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Diabetes is a major public health problem with increasing global prevalence. Type 2 diabetes (T2D), which accounts for 90% of all diagnosed cases, is a complex polygenic disease also modulated by epigenetics and lifestyle factors. For the identification of T2D-associated genes, linkage analyses combined with mouse breeding strategies and bioinformatic tools were useful in the past. In a previous study in which a backcross population of the lean and diabetes-prone dilute brown non-agouti (DBA) mouse and the obese and diabetes-susceptible New Zealand obese (NZO) mouse was characterized, a major diabetes quantitative trait locus (QTL) was identified on chromosome 4. The locus was designated non-insulin dependent diabetes from DBA (Nidd/DBA). The aim of this thesis was (i) to perform a detailed phenotypic characterization of the Nidd/DBA mice, (ii) to further narrow the critical region and (iii) to identify the responsible genetic variant(s) of the Nidd/DBA locus. The phenotypic characterization of recombinant congenic mice carrying a 13.6 Mbp Nidd/DBA fragment with 284 genes presented a gradually worsening metabolic phenotype. Nidd/DBA allele carriers exhibited severe hyperglycemia (~19.9 mM) and impaired glucose clearance at 12 weeks of age. Ex vivo perifusion experiments with islets of 13-week-old congenic mice revealed a tendency towards reduced insulin secretion in homozygous DBA mice. In addition, 16-week-old mice showed a severe loss of β-cells and reduced pancreatic insulin content. Pathway analysis of transcriptome data from islets of congenic mice pointed towards a downregulation of cell survival genes. Morphological analysis of pancreatic sections displayed a reduced number of bi-hormonal cells co-expressing glucagon and insulin in homozygous DBA mice, which could indicate a reduced plasticity of endocrine cells in response to hyperglycemic stress. Further generation and phenotyping of recombinant congenic mice enabled the isolation of a 3.3 Mbp fragment that was still able to induce hyperglycemia and contained 61 genes. Bioinformatic analyses including haplotype mapping, sequence and transcriptome analysis were integrated in order to further reduce the number of candidate genes and to identify the presumable causative gene variant. Four putative candidate genes (Ttc39a, Kti12, Osbpl9, Calr4) were defined, which were either differentially expressed or carried a sequence variant. In addition, in silico ChIP-Seq analyses of the 3.3 Mbp region indicated a high number of SNPs located in active regions of binding sites of β-cell transcription factors. This points towards potentially altered cis-regulatory elements that could be responsible for the phenotype conferred by the Nidd/DBA locus. In summary, the Nidd/DBA locus mediates impaired glucose homeostasis and reduced insulin secretion capacity which finally leads to β-cell death. The downregulation of cell survival genes and reduced plasticity of endocrine cells could further contribute to the β-cell loss. The critical region was narrowed down to a 3.3 Mbp fragment containing 61 genes, of which four might be involved in the development of the diabetogenic Nidd/DBA phenotype.
Investigation of Sirtuin 3 overexpression as a genetic model of fasting in hypothalamic neurons
(2021)
The central melanin-concentrating hormone (MCH) system has been intensively studied for its involvement in the regulation of feeding behaviour and body weight regulation. The importance of the neuropeptide MCH in the control of energy balance has been underlined by MCH knock out and Melanin-concentrating hormone receptor subtype 1 (MCHR-1) knock-out animals. The anorectic and anti-obesity effects of selective MCHR-1 antagonists have confirmed the notion that pharmacological blockade of MCHR-1 is a potential therapeutic approach for obesity. First aim of this work is to study the neurochemical “equipment” of MCHR-1 immunoreactive neurons by double-labelling immunohistochemistry within the rat hypothalamus. Of special interest is the neuroanatomical identification of other hypothalamic neuropeptides that are co-distributed with MCHR-1. A second part of this study deals with the examination of neuronal activation patterns after pharmacological or physiological, feeding-related stimuli and was introduced to further understand central regulatory mechanisms of the MCH system. In the first part of work, I wanted to neurochemically characterize MCHR-1 immunoreactive neurons in the rat hypothalamus for colocalisation with neuropeptides of interest. Therefore I performed an immunohistochemical colocalisation study using a specific antibody against MCHR-1 in combination with antibodies against hypothalamic neuropeptides. I showed that MCHR-1 immunoreactivity (IR) was co-localised with orexin A in the lateral hypothalamus, and with adrenocorticotropic hormone and neuropeptide Y in the arcuate nucleus. Additionally, MCHR-1 IR was co-localised with the neuropeptides vasopressin and oxytocin in magnocellular neurons of the supraoptic and paraventricular hypothalamic nucleus and corticotrophin releasing hormone in the parvocellular division of the paraventricular hypothalamic nucleus. Moreover, for the first time MCHR-1 immunoreactivity was found in both the adenohypophyseal and neurohypophyseal part of the rat pituitary. These results provide the neurochemical basis for previously described potential physiological actions of MCH at its target receptor. In particular, the MCHR-1 may be involved not only in food intake regulation, but also in other physiological actions such as fluid regulation, reproduction and stress response, possibly through here examined neuropeptides. Central activation patterns induced by pharmacological or physiological stimulation can be mapped using c-Fos immunohistochemistry. In the first experimental design, central administration (icv) of MCH in the rat brain resulted in acute and significant increase of food and water intake, but this animal treatment did not induce a specific c-Fos induction pattern in hypothalamic nuclei. In contrast, sub-chronic application of MCHR-1 antagonist promoted a significant decrease in food- and water intake during an eight day treatment period. A qualitative analysis of c-Fos immunohistochemistry of sections derived from MCHR-1 antagonist treated animals showed a specific neuronal activation in the paraventricular nucleus, the supraoptic nucleus and the dorsomedial hypothalamus. These results could be substantiated by quantitative evaluation of an automated, software-supported analysis of the c-Fos signal. Additionally, I examined the activation pattern of rats in a restricted feeding schedule (RFS) to identify pathways involved in hunger and satiety. Animals were trained for 9 days to feed during a three hour period. On the last day, food restricted animals was also allowed to feed for the three hours, while food deprived (FD) animals did not receive food. Mapping of neuronal activation showed a clear difference between stareved (FD) and satiated (FR) rats. FD animals showed significant induction of c-Fos in forebrain regions, several hypothalamic nuclei, amygdaloid thalamus and FR animals in the supraoptic nucleus and the paraventricular nucleus of the hypothalamus, and the nucleus of the solitary tract. In the lateral hypothalamus of FD rats, c-Fos IR showed strong colocalisation for Orexin A, but no co-staining for MCH immunoreactivity. However, a large number of c-Fos IR neurons within activated regions of FD and FR animals was co-localised with MCHR-1 within selected regions. To conclude, the experimental set-up of scheduled feeding can be used to induce a specific hunger or satiety activation pattern within the rat brain. My results show a differential activation by hunger signals of MCH neurons and furthermore, demonstrates that MCHR-1 expressing neurons may be essential parts of downstream processing of physiological feeding/hunger stimuli. In the final part of my work, the relevance of here presented studies is discussed with respect to possible introduction of MCHR-1 antagonists as drug candidates for the treatment of obesity.
The trace elements zinc and manganese are essential for human health, especially due to their enzymatic and protein stabilizing functions. If these elements are ingested in amounts exceeding the requirements, regulatory processes for maintaining their physiological concentrations (homeostasis) can be disturbed. Those homeostatic dysregulations can cause severe health effects including the emergence of neurodegenerative disorders such as Parkinson’s disease (PD). The concentrations of essential trace elements also change during the aging process. However, the relations of cause and consequence between increased manganese and zinc uptake and its influence on the aging process and the emergence of the aging-associated PD are still rarely understood. This doctoral thesis therefore aimed to investigate the influence of a nutritive zinc and/or manganese oversupply on the metal homeostasis during the aging process. For that, the model organism Caenorhabditis elegans (C. elegans) was applied. This nematode suits well as an aging and PD model due to properties such as its short life cycle and its completely sequenced, genetically amenable genome. Different protocols for the propagation of zinc- and/or manganese-supplemented young, middle-aged and aged C. elegans were established. Therefore, wildtypes, as well as genetically modified worm strains modeling inheritable forms of parkinsonism were applied. To identify homeostatic and neurological alterations, the nematodes were investigated with different methods including the analysis of total metal contents via inductively-coupled plasma tandem mass spectrometry, a specific probe-based method for quantifying labile zinc, survival assays, gene expression analysis as well as fluorescence microscopy for the identification and quantification of dopaminergic neurodegeneration.. During aging, the levels of iron, as well as zinc and manganese increased.. Furthermore, the simultaneous oversupply with zinc and manganese increased the total zinc and manganese contents to a higher extend than the single metal supplementation. In this relation the C. elegans metallothionein 1 (MTL-1) was identified as an important regulator of metal homeostasis. The total zinc content and the concentration of labile zinc were age-dependently, but differently regulated. This elucidates the importance of distinguishing these parameters as two independent biomarkers for the zinc status. Not the metal oversupply, but aging increased the levels of dopaminergic neurodegeneration. Additionally, nearly all these results yielded differences in the aging-dependent regulation of trace element homeostasis between wildtypes and PD models. This confirms that an increased zinc and manganese intake can influence the aging process as well as parkinsonism by altering homeostasis although the underlying mechanisms need to be clarified in further studies.
Das 1817 erstmals schriftlich erwähnte Selen galt lange Zeit nur als toxisch und sogar als procancerogen, bis es 1957 von Schwarz und Foltz als essentielles Spurenelement erkannt wurde, dessen biologische Funktionen in Säugern durch Selenoproteine vermittelt werden. Die Familie der Glutathionperoxidasen nimmt hierbei eine wichtige Stellung ein. Für diese sind konkrete Funktionen und die dazugehörigen molekularen Mechanismen, welche über die von ihnen katalysierte Hydroperoxidreduktion und damit verbundene antioxidative Kapazität hinausgehen, bislang nur unzureichend beschrieben worden. Die Funktion der gastrointestinalen Glutathionperoxidase (GI-GPx) wird als Barriere gegen eine Hydroperoxidabsorption im Gastrointestinaltrakt definiert. Neuen Erkenntnissen zufolge wird die GI-GPx aber auch in verschiedenen Tumoren verstärkt exprimiert, was weitere, bis dato unbekannte, Funktionen dieses Enzymes wahrscheinlich macht. Um mögliche neue Funktionen der GI-GPx, vor allem während der Cancerogenese, abzuleiten, wurde hier die transkriptionale Regulation der GI-GPx detaillierter untersucht. Die Sequenzanalyse des humanen GI-GPx-Promotors ergab das Vorhandensein von zwei möglichen "antioxidant response elements" (ARE), bei welchen es sich um Erkennungssequenzen des Transkriptionsfaktors Nrf2 handelt. Die meisten der bekannten Nrf2-Zielgene gehören in die Gruppe der Phase-II-Enzyme und verfügen über antioxidative und/oder detoxifizierende Eigenschaften. Sowohl auf Promotorebene als auch auf mRNA- und Proteinebene konnte die Expression der GI-GPx durch typische, in der Nahrung enthaltene, Nrf2-Aktivatoren wie z.B. Sulforaphan oder Curcumin induziert werden. Eine direkte Beteiligung von Nrf2 wurde durch Cotransfektion von Nrf2 selbst bzw. von Keap1, das Nrf2 im Cytoplasma festhält, demonstriert. Somit konnte die GI-GPx eindeutig als Nrf2-Zielgen identifiziert werden. Ob sich die GI-GPx in die Gruppe der antiinflammatorischen und anticancerogenen Phase-II-Enzyme einordnen lässt, bleibt noch zu untersuchen. Die Phospholipidhydroperoxid Glutathionperoxidase (PHGPx) nimmt aufgrund ihres breiten Substratspektrums, ihrer hohen Lipophilie und ihrer Fähigkeit, Thiole zu modifizieren, eine Sonderstellung innerhalb der Familie der Glutathionperoxidasen ein. Mit Hilfe eines PHGPx-überexprimierenden Zellmodells wurden deshalb Beeinflussungen des zellulären Redoxstatus und daraus resultierende Veränderungen in der Aktivität redoxsensitiver Transkriptionsfaktorsysteme und in der Expression atheroskleroserelevanter Adhäsionsmoleküle untersucht. Als Transkriptionsfaktoren wurden NF-kB und Nrf2 ausgewählt. Die Bindung von NF-kB an sein entsprechendes responsives Element in der DNA erfordert das Vorhandensein freier Thiole, wohingegen Nrf2 durch Thiolmodifikation von Keap1 freigesetzt wird und in den Kern transloziert. Eine erhöhte Aktivität der PHGPx resultierte in einer Erhöhung des Verhältnisses von GSH zu GSSG, andererseits aber in einer verminderten Markierbarkeit freier Proteinthiole. PHGPx-Überexpression reduzierte die IL-1-induzierte NF-kB-Aktivität, die sich in einer verminderten NF-kB-DNA-Bindefähigkeit und Transaktivierungsaktivität ausdrückte. Auch war die Proliferationsrate der Zellen vermindert. Die Expression des NF-kB-regulierten vaskulären Zelladhäsionsmoleküls, VCAM-1, war ebenfalls deutlich verringert. Umgekehrt war in PHGPx-überexprimierenden Zellen eine erhöhte Nrf2-Aktivität und Expression der Nrf2-abhängigen Hämoxygenase-1 zu verzeichnen. Letzte kann für die meisten der beobachteten Effekte verantwortlich gemacht werden. Die hier dargestellten Ergebnisse verdeutlichen, dass eine Modifizierung von Proteinthiolen als wichtige Determinante für die Regulation der Expression und Funktion von Glutathionperoxidasen angesehen werden kann. Entgegen früheren Vermutungen, welche oxidative Vorgänge generell mit pathologischen Veränderungen assoziierten, scheint ein moderater oxidativer Stress, bedingt durch eine transiente Thiolmodifikation, durchaus günstige Auswirkungen zu haben, da, wie hier dargelegt, verschiedene, miteinander interagierende, cytoprotektive Mechanismen ausgelöst werden. Hieran wird deutlich, dass sich "antioxidative Wirkung" oder "oxidativer Stress" keineswegs nur auf "gute" oder "schlechte" Vorgänge beschränken lassen, sondern im Zusammenhang mit den beeinflussten (patho)physiologischen Prozessen und dem Ausmaß der "Störung" des physiologischen Redoxgleichgewichtes betrachtet werden müssen.
Die Toxizität und Kanzerogenität von rein aromatischen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) ist seit Jahrzehnten bekannt und umfassend erforscht. Die alkylierten PAK (alkPAK) besitzen jedoch aufgrund ihrer Alkylgruppe eine weitere Möglichkeit zur Bioaktivierung und müssen daher gesondert betrachtet werden. Die Alkylgruppe wird zunächst hydroxyliert, anschließend zur Säure oxidiert oder direkt konjugiert. Entstehen hierbei instabile benzylische Sulfokonjugate, so können diese DNA-Addukte bilden und zu Mutationen führen. In Hinblick auf die Bioaktivierung von alkPAK galt es daher zu klären welchen Einfluss die Struktur auf die benzylische Hydroxylierung hat und welche humanen Formen der löslichen Sulfotransferasen besonders an der Umsetzung der alkPAK-Derivate beteiligt sind. Die Untersuchung der Albuminbindung von Schwefelsäureestern sowie ihre Aufnahme in Nierenzellen sollten Aufschluss hinsichtlich möglicher Transportvorgänge geben. Für die in-vivo-Situation wurde weiterhin die Modulation des Metabolismus ausgewählter benzylischer Alkohole durch verschiedene Nahrungsmittelbestandteile, Arzneimittel und Fremdstoffe an Ratten untersucht. Als Biomarker wurden benzylische Carbonsäuren im Urin und die entsprechenden Mercaptursäuren in Urin und Fäzes betrachtet. Zunächst wurde anhand von Inkubationen mit Rattenlebermikrosomen festgestellt, dass insbesondere größere Ringsystemen wie etwa alkylierte Benzo[a]pyrene im Gegensatz zu Methylpyrenen in wesentlich geringerem Umfang zum benzylischen Alkohol umgesetzt werden. Dies wurde auch in Untersuchungen mit humanen Lebermikrosomen bestätigt. Untersuchungen an einzelnen humanen Cytochromen P450 zeigten, dass insbesondere die durch PAK induzierbaren Formen hCYP1A1 und 1B1 hohe Umsatzraten aufwiesen. Die hepatisch exprimierten Formen hCYP1A2 und 3A4 waren jedoch auch zur Bildung der benzylischen Alkohole in der Lage. Für die anschließende Sulfonierung der benzylischen Alkohole wurden besonders hohe Aktivitäten mit den humanen Sulfotransferasen hSULT1A1, 1A2, 1C2 und 1E1 festgestellt. Aufgrund der Enzymexpression und der guten Durchblutung, die eine gute Substratversorgung ermöglicht, ist die Leber als Hauptort der benzylischen Hydroxylierung und Sulfonierung anzusehen. Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zeigen jedoch, dass nach 1-Hydroxymethylpyren-Applikation bei Ratten die Niere die höchste Zahl an DNA-Addukten aufweist. Wegen der Fokussierung der Sulfonierung auf die Leber ist die systemische Verteilung der Schwefelsäureester die einzig plausible Erklärung. So wurde im Rahmen dieser Arbeit eine hochaffine Bindungsstelle für 2-Sulfoxymethylpyren an Albumin beschrieben und die Aufnahme von benzylischen Sulfaten durch die humanen organischen Anionentransporter hOAT1, 3 und 4 in Nierenzellen in vitro gezeigt. Für die in-vivo-Situation wurde der Einfluss von Ethanol, 4-Methylpyrazol, Pentachlorphenol, Quercetin und Disulfiram untersucht. Neben der durch die Detoxifizierung mittels Alkoholdehydrogenase und Aldehyddehydrogenase entstandenen benzylischen Carbonsäure kann als Biomarker die entsprechende Mercaptursäure herangezogen werden. Sie ist ein indirekter Nachweis für die reaktiven und toxischen benzylischen Sulfate der alkPAK. Für die beiden im Tierversuch eingesetzten benzylischen Alkohole (1-Hydroxymethylpyren und 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren) konnte sie in Urin und Fäzes nachgewiesen werden. Es wurde jedoch ein deutlicher Unterschied in der gebildeten Menge sowie der Verteilung zwischen Urin und Fäzes für die beiden Mercaptursäuren festgestellt. Hierfür sind wahrscheinlich Unterschiede im Transport der benzylischen Schwefelsäureester sowie der Spezifität der an der Mercaptursäurebildung beteiligten Enzyme verantwortlich. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass der humane organische Anionentransporter hOAT1 1,8-Dimethylpyrenmercaptursäure nicht und der hOAT3 nur mit niedrigen Umsatzraten transportiert. Bei den Modulatoren zeigte die Gabe der kompetitiven Alkoholdehydrogenase-Hemmstoffe Ethanol und 4-Methylpyrazol die Bedeutung der Alkoholdehydrogenasen für die Entgiftung der benzylischen Alkohole: Die Oxidation zur entsprechenden Carbonsäure war reduziert und die Bildung der Mercaptursäure erhöht. Eine Hemmung der Toxifizierung vermittelt durch Sulfotransferase-Inhibitoren konnte nur für Pentachlorphenol beim Metabolismus des 1-Hydroxymethylpyrens beobachtet werden. Gleichzeitig erwies sich Pentachlorphenol als kompetitiver Alkoholdehydrogenase-Inhibitor, da eine signifikant geminderte Carbonsäureausscheidung zu beobachten war. Bei 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren traten diese Effekte nicht auf. Die unterschiedlichen bzw. unterschiedlich starken Effekte der Modulatoren beim Metabolismus der verschiedenen benzylischen Alkohole bestätigen die Beobachtungen aus den in-vitro-Untersuchungen, dass unterschiedliche Enzym- und Transporteraffinitäten und –aktivitäten vorliegen.
Der ubiquitär exprimierte, multifunktionale Glucosetransporter GLUT8 gehört zur Klasse III der Familie der passiven Glucosetransporter, die aus insgesamt 14 Proteinen besteht. Die fünf Mitglieder der Klasse IIII unterscheiden sich strukturell leicht von den Mitgliedern der Klasse I und II (Joost und Thorens, 2001). GLUT8 besitzt ein N-terminales Dileucin-Motiv, das Teil eines [DE]XXXL[LI] Motivs ist, welches für die Sortierung des Transporters in späte Endosomen und Lysosomen verantwortlich ist (Augustin et al., 2005). Da bis heute kein Signal identifiziert wurde, das eine Translokation des Transporters zur Plasmamembran auslöst, wird eine intrazelluläre Funktion von GLUT8 vermutet (Widmer et al., 2005). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die intrazelluläre Funktion des Transporters in der Regulation der Glucosehomöostase des Körpers durch Analyse einer Slc2a8-knockout-Maus untersucht. Die homozygote Deletion des Transporters erbrachte lebensfähige Nachkommen, die sich augenscheinlich nicht von ihren Wildtyp-Geschwistern unterschieden. Allerdings wurde bei Verpaarungen heterozygoter Mäuse eine verminderte Anzahl an Slc2a8-/--Nachkommen beobachtet, die signifikant von der erwarteten Mendel’schen Verteilung abwich. Da Slc2a8 die höchste mRNA-Expression in den Testes aufwies und die Überprüfung der Fertilität mittels verschiedener homozygoter Verpaarungen eine Störung der weiblichen Fortpflanzungsfähigkeit ausschloss, wurden die Spermatozoen der Slc2a8-/--Mäuse eingehender untersucht. Als Ursache für die verringerte Anzahl von Slc2a8-/--Geburten wurde eine verminderte Prozentzahl motiler Slc2a8-/--Spermien ermittelt, die durch eine unzureichende mitochondriale Kondensation in den Spermien bedingt war. Diese Veränderung war mit einem reduzierten mitochondrialen Membranpotential assoziiert, was eine verminderte ATP-Produktion nach sich zog. Somit scheint GLUT8 in den Spermien an einem intrazellulären Transportprozess beteiligt zu sein, der einen Einfluss auf die oxidative Phosphorylierung der Mitochondrien ausübt. Im Gehirn wurde Slc2a8 besonders stark im Hippocampus exprimiert, der in der Regulation von körperlicher Aktivität, Explorationsverhalten, Erinnerungs- und Lernprozessen sowie Angst- und Stressreaktionen eine Rolle spielt. Außerdem wurde GLUT8 im Hypothalamus nachgewiesen, der unter anderem an der Regulation der Nahrungsaufnahme beteiligt ist. Die Slc2a8-/--Mäuse zeigten im Vergleich zu ihren Slc2a8+/+-Geschwistern eine signifikant gesteigerte körperliche Aktivität, die zusammen mit der von Membrez et al. (2006) publizierten erhöhten Zellproliferation im Hippocampus auf eine Nährstoffunterversorgung dieses Areals hindeutet. Die Nahrungsaufnahme war in Abwesenheit von GLUT8 nicht verändert, was zusammen mit dem nur geringfügig niedrigeren Körpergewicht der Slc2a8-/--Mäuse eine Funktion von GLUT8 im Glucose-sensing der Glucose-sensitiven Neurone des Gehirns ausschließt. Das leicht reduzierte Körpergewicht der Slc2a8-/--Mäuse ließ sich keinem bestimmten Organ- oder Gewebetyp zuordnen, sondern schien durch eine marginale Gewichtsreduktion aller untersuchten Gewebe bedingt zu sein. Zusammen mit den erniedrigten Blutglucosespiegeln und der anscheinend gesteigerten Lebenserwartung zeigten die Slc2a8-/--Mäuse Symptome einer leichten Nährstoffunterversorgung. GLUT8 scheint daher am Transport von Zuckerderivaten, die während des lysosomalen/endosomalen Abbaus von Glykoproteinen anfallen, beteiligt zu sein. Die so wiederaufbereiteten Zucker dienen dem Körper offenbar als zusätzliche Energiequelle.
Sex-specific differences in the regulation of body weight dynamics and adipose tissue metabolism
(2014)
Kolorektalkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Tumorerkrankung weltweit. Neben dem Alter spielt auch die Ernährung eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Krankheit. Eine vermutlich krebspräventive Wirkung wird dabei dem Spurenelement Selen zugeschrieben, das fast ausschließlich über Lebensmittel aufgenommen wird. So hängt beispielsweise ein niedriger Selenstatus mit dem Risiko, im Laufe des Lebens an CRC zu erkranken, zusammen. Seine Funktionen vermittelt Selen dabei überwiegend durch Selenoproteine, in denen es in Form von Selenocystein eingebaut wird. Zu den bisher am besten untersuchten Selenoproteinen mit möglicher Funktion während CRC zählen die Glutathionperoxidasen (GPXen). Die Mitglieder dieser Familie tragen aufgrund ihrer Hydroperoxid-reduzierenden Eigenschaften entscheidend zum Schutz der Zellen vor oxidativem Stress bei. Dies kann je nach Art und Stadium des Tumors entweder krebshemmend oder -fördernd wirken, da auch transformierte Zellen von dieser Schutzfunktion profitieren.
In dieser Arbeit wurde die GPX2 in HT29-Darmkrebszellen mithilfe stabil-transfizierter shRNA herunterreguliert, um die Funktion des Enzyms vor allem in Hinblick auf regulierte Signalwege zu untersuchen. Ein Knockdowns (KD) der strukturell ähnlichen GPX1 kam ebenfalls zum Einsatz, um gezielt Isoform-spezifische Funktionen unterscheiden zu können. Anhand eines PCR-Arrays wurden Signalwege identifiziert, die auf einen Einfluss der beiden Proteine im Zellwachstum hindeuteten. Anschließende Untersuchungen ließen auf einen verminderten Differenzierungsstatus in den GPX1- und GPX2-KDs aufgrund einer geringeren Aktivität der Alkalischen Phosphatase schließen. Zudem war die Zellviabilität im Neutralrot-Assay (NRU) bei Fehlen der GPX1 bzw. GPX2 im Vergleich zur Kontrolle reduziert. Die Ergebnisse des PCR-Arrays, und speziell für die GPX2 frühere Untersuchungen der Arbeitsgruppe, wiesen weiterhin auf eine Rolle der beiden Proteine in der entzündungsgetriebenen Karzinogenese hin. Daher wurden auch mögliche Interaktionen mit dem NFκB-Signalweg analysiert. Eine Stimulation der Zellen mit dem proinflammatorischen Zytokin IL1β ging mit einer verstärkten Aktivierung der MAP-Kinasen ERK1/2 in den Zellen mit GPX1- bzw. GPX2-KD einher. Die gleichzeitige Behandlung mit dem Antioxidans NAC führte nicht zur Rücknahme der Effekte in den KDs, sodass möglicherweise nicht nur die antioxidativen Eigenschaften der Enzyme bei der Interaktion mit diesen Signalwegsproteinen relevant sind.
Weiterhin wurden Analysen zum Substratspektrum der GPX2 in HCT116-Zellen mit einer Überexpression des Proteins durchgeführt. Dabei zeigte sich mittels NRU-Assay und DNA-Laddering, dass die GPX2 besonders vor den proapoptotischen Effekten einer Behandlung mit den Lipidhydroperoxiden HPODE und HPETE schützt.
Im Gegensatz zur GPX2 lässt sich Selenoprotein H (SELENOH) stärker durch die alimentäre Selenzufuhr beeinflussen. Einer möglichen Nutzung als Biomarker oder gar als Ansatzpunkt bei der Prävention bzw. Behandlung von CRC steht allerdings unvollständiges Wissen über die Funktion des Proteins gegenüber. Zur genaueren Charakterisierung von SELENOH wurden daher stabil-transfizierte KD-Klone in HT29- und Caco2-Zellen hergestellt und zunächst auf ihre Tumorigenität untersucht.
Zellen mit SELENOH-KD bildeten mehr und größere Kolonien im Soft Agar und zeigten ein erhöhtes Proliferations- und Migrationspotenzial im Vergleich zur Kontrolle.
Ein Xenograft in Nacktmäusen resultierte zudem in einer stärkeren Tumorbildung nach Injektion von KD-Zellen. Untersuchungen zur Beteiligung von SELENOH an der Zellzyklusregulation deuten auf eine hemmende Rolle des Proteins in der G1/S-Phase hin.
Die weiterhin beobachtete Hochregulation von SELENOH in humanen Adenokarzinomen und präkanzerösem Mausgewebe lässt sich möglicherweise mit der postulierten Schutzfunktion vor oxidativen Zell- und DNA-Schäden erklären. In gesunden Darmepithelzellen war das Protein vorrangig am Kryptengrund lokalisiert, was zu einer potenziellen Rolle während der gastrointestinalen Differenzierung passt.
As of late, epidemiological studies have highlighted a strong association of dairy intake with lower disease risk, and similarly with an increased amount of odd-chain fatty acids (OCFA). While the OCFA also demonstrate inverse associations with disease incidence, the direct dietary sources and mode of action of the OCFA remain poorly understood.
The overall aim of this thesis was to determine the impact of two main fractions of dairy, milk fat and milk protein, on OCFA levels and their influence on health outcomes under high-fat (HF) diet conditions. Both fractions represent viable sources of OCFA, as milk fats contain a significant amount of OCFA and milk proteins are high in branched chain amino acids (BCAA), namely valine (Val) and isoleucine (Ile), which can produce propionyl-CoA (Pr-CoA), a precursor for endogenous OCFA synthesis, while leucine (Leu) does not. Additionally, this project sought to clarify the specific metabolic effects of the OCFA heptadecanoic acid (C17:0).
Both short-term and long-term feeding studies were performed using male C57BL/6JRj mice fed HF diets supplemented with milk fat or C17:0, as well as milk protein or individual BCAA (Val; Leu) to determine their influences on OCFA and metabolic health. Short-term feeding revealed that both milk fractions induce OCFA in vivo, and the increases elicited by milk protein could be, in part, explained by Val intake. In vitro studies using primary hepatocytes further showed an induction of OCFA after Val treatment via de novo lipogenesis and increased α-oxidation. In the long-term studies, both milk fat and milk protein increased hepatic and circulating OCFA levels; however, only milk protein elicited protective effects on adiposity and hepatic fat accumulation—likely mediated by the anti-obesogenic effects of an increased Leu intake. In contrast, Val feeding did not increase OCFA levels nor improve obesity, but rather resulted in glucotoxicity-induced insulin resistance in skeletal muscle mediated by its metabolite 3-hydroxyisobutyrate (3-HIB). Finally, while OCFA levels correlated with improved health outcomes, C17:0 produced negligible effects in preventing HF-diet induced health impairments.
The results presented herein demonstrate that the beneficial health outcomes associated with dairy intake are likely mediated through the effects of milk protein, while OCFA levels are likely a mere association and do not play a significant causal role in metabolic health under HF conditions. Furthermore, the highly divergent metabolic effects of the two BCAA, Leu and Val, unraveled herein highlight the importance of protein quality.
Comparative study of gene expression during the differentiation of white and brown preadipocytes
(2002)
Introduction Mammals have two types of adipose tissue: the lipid storing white adipose tissue and the brown adipose tissue characterised by its capacity for non-shivering thermogenesis. White and brown adipocytes have the same origin in mesodermal stem cells. Yet nothing is known so far about the commitment of precursor cells to the white and brown adipose lineage. Several experimental approaches indicate that they originate from the differentiation of two distinct types of precursor cells, white and brown preadipocytes. Based on this hypothesis, the aim of this study was to analyse the gene expression of white and brown preadipocytes in a systematic approach. Experimental approach The white and brown preadipocytes to compare were obtained from primary cell cultures of preadipocytes from the Djungarian dwarf hamster. Representational difference analysis was used to isolate genes potentially differentially expressed between the two cell types. The thus obtained cDNA libraries were spotted on microarrays for a large scale gene expression analysis in cultured preadipocytes and adipocytes and in tissue samples. Results 4 genes with higher expression in white preadipocytes (3 members of the complement system and a fatty acid desaturase) and 8 with higher expression in brown preadipocytes were identified. From the latter 3 coded for structural proteins (fibronectin, metargidin and a actinin 4), 3 for proteins involved in transcriptional regulation (necdin, vigilin and the small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A) and 2 are of unknown function. Cluster analysis was applied to the gene expression data in order to characterise them and led to the identification of four major typical expression profiles: genes up-regulated during differentiation, genes down-regulated during differentiation, genes higher expressed in white preadipocytes and genes higher expressed in brown preadipocytes. Conclusion This study shows that white and brown preadipocytes can be distinguished by different expression levels of several genes. These results draw attention to interesting candidate genes for the determination of white and brown preadipocytes (necdin, vigilin and others) and furthermore indicate that potential importance of several functional groups in the differentiation of white and brown preadipocytes, mainly the complement system and extracellular matrix.
Zellbasierte heterologe Expressionssysteme bieten ein einfaches und schnelles Verfahren, um neue Süßstoffe oder Süßverstärker zu finden. Unter Verwendung eines solchen Testsystems, konnte ich in Zusammenarbeit mit der Symrise AG, Holzminden und dem Institut für Pflanzenbiochemie in Halle/Saale die vietnamesische Pflanze Mycetia balansae als Quelle eines neuen Süßstoffs identifizieren. Deren Hauptkomponenten, genannt Balansine, aktivieren spezifisch den humanen Süßrezeptor. Chimäre Rezeptoren zeigten, dass die amino-terminalen Domänen der Süßrezeptoruntereinheiten, welche ein Großteil der Liganden des Süßrezeptors binden, für dessen Aktivierung durch Balansin A nicht notwendig sind.
Voraussetzung für die Anwendung zellbasierter Testsysteme zum Auffinden neuer Süßstoffe ist jedoch, dass süße Substanzen gesichert identifiziert werden, während nicht süße Substanzen zuverlässig keine Rezeptoraktivierung aufweisen. Während in HEK293 TAS1R2 TAS1R3To Galpha15i3-Zellen Süßrezeptoraktivierung gegenüber nicht süß schmeckenden Substanzen beobachtet wurde, konnte mit den HEK293PEAKrapid Galpha15-Zellen ein zuverlässiges Testsystem identifiziert, welches den Süßgeschmack der untersuchten Substanzen widerspiegelte.
Es fanden sich keine Hinweise, dass akzessorische Proteine oder verwandte Rezeptoren des Süßrezeptors das unterschiedliche Verhalten der Zellen verursachen. Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung unterschiedlicher G-Proteine die Signalamplituden des Süßrezeptors beeinflusst, die Unterschiede zwischen den Zellsystemen jedoch nicht vollständig erklärt. Keine der untersuchten Galpha-Proteinchimären spiegelte die intrinsische Süße der Substanzen wider.
Wenn auch nicht ursächlich für die Diskrepanz zwischen Süßrezeptoraktivierung in vitro und Süßgeschmack in vivo, so weisen die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine Interaktion der Süßrezeptoruntereinheiten mit dem humanen Calcium-sensing Rezeptor hin. Vanillin und Ethylvanillin konnten als neue Agonisten des Calcium-sensing Rezeptors identifiziert werden.
Wie die vorliegende Arbeit zeigt, können sich kleine Unterschiede im Zellhintergrund deutlich auf die Funktionsweise heterolog exprimierter Rezeptoren auswirken. Dies zeigt wie wichtig die Wahl der Zellen für solche Screeningsysteme ist.
Die Bittergeschmacksrezeptoren stellen in der Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine besondere Gruppe dar. Im Menschen können die 25 Rezeptoren eine große Anzahl unterschiedlichster Bittergeschmacksstoffe detektieren. Diese Substanzen können sowohl schädlich, wie etwa Strychnin, als auch der Gesundheit förderliche Arzneistoffe, wie etwa Chloramphenicol sein. Unter den Bittergeschmacksrezeptoren des Menschen gibt es eine Gruppe von drei Rezeptoren, die besonders viele Bitterstoffe detektieren können. Einer von ihnen ist der Rezeptor hTAS2R10. In dieser Arbeit konnte sowohl experimentell als auch durch computergestützte Modellierung gezeigt werden, dass der hTAS2R10 nur eine Bindungstasche besitzt. Das stimmt mit den bisher ausführlich experimentell und in silico untersuchten Rezeptoren hTAS2R1, -R16, -R38 und -R46 überein. Die für die Agonisteninteraktionen nachweislich wichtigen Transmembrandomänen sind in den bisher untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren, wie auch im hTAS2R10, die Transmembrandomänen 3, 5, 6 und 7. Die Untersuchungen zeigten, dass die Bindungstasche des hTAS2R10 in der oberen Hälfte des zum extrazellulären Raum gerichteten Bereichs lokalisiert ist. Insbesondere konnte für die untersuchten Agonisten Strychnin, Parthenolid und Denatoniumbenzoat gezeigt werden, dass die Seitenketten der Aminosäuren in Position 3.29 und 5.40 ausgeprägte agonistenselektive Wechselwirkungen eingehen. Weitere Untersuchungen haben ergeben, dass das weitgefächerte Agonistenspektrum des hTAS2R10 zu Lasten der Sensitivität für einzelne Bitterstoffe geht. Der Vergleich wichtiger Positionen im hTAS2R10, hTAS2R46 und mTas2r105 hat deutlich gemacht, dass sich die Bindungsmodi zwischen diesen Rezeptoren unterscheiden. Dies deutet auf eine getrennte evolutionäre Entwicklung der Bindungseigenschaften dieser Rezeptoren hin. Gleichfalls zeigten die Untersuchungen, dass einige Positionen wie z.B. 7.39 die Funktion aller untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren prägen, sich jedoch die genaue Bedeutung im jeweiligen Rezeptor unterscheiden kann. Einzelne dieser Positionen konnten auch bei der Agonisteninteraktion des Rhodopsins und des β2-adrenergen Rezeptors beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit helfen dabei die Wechselwirkungen zwischen Bitterstoffen und den Bittergeschmacksrezeptoren zu verstehen und geben erste Einblicke in die Entwicklung der Rezeptoren in Hinblick auf ihren Funktionsmechanismus. Diese Erkenntnisse können genutzt werden, um Inhibitoren zu entwickeln, die sowohl ein wichtiges Werkzeug in der Rezeptoranalytik wären, als auch dazu genutzt werden könnten, den unerwünschten bitteren Geschmack von Medikamenten oder gesundheitsfördernden sekundären Pflanzenstoffen zu mindern. Damit könnte ein Beitrag zur Gesundheit der Menschen geleistet werden.
Obesity is a major health problem for many developing and industrial countries. Increasing rates reach almost 50 % of the population in some countries and related metabolic diseases including cardiovascular events and T2DM are challenging the health systems. Adiposity, an increase in body fat mass, is a major hallmark of obesity. Adipose tissue is long known not only to store lipids but also to influence whole-body metabolism including food intake, energy expenditure and insulin sensitivity. Adipocytes can store lipids and thereby protect other tissue from lipotoxic damage. However, if the energy intake is higher than the energy expenditure over a sustained time period, adipose tissue will expand. This can lead to an impaired adipose tissue function resulting in higher levels of plasma lipids, which can affect other tissue like skeletal muscle, finally leading to metabolic complications. Several studies showed beneficial metabolic effects of weight reduction in obese subjects immediately after weight loss. However, weight regain is frequently observed along with potential negative effects on cardiovascular risk factors and a high intra-individual response.
We performed a body weight maintenance study investigating the mechanisms of weight maintenance after intended WR. Therefore we used a low caloric diet followed by a 12-month life-style intervention. Comprehensive phenotyping including fat and muscle biopsies was conducted to investigate hormonal as well as metabolic influences on body weight regulation. In this study, we showed that weight reduction has numerous potentially beneficial effects on metabolic parameters. After 3-month WR subjects showed significant weight and fat mass reduction, lower TG levels as well as higher insulin sensitivity. Using RNA-Seq to analyse whole fat and muscle transcriptome a strong impact of weight reduction on adipose tissue gene expression was observed. Gene expression alterations over weight reduction included several cellular metabolic genes involved in lipid and glucose metabolism as well as insulin signalling and regulatory pathways. These changes were also associated with anthropometric parameters assigning body composition. Our data indicated that weight reduction leads to a decreased expression of several lipid catabolic as well as anabolic genes. Long-term body weight maintenance might be influenced by several parameters including hormones, metabolic intermediates as well as the transcriptional landscape of metabolic active tissues. Our data showed that genes involved in biosynthesis of unsaturated fatty acids might influence the BMI 18-month after a weight reduction phase. This was further supported by analysing metabolic parameters including RQ and FFA levels. We could show that subjects maintaining their lost body weight had a higher RQ and lower FFA levels, indicating increased metabolic flexibility in subjects.
Using this transcriptomic approach we hypothesize that low expression levels of lipid synthetic genes in adipose tissue together with a higher mitochondrial activity in skeletal muscle tissue might be beneficial in terms of body weight maintenance.
Respiratorische Erkrankungen stellen zunehmend eine relevante globale Problematik dar. Die Erweiterung bzw. Modifizierung von Applikationswegen möglicher Arzneimittel für gezielte topische Anwendungen ist dabei von größter Bedeutung. Die Variation eines bekannten Applikationsweges durch unterschiedliche technologische Umsetzungen kann die Vielfalt der Anwendungsmöglichkeiten, aber auch die Patienten-Compliance erhöhen. Die einfache und flexible Verfahrensweise durch schnelle Verfügbarkeit und eine handliche Technologie sind heutzutage wichtige Eigenschaften im Entwicklungsprozess eines Produktes. Eine direkte topische Behandlung von Atemwegserkrankungen am Wirkort in Form einer inhalativen Applikation bietet dabei viele Vorteile gegenüber einer systemischen Therapie. Die medizinische Inhalation von Wirkstoffen über die Lunge ist jedoch eine komplexe Herausforderung. Inhalatoren gehören zu den erklärungsbedürftigen Applikationsformen, die zur Erhöhung der konsequenten Einhaltung der Verordnung so einfach, wie möglich gestaltet werden müssen. Parallel besitzen und nutzen weltweit annähernd 68 Millionen Menschen die Technologie eines inhalativen Applikators zur bewussten Schädigung ihrer Gesundheit in Form einer elektronischen Zigarette. Diese bekannte Anwendung bietet die potentielle Möglichkeit einer verfügbaren, kostengünstigen und qualitätsgeprüften Gesundheitsmaßnahme zur Kontrolle, Prävention und Heilung von Atemwegserkrankungen. Sie erzeugt ein Aerosol durch elektrothermische Erwärmung eines sogenannten Liquids, das durch Kapillarkräfte eines Trägermaterials an ein Heizelement gelangt und verdampft. Ihr Bekanntheitsgrad zeigt, dass eine beabsichtigte Wirkung in den Atemwegen eintritt. Diese Wirkung könnte jedoch auch auf potentielle pharmazeutische Einsatzgebiete übertragbar sein. Die Vorteile der pulmonalen Verabreichung sind dabei vielfältig. Im Vergleich zur peroralen Applikation gelangt der Wirkstoff gezielt zum Wirkort. Wenn eine systemische Applikation zu Arzneimittelkonzentrationen unterhalb der therapeutischen Wirksamkeit in der Lunge führt, könnte eine inhalative Darreichung bereits bei niedriger Dosierung die gewünschten höheren Konzentrationen am Wirkort hervorrufen. Aufgrund der großen Resorptionsfläche der Lunge sind eine höhere Bioverfügbarkeit und ein schnellerer Wirkungseintritt infolge des fehlenden First-Pass-Effektes möglich. Es kommt ebenfalls zu minimalen systemischen Nebenwirkungen. Die elektronische Zigarette erzeugt wie die medizinischen Inhalatoren lungengängige Partikel. Die atemzuggesteuerte Technik ermöglicht eine unkomplizierte und intuitive Anwendung. Der prinzipielle Aufbau besteht aus einer elektrisch beheizten Wendel und einem Akku. Die Heizwendel ist von einem sogenannten Liquid in einem Tank umgeben und erzeugt das Aerosol. Das Liquid beinhaltet eine Basismischung bestehend aus Propylenglycol, Glycerin und reinem Wasser in unterschiedlichen prozentualen Anteilen. Es besteht die Annahme, dass das Basisliquid auch mit pharmazeutischen Wirkstoffen für die pulmonale Applikation beladen werden kann. Aufgrund der thermischen Belastung durch die e-Zigarette müssen potentielle Wirkstoffe sowie das Vehikel eine thermische Stabilität aufweisen.
Die potentielle medizinische Anwendung der Technologie einer handelsüblichen e-Zigarette wurde anhand von drei Schwerpunkten an vier Wirkstoffen untersucht. Die drei ätherischen Öle Eucalyptusöl, Minzöl und Nelkenöl wurden aufgrund ihrer leichten Flüchtigkeit und der historischen pharmazeutischen Anwendung anhand von Inhalationen bei Erkältungssymptomen bzw. im zahnmedizinischen Bereich gewählt. Das eingesetzte Cannabinoid Cannabidiol (CBD) hat einen aktuellen Bezug zu dem pharmazeutischen Markt Deutschlands zur Legalisierung von cannabishaltigen Produkten und der medizinischen Forschung zum inhalativen Konsum. Es wurden relevante wirkstoffhaltige Flüssigformulierungen entwickelt und hinsichtlich ihrer Verdampfbarkeit zu Aerosolen bewertet. In den quantitativen und qualitativen chromatographischen Untersuchungen konnten spezifische Verdampfungsprofile der Wirkstoffe erfasst und bewertet werden. Dabei stieg die verdampfte Masse der Leitsubstanzen 1,8-Cineol (Eucalyptusöl), Menthol (Minzöl) und Eugenol (Nelkenöl) zwischen 33,6 µg und 156,2 µg pro Zug proportional zur Konzentration im Liquid im Bereich zwischen 0,5% und 1,5% bei einer Leistung von 20 Watt. Die Freisetzungsrate von Cannabidiol hingegen schien unabhängig von der Konzentration im Liquid im Mittelwert bei 13,3 µg pro Zug zu liegen. Dieses konnte an fünf CBD-haltigen Liquids im Konzentrationsbereich zwischen 31 µg/g und 5120 µg/g Liquid gezeigt werden. Außerdem konnte eine Steigerung der verdampften Massen mit Zunahme der Leistung der e-Zigarette festgestellt werden. Die Interaktion der Liquids bzw. Aerosole mit den Bestandteilen des Speichels sowie weiterer gastrointestinaler Flüssigkeiten wurde über die Anwendung von zugehörigen in vitro Modellen und Einsatz von Enzymaktivitäts-Assays geprüft. In den Untersuchungen wurden Änderungen von Enzymaktivitäten anhand des oralen Schlüsselenzyms α-Amylase sowie von Proteasen ermittelt. Damit sollte exemplarisch ein möglicher Einfluss auf physiologische bzw. metabolische Prozesse im humanen Organismus geprüft werden. Das Bedampfen von biologischen Suspensionen führte bei niedriger Leistung der e-Zigarette (20 Watt) zu keiner bzw. einer leichten Änderung der Enzymaktivität. Die Anwendung einer hohen Leistung (80 Watt) bewirkte tendenziell das Herabsetzen der Enzymaktivitäten. Die Erhöhung der Enzymaktivitäten könnte zu einem enzymatischen Abbau von Schleimstoffen wie Mucinen führen, was wiederum die effektive, mechanische Abwehr gegenüber bakteriellen Infektionen zur Folge hätte. Da eine Anwendung der Applikation insbesondere bei bakteriellen Atemwegserkrankungen denkbar wäre, folgten abschließend Untersuchungen der antibakteriellen Eigenschaften der Liquids bzw. Aerosole in vitro. Es wurden sechs klinisch relevante bakterielle Krankheitserreger ausgewählt, die nach zwei Charakteristika gruppiert werden können. Die drei multiresistenten Bakterien Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae und Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus können mithilfe von üblichen Therapien mit Antibiotika nicht abgetötet werden und haben vor allem eine nosokomiale Relevanz. Die zweite Gruppe weist Eigenschaften auf, die vordergründig assoziiert sind mit respiratorischen Erkrankungen. Die Bakterien Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae sind repräsentativ beteiligt an Atemwegserkrankungen mit diverser Symptomatik. Die Bakterienarten wurden mit den jeweiligen Liquids behandelt bzw. bedampft und deren grundlegende Dosis-Wirkungsbeziehung charakterisiert. Dabei konnte eine antibakterielle Aktivität der Formulierungen ermittelt werden, die durch Zugabe eines Wirkstoffes die bereits antibakterielle Wirkung der Bestandteile Glycerin und Propylenglycol verstärkte. Die hygroskopischen Eigenschaften dieser Substanzen sind vermutlich für eine Wirkung in aerosolierter Form verantwortlich. Sie entziehen die Feuchtigkeit aus der Luft und haben einen austrocknenden Effekt auf die Bakterien. Das Bedampfen der Bakterienarten Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae hatte einen antibakteriellen Effekt, der zeitlich abhängig von der Leistung der e-Zigarette war.
Die Ergebnisse der Untersuchungen führen zu dem Schluss, dass jeder Wirkstoff bzw. jede Substanzklasse individuell zu bewerten ist und somit Inhalator und Formulierung aufeinander abgestimmt werden müssen. Der Einsatz der e-Zigarette als Medizinprodukt zur Applikation von Arzneimitteln setzt stets Prüfungen nach Europäischem Arzneibuch voraus. Durch Modifizierungen könnte eine Dosierung gut kontrollierbar gemacht werden, aber auch die Partikelgrößenverteilung kann insoweit reguliert werden, dass die Wirkstoffe je nach Partikelgröße zu einem geeigneten Applikationsort wie Mund, Rachen oder Bronchien transportiert werden. Der Vergleich mit den Eigenschaften anderer medizinischer Inhalatoren führt zu dem Schluss, dass die Technologie der e-Zigarette durchaus eine gleichartige oder bessere Performance für thermisch stabile Wirkstoffe bieten könnte. Dieses fiktive Medizinprodukt könnte aus einer hersteller-unspezifisch produzierten, wieder aufladbaren Energiequelle mit Universalgewinde zum mehrfachen Gebrauch und einer hersteller- und wirkstoffspezifisch produzierten Einheit aus Verdampfer und Arzneimittel bestehen. Das Arzneimittel, ein medizinisches Liquid (Vehikel und Wirkstoff) kann in dem Tank des Verdampfers mit konstanten, nicht variablen Parametern patientenindividuell produziert werden. Inhalative Anwendungen werden perspektivisch wohl nicht zuletzt aufgrund der aktuellen COVID-19-Pandemie eine zunehmende Rolle spielen. Der Bedarf nach alternativen Therapieoptionen wird weiter ansteigen. Diese Arbeit liefert einen Beitrag zum Einsatz der Technologie der elektronischen Zigarette als electronic nicotin delivery system (ENDS) nach Modifizierung zu einem potentiellen pulmonalen Applikationssystem als electronic drug delivery system (EDDS) von inhalativen, thermisch stabilen Arzneimitteln in Form eines Medizinproduktes.
Menschen nehmen Tausende von Stoffen als bitter wahr. Die chemische Struktur der verschiedenen Bitterstoffe ist sehr vielfältig: Sie reicht von kleinen Molekülen wie Kaliumchlorid oder Harnstoff, bis zu sehr komplexen organischen Verbindungen. Die Größe der einzigen bekannten menschlichen Familie von Bitterrezeptoren (TAS2Rs) wurde auf nur ca. 80-120 Mitglieder geschätzt. In Anbetracht der hohen Zahl und Komplexität der Bitterstoffe erscheint die Zahl von Rezeptoren als sehr gering. Dies führt natürlich zu einer Reihe von Fragen: Wie viele Mitglieder hat die menschliche TAS2R-Genfamilie? Wie viele verschiedene Substanzen können denselben Rezeptor aktivieren? Scheint die Zahl der TAS2R-Rezeptoren ausreichend, alle Bitterstoffe wahrnehmen zu können oder muss es noch andere Bitterrezeptorfamilien geben? Diese Fragen zu beantworten, ist das Ziel der vorliegenden Arbeit. Hier durchgeführte Analysen des menschlichen Genomprojektes zeigen, dass Menschen ca. 25 TAS2R-Rezeptoren besitzt, die eine sehr divergente Aminosäurestruktur aufweisen. Diese Rezeptoren wurden in eine neu entwickelte Expressionskassette kloniert, die den Transport des Rezeptors an die Zelloberfläche ermöglicht. Um Liganden für die menschliche TAS2R-Rezeptoren zu identifizieren, wurden die Rezeptoren in HEK293 Zellen exprimiert und mit verschiedenen Bitterstoffen stimuliert. Der Nachweis der Rezeptoraktivierung erfolgte durch Calcium-Imaging. Es konnte gezeigt werden, dass hTAS2R16 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Salicin und verwandten bitteren Pyranosiden ist. So wird hTAS2R16 in HEK293 Zellen durch Salicin und chemisch verwandte Substanzen aktiviert. Ein Vergleich der in diesem Messsystem erhaltenen Daten mit psychophysikalisch ermittelten Geschmackswahrnehmungen beim Menschen, ergab eine hohe Übereinstimmung. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Desensitiverung einzelner Rezeptoren die Ursache für die Adaption des Bittergeschmacks ist. Der Nachweis der Expression des Rezeptors in menschlichen Geschmackspapillen, sowie die festgestellte Assoziation des G/A Polymorpphismus an Position 665 des hTAS2R16 Gens mit einer reduzierten Salicinwahrnehmung, sind weitere unabhängige Beweise für diese These. Ein anderer menschlicher Rezeptor, hTAS2R10, wird durch die Bitterstoffe Strychnin, Brucin und Denatonium aktiviert. Dies sowie die Tatsache, dass die zur Aktivierung benutzten Konzentrationen eine sinnvolle Korrelation zu dem menschlichen Geschmacksschwellwert von Strychnin zeigen, sind starke Hinweise, dass hTAS2R10 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Strychnin und verwandten Substanzen ist. Die vorliegenden Daten zeigen eindeutig, dass die TAS2R-Rezeptoren auch beim Menschen Bitterrezeptoren darstellen. Sowohl hTAS2R16, als auch hTAS2R10 werden durch ein Spektrum strukturell sehr unterschiedlicher Bitterstoffe aktiviert. Falls die anderen Mitglieder der TAS2R-Familie ebenfalls dieses Verhalten zeigen, wäre es möglich, dass die nur ca. 25 Mitglieder umfassende TAS2R-Rezeptorfamilie des Menschen tatsächlich zur Wahrnehmung aller Bitterstoffe ausreicht.
Role of dietary sulfonates in the stimulation of gut bacteria promoting intestinal inflammation
(2021)
The interplay between intestinal microbiota and host has increasingly been recognized as a major factor impacting health. Studies indicate that diet is the most influential determinant affecting the gut microbiota. A diet rich in saturated fat was shown to stimulate the growth of the colitogenic bacterium Bilophila wadsworthia by enhancing the secretion of the bile acid taurocholate (TC). The sulfonated taurine moiety of TC is utilized as a substrate by B. wadsworthia. The resulting overgrowth of B. wadsworthia was accompanied by an increased incidence and severity of colitis in interleukin (IL)-10-deficient mice, which are genetically prone to develop inflammation.
Based on these findings, the question arose whether the intake of dietary sulfonates also stimulates the growth of B. wadsworthia and thereby promotes intestinal inflammation in genetically susceptible mice. Dietary sources of sulfonates include green vegetables and cyanobacteria, which contain the sulfolipids sulfoquinovosyl diacylglycerols (SQDG) in considerable amounts. Based on literature reports, the gut commensal Escherichia coli is able to release sulfoquinovose (SQ) from SQDG and in further steps, convert SQ to 2,3-dihydroxypropane-1-sulfonate (DHPS) and dihydroxyacetone phosphate. DHPS may then be utilized as a growth substrate by B. wadsworthia, which results in the formation of sulfide. Both, sulfide formation and a high abundance of B. wadsworthia have been associated with intestinal inflammation.
In the present study, conventional IL-10-deficient mice were fed either a diet supplemented with the SQDG-rich cyanobacterium Spirulina (20%, SD) or a control diet. In addition SQ, TC, or water were orally applied to conventional or gnotobiotic IL-10-deficient mice. The gnotobiotic mice harbored a simplified human intestinal microbiota (SIHUMI) either with or without B. wadsworthia. During the intervention period, the body weight of the mice was monitored, the colon permeability was assessed and fecal samples were collected. After the three-week intervention, the animals were examined with regard to inflammatory parameters, microbiota composition and sulfonate concentrations in different intestinal sites.
None of the mice treated with the above-mentioned sulfonates showed weight loss or intestinal inflammation. Solely mice fed SD or gavaged with TC displayed a slight immune response. These mice also displayed an altered microbiota composition, which was not observed in mice gavaged with SQ. The abundance of B. wadsworthia was strongly reduced in mice fed SD, while that of mice treated with SQ or TC was in part slightly increased. The intestinal SQ-concentration was elevated in mice orally treated with SD or SQ, whereas neither TC nor taurine concentrations were consistently elevated in mice gavaged with TC. Additional colonization of SIHUMI mice with B. wadsworthia resulted in a mild inflammatory response, but only in mice treated with TC. In general, TC-mediated effects on the immune system and abundance of B. wadsworthia were not as strong as described in the literature.
In summary, neither the tested dietary sulfonates nor TC led to bacteria-induced intestinal inflammation in the IL-10-deficient mouse model, which was consistently observed in both conventional and gnotobiotic mice. For humans, this means that foods containing SQDG, such as spinach or Spirulina, do not increase the risk of intestinal inflammation.
Ontogeny of leptin signalling in the rat hypothalamus: Evidence for selective leptin insensitivity
(2006)
Metabolism of the dietary lignan secoisolariciresinol diglucoside by human intestinal bacteria
(2006)
Eine Störung des Leberstoffwechsels durch die Ausbildung einer Insulinresistenz kann zu Folgeerkrankungen wie der nicht alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) bis hin zur Steatohepatitis (NASH) und zur Entwicklung eines Diabetes Typ II führen. Am Krankheitsverlauf sind residente (Kupfferzellen) sowie infiltrierende Makrophagen beteiligt, die durch inflammatorische Stimuli aktiviert werden und zur Progression von Lebererkrankungen führen können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von mPGES1-abhängig gebildetem Prostaglandin E2 (PGE2) an der Modulation von aktivierten Lebermakrophagen untersucht. Dazu wurden Kupfferzellen und Peritonealmakrophagen (als Modell für infiltrierende Makrophagen) aus Wildtyp und mPGES1-defizienten Mäusen isoliert. Beide Makrophagenpopulationen wurden in Zellkulturversuchen mit Lipopolysacchariden (LPS) aktiviert und auf ihre PGE2-Synthese, Genexpression und Sekretion von verschiedenen Cytokinen hin untersucht. Die beiden Makrophagenpopulationen unterschieden sich hinsichtlich der PGE2-Synthese bei mPGSE1-Defizienz. Während bei Peritonealmakrophagen die LPS-abhängige PGE2-Synthese bei Abwesenheit der mPGES1 fast vollständig reprimiert war, war bei Kupfferzellen nur eine 25%ige Abnahme zu verzeichnen. Die postulierte selbstverstärkende Rückkopplungsschleife von PGE2 im Hinblick auf seine eigene Synthese konnte in isolierten Peritonealmakrophagen, nicht jedoch in Kupfferzellen, bestätigt werden. In Kupfferzellen führte exogenes PGE2 ferner zu einer Repression von den pro-inflammatorischen Cytokinen TNFα und IL-1β und für endogenes PGE2 konnte in diesem Zelltyp kein Effekt festgestellt werden. In Peritonealmakrophagen konnte hingegen auch für endogenes PGE2 eine reprimierende Wirkung auf die Expression von TNFα beobachtet werden. Das ist eventuell auf eine höhere Sensitivität gegenüber PGE2 von Peritonealmakrophagen im Vergleich zu Kupfferzellen zurückzuführen. PGE2 wirkte unter den gewählten Versuchsbedingungen in vitro somit eher anti-inflammatorisch. Cholesterolkristalle induzierten in Kupfferzellen die Expression der PGE2-synthetisierenden Enzyme und verschiedener pro-inflammatorische Cytokine. Sie könnten somit zu einer Progression von NAFL zu NASH beitragen. Die Daten aus dieser Arbeit deuten darauf hin, dass PGE2 im Rahmen von entzündlichen Leberveränderungen eine eher protektive Wirkung im Hinblick auf die Progression von NAFLD und Insulinresistenz haben könnte.
Alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe werden in vielen Matrizes wie Fahrzeugabgasen und Tabakrauch und auch als Kontaminanten in Nahrungsmitteln neben rein aromatischen Kongeneren gefunden. Alkylierte PAK können über die Alkylseitenkette über benzylische Hydroxylierung und nachfolgende Sulfonierung katalysiert über Sulfotransferasen (SULT) zu reaktiven Schwefelsäureestern umgesetzt werden. Die SULT-vermittelte Bioaktivierung zu einem genotoxischen Schwefelsäureester wurde für den benzylischen Alkohol 1-Hydroxymethylpyren des Hepatokanzerogens 1-Methylpyren in früheren Arbeiten gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob die benzylischen Alkohole weiterer alkylierter PAK über Sulfonierung zu genotoxischen Schwefelsäureestern umgesetzt werden. Hierzu wurde eine Gruppe von 17 Modellsubstanzen ausgewählt, um die Ableitung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen zu ermöglichen. Das genotoxische Potenzial authentischer benzylischer Schwefelsäureester der Modellsubstanzen wurde zunächst in vitro über DNA-Adduktbildung im zellfreien System und Mutagenität im Salmonella-Rückmutationstest untersucht. Die Sulfate zeigten große Reaktivitätsunterschiede in Abhängigkeit von der Struktur des aromatischen Systems und der Position der Alkylseitenkette, wobei die Endpunkte DNA-Adduktbildung und Mutagenität gut korrelierten. Des Weiteren wurde der Salmonella-Mutagenitätstest mit den benzylischen Alkoholen der untersuchten alkylierten PAK und gentechnisch veränderten S. typhimurium-Stämmen, die SULT-Formen des Menschen heterolog exprimieren, durchgeführt. Bis auf die Alkohole 2- und 4-HMP zeigten alle untersuchten benzylischen Alkohole deutliche mutagene Effekte in einem oder mehreren humane SULT exprimierenden Stämmen. Die durchgeführten in vitro-Versuche zeigten das Potenzial der benzylischen Metabolite alkylierter PAK für genotoxische Wirkungen. Nachfolgend musste geklärt werden, welche Relevanz die beobachteten Effekte für die komplexere in vivo-Situation haben. Nach Verabreichung verschiedener benzylischer Schwefelsäureester und Alkohole an männliche Ratten konnten DNA-Addukte in den untersuchten Organen detektiert werden, was im Fall der Schwefelsäureester deren systemische Bioverfügbarkeit und im Fall der benzylischen Alkohole deren Umsatz durch SULT der männlichen Ratte zeigte. Da im Gegensatz zum Menschen die SULT-Expression in der Ratte auf die Leber fokussiert ist, musste ein Großteil des Umsatzes zu genotoxischen Sulfaten in der Leber stattgefunden haben. DNA-Addukte wurden jedoch auch in extrahepatischen Organen gefunden, was über einen hepatischen Export der gebildeten reaktiven Sulfate und deren Transport über den Blutkreislauf zu diesen Geweben erklärt werden kann. Für die weiterführenden in vivo-Studien wurden die benzylischen Alkohole 1-HMP und 1-HM-8-MP ausgewählt, die trotz großer struktureller Ähnlichkeit toxikodynamische Unterschiede zeigten. Zur Untersuchung der Bedeutung des SULT-vermittelten Toxifizierungsweges als auch konkurrierender detoxifizierender oxidativer Stoffwechselprozesse, wurden für 1-HMP und 1-HM-8-MP in vivo-Inhibitionsstudien mit SULT-Inhibitoren und für 1-HM-8-MP auch mit ADH/ALDH-Inhibitoren durchgeführt. Eine Vorbehandlung mit dem SULT-Hemmstoff Pentachlorphenol führte zu einer Reduktion der DNA-Adduktniveaus in Organen 1-HMP- und 1-HM-8-MP-behandelter Tiere. Die Verabreichung von Quercetin hatte keine Auswirkung auf die DNA-Adduktniveaus. Die Hemmung der DNA-Adduktbildung bei Verabreichung von Pentachlorphenol verdeutlichte jedoch, dass benzylische Alkohole alkylierter PAK in vivo über Sulfonierung bioaktiviert werden. Eine Vorbehandlung mit dem ADH-Inhibitor 4-Methylpyrazol und dem ADH-Substrat Ethanol führte zu erhöhten DNA-Adduktniveaus in Organen 1-HM-8-MP-behandelter Tiere. Den gleichen Effekt, jedoch in geringerem Ausmaß, hatte auch die Vorbehandlung mit dem ALDH-Inhibitor Disulfiram. Dies deutet darauf hin, dass oxidative Modifikationen an der Seitenkette des 1-HM-8-MP einen Detoxifizierungsmechanismus darstellen. Nach Verabreichung benzylischer Metabolite alkylierter PAK wurden oftmals hohe Adduktniveaus in der Niere detektiert. Als mögliche Ursache hierfür wurde eine Transporter-vermittelte renale Sekretion reaktiver Sulfate postuliert, die über Vorbehandlung mit Probenecid vor Verabreichung von 1-HMP und 1-HM-8-MP überprüft wurde. Der Haupteffekt der Probenecid-Behandlung wurde jedoch nicht in der Niere, sondern in der Leber beobachtet, die stark erhöhte Adduktniveaus zeigte. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die Hemmung des Exportes in der Leber gebildeter reaktiver Sulfate über Inhibition hepatischer organischer Anionentransporter.
Die Bedeutung Eisen-Schwefel-Cluster-assoziierter Mechanismen für Mutagenese und Kanzerogenese
(2009)
Selenium (Se) is an essential trace element that is ubiquitously present in the environment in small concentrations. Essential functions of Se in the human body are manifested through the wide range of proteins, containing selenocysteine as their active center. Such proteins are called selenoproteins which are found in multiple physiological processes like antioxidative defense and the regulation of thyroid hormone functions. Therefore, Se deficiency is known to cause a broad spectrum of physiological impairments, especially in endemic regions with low Se content. Nevertheless, being an essential trace element, Se could exhibit toxic effects, if its intake exceeds tolerable levels. Accordingly, this range between deficiency and overexposure represents optimal Se supply. However, this range was found to be narrower than for any other essential trace element. Together with significantly varying Se concentrations in soil and the presence of specific bioaccumulation factors, this represents a noticeable difficulty in the assessment of Se
epidemiological status. While Se is acting in the body through multiple selenoproteins, its intake occurs mainly in form of small organic or inorganic molecular mass species. Thus, Se exposure not only depends on daily intake but also on the respective chemical form, in which it is present.
The essential functions of selenium have been known for a long time and its primary forms in different food sources have been described. Nevertheless, analytical capabilities for a comprehensive investigation of Se species and their derivatives have been introduced only in the last decades. A new Se compound was identified in 2010 in the blood and tissues of bluefin tuna. It was called selenoneine (SeN) since it is an isologue of naturally occurring antioxidant ergothioneine (ET), where Se replaces sulfur. In the following years, SeN was identified in a number of edible fish species and attracted attention as a new dietary Se source and potentially strong antioxidant. Studies in populations whose diet largely relies on fish revealed that SeN
represents the main non-protein bound Se pool in their blood. First studies, conducted with enriched fish extracts, already demonstrated the high antioxidative potential of SeN and its possible function in the detoxification of methylmercury in fish. Cell culture studies demonstrated, that SeN can utilize the same transporter as ergothioneine, and SeN metabolite was found in human urine.
Until recently, studies on SeN properties were severely limited due to the lack of ways to obtain the pure compound. As a predisposition to this work was firstly a successful approach to SeN synthesis in the University of Graz, utilizing genetically modified yeasts. In the current study, by use of HepG2 liver carcinoma cells, it was demonstrated, that SeN does not cause toxic effectsup to 100 μM concentration in hepatocytes. Uptake experiments showed that SeN is not bioavailable to the used liver cells.
In the next part a blood-brain barrier (BBB) model, based on capillary endothelial cells from the porcine brain, was used to describe the possible transfer of SeN into the central nervous system (CNS). The assessment of toxicity markers in these endothelial cells and monitoring of barrier conditions during transfer experiments demonstrated the absence of toxic effects from SeN on the BBB endothelium up to 100 μM concentration. Transfer data for SeN showed slow but substantial transfer. A statistically significant increase was observed after 48 hours following SeN incubation from the blood-facing side of the barrier. However, an increase in Se content was clearly visible already after 6 hours of incubation with 1 μM of SeN. While the transfer rate of SeN after application of 0.1 μM dose was very close to that for 1 μM, incubation with 10 μM of SeN resulted in a significantly decreased transfer rate. Double-sided application of SeN caused no side-specific transfer of SeN, thus suggesting a passive diffusion mechanism of SeN across the BBB. This data is in accordance with animal studies, where ET accumulation was observed in the rat brain, even though rat BBB does not have the primary ET transporter – OCTN1. Investigation of capillary endothelial cell monolayers after incubation with SeN and reference selenium compounds showed no significant increase of intracellular selenium concentration. Speciesspecific Se measurements in medium samples from apical and basolateral compartments, as good as in cell lysates, showed no SeN metabolization. Therefore, it can be concluded that SeN may reach the brain without significant transformation.
As the third part of this work, the assessment of SeN antioxidant properties was performed in Caco-2 human colorectal adenocarcinoma cells. Previous studies demonstrated that the intestinal epithelium is able to actively transport SeN from the intestinal lumen to the blood side and accumulate SeN. Further investigation within current work showed a much higher antioxidant potential of SeN compared to ET. The radical scavenging activity after incubation with SeN was close to the one observed for selenite and selenomethionine. However, the SeN effect on the viability of intestinal cells under oxidative conditions was close to the one caused by ET. To answer the question if SeN is able to be used as a dietary Se source and induce the activity of selenoproteins, the activity of glutathione peroxidase (GPx) and the secretion of selenoprotein P (SelenoP) were measured in Caco-2 cells, additionally. As expected, reference selenium compounds selenite and selenomethionine caused efficient induction of GPx activity. In contrast to those SeN had no effect on GPx activity. To examine the possibility of SeN being embedded into the selenoproteome, SelenoP was measured in a culture medium. Even though Caco-2 cells effectively take up SeN in quantities much higher than selenite or selenomethionine, no secretion of SelenoP was observed after SeN incubation.
Summarizing, we can conclude that SeN can hardly serve as a Se source for selenoprotein synthesis. However, SeN exhibit strong antioxidative properties, which appear when sulfur in ET is exchanged by Se. Therefore, SeN is of particular interest for research not as part of Se metabolism, but important endemic dietary antioxidant.
In einer Zeit, in der eine Zunahme von ernährungsbedingten Erkrankungen in steigendem Maße zu beobachten ist, wird dem Getreide als Grundlage der menschlichen Ernährung erhöhte Aufmerksamkeit gewidmet. Ein hoher Verzehr von Ballaststoffen ist ein wesentlicher Aspekt in der präventiv-medizinischen Ernährung. Die von der Deutschen Gesellschaft für Ernährung vorgeschlagene tägliche Ballaststoffzufuhr liegt bei 30 g. Die Aufnahme von Ballaststoffen ist jedoch in Deutschland deutlich unterhalb dieser empfohlenen Menge. Getreideprodukte, besonders vom Vollkorntyp, sind die wichtigste Quelle für Ballaststoffe. Deshalb sollten im Rahmen dieser Arbeit direkt verzehrsfähige, Ballaststoff-angereicherte Haferprodukte (vorwiegend Extrudate) mit hohen Gehalten an b-Glucanen und resistenter Stärke hergestellt, analysiert und nachfolgend auf relevante ernährungsphysiologische Wirkungen geprüft werden. Als Basis für die Produkte wurden Hafermehl und Haferkleie eingesetzt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Analyse der Haferprodukte. Diese wiesen eine hohe Wasserbindungskapazität auf. Bei den Untersuchungen am Tiermodell wurde gezeigt, dass im Dünndarm eine größere Menge an Wasser durch die Haferprodukte gebunden wurde, was zu einem höheren Feuchtigkeitsanteil der gastrointestinalen Inhalte der Tiere führte, die ballaststoffreiches Futter erhielten. Trotz der hydrothermischen Behandlung während der Extrusion wurden Produkte gewonnen, deren β-Glucane im hochmolekularen Zustand erhalten blieben und somit eine hohe Viskosität in wässrigen Lösungen beibehielten. In rheologischen Untersuchungen wurde bestätigt, dass die aus Haferprodukten isolierten β-Glucane ein pseudoplastisches Fließverhalten besitzen. Demgegenüber führte ein Autoklavieren der Produkte zu einer starken Depolymerisation der b-Glucane, was sich in einer Änderung der funktionellen Eigenschaften der b-Glucane widerspiegelte. Im Mittelpunkt der Untersuchungen standen ernährungsphysiologische In-vitro- und In-vivo-Experimente mit Extrudaten und Proben auf der Basis von Hafer, die einen erhöhten Anteil an Ballaststoffen, speziell an b-Glucan und an resistenter Stärke, besaßen und die direkt verzehrbar sind. Diese Haferprodukte zeigten eine Reihe von ernährungsphysiologisch vorteilhaften und protektiven Wirkungen in In-vitro-Experimenten. So traten sie mit Gallensäuren unter den Bedingungen des Dünndarms in Wechselwirkung und waren gut mit Faecesflora vom Menschen fermentierbar. Die In-vitro-Verdauung von Maisstärke durch Pankreatin, wurde durch die ballaststoffreichen Haferprodukte partiell gehemmt. Dieser Befund lässt eine Abschwächung des postprandialen Glukoseanstieges erwarten. In einem sechswöchigen Fütterungsversuch erhielten Ratten Diäten, die zu 50 % aus ballaststoffreichen Haferprodukten bestanden. Diese Haferprodukte bewirkten einen erhöhten Transport von Gallensäuren und neutralen Sterolen in den unteren Intestinaltrakt sowie deren verstärkte Ausscheidung. Durch den Verzehr der ballaststoffreichen Haferprodukte kam es zu Veränderungen in der Mikroflora, wobei sich besonders die coliformen Keime verminderten und die Keimzahlen der Lactobacillen sowie die Bifidobakterien erhöhten. Die Fermentation der Ballaststoffe führte zur erhöhten Bildung von kurzkettigen Fettsäuren einschließlich von Butyrat. Die Bildung der kurzkettigen Fettsäuren geht mit einer pH-Wert-Absenkung im Caecum und Colon einher, die wiederum für eine geringere Bildung von sekundären Gallensäuren verantwortlich ist. Die Ergebnisse des Fütterungsversuchs an Ratten wurden prinzipiell durch eine vierwöchige Pilotstudie am Menschen, in der Probanden täglich 100 g Haferextrudat erhielten, bestätigt. Das Extrudat wurde von den Probanden gut akzeptiert. In der 4. Woche wurden eine geringe Abnahme der Cholesterolfraktionen im Serum, höhere Keimzahlen für Lactobacillen, Bifidobacterien und Bacteroides, geringere pH-Werte und Trockenmassegehalte in den Faeces, eine Zunahme der individuellen und Gesamt-SCFA sowie des Butyratanteils in den Faeces, eine erhöhte Ausscheidung an Steroiden, eine Zunahme der primären Gallensäuren und eine Abnahme des prozentualen Anteils an sekundären Gallensäuren sowie der Cholesterol-Metaboliten gefunden. Diese Parameter gingen 2 Wochen nach Beendigung der Intervention mit dem Haferextrudat wieder in Richtung der Ausgangswerte (0. Woche) zurück. Die untersuchten Haferprodukte erwiesen sich als gut fermentierbare Substrate für die intestinale Mikroflora und können deshalb als ein Präbiotikum mit Ballaststoffcharakter eingeschätzt werden. Diese Produkte, die mit einem erhöhten Anteil an resistenter Stärke und wertvollen Haferballaststoffen hergestellt wurden, können dazu beitragen, die Ballaststofflücke in unserer Ernährung zu schließen und positive ernährungsphysiologische Effekte zu bewirken.
Dietary antioxidants are believed to play an important role in the prevention and treatment of a variety of diseases associated with oxidative stress. Although there is a wide range of dietary antioxidants, the bulk of the research to date has been focused on the nutrient antioxidants vitamin C, E, and carotenoids. Certain relatively uncommon antioxidants such as lipoic acid (LA), and phenolic compounds such as (-)-epicatechin (EC), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epicatechin gallate (ECG), and (-)-epigallocatechin gallate (EGCG), have not been extensively investigated although they may exert greater antioxidant potency than that of carotenoids and vitamins. Extracts from selected plants and plant byproducts may represent rich sources for one or more of such antioxidants and therefore exhibit higher effects than a single antioxidant due to the synergistic effects produced between such antioxidants. However, in the last decade a number of epidemiological, animal and in vitro studies have suggested a protective and therapeutic potency of these antioxidants in a broad range of diseases such as cancer, diabetes, atherosclerosis, cataract and acute and chronic neurological disorders. Inflammation, the response of the host toward any infection or injury, plays a central role in the development of many chronic diseases. Several evidences demonstrated the rise of different types of cancer from sites of inflammation. This suggests that active oxygen species and some cytokines generated in the inflamed tissues can cause injury to DNA and ultimately lead to carcinogenesis. Diethylnitrosamine (DEN) is one of the most important environmental carcinogens, present in a variety of foods, alcoholic beverages, tobacco smoke and it can be synthesized endogenously. In addition to the liver it can induce carcinogenesis in other organs like kidney, trachea, lung, esophagus, fore stomach, and nasal cavity. Several epidemiological and laboratory studies indicate that nitroso compounds including DEN may induce hyperplasia and chronic inflammation which is closely associated with the development of hepatocellular carcinoma. Despite increasing evidence on the potential of antioxidants in modulating the etiology of chronic diseases, little is known about their role in inflammation and acute phase response (APR). Therefore the aim of the present work was to study the protective effect of water and solvent extracts of eight plant and plant byproducts including green tea, artichoke, spinach, broccoli, onion and eggplant, orange and potato peels as well as eight antioxidants agents including EC, EGC, ECG, EGCG, ascorbic acid (AA), acetylcysteine (NAC), α-LA, and alpha-tocopherol (α-TOC) toward acute inflammation induced by interleukin-6 (IL-6) and hepatotoxicity induced by DEN in vitro. The negative acute phase proteins (APP), transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) were used as inflammatory biomarkers analyzed by ELISA, whereas neutral red assay was used for evaluating the cytotoxicity. All experiments were performed in vitro using human hepatocarcinoma cell line (HepG2). Additionally the antioxidant activity was measured by TEAC and FRAP assays, phenolic content was measured by Folin–Ciocalteu and characterized by HPLC. Moreover, the microheterogeneity of TTR was detected using immunoprecipitation assay combined with SELDI-TOF MS. Results of present study showed that HepG2 cells provide a simple, sensitive in vitro system for studying the regulation of the negative APP, TTR and RBP under free and inflammatory condition. IL-6, a potent proinflammatory cytokine, in a concentration of 25 ng/ml was able to reduce TTR and RBP secretion by approximately 50-60% after 24h of incubation. With exception of broccoli and water extract of onion which showed pro-inflammatory effects in this study, all other plant extracts, at specific concentrations, were able to elevate TTR secretion in normal condition and even under treatment of IL-6 where the effect was quite lower. Green tea followed by artichoke and potato peel exhibited the highest elevation in TTR concentration which reached 1.1 and 2.5 folds of control in presence and absences of IL-6 respectively. In general Plant extracts were ordered according their anti-inflammatory potency as following: in water extracts; green tea > artichoke > potato peel > orange peel > spinach > eggplant peel, where in solvent extracts; green tea > artichoke > potato peel > spinach > eggplant peel > onion > orange peel. The antiinflammatory effect of water extracts of green tea, artichoke and orange peel were significantly higher than their corresponding solvent extracts whereas water extracts of eggplant-, potato peels and spinach showed lower effect than their solvent extracts. On the other hand α-LA followed by EGCG and ECG exhibited the highest elevation in TTR concentration compared to other antioxidants. The relation between the anti-inflammatory potential and antioxidants activity and phenolic content for the investigated substances was generally weak. This may suggest the involvement of other mechanisms than antioxidants properties for the observed effect. TTR secreted by HepG2 cells has a molecular structure quite similar to the purified standard and serum TTR in which all the three main variants are contained including native, S-cystinylated and Sglutathionylated TTR. Interestingly, a variant with molecular mass of 13453.8 + 8.3 Da has been detected only in TTR secreted by HepG2. Among all investigated antioxidants and plant extracts, six substances were able to elevate the native preferable TTR variant. The potency of these substances can be ordered as following α-LA > NAC > onion > AA > EGCG > green tea. A weak correlation between elevation on TTR and shifting to the native form was observed. Similar weak correlation has also been observed between antioxidants activity and elevation in native TTR. Although DEN was able to induce cell death in a concentration dependent manner, it requires considerably higher concentrations for its effects especially after 24h. This may be attributed to a lack in cytochrome P450 enzymes produced by HepG2. At selected concentrations some antioxidants and plant extracts significantly attenuate DEN cytotoxicity as following: spinach > α-LA > artichoke > orange peel > eggplant peel > α-TOC > onion > AA. Contrary all other substances especially green tea, broccoli, potato peel, and ECG stimulate DEN toxicity. In conclusion, this study demonstrated that selected antioxidants and plant extracts may attenuate the inflammatory process, not only by their antioxidants potency but also by other mechanisms which remain unclear. They may also play a vital role on stabilizing the tetramic structure of TTR and thereby prevent amyloidosis diseases. Lipoic acid represents in this study unique function against inflammation and hepatotoxicity. Despite the protective effect demonstrated by investigated substances, attention should also be given to the pro-oxidant and potential cytotoxic effects produced at higher concentrations.
Humans are frequently exposed to a variety of endocrine disrupting chemicals (EDCs), which can cause harmful effects, e.g. disturbance of growth, development and reproduction, and cancer (UBA, 2016). EDCs are often components of synthetically manufactured products. Materials made of plastics, building materials, electronic items, textiles or cosmetic products can be particularly contaminated (Ain et al., 2021). One group of EDCs that has gained increased interest in recent years is phthalates. They are used as plasticizers in plastic materials to which people are daily exposed to. Phthalate plasticizers exert their harmful effects among others via activation of the estrogen receptor α (ERα), the estrogen receptor β (ERβ) and via inhibition of the androgen receptor (AR). Some phthalates have already been classified by the EU as Cancerogenic-, Mutagenic-, Reprotoxic- (CMR) substances and their use in industry has been restricted. After oral ingestion, phthalates are metabolized and are finally excreted with the urine. Numerous toxicological studies exist on phthalates, but mainly with the parent substances, not with their primary and secondary metabolites. In the course of the restriction of phthalates by the EU, the phthalate-free plasticizer di-isononylcyclohexane-1,2-dicarboxylate (DINCH®), was introduced to the market. So far, almost no toxicologically relevant properties have been identified for DINCH®. However, the effects of DINCH® have only been studied in animal experiments and, as with phthalates, almost exclusively with the parent substance. However, toxic effects of a particular compound may be induced by its metabolites and not by the parent compound itself. Therefore, potential endocrine effects of 15 phthalates, 19 phthalate metabolites, DINCH®, and five of its metabolites were investigated using reporter gene assays on the ERα, ERβ, and the AR. In addition, studies of the influence of some selected plasticizers on peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα) and peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) activity were performed. Furthermore, a H295R steroidogenesis assay was performed to determine the influence of DINCH® and its metabolites on estradiol or testosterone synthesis. Analysis of the experiments shows that the phthalates either stimulated or inhibited ERα and ERβ activity and inhibited AR activity, whereas the phthalate metabolites did not affect the activity of these human hormone receptors. In contrast, metabolites of di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) stimulated transactivation of the human PPARα and PPARγ in analogous reporter gene assays, although DEHP itself did not activate these nuclear receptors. Therefore, primary and secondary phthalate metabolites appear to exert different effects at the molecular level compared to the parent compounds. Similarly, the results showed that the phthalate-free plasticizer DINCH® itself did not affect the activity of ERα, ERβ, AR, PPARα and PPARγ, while the DINCH® metabolites were shown to activate all these receptors. In the case of AR, DINCH® metabolites mainly enhanced AR activity stimulated by dihydrotestosterone (DHT). In the H295R steroidogenesis assay, neither DINCH® nor any of its metabolites affected estradiol or testosterone synthesis. Primary and secondary metabolites of DINCH® thus exert different effects at the molecular level than DINCH® itself. However, all these in vitro effects of DINCH® metabolites were observed only at high concentrations, which were about three orders of magnitude higher than the reported DINCH® metabolite concentrations in human urine. Therefore, the in vitro data does not support the assumption that DINCH® or any of the metabolites studied could have significant endocrine effects in vivo at relevant exposure levels in humans. Following the demonstration of direct and indirect endocrine effects of the studied plasticizers, a new effect-based in vitro 3D screening tool for toxicity assays of non-genotoxic carcinogens was developed using estrogen receptor-negative (ER-) MCF10-A cells and estrogen receptor-positive (ER+) MCF-12A cells. This arose from the background that breast cancer is the most common cancer occurring in women and estrogenic substances, such as phthalates, can probably influence the disease. The human mammary epithelial cell lines MCF-10A and MCF-12A form well-differentiated acini-like structures when cultured in three-dimensional Matrigel culture for a period of 20 days. The model should make it possible to detect substance effects on cell differentiation and growth, on mammary cell acini, and to differentiate between estrogenic and non-estrogenic effects at the same time. In the present study, both cell lines were tested for their suitability as an effect-based in vitro assay system for non-genotoxic carcinogens. An Automated Acinus Detection And Morphological Evaluation (ADAME) software solution has been developed for automatic acquisition of acinus images and determination of morphological parameters such as acinus size, lumen size, and acinus roundness. Several test substances were tested for their ability to affect acinus formation and cellular differentiation. Human epithelial growth factor (EGF) stimulated acinus growth for both cell lines, while all trans retinoic acid (RA) inhibited acinar growth. The potent estrogen 17β-estradiol had no effect on acinus formation of MCF-10A cells but resulted in larger MCF-12A acini. Thus, the parallel use of both cell lines together with the developed high content screening and evaluation tool allows the rapid identification of the estrogenic and cancerogenic properties of a given test compound. The morphogenesis of the acini was only slightly affected by the test substances. On the one hand, this suggests a robust test system, on the other hand, it probably cannot detect low-potent estrogenic compounds such as phthalates or DINCH®. The advantage of the robustness of the system, however, may be that vast numbers of "positive" results with questionable biological relevance could be avoided, such as those observed in sensitive reporter gene assays.
Substanzen der pharmazeutischen und chemischen Industrie müssen nach internationalen Richtlinien auf deren Toxizität gegenüber Mensch und Umwelt geprüft werden. Dazu gehören u. a. Prüfungen zur Vorhersage des embryotoxischen Potentials, die am lebenden Organismus durchgeführt werden. Mit dem Ziel die Anzahl der Tierversuche zu verringern, die notwendig sind um das toxikologische Profil einer Prüfsubstanz zu bestimmen, wurde der Embryonale Stammzelltest (EST) entwickelt. Als Grundlage des EST dienen embryonale Stammzellen (ES-Zellen) einer Zelllinie. ES-Zellen sind Zellen, die sich in der frühen embryonalen Entwicklung in die Zellen der Keimblätter entwickeln können. Daraus wiederum differenzieren die vielen verschiedenen, unterschiedlich spezialisierten Zelltypen des komplexen Organismus. Im EST wird die Konzentration einer Prüfsubstanz bestimmt, bei der die Differenzierung von ES-Zellen zu Herzmuskelzellen zu 50 % inhibiert wird. Zusätzlich wird die Konzentration der Prüfsubstanz bestimm°t, bei der 50 % der ES-Zellen (IC50D3) bzw. Fibroblastenzellen (IC503T3) absterben. Die allgemeine Toxizität ist damit von der spezifischen Toxizität der Prüfsubstanz auf die ES-Zellen und deren Differenzierung unterscheidbar. Die Parameter fliessen in ein biostatistisches Modell zur Prädiktion des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanzen ein. Es wurde ein Versuchsprotokoll entwickelt, wonach die ES-Zellen sich verstärkt zu Endothelzellen differenzieren. Die Endothelzellen, die im lebenden Organismus die Wand der späteren Blutgefässe, wie Venen und Arterien bilden, wurden mittels molekularbiologischer Methoden auf der RNA- und der Protein-Ebene nachgewiesen und quantifiziert. Verschiedene Zellkulturmethoden, Wachstumsfaktoren, als auch Wachstumsfaktorkonzentrationen wurden auf deren Vermögen die Differenzierung der ES-Zellen zu Endothelzellen zu induzieren, untersucht. Nach der Etablierung des Differenzierungsprotokolls wurden sieben Substanzen auf deren Vermögen geprüft, die Differenzierung von ES-Zellen zu Endothelzellen zu inhibieren. Die Endothelzellen wurden dabei über die Expression der RNA von zwei endothelzellspezifischen Genen quantifiziert. Im Vergleich dazu wurden die IC50D3 und die IC503T3 der Prüfsubstanz bestimmt, um eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanz zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der sieben Prüfsubstanzen in nicht-, schwach- oder stark embryotoxisch vorgenommen werden konnte. Es ist zu schlussfolgern, dass der weiterentwickelte in vitro Embryotoxizitätsassay sensitiv und reproduzierbar ist. Mit der Verwendung von verschiedenen Differenzierungsendpunkten kann die Prädiktionskraft des Assays deutlich verbessert, und die Anzahl von Tierversuchen verringert werden. Durch die Verwendung von molekularbiologischen Markern kann der Assay einem Hochdurchsatzscreening zugängig gemacht werden und damit die Anzahl von Prüfsubstanzen deutlich erhöht werden.
Countries processing raw coffee beans are burdened with low economical incomes to fight the serious environmental problems caused by the by-products and wastewater that is generated during the wet-coffee processing. The aim of this work was to develop alternative methods of improving the waste by-product quality and thus making the process economically more attractive with valorization options that can be brought to the coffee producers.
The type of processing influences not only the constitution of green coffee but also of by-products and wastewater. Therefore, coffee bean samples as well as by-products and wastewater collected at different production steps of were analyzed. Results show that the composition of wastewater is dependent on how much and how often the wastewater is recycled in the processing. Considering the coffee beans, results indicate that the proteins might be affected during processing and a positive effect of the fermentation on the solubility and accessibility of proteins seems to be probable. The steps of coffee processing influence the different constituents of green coffee beans which, during roasting, give rise to aroma compounds and express the characteristics of roasted coffee beans. Knowing that this group of compounds is involved in the Maillard reaction during roasting, this possibility could be utilized for the coffee producers to improve the quality of green coffee beans and finally the coffee cup quality.
The valorization of coffee wastes through modification to activated carbon has been considered as a low-cost option creating an adsorbent with prospective to compete with commercial carbons. Activation protocol using spent coffee and parchment was developed and prepared to assess their adsorption capacity for organic compounds. Spent coffee grounds and parchment proved to have similar adsorption efficiency to commercial activated carbon.
The results of this study document a significant information originating from the processing of the de-pulped to green coffee beans. Furthermore, it showed that coffee parchment and spent coffee grounds can be valorized as low-cost option to produce activated carbons. Further work needs to be directed to the optimization of the activation methods to improve the quality of the materials produced and the viability of applying such experiments in-situ to bring the coffee producer further valorization opportunities with environmental perspectives.
Coffee producers would profit in establishing appropriate simple technologies to improve green coffee quality, re-use coffee by-products, and wastewater valorization.
With the many challenges facing the agricultural system, such as water scarcity, loss of arable land due to climate change, population growth, urbanization or trade disruptions, new agri-food systems are needed to ensure food security in the future. In addition, healthy diets are needed to combat non-communicable diseases. Therefore, plant-based diets rich in health-promoting plant secondary metabolites are desirable. A saline indoor farming system is representing a sustainable and resilient new agrifood system and can preserve valuable fresh water. Since indoor farming relies on artificial lighting, assessment of lighting conditions is essential. In this thesis, the cultivation of halophytes in a saline indoor farming system was evaluated and the influence of cultivation conditions were assessed in favor of improving the nutritional quality of halophytes for human consumption. Therefore, five selected edible halophyte species (Brassica oleracea var. palmifolia, Cochlearia officinalis, Atriplex hortensis, Chenopodium quinoa, and Salicornia europaea) were cultivated in saline indoor farming. The halophyte species were selected for to their salt tolerance levels and mechanisms. First, the suitability of halophytes for saline indoor farming and the influence of salinity on their nutritional properties, e.g. plant secondary metabolites and minerals, were investigated. Changes in plant performance and nutritional properties were observed as a function of salinity. The response to salinity was found to be species-specific and related to the salt tolerance mechanism of the halophytes. At their optimal salinity levels, the halophytes showed improved carotenoid content. In addition, a negative correlation was found between the nitrate and chloride content of halophytes as a function of salinity. Since chloride and nitrate can be antinutrient compounds, depending on their content, monitoring is essential, especially in halophytes. Second, regional brine water was introduced as an alternative saline water resource in the saline indoor farming system. Brine water was shown to be feasible for saline indoor farming
of halophytes, as there was no adverse effect on growth or nutritional properties, e.g. carotenoids. Carotenoids were shown to be less affected by salt composition than by salt concentration. In addition, the interaction between the salinity and the light regime in indoor farming and greenhouse cultivation has been studied. There it was shown that interacting light regime and salinity alters the content of carotenoids and chlorophylls. Further, glucosinolate and nitrate content were also shown to be influenced by light regime. Finally, the influence of UVB light on halophytes was investigated using supplemental narrow-band UVB LEDs. It was shown that UVB light affects the growth, phenotype and metabolite profile of halophytes and that the UVB response is species specific. Furthermore, a modulation of carotenoid content in S. europaea could be achieved to enhance health-promoting properties and thus improve nutritional quality. This was shown to be dose-dependent and the underlying mechanisms of carotenoid accumulation were also investigated. Here it was revealed that carotenoid accumulation is related to oxidative stress.
In conclusion, this work demonstrated the potential of halophytes as alternative vegetables produced in a saline indoor farming system for future diets that could contribute to ensuring food security in the future. To improve the sustainability of the saline indoor farming system, LED lamps and regional brine water could be integrated into the system. Since the nutritional properties have been shown to be influenced by salt, light regime and UVB light, these abiotic stressors must be taken into account when considering halophytes as alternative vegetables for human nutrition.
Durch die Zunahme metabolischer Stoffwechselstörungen und Erkrankungen in der Weltbevölkerung wird in der Medizin und den Lebenswissenschaften vermehrt nach Präventionsstrategien und Ansatzpunkten gesucht, die die Gesundheit fördern, Erkrankungen verhindern helfen und damit auch die Gesamtlast auf die Gesundheitssysteme erleichtern. Ein Ansatzpunkt wird dabei in der Ernährung gesehen, da insbesondere der Konsum von gesättigten Fetten die Gesundheit nachträglich zu beeinflussen scheint. Dabei wird übersehen, dass in vielen Studien Hochfettdiäten nicht ausreichend von den Einflüssen einer zum Bedarf hyperkalorischen Energiezufuhr getrennt werden, sodass die Datenlage zu dem Einfluss von (gesättigten) Fetten auf den Metabolismus bei gleichbleibender Energieaufnahme noch immer unzureichend ist.
In der NUtriGenomic Analysis in Twins-Studie wurden 46 Zwillingspaare (34 monozygot, 12 dizygot) über einen Zeitraum von sechs Wochen mittels einer kohlenhydratreichen, fettarmen Diät nach Richtlinien der Deutschen Gesellschaft für Ernährung für ihr Ernährungsverhalten standardisiert, ehe sie zu einer kohlenhydratarmen, fettreichen Diät, die insbesondere gesättigte Fette enthielt, für weitere sechs Wochen wechselten. Beide Diäten waren dem individuellen Energiebedarf der Probanden angepasst, um so sowohl akut nach einerWoche als auch längerfristig nach sechs Wochen Änderungen des Metabolismus beobachten zu können, die sich in der vermehrten Aufnahme von (gesättigten) Fetten begründeten.
Die über die detaillierte Charakterisierung der Probanden an den klinischen Untersuchungstagen generierten Datensätze wurden mit statistischen und mathematischen Methoden (z.B. lineare gemischte Modellierung) analysiert, die der Größe der Datensätze und damit ihrem Informationsvolumen angepasst waren.
Es konnte gezeigt werden, dass die metabolisch gesunden und relativ jungen Probanden, die eine gute Compliance zeigten, im Hinblick auf ihren Glukosestoffwechsel adaptieren konnten, indem die Akutantwort nach einer Woche im Nüchterninsulin und dem Index für Insulinresistenz in den weiteren fünf Wochen ausgeglichen wurde.
Der Lipidstoffwechsel in Form der klassischen Marker wie Gesamtcholesterin, LDL und HDL war dagegen stärker beeinflusst und auch nach insgesamt sechs Wochen deutlich erhöht.
Letzteres unterstützt die Beobachtung im Transkriptom des weißen, subkutanen Fettgewebes, bei der eine Aktivierung der über die Toll-like receptors und das Inflammasom vermittelten subklinischen Inflammation beobachtet werden konnte.
Die auftretenden Veränderungen in Konzentration und Komposition des Plasmalipidoms zeigte ebenfalls nur eine teilweise und auf bestimmte Spezies begrenzte Gegenregulation.
Diesbezüglich kann also geschlussfolgert werden, dass auch die isokalorische Aufnahme von (gesättigten) Fetten zu Veränderungen im Metabolismus führt, wobei die Auswirkungen in weiteren (Langzeit-)Studien und Experimenten noch genauer untersucht werden müssen. Insbesondere wäre dabei ein längerer Zeitraum unter isokalorischen Bedingungen von Interesse und die Untersuchung von Probanden mit metabolischer Vorbelastung (z.B. Insulinresistenz).
Darüber hinaus konnte in NUGAT aber ebenfalls gezeigt werden, dass die Nutrigenetik und Nutrigenomik zwei nicht zu vernachlässigende Faktoren darstellen. So zeigten unter anderem die Konzentrationen einiger Lipidspezies eine starke Erblichkeit und Abhängigkeit der Diät.
Zudem legen die Ergebnisse nahe, dass laufende wie geplante Präventionsstrategien und medizinische Behandlungen deutlich stärker den Patienten als Individuum mit einbeziehen müssen, da die Datenanalyse interindividuelle Unterschiede identifizierte und Hinweise lieferte, dass einige Probanden die nachteiligen, metabolischen Auswirkungen einer Hochfettdiät besser ausgleichen konnten als andere.
Aminosäuren sind lebensnotwendige Moleküle für alle Organismen. Ihre Erkennung im Körper ermöglicht eine bedarfsgerechte Regulation ihrer Aufnahme und ihrer Verwertung. Welcher Chemosensor für diese Erkennung jedoch hauptverantwortlich ist, ist bisher unklar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Umamigeschmacksrezeptoruntereinheit Tas1r1 jenseits ihrer gustatorischen Bedeutung für die Aminosäuredetektion in der Mundhöhle untersucht.
In der histologischen Tas1r1-Expressionsanalyse nichtgustatorischer Gewebe der Mauslinie Tas1r1-Cre/ROSA26-tdRFP wurde über die Detektion des Reporterproteins tdRFP die Expression des Tas1r1 in allen untersuchten Geweben (Speiseröhre, Magen, Darm, Bauchspeicheldrüse, Leber, Niere, Muskel- und Fettgewebe, Milz, Thymus, Lymphknoten, Lunge sowie Hoden) nachgewiesen. Mit Ausnahme von Dünndarm und Hoden gelang hierbei der Nachweis erstmals spezifisch auf zellulärer Ebene. Caecum und Lymphknoten wurden zudem neu als Expressionsorte des Tas1r1 identifiziert.
Trotz der beobachteten weiten Verbreitung des Tas1r1 im Organismus – unter anderem auch in Geweben, die für den Proteinstoffwechsel besonders relevant sind – waren im Zuge der durchgeführten Untersuchung potentieller extraoraler Funktionen des Rezeptors durch phänotypische Charakterisierung der Mauslinie Tas1r1-BLiR nur schwache Auswirkungen auf Aminosäurestoffwechsel bzw. Stickstoffhaushalt im Falle eines Tas1r1-Knockouts detektierbar. Während sich Ernährungsverhalten, Gesamtphysiologie, Gewebemorphologie sowie Futterverdaulichkeit unverändert zeigten, war die renale Stickstoffausscheidung bei Tas1r1-Knockout-Mäusen auf eiweißarmer sowie auf eiweißreicher Diät signifikant verringert. Eine Überdeckung der Auswirkungen des Tas1r1-Knockouts aufgrund kompensatorischer Effekte durch den Aminosäuresensor CaSR oder den Peptidsensor Gpr93 war nicht nachweisbar. Es bleibt offen, ob andere Mechanismen oder andere Chemosensoren an einer Kompensation beteiligt sind oder aber Tas1r1 in extraoralem Gewebe andere Funktionen als die der Aminosäuredetektion übernimmt. Unterschiede im extraoralen Expressionsmuster der beiden Umamirezeptor-untereinheiten Tas1r1 und Tasr3 lassen Spekulationen über andere Partner, Liganden und Funktionen zu.
The fat-soluble vitamin A, which is chemically referred to retinol (ROH), is known to be essential for the process of vision, the immune system but also for cell differentiation and proliferation. Recently, ROH itself has been reported to be involved in adipogenesis and a ROH transport protein, the retinol-binding protein 4 (RBP4), in insulin resistance and type 2 diabetes. However, there is still considerable scientific debate about this relation. With the increasing amount of studies investigating the relation of ROH in obesity and type 2 diabetes, basic research is an essential prerequisite for interpreting these results. This thesis enhances the knowledge on this relation by reviewing ROH metabolism on extra- and intracellular level. Aim 1: In the blood stream ROH is transported in a complex with RBP4 and a second protein, transthyretin (TTR), to the target cells. The levels of RBP4 and TTR are influenced by several factors but mainly by liver and kidney function. The reason for that is that liver and the kidneys are the sites of RBP4 synthesis and catabolism, respectively. Interestingly, obesity and type 2 diabetes involve disorders of the liver and the kidneys. Therefore the aim was to investigate factors that influence RBP4 and TTR levels in relation to obesity and type 2 diabetes (Part 1). Aim 2: Once arrived in the target cell ROH is bound to cellular retinol-binding protein type I (CRBP-I) and metabolised: ROH can either be stored as retinylesters or it can be oxidised to retinoic acid (RA). By acting as a transcription factor in the nucleus RA may influence processes such as adipogenesis. Therefore vitamin A has been postulated to be involved in obesity and type 2 diabetes. CRBP-I is known to mediate the storage of ROH in the liver, but the extra-hepatic metabolism and the functions of CRBP-I are not well known. This has been investigated in Part 2 of this work. Material & Methods: RBP4 and TTR levels were investigated by ELISA in serum samples of human subjects with overweight, type 2 diabetes, kidney or liver dysfunction. Molecular alterations of the RBP4 and TTR protein structure were analysed by MALDI-TOF mass spectrometry. The functions of intracellular CRBP-I were investigated in CRBP-I knock-out mice in liver and extra-hepatic tissues by measuring ROH levels as well as the levels of its storage form, the retinylesters, using reverse phase HPLC. The postprandial uptake of ROH into tissues was analysed using labelled ROH. The mRNA levels of enzymes that metabolize ROH were examined by real-time polymerase chain reaction (RCR). Results: The previous published results showing increased RBP4 levels in type 2 diabetic patients could not be confirmed in this work. However, it could be shown that during kidney dysfunction RBP4 levels are increased and that RBP4 and TTR levels are decreased during liver dysfunction. The important new finding of this work is that increased RBP4 levels in type 2 diabetic mice were increased when kidney function was decreased. Thus an increase in RBP4 levels in type 2 diabetes may be the effect of a reduced kidney function which is common in type 2 diabetes. Interestingly, during severe kidney dysfunction the molecular structure of RBP4 and TTR was altered in a specific manner which was not the case during liver diseases and type 2 diabetes. This underlines the important function of the kidneys in RBP4 metabolism. CRBP-I has been confirmed to be responsible for the ROH storage in the liver since CRBP-I knock-out mice had decreased ROH and retinylesters (the storage form of ROH) levels in the liver. Interestingly, in the adipose tissue (the second largest ROH storage tissue in the body) ROH and retinylesters levels were higher in the CRBP-I knock-out compared to the wild-type mice. It could be shown in this work that a different ROH binding protein, cellular retinol-binding protein type III, is upregulated in CRBP-I knock-out mice. Moreover enzymes were identified which mediate very efficiently ROH esterification in the adipose tissue of the knock-out mice. In the pancreas there was a higher postprandial ROH uptake in the CRBP-I knock-out compard to wild-type mice. Even under a vitamin A deficient diet the knock-out animals had ROH and retinylesters levels which were comparable to wild-type animals. These results underline the important role of ROH for insulin secretion in the pancreas. Summing up, there is evidence that RBP4 levels are more determined by kidney function than by type 2 diabetes and that specific molecular modifications occur during kidney dysfunction. The results in adipose tissue and pancreas of CRBP-I knock-out mice support the hypothesis that ROH plays an important role in glucose and lipid metabolism.
Die gesundheitsfördernden Eigenschaften von grünem Tee sind weitgehend akzeptiert. Den Teecatechinen, insbesondere dem Epigallocatechin-3-gallat (EGCG), werden zahlreiche positive Effekte zugesprochen (z. B. antioxidativ, antikanzerogen, antiinflammatorisch, Blutdruck und Cholesterinspiegel senkend). Die Mechanismen, die zu einer Reduktion der in Tierversuchen beschriebenen Körper- und Fettmasse führen, sind nicht ausreichend geklärt. Ziel dieser Arbeit bestand darin, die kurz- und mittelfristigen Wirkungen einer TEAVIGO®-Applikation (mind. 94 % EGCG) am Mausmodell im Hinblick auf den Energie- und Fettstoffwechsel sowie die Expression daran beteiligter Gene in wichtigen Organen und Geweben zu untersuchen. In verschiedenen Tierversuchen wurde männlichen C57BL/6-Mäusen eine Hochfettdiät (HFD) mit und ohne Supplementation (oral, diätetisch) des entkoffeinierten Grüntee-Extraktes TEAVIGO® in unterschiedlichen Dosierungen gefüttert. Es wurden sowohl kurz- als auch mittelfristige Wirkungen des EGCG auf die Energiebilanz (u. a. indirekte Tierkalorimetrie) und Körperzusammensetzung (NMR) sowie die exogene Substratoxidation (Stabilisotopentechnik: Atemtests, Inkorporation natürlicher 13C-angereicherter Triglyceride aus Maiskeimöl in diverse Organe/Gewebe) und Gen-expression (quantitative real-time PCR) untersucht. Die Applikationsform und ihre Dauer riefen unterschiedliche Wirkungen hervor. Mäuse mit diätetischer Supplementation zeigten bereits nach kurzer Zeit eine verminderte Körperfettmasse, die bei weiterer Verabreichung auch zu einer Reduktion der Körpermasse führte. Beide Applikationsformen resultieren, unabhängig von der Dauer der Intervention, in einer erhöhten Energieausscheidung, während die Futter- und Energieaufnahme durch EGCG nicht beeinflusst wurden. Der Energieverlust war von einer erhöhten Fett- und Stickstoffausscheidung begleitet, deren Ursache die in der Literatur beschriebene Interaktion und Hemmung digestiver Enzyme sein könnte. Besonders unter postprandialen Bedingungen wiesen EGCG-Mäuse erniedrigte Triglycerid- und Glycogengehalte in der Leber auf, was auf eine eingeschränkte intestinale Absorption der Nährstoffe hindeutet. Transkriptanalysen ergaben im Darm eine verminderte Expression von Fettsäuretransportern, während die Expression von Glucosetransportern durch EGCG erhöht wurde. Weiterhin reduzierte EGCG, nach Umstellung von Standard- auf eine maiskeimölhaltige Hochfettdiät, die Inkorporation natürlicher 13C-angereicherter Triglyceride in diverse Organe und Gewebe – insbesondere Leber, viszerales und braunes Fettgewebe sowie Skelettmuskel. Die Analyse der 13C-Anreicherung im Atem der Mäuse und die Energieumsatzmessungen ergaben nach kurzer Applikation eine erhöhte Fettoxidation, die im weiteren Verlauf der Intervention auf eine erhöhte Kohlenhydratoxidation umgeschaltet wurde. Weiterhin war die orale Applikation von EGCG bei gleichzeitiger Fütterung einer Hochfettdiät von makroskopischen und mikroskopischen degenerativen Veränderungen der Leber begleitet. Diese Effekte wurden nach diätetischer Supplementation der Hochfettdiät mit EGCG nicht beobachtet. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Körpergewichts- und Fettgewebs-abnahme durch diätetisches EGCG sich durch eine herabgesetzte Verdaulichkeit der Nahrung erklären lässt. Dies führte zu verschiedenen kurz- und mittelfristigen Veränderungen in der Fettverteilung und im Fettmetabolismus.
Die Zahl der Kolonkarzinome in den westlichen Industrieländern steigt in den letzten Jahren stetig an. Zu den Verbindungen, die mit der Zubereitung der Nahrung entstehen, mit ihr aufgenommen werden und die Kolonkanzerogenese möglicherweise begünstigen, gehört das heterozyklische aromatische PhIP, das bei der Erhitzung proteinreicher Nahrungsmittel entsteht. Neben zahlreichen Fütterungsversuchen an Nagern existieren auch Zellkulturmodelle zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der PhIP-induzierten Kolonkanzerogenese. Die chemische Transformation von Zellen sollte durch wiederholte Exposition gegenüber dem hydroxylierten Metaboliten des Kanzerogens (N2-OH-PhIP) erzielt werden. Es wurden IEC-18-Zellen der Ratte und HCEC-Zellen des Menschen zur Untersuchung verwendet. Die Behandlung der IEC-18-Zellen führt nach 25 Behandlungszyklen mit Konzentrationen von 5 bis 20 µM nicht zur Transformation der Zellen. Die Anwesenheit von N2-OH-PhIP führt zu einer zehnfach erhöhten Induktion der GST-Aktivität, insbesondere der Untereinheiten GST-A1, -A3, -Pi und -T2, die für die effiziente Detoxifizierung des N-Acetoxy-Metaboliten vom N2-OH-PhIP verantwortlich sind. Bereits nach drei Behandlungen mit 1,5 µM N2-OH-PhIP konnte eine maligne Transformation der HCEC-Zellen erzielt werden. Die Zellen zeigten die charakteristischen Zeichen der Transformation: veränderte Wachstumseigenschaften wie klonales dreidimensionales Zellwachstum („pilling up“), Hemmung der Zell-Zell-Kontaktinhibierung, verkürzte Populationsverdopplungszeiten und tumorigene und metastasierende Eigenschaften. Außerdem exprimierten die N2-OH-PhIP-exponierten humanen Kolonzellen mit steigender Anzahl der Behandlungen größere Mengen des trunkierten APC-Proteins. Die bekannten PhIP-spezifischen Mutationen im APC-Gen resultieren in der Expression eines trunkierten Proteinproduktes und werden als frühe Ereignisse in der Kolonkanzerogenese betrachtet. Die zusammenfassende Betrachtung aller Ergebnisse zeigt, dass die IEC-18-Zelllinie zur chemischen Transformation durch N2-OH-PhIP ungeeignet ist. Dagegen wurde erstmalig eine vollständige chemische Transformation von Humandickdarmepithelzellen in vitro durch Exposition der humanen Kolonepithelzelllinie HCEC gegenüber dem Kolonkarzinogen N2-OH-PhIP erzielt.
Initiation and perpetuation of inflammatory bowel diseases (IBD) may result from an exaggerated mucosal immune response to the luminal microbiota in a susceptible host. We proposed that this may be caused either 1) by an abnormal microbial composition or 2) by weakening of the protective mucus layer due to excessive mucus degradation, which may lead to an easy access of luminal antigens to the host mucosa triggering inflammation. We tested whether the probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 (NCIMB) is capable of reducing chronic gut inflammation by changing the existing gut microbiota composition and aimed to identify mechanisms that are involved in possible beneficial effects of the probiotic. To identify health-promoting mechanisms of the strain, we used interleukin (IL)-10 deficient mice that spontaneously develop gut inflammation and fed these mice a diet containing NCIMB (106 cells g-1) for 3, 8 and 24 weeks, respectively. Control mice were fed an identically composed diet but without the probiotic strain. No clear-cut differences between the animals were observed in pro-inflammatory cytokine gene expression and in intestinal microbiota composition after probiotic supplementation. However, we observed a low abundance of the mucin-degrading bacterium Akkermansia muciniphila in the mice that were fed NCIMB for 8 weeks. These low cell numbers were associated with significantly lower interferon gamma (IFN-γ) and IFN-γ-inducible protein (IP-10) mRNA levels as compared to the NCIMB-treated mice that were killed after 3 and 24 weeks of intervention. In conclusion, NCIMB was not capable of reducing gut inflammation in the IL-10-/- mouse model. To further identify the exact role of A. muciniphila and uncover a possible interaction between this bacterium, NCIMB and the host in relation to inflammation, we performed in vitro studies using HT-29 colon cancer cells. The HT-29 cells were treated with bacterial conditioned media obtained by growing either A. muciniphila (AM-CM) or NCIMB (NCIMB-CM) or both together (COMB-CM) in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) for 2 h at 37 °C followed by bacterial cell removal. HT-29 cells treated with COMB-CM displayed reduced cell viability after 18 h (p<0.01) and no viable cells were detected after 24 h of treatment, in contrast to the other groups or heated COMB-CM. Detection of activated caspase-3 in COMB-CM treated groups indicated that death of the HT-29 cells was brought about by apoptosis. It was concluded that either NCIMB or A. muciniphila produce a soluble and heat-sensitive factor during their concomitant presence that influences cell viability in an in vitro system. We currently hypothesize that this factor is a protein, which has not yet been identified. Based on the potential effect of A. muciniphila on inflammation (in vivo) and cell-viability (in vitro) in the presence of NCIMB, we investigated how the presence of A. muciniphila affects the severity of an intestinal Salmonella enterica Typhimurium (STm)-induced gut inflammation using gnotobiotic C3H mice with a background microbiota of eight bacterial species (SIHUMI, referred to as simplified human intestinal microbiota). Presence of A. muciniphila in STm-infected SIHUMI (SIHUMI-AS) mice caused significantly increased histopathology scores and elevated mRNA levels of IFN-γ, IP-10, tumor necrosis factor alpha (TNF-α), IL-12, IL-17 and IL-6 in cecal and colonic tissue. The number of mucin filled goblet cells was 2- to 3- fold lower in cecal tissue of SIHUMI-AS mice compared to SIHUMI mice associated with STm (SIHUMI-S) or A. muciniphila (SIHUMI-A) or SIHUMI mice. Reduced goblet cell numbers significantly correlated with increased IFN-γ (r2 = -0.86, ***P<0.001) in all infected mice. In addition, loss of cecal mucin sulphation was observed in SIHUMI-AS mice. Concomitant presence of A. muciniphila and STm resulted in a drastic change in microbiota composition of the SIHUMI consortium. The proportion of Bacteroides thetaiotaomicron in SIHUMI, SIHUMI-A and SIHUMI-S mice made up to 80-90% but was completely taken over by STm in SIHUMI-AS mice contributing 94% to total bacteria. These results suggest that A. muciniphila exacerbates STm-induced intestinal inflammation by its ability to disturb host mucus homeostasis. In conclusion, abnormal microbiota composition together with excessive mucus degradation contributes to severe intestinal inflammation in a susceptible host.
Am Beispiel der Wiederkäuer wurde unter Zuhilfenahme von biochemischen und molekularbiologischen Methoden die Adaptation von Pflanzenfressern (Herbivoren) an pflanzliche Sekundärmetabolite wie z.B. Tannine untersucht. Tannine können in nicht an ihren Verzehr adaptierten Spezies durch ihr Proteinbindungsvermögen die Nahrungsverwertung und damit Wachstum und Gesundheit des Pflanzenfressers beeinträchtigen (antinutritive Wirkung). Einige Wiederkäuerarten wie z.B. das Reh (Capreolus capreolus) haben in ihrem Nahrungsspektrum viele stark tanninhaltige Pflanzen, leiden aber nicht unter den erwähnten postdigestiven Konsequenzen. Eine Möglichkeit, die antinutritive Wirkung von Tanninen zu neutralisieren, besteht in der Produktion tanninbindender Speichelproteine. Der Speichel verschiedener Wiederkäuerarten wurde auf das Vorhandensein tanninbindender Proteine untersucht. Diese Arten wurden so ausgewählt, dass alle drei Ernährungstypen (Konzentratselektierer, Intermediärtyp, Gras- und Rauhfutterfresser) in den Vergleich eingeschlossen werden konnten. Als Referenzspezies wurde der Konzentratselektierer Reh herangezogen. Die Speichelproteine des Rehs und die der Intermediärtypen (Rentier, Rangifer tarandus; Damhirsch, Cervus dama; Moschusochse, Ovibos moschatus) banden ungefähr doppelt so effektiv an hydrolysierbare Tannine (Tanninsäure), wie die der untersuchten Gras- und Rauhfutterfresser (Rind, Bos taurus; und Mufflon, Ovis orientalis musimon). Diese Abstufung zeigte sich auch bei der Untersuchung der Bindung an kondensierte Tannine (Quebracho). Eine Ausnahme stellte Mufflonspeichel dar, dieser band ebenso gut an Quebracho wie die Speichelproteine der anderen Ernährungstypen. Über eine Aminosäuretotalanalyse konnte festgestellt werden, dass der Speichel einiger untersuchter Wiederkäuerarten prolinreiche Proteine (PRPs) enthielt. Unter Ausnutzung ihrer Trichloressigsäure (TCA)-Löslichkeit wurden diese angereichert und genauer untersucht. Die Analyse der TCA-löslichen Speichelproteine der Konzentratselektierer (Reh, Elch) ergab einen relativen Prolingehalt von über 35 %, während beim Moschusochsen noch 29 % gemessen wurden. In Damhirsch- und Rinderspeichel wurden keine prolinreichen Proteine gefunden. Für die TCA-löslichen Speichelproteine des Rehs konnte eine hohe Tanninbindungskapazität nachgewiesen werden. Diese banden 24 - 30 x effektiver an Tannine als die TCA-löslichen Speichelproteine des Rindes. Die Tanninbindungskapazitäten der TCA-löslichen Speichelproteine von Moschusochse und Damhirsch waren ebenfalls höher als die des Rindes, aber niedriger als die des Rehs. Die Kohlenhydrat-Analyse der TCA-löslichen Speichelproteine des Rehs erbrachte, dass es sich bei ihnen um Glykoproteine handelt. Mittels Gelfiltration und zweidimensionaler Polyacrylamidgelektrophorese konnten fünf Proteingruppen mit Molekulargewichten zwischen 15 und 50 kd sowie isoelektrischen Punkten zwischen 4,0 und 8,2 detektiert werden. Von 15 dieser Proteine konnten die N-terminalen Aminosäuresequenzen ermittelt werden. Ausgehend von diesen Informationen wurden Reh-PRP spezifische mRNAs isoliert und partiell sequenziert. Die meisten dieser Fragmente hatten eine gemeinsame 18 Aminosäuren lange C-terminale Sequenz PPPEEQPEE/QSPDEE/DSPSE. Die Suche nach Übereinstimmungen der analysierten Sequenzen mit anderen Säugetier-PRPs in der Genbank ergab keine sinnvollen Ähnlichkeiten. Die Ergebnisse können zu Informationen über tanninbindende Proteine anderer Wiederkäuer führen. Die Sequenzinformationen stellen einen Ausgangspunkt bei der Analyse der evolutiven Zusammenhänge der Cerviden dar.
Die allergische Kontaktdermatitis ist eine immunologisch bedingte Hauterkrankung mit insbesondere in den westlichen Industrienationen hoher und weiter ansteigender Prävalenz. Es handelt sich hierbei um eine Hypersensitivitätsreaktion vom Typ IV, die sich nach Allergenkontakt durch Juckreiz, Rötung, Bläschenbildung und Abschälung der Haut äußert. Zahlreiche Xenobiotika besitzen das Potenzial, Kontaktallergien auszulösen, darunter Konservierungsstoffe, Medikamente, Duftstoffe und Chemikalien. Die wirksamste Maßnahme zur Eindämmung der Erkrankung ist die Expositionsprophylaxe, also die Vermeidung des Kontakts mit den entsprechenden Substanzen. Dies wiederum setzt die Kenntnis des jeweiligen sensibilisierenden Potenzials einer Substanz voraus, dessen Bestimmung aus diesem Grund eine hohe toxikologische Relevanz besitzt. Zu diesem Zweck existieren von der OECD veröffentlichte Testleitlinien, welche auf entsprechend validierten Testmethoden basieren. Goldstandard bei der Prüfung auf hautsensibilisierendes Potenzial war über lange Zeit der murine Lokale Lymphknotentest. Seit der 7. Änderung der EU-Kosmetikrichtlinie, welche Tierversuche für Kosmetika und deren Inhaltsstoffe untersagt, wurden vermehrt Alternativmethoden in die OECD-Testleitlinien implementiert.. Die bestehenden in vitro Methoden sind jedoch alleinstehend nur begrenzt aussagekräftig, da sie lediglich singuläre Mechanismen bei der Entstehung einer Kontaktallergie abbilden. Die Entwicklung von Testmethoden, welche mehrere dieser Schlüsselereignisse berücksichtigen, erscheint daher richtungsweisend. Einen vielversprechenden Ansatz liefert hierbei der Loose-fit coculture-based sensitisation assay (LCSA), welcher eine Kokultur aus primären Keratinozyten und PBMC darstellt. Bei der Kokultivierung von Immunzellen mit anderen Zelltypen stellt sich allerdings die Frage, inwiefern die Nutzung von Zellen derselben Spender*innen (autologe Kokultur) bzw. verschiedener Spender*innen (allogene Kokultur) einen Einfluss nimmt. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit Hautzellen spenderspezifisch aus gezupften Haarfollikeln isoliert und der LCSA mit den generierten HFDK in autologen und allogenen Ansätzen verglichen. Zusätzlich wurde auch ein Vergleich zwischen der Nutzung von HFDK und NHK, welche aus humaner Vorhaut isoliert wurden, im LCSA durchgeführt. Dabei ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen autologen und allogenen Kokulturen bzw. zwischen der Verwendung von HFDK und NHK. Die Verwendung allogener Zellen aus anonymem Spendermaterial sowie die Nutzung von Keratinozyten aus unterschiedlichen Quellen scheint im Rahmen des LCSA problemlos möglich. Einige der getesteten Kontaktallergene, darunter DNCB und NiCl2, erwiesen sich im LCSA jedoch als problematisch und konnten nicht zufriedenstellend als sensibilisierend detektiert werden. Daher wurde eine Optimierung der Kokultur durch Verwendung ex vivo differenzierter Langerhans Zellen (MoLC) angestrebt, welche ein besseres Modell primärer epidermaler Langerhans Zellen darstellen als die dendritischen Zellen aus dem LCSA. Zusätzlich wurden weitere, den Erfolg der Kokultur beeinflussende Faktoren, wie die Art und Zusammensetzung des Mediums und die Kokultivierungsdauer, untersucht und angepasst. Das schlussendlich etablierte Kokultivierungsprotokoll führte zu einer maßgeblich verstärkten Expression von CD207 (Langerin) auf den MoLC, was auf eine wirkungsvolle Interaktion zwischen Haut- und Immunzellen in der Kokultur hindeutete. Des Weiteren konnten DNCB und NiCl2 im Gegensatz zum LCSA durch Verwendung des kostimulatorischen Moleküls CD86 sowie des Reifungsmarkers CD83 als Ausleseparameter eindeutig als Kontaktallergene identifiziert werden. Die Untersuchungen zur Kokultur von MoLC und HFDK wurden jeweils vergleichend in autologen und allogenen Ansätzen durchgeführt. Ähnlich wie beim LCSA kam es aber auch hier zu keinen signifikanten Unterschieden, weder hinsichtlich der Expression von Charakterisierungs- und Aktivierungsmarkern auf MoLC noch hinsichtlich der Zytokinsekretion in den Zellkulturüberstand. Die Hinweise aus zahlreichen Studien im Mausmodell, dass Zellen des angeborenen Immunsystems zur Erkennung von und Aktivierung durch allogene Zellen bzw. Gewebe in der Lage sind, bestätigten sich im Rahmen dieser Arbeit dementsprechend nicht. Aus diesem Grund wurden abschließend CD4+ T-Lymphozyten, die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems, in die Kokultur aus MoLC und autologen bzw. allogenen HFDK integriert. Überraschenderweise traten auch hier keine verstärkten Aktivierungen in allogener Kokultur im Vergleich zur autologen Kokultur auf. Die Nutzung autologer Primärzellen scheint im Rahmen der hier getesteten Methoden nicht notwendig zu sein, was die Validierung von Kokulturen und deren Implementierung in die OECD-Testleitlinien erleichtern dürfte. Zuletzt wurde eine Kokultivierung primärer Haut- und Immunzellen auch im 3D-Vollhautmodell durchgeführt, wobei autologe MoLC in die Epidermisäquivalente entsprechender Modelle integriert werden sollten. Obwohl die erstellten Hautmodelle unter Verwendung autologer Haarfollikel-generierter Keratinozyten und Fibroblasten eine zufriedenstellende Differenzierung und Stratifizierung aufwiesen, gestaltete sich die Inkorporation der MoLC als problematisch und konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erreicht werden.
The ever-increasing fat content in Western diet, combined with decreased levels of physical activity, greatly enhance the incidence of metabolic-related diseases. Cancer cachexia (CC) and Metabolic syndrome (MetS) are both multifactorial highly complex metabolism related syndromes, whose etiology is not fully understood, as the mechanisms underlying their development are not completely unveiled. Nevertheless, despite being considered “opposite sides”, MetS and CC share several common issues such as insulin resistance and low-grade inflammation. In these scenarios, tissue macrophages act as key players, due to their capacity to produce and release inflammatory mediators. One of the main features of MetS is hyperinsulinemia, which is generally associated with an attempt of the β-cell to compensate for diminished insulin sensitivity (insulin resistance). There is growing evidence that hyperinsulinemia per se may contribute to the development of insulin resistance, through the establishment of low grade inflammation in insulin responsive tissues, especially in the liver (as insulin is secreted by the pancreas into the portal circulation). The hypothesis of the present study was that insulin may itself provoke an inflammatory response culminating in diminished hepatic insulin sensitivity. To address this premise, firstly, human cell line U937 differentiated macrophages were exposed to insulin, LPS and PGE2. In these cells, insulin significantly augmented the gene expression of the pro-inflammatory mediators IL-1β, IL-8, CCL2, Oncostatin M (OSM) and microsomal prostaglandin E2 synthase (mPGES1), and of the anti-inflammatory mediator IL-10. Moreover, the synergism between insulin and LPS enhanced the induction provoked by LPS in IL-1β, IL-8, IL-6, CCL2 and TNF-α gene. When combined with PGE2, insulin enhanced the induction provoked by PGE2 in IL-1β, mPGES1 and COX2, and attenuated the inhibition induced by PGE2 in CCL2 and TNF-α gene expression contributing to an enhanced inflammatory response by both mechanisms. Supernatants of insulin-treated U937 macrophages reduced the insulin-dependent induction of glucokinase in hepatocytes by 50%. Cytokines contained in the supernatant of insulin-treated U937 macrophages also activated hepatocytes ERK1/2, resulting in inhibitory serine phosphorylation of the insulin receptor substrate. Additionally, the transcription factor STAT3 was activated by phosphorylation resulting in the induction of SOCS3, which is capable of interrupting the insulin receptor signal chain. MicroRNAs, non-coding RNAs linked to protein expression regulation, nowadays recognized as active players in the generation of several inflammatory disorders such as cancer and type II diabetes are also of interest. Considering that in cancer cachexia, patients are highly affected by insulin resistance and inflammation, control, non-cachectic and cachectic cancer patients were selected and the respective circulating levels of pro-inflammatory mediators and microRNA-21-5p, a posttranscriptional regulator of STAT3 expression, assessed and correlated. Cachectic patients circulating cytokines IL-6 and IL-8 levels were significantly higher than those of non-cachectic and controls, and the expression of microRNA-21-5p was significantly lower. Additionally, microRNA-21-5p reduced expression correlated negatively with IL-6 plasma levels. These results indicate that hyperinsulinemia per se might contribute to the low grade inflammation prevailing in MetS patients and thereby promote the development
of insulin resistance particularly in the liver. Diminished MicroRNA-21-5p expression may enhance inflammation and STAT3 expression in cachectic patients, contributing to the development of insulin resistance.
Pannexin 1
(2022)
Hypoxic pulmonary vasoconstriction is an active alveolar hypoxia-caused physiological response redirecting pulmonary blood flow from poorly ventilated areas to better oxygenated lung regions in order to optimize oxygen supply. However, the signaling pathways underlying this pulmonary vascular response remain an area under investigation. In the present study I investigated the functional relevance of Pannexin 1 (Panx1)-mediated ATP release in hypoxic pulmonary vasoconstriction and chronic hypoxic pulmonary hypertension using murine isolated perfused lungs, chronic hypoxic mice, and pulmonary artery smooth muscle cell culture. In isolated mouse lungs, switch to hypoxic gas induced a marked increase in pulmonary artery pressure. Pharmacological inhibition of Panx1 using probenecid, Panx1 specific inhibitory peptide (10Panx1) or spironolactone as well as genetic deletion of Panx1 in smooth muscle cells diminished hypoxic pulmonary vasoconstriction in isolated perfused mouse lungs. Fura-2 imaging revealed a reduced Ca2+ response to hypoxia in pulmonary artery smooth muscle cells treated with spironolactone or 10Panx1. Although these findings suggested an important role of Panx1 in HPV, neither smooth muscle cell nor endothelial cell specific genetic deletion of Panx1 prevented the development of pulmonary hypertension in chronic hypoxic mice. Surprisingly, hypoxia did not induce ATP release and inhibition of purinergic receptors or ATP degradation by ATPase failed to decrease the pulmonary vasoconstriction response to hypoxia in isolated perfused mouse lungs. However, Panx1 antagonism as well as TRPV4 inhibition prevented the hypoxia-induced increase in intracellular Ca2+ concentration in pulmonary artery smooth muscle cells in an additive manner suggesting that Panx1 might modulate intracellular Ca2+ signaling independently of the ATP-P2-TRPV4 signaling axis. In line with this assumption, overexpression of Panx1 in HeLa cells increased intracellular Ca2+ concentrations in response to acute hypoxia. Conclusion: In this study I identifiy Panx1 as novel regulator of HPV.. Yet, the role of Panx1 was not attributable to the release of ATP and downstream P2 signaling pathways or activation of TRPV4 but rathter relates to a role of Panx1 as indirect or direct modulator of the Ca2+ response to hypoxia in PASMCs. Genetic deletion of Panx1 did not influence the development of chronic hypoxic pulmonary hypertension in mice.
Das Metabolische Syndrom stellt eine Kombination verschiedener metabolischer Anomalien in einem Individuum dar. Starkes Übergewicht gilt als maßgebende Größe in der Genese des Syndroms, welches mit einem enormen Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen einhergeht. Um die stark steigende Prävalenz des Metabolischen Syndroms einzudämmen, sind dringend Konzepte für die Behandlung, vor allem jedoch für die Prävention von Übergewicht erforderlich. Einen wichtigen Beitrag leisten diesbezüglich Ballaststoffe in der Ernährung. Sie tragen auf unterschiedlichen Wegen zur Gewichtskontrolle bei und beeinflussen zudem verschiedene mit dem Metabolischen Syndrom assoziierte Blutparameter. Ebenso werden protektive Effekte von Polyphenolen, welche zur Gruppe der sekundären Pflanzenstoffe zählen, beschrieben. Diese wirken u. a. auf den Glukose- sowie den Insulinhaushalt und greifen darüber hinaus in die Regulation der Fettverbrennung sowie des Energieverbrauches ein. Die Kombination beider Substanzgruppen verspricht bedeutendes gesundheitsförderndes Potential; dieses wurde gegenwärtig jedoch kaum untersucht. Carobballaststoff ist ein polyphenolreicher und vorwiegend unlöslicher Extrakt der Frucht des Johannisbrotbaumes (Ceratonia siliqua L). Bislang publizierte Studien zur physiologischen Wirksamkeit dieses Ballaststoffpräparates weisen sowohl beim Tier als auch beim Menschen bemerkenswerte hypocholesterinämische Eigenschaften nach. Inwiefern sich der Verzehr des Carobballaststoffes ebenso auf die Entwicklung von Übergewicht sowie anderen Messgrößen des Metabolischen Syndroms auswirkt, ist allerdings nicht bekannt. Die Zielstellung der Promotionsarbeit bestand darin, die postprandialen Wirkungen des Carobballaststoffverzehrs mit Hilfe einer Humanstudie aufzuzeigen. In die randomisierten, einfach verblindeten Untersuchungen im cross-over-Design wurden 20 gesunde Erwachsene im Alter zwischen 22 und 62 Jahren eingeschlossen. Unter Verwendung variierender Begleitmahlzeiten wurden die postprandialen Effekte verschiedener Mengen des Carobballaststoffes untersucht. Hierbei standen die Veränderungen der Plasmakonzentrationen von Glukose, Triglyceriden (TG), totalem und acyliertem Ghrelin sowie der Serumkonzentrationen von Insulin und nicht-veresterten Fettsäuren (NEFA) im Mittelpunkt der Betrachtungen. Der Verzehr des Carobballaststoffes in Kombination mit 200 ml Wasser und 50 g Glukose erhöhte die postprandialen Glukose- und Insulinkonzentrationen gegenüber der Glukoselösung ohne Ballaststoffzusatz. In Kombination mit 400 ml einer Flüssigmahlzeit verzehrt, senkte Carobballaststoff die postprandialen TG-, NEFA- und Ghrelin- (acyliert) Antworten. Die Untersuchung des respiratorischen Quotienten nach Zusatz von Carobballaststoff zur Flüssigmahlzeit mittels indirekter Respirationskalorimetrie bekräftigte die bereits bekannten Effekte auf den Lipidmetabolismus und wies zudem eine Steigerung der Fettverwertung unter Verminderung der Glukoseoxidation nach. Wurde Carobballaststoff schließlich in Lebensmittel eingebracht, sanken nach dem Verzehr dieser Lebensmittel erneut die postprandialen Konzentrationen an TG und NEFA. Gleichzeitig erhöhten sich die Glukose-, Insulin- sowie Ghrelin- (acyliert) Antworten. Carobballaststoff löst in Abhängigkeit von der jeweils verzehrten Begleitmatrix unterschiedliche Effekte aus. Das Präparat weist beachtliche Wirkungen auf die Blutlipide sowie den Energieverbrauch auf, hat indes ungünstige Wirkungen auf die Blutglukose, sofern er in Kombination mit einer veränderten Nährstoffmatrix aufgenommen wird. Carobballaststoff besitzt starkes gesundheitsförderndes Potential; jedoch sind weitere Studien notwendig, um seine Wirkungen sowie deren Voraussetzungen besser zu verstehen. Ferner sollten Untersuchungen über einen längeren Zeitraum vorgenommen werden, um die langfristige Relevanz der gewonnenen Ergebnisse darzulegen. Danach stellt die Anreicherung spezieller Lebensmittel mit Carobballaststoff einen geeigneten Weg dar, um von den viel versprechenden protektiven Wirkungen des Präparates zu profitieren.
Effect of benzylglucosinolate on signaling pathways associated with type 2 diabetes prevention
(2014)
Type 2 diabetes (T2D) is a health problem throughout the world. In 2010, there were nearly 230 million individuals with diabetes worldwide and it is estimated that in the economically advanced countries the cases will increase about 50% in the next twenty years. Insulin resistance is one of major features in T2D, which is also a risk factor for metabolic and cardiovascular complications. Epidemiological and animal studies have shown that the consumption of vegetables and fruits can delay or prevent the development of the disease, although the underlying mechanisms of these effects are still unclear. Brassica species such as broccoli (Brassica oleracea var. italica) and nasturtium (Tropaeolum majus) possess high content of bioactive phytochemicals, e.g. nitrogen sulfur compounds (glucosinolates and isothiocyanates) and polyphenols largely associated with the prevention of cancer. Isothiocyanates (ITCs) display their anti-carcinogenic potential by inducing detoxicating phase II enzymes and increasing glutathione (GSH) levels in tissues. In T2D diabetes an increase in gluconeogenesis and triglyceride synthesis, and a reduction in fatty acid oxidation accompanied by the presence of reactive oxygen species (ROS) are observed; altogether is the result of an inappropriate response to insulin. Forkhead box O (FOXO) transcription factors play a crucial role in the regulation of insulin effects on gene expression and metabolism, and alterations in FOXO function could contribute to metabolic disorders in diabetes. In this study using stably transfected human osteosarcoma cells (U-2 OS) with constitutive expression of FOXO1 protein labeled with GFP (green fluorescent protein) and human hepatoma cells HepG2 cell cultures, the ability of benzylisothiocyanate (BITC) deriving from benzylglucosinolate, extracted from nasturtium to modulate, i) the insulin-signaling pathway, ii) the intracellular localization of FOXO1 and iii) the expression of proteins involved in glucose metabolism, ROS detoxification, cell cycle arrest and DNA repair was evaluated. BITC promoted oxidative stress and in response to that induced FOXO1 translocation from cytoplasm into the nucleus antagonizing the insulin effect. BITC stimulus was able to down-regulate gluconeogenic enzymes, which can be considered as an anti-diabetic effect; to promote antioxidant resistance expressed by the up-regulation in manganese superoxide dismutase (MnSOD) and detoxification enzymes; to modulate autophagy by induction of BECLIN1 and down-regulation of the mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) pathway; and to promote cell cycle arrest and DNA damage repair by up-regulation of the cyclin-dependent kinase inhibitor (p21CIP) and Growth Arrest / DNA Damage Repair (GADD45). Except for the nuclear factor (erythroid derived)-like2 (NRF2) and its influence in the detoxification enzymes gene expression, all the observed effects were independent from FOXO1, protein kinase B (AKT/PKB) and NAD-dependent deacetylase sirtuin-1 (SIRT1). The current study provides evidence that besides of the anticarcinogenic potential, isothiocyanates might have a role in T2D prevention. BITC stimulus mimics the fasting state, in which insulin signaling is not triggered and FOXO proteins remain in the nucleus modulating gene expression of their target genes, with the advantage of a down-regulation of gluconeogenesis instead of its increase. These effects suggest that BITC might be considered as a promising substance in the prevention or treatment of T2D, therefore the factors behind of its modulatory effects need further investigation.
Protected cultivation in greenhouses or polytunnels offers the potential for sustainable production of high-yield, high-quality vegetables. This is related to the ability to produce more on less land and to use resources responsibly and efficiently. Crop yield has long been considered the most important factor. However, as plant-based diets have been proposed for a sustainable food system, the targeted enrichment of health-promoting plant secondary metabolites should be addressed. These metabolites include carotenoids and flavonoids, which are associated with several health benefits, such as cardiovascular health and cancer protection.
Cover materials generally have an influence on the climatic conditions, which in turn can affect the levels of secondary metabolites in vegetables grown underneath. Plastic materials are cost-effective and their properties can be modified by incorporating additives, making them the first choice. However, these additives can migrate and leach from the material, resulting in reduced service life, increased waste and possible environmental release. Antifogging additives are used in agricultural films to prevent the formation of droplets on the film surface, thereby increasing light transmission and preventing microbiological contamination.
This thesis focuses on LDPE/EVA covers and incorporated antifogging additives for sustainable protected cultivation, following two different approaches. The first addressed the direct effects of leached antifogging additives using simulation studies on lettuce leaves (Lactuca sativa var capitata L). The second determined the effect of antifog polytunnel covers on lettuce quality. Lettuce is usually grown under protective cover and can provide high nutritional value due to its carotenoid and flavonoid content, depending on the cultivar.
To study the influence of simulated leached antifogging additives on lettuce leaves, a GC-MS method was first developed to analyze these additives based on their fatty acid moieties. Three structurally different antifogging additives (reference material) were characterized outside of a polymer matrix for the first time. All of them contained more than the main fatty acid specified by the manufacturer. Furthermore, they were found to adhere to the leaf surface and could not be removed by water or partially by hexane.
The incorporation of these additives into polytunnel covers affects carotenoid levels in lettuce, but not flavonoids, caffeic acid derivatives and chlorophylls. Specifically, carotenoids were higher in lettuce grown under polytunnels without antifog than with antifog. This has been linked to their effect on the light regime and was suggested to be related to carotenoid function in photosynthesis.
In terms of protected cultivation, the use of LDPE/EVA polytunnels affected light and temperature, and both are closely related. The carotenoid and flavonoid contents of lettuce grown under polytunnels was reversed, with higher carotenoid and lower flavonoid levels. At the individual level, the flavonoids detected in lettuce did not differ however, lettuce carotenoids adapted specifically depending on the time of cultivation. Flavonoid reduction was shown to be transcriptionally regulated (CHS) in response to UV light (UVR8). In contrast, carotenoids are thought to be regulated post-transcriptionally, as indicated by the lack of correlation between carotenoid levels and transcripts of the first enzyme in carotenoid biosynthesis (PSY) and a carotenoid degrading enzyme (CCD4), as well as the increased carotenoid metabolic flux. Understanding the regulatory mechanisms and metabolite adaptation strategies could further advance the strategic development and selection of cover materials.
The mitochondrial chaperone complex HSP60/HSP10 facilitates mitochondrial protein homeostasis by folding more than 300 mitochondrial matrix proteins. It has been shown previously that HSP60 is downregulated in brains of type 2 diabetic (T2D) mice and patients,
causing mitochondrial dysfunction and insulin resistance. As HSP60 is also decreased in peripheral tissues in T2D animals, this thesis investigated the effect of overall reduced HSP60 in the development of obesity and associated co-morbidities.
To this end, both female and male C57Bl/6N control (i.e. without further alterations in their genome, Ctrl) and heterozygous whole-body Hsp60 knock-out (Hsp60+/-) mice, which exhibit a 50 % reduction of HSP60 in all tissues, were fed a normal chow diet (NCD) or a highfat diet (HFD, 60 % calories from fat) for 16 weeks and were subjected to extensive metabolic phenotyping including indirect calorimetry, NMR spectroscopy, insulin, glucose and pyruvate tolerance tests, vena cava insulin injections, as well as histological and molecular analysis.
Interestingly, NCD feeding did not result in any striking phenotype, only a mild increase in energy expenditure in Hsp60+/- mice. Exposing mice to a HFD however revealed an increased body weight due to higher muscle mass in female Hsp60+/- mice, with a simultaneous decrease in energy expenditure. Additionally, these mice displayed decreased fasting glycemia. Opposingly, male Hsp60+/- compared to control mice showed lower body weight gain due to decreased fat mass and an increased energy expenditure, strikingly independent of lean mass. Further, only male Hsp60+/- mice display improved HOMA-IR and Matsuda
insulin sensitivity indices.
Despite the opposite phenotype in regards to body weight development, Hsp60+/- mice of both sexes show a significantly higher cell number, as well as a reduction in adipocyte size in the subcutaneous and gonadal white adipose tissue (sc/gWAT). Curiously, this adipocyte hyperplasia – usually associated with positive aspects of WAT function – is disconnected from metabolic improvements, as the gWAT of male Hsp60+/- mice shows mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and insulin resistance. Transcriptomic analysis of gWAT shows an up
regulation of genes involved in macroautophagy. Confirmatory, expression of microtubuleassociated protein 1A/1B light chain 3B (LC3), as a protein marker of autophagy, and direct measurement of lysosomal activity is increased in the gWAT of male Hsp60+/- mice.
In summary, this thesis revealed a novel gene-nutrient interaction. The reduction of the crucial chaperone HSP60 did not have large effects in mice fed a NCD, but impacted metabolism during DIO in a sex-specific manner, where, despite opposing body weight and
body composition phenotypes, both female and male Hsp60+/- mice show signs of protection from high fat diet-induced systemic insulin resistance.
Mit dem Alter kann eine Zunahme leichtgradiger Entzündungsprozesse beobachtet werden, von denen angenommen wird, dass sie den typischen, altersbedingten Verlust an Muskelmasse, -kraft und -funktion „befeuern“. Diese als Inflammaging bezeichneten Prozesse können auf ein komplexes Zusammenspiel aus einem dysfunktionalen (viszeralen) Fettgewebe, einer Dysbiose und damit einhergehender mikrobiellen Translokation und geringeren Abwehrfähigkeit sowie einer insgesamt zunehmenden Immunseneszenz zurückgeführt werden. In Summa begünstigt ein pro-inflammatorisches Milieu metabolische Störungen und chronische, altersassoziierte Erkrankungen, die das Entzündungsgeschehen aufrechterhalten oder vorantreiben. Neben einem essenziellen Bewegungsmangel trägt auch eine westlich geprägte, industrialisierte Ernährungsweise zum Entzündungsgeschehen und zur Entwicklung chronischer Erkrankungen bei. Daher liegt die Vermutung nahe, dem Entzündungsgeschehen mit ausreichend Bewegung und einer anti-inflammatorischen Ernährung entgegenzuwirken. In dieser Hinsicht werden insbesondere Omega-3-Fettsäuren (Omega-3) mit anti-inflammatorischen Eigenschaften verbunden. Obwohl ein Zusammenhang zwischen dem ernährungsbedingten Inflammationspotenzial bzw. der Zufuhr von Omega-3 und dem Inflammationsprofil bereits untersucht wurde, fehlen bislang Untersuchungen insbesondere bei älteren Erwachsenen, die den Link zwischen dem Inflammationspotenzial der Ernährung und Sarkopenie-relevanten Muskelparametern herstellen.
Aufgrund des Proteinmehrbedarfs zum Erhalt der funktionellen Muskulatur im Alter wurde bereits eine Vielzahl an Sport- und Ernährungsinterventionen durchgeführt, die eine Verbesserung des Muskelstatus mit Hilfe von strukturiertem Krafttraining und einer proteinreichen Ernährung zeigen. Es gibt zudem Hinweise, dass Omega-3 auch die Proteinsynthese verstärken könnten. Unklar ist jedoch, inwiefern eine anti-inflammatorische Ernährung mit Fokus auf Omega-3 sowohl die Entzündungsprozesse als auch den Muskelproteinmetabolismus und die neuromuskuläre Funktionalität im Alter günstig unterstützen kann. Dies vor allem im Hinblick auf die Muskelleistung, die eng mit der Sturzneigung und der Autonomie im Alltag verknüpft ist, aber in Interventionsstudien mit älteren Erwachsenen bisher wenig Berücksichtigung erhielt. Darüber hinaus werden häufig progressive Trainingselemente genutzt, die nach Studienabschluss oftmals wenig Anschluss im Lebensalltag der Betroffenen finden und somit wenig nachhaltig sind. Ziel dieser Arbeit war demnach die Evaluierung einer proteinreichen und zusätzlich mit Omega-3 supplementierten Ernährung in Kombination mit einem wöchentlichen Vibrationstraining und altersgemäßen Bewegungsprogramm auf Inflammation und neuromuskuläre Funktion bei älteren, selbständig lebenden Erwachsenen.
Hierzu wurden zunächst mögliche Zusammenhänge zwischen dem ernährungsbedingten Inflammationspotenzial, ermittelt anhand des Dietary Inflammatory Index, und dem Muskelstatus sowie dem Inflammationsprofil im Alter eruiert. Dazu dienten die Ausgangswerte von älteren, selbständig lebenden Erwachsenen einer postprandialen Interventionsstudie (POST-Studie), die im Querschnitt analysiert wurden. Die Ergebnisse bestätigten, dass eine pro-inflammatorische Ernährung sich einerseits in einem stärkeren Entzündungsgeschehen widerspiegelt und andererseits mit Sarkopenie-relevanten Parametern, wie einer geringeren Muskelmasse und Gehgeschwindigkeit, ungünstig assoziiert ist. Darüber hinaus zeigten sich diese Zusammenhänge auch in Bezug auf die Handgreifkraft bei den inaktiven, älteren Erwachsenen der Studie.
Anschließend wurde in einer explorativ ausgerichteten Pilot-Interventionsstudie (AIDA-Studie) in einem dreiarmigen Design untersucht, inwieweit sich eine Supplementierung mit Omega-3 unter Voraussetzung einer optimierten Proteinzufuhr und altersgemäßen Sportintervention mit Vibrationstraining auf die neuromuskuläre Funktion und Inflammation bei selbständig lebenden, älteren Erwachsenen auswirkt. Nach acht Wochen Intervention zeigte sich, dass eine mit Omega-3 supplementierte, proteinreiche Ernährung die Muskelleistung insbesondere bei den älteren Männern steigerte. Während sich die Kontrollgruppe nach acht Wochen Sportintervention nicht verbesserte, bestätigte sich zusätzlich eine Verbesserung der Beinkraft und der Testzeit beim Stuhl-Aufsteh-Test der älteren Erwachsenen mit einer proteinreichen Ernährung in Kombination mit der Sportintervention.
Darüber hinaus wurde deutlich, dass die zusätzliche Omega-3-Supplementierung insbesondere bei den Männern eine Reduktion der pro-inflammatorischen Zytokine im Serum zur Folge hatte. Allerdings spiegelten sich diese Beobachtungen nicht auf Genexpressionsebene in mononukleären Immunzellen oder in der LPS-induzierten Sekretion der Zytokine und Chemokine in Vollblutzellkulturen wider. Dies erfordert weitere Untersuchungen.
Cross-sectional associations of dietary biomarker patterns with health and nutritional status
(2024)
Chronic kidney disease and type 2 diabetes mellitus as factors influencing retinol-binding protein 4
(2009)
Fibroblast growth differentiation factor 21 (FGF21) is known as a pivotal regulator of the glucose and lipid metabolism. As such, it is considered beneficial and has even been labelled a longevity hormone. Nevertheless, recent observational studies have shown that FGF21 is increased in higher age with possible negative effects such as loss of lean and bone mass as well as decreased survival. Hepatic FGF21 secretion can be induced by various nutritional stimuli such as starvation, high carbohydrate and fat intake as well as protein deficiency.. So far it is still unclear whether the FGF21 response to different macronutrients is altered in older age. An altered response would potentially contribute to explain the higher FGF21 concentrations found in older age. In this publication-based doctoral dissertation, a cross-sectional study as well as a dietary challenge were conducted to investigate the influence of nutrition on FGF21 concentrations and response in older age. In a cross-sectional study, FGF21 concentrations were assessed in older patients with and without cachexia anorexia syndrome anorexia syndrome compared to an older community-dwelling control group. Cachexia anorexia syndrome is a multifactorial syndrome frequently occurring in old age or in the context of an underlying disease. It is characterized by a severe involuntary weight loss, loss of appetite (anorexia) and reduced food intake, therefore representing a state of severe nutrient deficiency, in some aspects similar to starvation. The highest FGF21 concentrations were found in patients with cachexia anorexia syndrome. Moreover, FGF21 was positively correlated with weight loss and loss of appetite. In addition, cachexia anorexia syndrome itself was associated with FGF21 independent of sex, age and body mass index. As cachectic patients presumably exhibit protein malnutrition and FGF21 has been proposed a marker for protein insufficiency, the higher levels of FGF21 in patients with cachexia anorexia syndrome might be partly explained by insufficient protein intake. In order to investigate the acute response of FGF21 to different nutritional stimuli, a dietary challenge with a parallel group design was conducted. Here, healthy older (65-85 years) and younger (18-35 years) adults were randomized to one of four test meals: a dextrose drink, a high carbohydrate, high fat or high protein meal. Over the course of four hours, postprandial FGF21 concentrations (dynamics) were assessed and the FGF21 response (incremental area under the curve) to each test meal was examined.. In a sub-group of older and younger women, also the adiponectin response was investigated, as adiponectin is a known mediator of FGF21 effects on glucose and lipid metabolism. The dietary meal challenge revealed that dextrose and high carbohydrate intake result in higher FGF21 concentrations after four hours in older adults. This was partly explained by higher postprandial glucose concentrations in the old. For high fat ingestion no age differences were found. For the first time, acute FGF21 response to high protein intake was shown. Here, protein ingestion resulted in lower FGF21 concentrations in younger compared to older adults. Furthermore, sufficient protein intake, according to age-dependent recommendations, of the previous day, was associated with lower FGF21 concentrations in both age groups. The higher FGF21 response to dextrose ingestion resulted in a higher adiponectin response in older women, independent of fat mass, insulin resistance, triglyceride concentrations, inflammation and oxidative stress. Following the high fat meal, adiponectin concentrations declined in older women. Adiponectin response was not affected by meal composition in younger women. In summary, this thesis showed a positive association of FGF21 and cachexia anorexia syndrome with concomitant anorexia in older patients. Regarding the acute FGF21 response, a higher response following dextrose and carbohydrate ingestion was found in older compared with younger subjects. This might be attributed to a higher glucose response in older age. Furthermore, it was shown that the higher FGF21 response after dextrose ingestion possibly contributes to a higher adiponectin response in older women, independent of potential metabolic and inflammatory confounders. Acute protein ingestion resulted in a significant decrease in FGF21 concentrations. Moreover, protein intake of the previous day was inversely associated with fasting FGF21 concentrations. This might explain why FGF21 concentrations are higher in cachexia anorexia syndrome. These results therefore support the role of FGF21 as a sensor of protein restriction.