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Aufgrund ihrer potenziell gesundheitsfördernden Wirkung sind die polyphenolischen Isoflavone für die menschliche Ernährung von großem Interesse. Eine Vielzahl an experimentellen und epidemiologischen Studien zeigen für die in Soja enthaltenen Isoflavone Daidzein und Genistein eine präventive Wirkung bezüglich hormon-abhängiger und altersbedingter Erkrankungen, wie Brust- und Prostatakrebs, Osteoporose, Herz-Kreislauf-Erkrankungen sowie des menopausalen Syndroms. Die Metabolisierung und Bioaktivierung dieser sekundären Pflanzenstoffe durch die humane intestinale Darmmikrobiota ist individuell unterschiedlich. Nur in einem geringen Teil der westlichen Bevölkerung wird der Daidzein-Metabolit Equol durch spezifische Darmbakterien gebildet. Ein isoliertes Equol-produzierendes Bakterium des menschlichen Darmtrakts ist Slackia isoflavoniconvertens. Anhand dieser Spezies sollten die bislang unbekannten, an der Umsetzung von Daidzein und Genistein beteiligten Enzyme identifiziert und charakterisiert werden.
Fermentationsexperimente mit S. isoflavoniconvertens zeigten, dass die Gene der Daidzein und Genistein-umsetzenden Enzyme nicht konstitutiv exprimiert werden, sondern induziert werden müssen. Mit Hilfe der zweidimensionalen differentiellen Gelelektrophorese wurden sechs Proteine detektiert, welche in einer S. isoflavoniconvertens-Kultur in Anwesenheit von Daidzein induziert wurden. Auf Grundlage einzelner Peptidsequenzen erfolgte die Sequenzierung eines Genkomplexes mit den in gleicher Orientierung angeordneten Genen der durch Daidzein induzierten Proteine. Sequenzvergleiche identifizierten zudem äquivalente Genprodukte zu den Proteinen von S. isoflavoniconvertens in anderen Equolproduzierenden Bakterien. Nach der heterologen Expression in Escherichia coli wurden drei dieser Gene durch enzymatische Aktivitätstests als Daidzein-Reduktase (DZNR), Dihydrodaidzein-Reduktase (DHDR) und Tetrahydrodaidzein-Reduktase (THDR) identifiziert. Die Kombination der E. coli-Zellextrakte führte zur vollständigen Umsetzung von Daidzein über Dihydrodaidzein zu Equol. Neben Daidzein setzte die DZNR auch Genistein zu Dihydrogenistein um. Dies erfolgte mit einer größeren Umsatzgeschwindigkeit im Vergleich zur Reduktion von Daidzein zu Dihydrodaidzein. Enzymatische Aktivitätstests mit dem Zellextrakt von S. isoflavoniconvertens zeigten ebenfalls eine schnellere Umsetzung von Genistein. Die Kombination der rekombinanten DHDR und THDR führte zur Umsetzung von Dihydrodaidzein zu Equol. Der korrespondierende Metabolit 5-Hydroxyequol konnte als Endprodukt des Genistein-Metabolismus nicht detektiert werden. Zur Reinigung der drei identifizierten Reduktasen wurden diese genetisch an ein Strep-tag fusioniert und mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Die übrigen durch Daidzein induzierten Proteine IfcA, IfcBC und IfcE wurden ebenfalls in E. coli exprimiert und als Strep-Fusionsproteine gereinigt. Vergleichende Aktivitätstests identifizierten das induzierte Protein IfcA als Dihydrodaidzein-Racemase. Diese katalysierte die Umsetzung des (R)- und (S)-Enantiomers von Dihydrodaidzein und Dihydrogenistein zum korrespondierenden Racemat. Neben dem Elektronentransfer-Flavoprotein IfcBC wurden auch die THDR, DZNR und IfcE als FAD-haltige Flavoproteine identifiziert. Zudem handelte es sich bei IfcE um ein Eisen-Schwefel-Protein. Nach Induktion der für die Daidzein-Umsetzung kodierenden Gene wurden mehrere verschieden lange mRNA-Transkripte gebildet. Dies zeigte, dass die Transkription des durch Daidzein induzierten Genkomplexes in S. isoflavoniconvertens nicht in Form eines einzelnen Operonsystems erfolgte.
Auf Grundlage der identifizierten Daidzein-umsetzenden Enzyme kann der Mechanismus der bakteriellen Umsetzung von Isoflavonen durch S. isoflavoniconvertens eingehend erforscht werden. Die ermittelten Gensequenzen der durch Daidzein induzierten Proteine sowie die korrespondierenden Gene weiterer Equol-produzierender Bakterien bieten zudem die Möglichkeit der mikrobiellen Metagenomanalyse im humanen Darmtrakt.
Introduction: Intestinal bacteria influence gut morphology by affecting epithelial cell proliferation, development of the lamina propria, villus length and crypt depth [1]. Gut microbiota-derived factors have been proposed to also play a role in the development of a 30 % longer intestine, that is characteristic of PRM/Alf mice compared to other mouse strains [2, 3]. Polyamines and SCFAs produced by gut bacteria are important growth factors, which possibly influence mucosal morphology, in particular villus length and crypt depth and play a role in gut lengthening in the PRM/Alf mouse. However, experimental evidence is lacking. Aim: The objective of this work was to clarify the role of bacterially-produced polyamines on crypt depth, mucosa thickness and epithelial cell proliferation. For this purpose, C3H mice associated with a simplified human microbiota (SIHUMI) were compared with mice colonized with SIHUMI complemented by the polyamine-producing Fusobacterium varium (SIHUMI + Fv). In addition, the microbial impact on gut lengthening in PRM/Alf mice was characterized and the contribution of SCFAs and polyamines to this phenotype was examined. Results: SIHUMI + Fv mice exhibited an up to 1.7 fold higher intestinal polyamine concentration compared to SIHUMI mice, which was mainly due to increased putrescine concentrations. However, no differences were observed in crypt depth, mucosa thickness and epithelial proliferation. In PRM/Alf mice, the intestine of conventional mice was 8.5 % longer compared to germfree mice. In contrast, intestinal lengths of C3H mice were similar, independent of the colonization status. The comparison of PRM/Alf and C3H mice, both associated with SIHUMI + Fv, demonstrated that PRM/Alf mice had a 35.9 % longer intestine than C3H mice. However, intestinal SCFA and polyamine concentrations of PRM/Alf mice were similar or even lower, except N acetylcadaverine, which was 3.1-fold higher in PRM/Alf mice. When germfree PRM/Alf mice were associated with a complex PRM/Alf microbiota, the intestine was one quarter longer compared to PRM/Alf mice colonized with a C3H microbiota. This gut elongation correlated with levels of the polyamine N acetylspermine. Conclusion: The intestinal microbiota is able to influence intestinal length dependent on microbial composition and on the mouse genotype. Although SCFAs do not contribute to gut elongation, an influence of the polyamines N acetylcadaverine and N acetylspermine is conceivable. In addition, the study clearly demonstrated that bacterial putrescine does not influence gut morphology in C3H mice.
Microbiota analyses of patients suffering from various diseases suggest a beneficial role of Akkermansia muciniphila in the maintenance of health, whereas several studies in animal models of intestinal inflammation report that this organism may aggravate inflammation. Therefore, it is important to clarify under which circumstances A. muciniphila exerts negative effects in the intestine of its host.
The previously reported observation that A. muciniphila aggravates acute intestinal inflammation in the Salmonella enterica serovar Typhimurium infection mouse model colonized with a simplified human intestinal microbiota was investigated in this study. To unravel the underlying mechanism that led to the observed phenomenon, the time course of events following the infection was analyzed. In mice colonized with a simplified human intestinal microbiota, Salmonella infection induced clear signs of intestinal inflammation three days post infection. The inflammatory response was similar in mice colonized with A. muciniphila before Salmonella infection. These observations were independent of the time when colonization with the simplified human intestinal microbiota occurred, right after birth or only after weaning, and contradict the previous report.
To find out whether A. muciniphila influences the development of chronic intestinal inflammation in a genetically predisposed host, mono-associated interleukin-10-deficient (Il10-/-) mice, Il10-/- mice dual-associated with A. muciniphila and colitogenic Escherichia coli NC101, as well as Il10-/- mice associated with A. muciniphila and a simplified human intestinal microbiota were compared to the respective mice without A. muciniphila. The data clearly show that in these gnotobiotic Il10-/- mice, A. muciniphila neither induces intestinal inflammation itself nor modulates it after induction by a colitogenic bacterium or by a simplified human intestinal microbiota.
The experiments lead to the conclusion that the promotion of intestinal inflammation is not an intrinsic feature of this bacterium. The results of this study encourage the proposed use of A. muciniphila for the prevention or treatment of metabolic disorders.