Oxidation und durch Reduktion der Radikale. Somit sind beide Teilreaktionen von analytischem Interesse. Zyklovoltammetrisch konnte sowohl die Oxidation als auch die Reduktion des Radikals durch die immobilisierten Superoxiddismutase-Mutanten nachgewiesen werden. In amperometrischen Messanordnungen konnten beide Teilreaktionen zur analytischen Quantifizierung von Superoxidradikalen genutzt werden. Im positiven Potentialfenster wurde die Empfindlichkeit um einen Faktor von etwa 10 gegenüber der Cytochrom c–Monoschichtelektrode verbessert.
Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des multidisziplinären Deutsch-Russischen Verbundprojektes "Laptev See 2000" erstellt. Die dargestellten bodenkundlichen und mikro-biologischen Untersuchungen verfolgten das Ziel die mikrobielle Lebensgemeinschaft eines Permafrostbodens im sibirischen Lena Delta zu charakterisieren, wobei den methanogenen Archaea besondere Beachtung zukam. Die Probennahme wurde im August 2001 im zentralen Lenadelta, auf der Insel Samoylov durchgeführt. Das Delta liegt im Bereich des kontinuierlichen Permafrostes, was bedeutet, dass nur eine flache saisonale Auftauschicht während der Sommermonate auftaut. Das untersuchte Bodenprofil lag im Zentrum eines für die Landschaft repräsentativen Low Center Polygons. Zum Zeitpunkt der Beprobung betrug die Auftautiefe des untersuchten Bodens 45 cm.. Der Wasserstand lag zum Untersuchungszeitpunkt 18 cm unter der Geländeoberfläche, so dass alle tiefer liegenden Horizonte durch anaerobe Verhältnisse charakterisiert waren. Die Untersuchung der bodenkundlichen Parameter ergab unter anderem eine mit zunehmender Tiefe abnehmende Konzentration von Kohlenstoff und Stickstoff, sowie eine Abnahme von Temperatur und Wurzeldichte. Um die Auswirkungen der sich mit der Tiefe verändernden Bodeneigenschaften auf die Mikroorganismen zu ermitteln, wurden die Mikroorganismenpopulationen der verschiedenen Bodentiefen mit Hilfe der Fluoreszenz in situ Hybridisierung hinsichtlich ihrer Anzahl, Aktivität und Zusammensetzung beschrieben. Für die Charakterisierung des physiologischen Profils dieser Gemeinschaften, bezüglich der von ihr umsetzbaren Kohlenstoffverbindungen, wurden BIOLOG Mikrotiterplatten unter den in situ Bedingungen angepassten Bedingungen eingesetzt. Die sich im Profil verändernden Bodenparameter, vor allem die abnehmende Substratversorgung, die geringe Temperatur und die anaeroben Verhältnisse in den unteren Bodenschichten führten zu einer Veränderung der Mikroorganismenpopulation im Bodenprofil. So nahm von oben nach unten die Gesamtanzahl der ermittelten Mikroorganismen von 23,0 × 108 auf 1,2 × 108 Zellen g-1 ab. Gleichzeitig sank der Anteil der aktiven Zellen von 59% auf 33%. Das bedeutet, dass im Bereich von 0-5 cm 35mal mehr aktive Zellen g-1 als im Bereich von 40-45 cm gefunden wurden. Durch den Einsatz spezieller rRNS-Sonden konn-te zusätzlich eine Abnahme der Diversität mit zunehmender Bodentiefe nachgewiesen werden. Die geringere Aktivität der Population in den unteren Horizonten sowie die Unterschiede in der Zusammensetzung wirkten sich auf den Abbau der organischen Substanz aus. So wur-den die mit Hilfe der BIOLOG Mikrotiterplatten angebotenen Substanzen in größerer Tiefe langsamer und unvollständiger abgebaut. Insbesondere in den oberen 5 cm konnten einige der angebotenen Polymere und Kohlehydrate deutlich besser als im restlichen Profil umge-setzt werden. Das außerdem unter anaeroben Versuchsbedingungen diese Substrate deutlich schlechter umgesetzt wurden, kann so interpretiert werden, dass die konstant anaeroben Bedingungen in den unteren Horizonten ein Auftreten der Arten, die diese Substrate umset-zen, erschweren. Die in den oberen, aeroben Bodenabschnitten wesentlich höheren Zellzahlen und Aktivitäten und die dadurch schnellere C-Umsetzung führen auch zu einer besseren Substratversorgung der methanogenen Archaea in den makroskopisch aeroben Horizonten. Die erhöhte Substratverfügbarkeit erklärt die Tatsache, dass im Bereich von 0-5 cm die meisten methanogenen Archaea gefunden wurden, obwohl sich dieser Bereich zum Zeitpunkt der Probennahme oberhalb des wassergesättigten Bodenbereichs befand. Trotz der aeroben Bedingungen in, liegt im Bereich von 5 10 cm die für die methanogenen Archaea am besten geeignete Kombination aus Substratangebot und anaeroben Nischen vor. Hinzu kommt, dass in diesen Tiefen die Sommertemperaturen etwas höher liegen als in den tieferen Horizonten, was wiederum die Aktivität positiv beeinflusst. Bei zusammenfassender Betrachtung der Untersuchungsergebnisse von Anzahl, Aktivität, Zusammensetzung und Leistung der gesamten, aber im besonderen auch der methanogenen Mikroorganismenpopulation wird deutlich, dass in dem untersuchten Bodenprofil unter ökologischen Gesichtspunkten die oberen 15-20 cm den für den C-Umsatz relevantesten Bereich darstellen. Das Zusammenspiel wichtiger Bodenparameter wie Bodentemperatur, Wasserstand, Nährstoffversorgung und Durchwurzelung führt dazu, dass in dem untersuchten Tundraboden in den oberen 15-20 cm eine wesentlich größere und diversere Anzahl an Mikroorganismen existiert, die für einen schnelleren und umfassenderen Kohlenstoffumsatz in diesem Bereich des active layers sorgt.
Bei konventionellen Mikroarray-Experimenten zur Genexpressionsanalyse wird fluoreszenz- oder radioaktiv-markierte cDNA oder RNA mit immobilisierten Proben hybridisiert. Für ein gut detektierbares und auswertbares Ergebnis werden jedoch pro Array mindestens 15 - 20 µg Hybridisierungstarget benötigt. Dazu müssen entweder 15 - 20 µg RNA direkt durch Reverse Transkription in markierte cDNA umgeschrieben werden oder bei Vorhandensein von weniger Startmaterial die RNA amplifiziert werden (Standard- Affymetrix-Protokolle, Klur et al. 2004). Oft sind damit zeit- und kostenintensive Probenpräparationen verbunden und das Ergebnis ist nicht immer reproduzierbar. Obwohl es inzwischen einige Protokolle gibt, die dieses Problem zu lösen versuchen (Zhang et al. 2001, Iscove et al. 2002, McClintick et al. 2003, Stirewalt et al. 2004), eine optimale, leicht handbare und reproduzierbare Methode gibt es weiterhin nicht, weshalb in dieser Arbeit ein weiterer Lösungsansatz gesucht wurde. In der vorgestellten Arbeit werden zwei einfache Methoden beschrieben, mit denen Gene aus geringen RNA-Mengen nachgewiesen werden können: erstens die On Chip- RT-PCR mit cDNA als Matrize und zweitens diese Methode als One-Step-Reaktion mit RNA als Matrize. Beide Methoden beruhen auf dem Prinzip der PCR an immobilisierten Primern auf einer Chipoberfläche. Diese Möglichkeit der exponentiellen Amplifikation ist reproduzierbar und sensitiv. In Experimenten zur Etablierung des On-Chip-PCR-Systems wurden für die Immobilisierung der Primer verschiedene Kopplungsmethoden verwendet. Die affine Kopplung über Biotin- Streptavidin erwies sich als geeignet. Die On-Chip-Reaktion an kovalent gebundenen Primern wurde für amino-modifizierte Primer auf Epoxy-Oberflächen sowie für EDC-Kopplung auf silanisierten Oberflächen gezeigt. Für die letztgenannte Methode wurde die On-Chip-PCR optimiert, dass Spottingkonzentrationen der Primer von 5 - 10µM schon ausreichend sind. Der Einsatz von fluoreszenz-markierten Primern während der PCR ermöglicht eine unmittelbare Auswertung nach der Synthese ohne zusätzliche Detektionsschritte. In dieser Arbeit konnte außerdem mit der vorgestellten Methode der simultane Nachweis zweier Gene gezeigt werden. Die Methode kann noch als Multiplex-Analyse ausgebaut werden, um so mehrere Gene in gleichzeitig einem Ansatz nachweisen zu können. Die Ergebnisse der Versuche mit Matrizen aus unterschiedlichen Zelltypen deuten darauf hin, dass die On-Chip-RT-PCR eine weitere optimale Methode für den Nachweis von gering exprimierten Genen bietet.
Für ein tiefergehendes Verständnis von Entwicklung und Funktion der quergestreiften Muskulatur ist eine Betrachtung der am Aufbau der Myofibrillen, den kontraktilen Organellen, beteiligten Proteine essentiell. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Myomesin, einem Protein der sarkomeren M-Bande. Zunächst wurde die cDNA des humanen Myomesins vollständig kloniert, sequenziert und nachfolgend die komplette Größe der aminoterminalen Kopfdomäne bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß Myomesin in vitro mit den Domänen 1 und 12 an Myosin bindet. Die muskelspezifische Isoform der Kreatinkinase bindet an die Domänen 7 und 8. Stimulations- und Inhibitionsexperimente belegen, daß Myomesin an Serin 618 in vivo durch die Proteinkinase A phosphoryliert wird und daß diese Phosphorylierung durch Aktivierung beta2-adrenerger Rezeptoren stimulierbar ist. In Muskelgewebeproben von Patienten, die an der Hypertrophen Kardiomyopathie, einer genetisch bedingten Herzmuskelkrankheit, erkrankt sind, konnte mit einem neu hergestellten phosphorylierungsabhängigen Antikörper eine Verminderung der Menge phosphorylierten Myomesins nachgewiesen werden. Mögliche Ursachen werden diskutiert. Myomesin bildet Dimere, wie durch hefegenetische und biochemische Experimente gezeigt werden konnte. Die Dimerisierung von Myomesin könnte eine zentrale Rolle für den Einbau der Myosinfilamente in die naszierende Myofibrille haben. Anhand der gewonnenen Daten wurde ein verbessertes Modell der zentralen M-Bande erstellt.