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Zusammenfassung zur Dissertation „Neuartige DBD-Fluoreszenzfarbstoffe: Synthese, Untersuchungen und Anwendungen“ von Leonard John
In dieser Arbeit konnten auf Basis der etablierten [1,3]-Dioxolo[4,5-f][1,3]benzodioxol (DBD) Fluoreszenzfarbstoffe zwei neue Konzepte zur Darstellung unsymmetrisch funktionalisierter DBD-Fluorophore entwickelt werden. Die Variation der elektronenziehenden Reste führte zu einer Erweiterung des Farbspektrums an DBD-Fluorophoren, wobei alle weiteren spektroskopischen Parameter (Fluoreszenzlebenszeit, -quantenausbeute und STOKES-Verschiebung) unverändert hohe Werte aufweisen. Neben der Variation der elektronenziehenden Reste wurde das "pi"-System des DBD-Farbstoffs mit der Einführung von Stilben-, und Tolan-Derivaten vergrößert. Stilben-Derivate zeigten ähnlich gute spektroskopische Eigenschaften wie die bereits etablierten DBD-Farbstoffe.
Fluorophore mit langwelliger Emission sind auf Grund der großen Gewebe-Eindringtiefe besonders interessant für biologische Anwendungen. Da der langwelligste Vertreter der O4-DBD-Farbstoffe in polaren Medien nur schwer löslich ist, wurde ein Weg zur Einführung löslichkeitsvermittelnder Gruppen gesucht. Hierbei fiel die Wahl auf eine Carbonsäure-Gruppe zur Steigerung der Hydrophilie. Eine von vier untersuchten Methoden erwies sich als zielführend, sodass das gewünschte Molekül isoliert werden konnte. Eine erhöhte Wasserlöslichkeit wurde allerdings nicht beobachtet.
Zur Erforschung von Fettstoffwechselkrankheiten wie der ALZHEIMER-Krankheit werden fluoreszenzmarkierte Lipide benötigt. Um unterschiedliche Bereiche einer Membran zu untersuchen, war das Ziel, den Fluorophor an unterschiedlichen Stellen innerhalb der Fettsäure zu lokalisieren. Hierbei sollte die Gesamtkettenlänge des DBD-Lipids einer C18-Kette, analog der Stearinsäure, entsprechen. Durch die stufenweise Einführung der Reste gelang es, drei DBD-Lipide herzustellen, wobei sich der Fluorophor an unterschiedlichen Positionen innerhalb der Kette befindet. Die photophysikalischen Eigenschaften der Lipide weichen nur marginal von denen der reinen Fluorophore ab. Eine Einlagerung in giant unilamellar vesicles (GUVs) konnte für zwei Derivate beobachtet werden, wobei keine domänenspezifisch war.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die vier Sauerstoffatome im DBD-Grundkörper stufenweise durch Schwefelatome zu ersetzen und die Ringgrößen des DBD-Fluorophors zu variieren. Für die Ringgröße zeigte der 1,2-S2-DBD mit jeweils zwei Fünfringen die besten spektroskopischen Eigenschaften. Durch die Synthese von zwei weiteren schwefelhaltigen DBD-Grundkörpern (S1- und 1,4-S2-DBD) konnten insgesamt drei neue Farbstoffklassen zugänglich gemacht werden. Für alle neuen Chromophore wurden elektronenziehende Reste (Aldehyd, Acyl, Ester, Carboxy) eingeführt und die jeweiligen Derivate spektroskopisch untersucht. Mit steigender Anzahl an Schwefel-Atomen im Grundkörper zeigt sich eine bathochrome Verschiebung der Emission,
wobei die Werte für die Fluoreszenzlebenszeit- und -quantenausbeute abnehmen. Die optimalen spektroskopischen Eigenschaften aus langwelliger Emission, hoher Fluoreszenzlebenszeit und -quantenausbeute zeigt das 1,4-S2-Dialdehyd-Derivat. Für die S1- und 1,2-S2-Dialdehyd-
Derivate wurden Konzepte entwickelt, um bioreaktive Reste (Alkin, HOSu, Maleimid) einzuführen und die Fluorophore in biologischen Systemen anwenden zu können.
Neue Systeme für triphile, fluorkohlenstofffreie Blockcopolymere in Form von Acrylat-basierten thermoresponsiven Blockcopolymeren sowie Acrylat- bzw. Styrol-basierten Terblock-Polyelektrolyten mit unterschiedlich chaotropen Kationen des jeweiligen polyanionischen Blocks wurden entwickelt. Multikompartiment-Mizellen, mizellare Aggregate mit ultrastrukturiertem hydrophobem Mizellkern die biologischen Strukturen wie dem Humanalbumin nachempfunden sind, sollten bei der Selbstorganisation in wässriger Umgebung entstehen. Durch Verwendung apolarer und polarer Kohlenwasserstoff-Domänen anstelle von fluorophilen Fluorkohlenstoff-Domänen sollte erstmals anhand solcher triphilen Systeme nachgewiesen werden, ob diese in der Lage zur selektiven Aufnahme hydrophober Substanzen in unterschiedliche Domänen des Mizellkerns sind.
Mit Hilfe von sequentieller RAFT-Polymerisation wurden diese neuen triphilen Systeme hergestellt, die über einen permanent hydrophilen, eine permanent stark hydrophoben und einen dritten Block verfügen, der durch externe Einflüsse, speziell die Induzierung eines thermischen Coil-to-globule-Übergangs bzw. die Zugabe von organischen, hydrophoben Gegenionen von einem wasserlöslichen in einen polar-hydrophoben Block umgewandelt werden kann. Als RAFT-Agens wurde 4-(Trimethylsilyl)benzyl(3-(trimethylsilyl)-propyl)-trithiocarbonat mit zwei unterschiedlichen TMS-Endgruppen verwendet, das kontrollierte Reaktions-bedingungen sowie die molekulare Charakterisierung der komplexen Copolymere ermöglichte.
Die beiden Grundtypen der linearen ternären Blockcopolymere wurden jeweils in zwei 2 Modell-Systeme, die geringfügig in ihren chemischen Eigenschaften sowie in dem Blocklängenverhältnis von hydrophilen und hydrophoben Polymersegmenten variierten, realisiert und unterschiedliche Permutation der Blöcke aufwiesen.
Als ersten Polymertyp wurden amphiphile thermoresponsive Blockcopolymere verwendet. Modell-System 1 bestand aus dem permanent hydrophoben Block Poly(1,3-Bis(butylthio)-prop-2-yl-acrylat), permanent hydrophilen Block Poly(Oligo(ethylenglykol)monomethyletheracrylat) und den thermoresponsiven Block Poly(N,N‘-Diethylacrylamid), dessen Homopolymer eine LCST-Phasenübergang (LCST, engl.: lower critical solution temperature) bei ca. 36°C aufweist. Das Modell-System 2 bestand aus dem permanent hydrophilen Block Poly(2-(Methylsulfinyl)ethylacrylat), dem permanent hydrophoben Block Poly(2-Ethylhexylacrylat) und wiederum Poly(N,N‘-Diethylacrylamid). Im ternären Blockcopolymer erhöhte sich, je nach Blocksequenz und relativen Blocklängen, der LCST-Übergang auf 50 – 65°C. Bei der Untersuchung der Selbstorganisation für die Polymer-Systeme dieses Typs wurde die Temperatur variiert, um verschieden mizellare Überstrukturen in wässriger Umgebung zu erzeugen bzw. oberhalb des LCST-Übergangs Multikompartiment-Mizellen nachzuweisen. Die Unterschiede in der Hydrophilie bzw. den sterischen Ansprüche der gewählten hydrophilen Blöcke sowie die Variation der jeweiligen Blocksequenzen ermöglichte darüber hinaus die Bildung verschiedenster Morphologien mizellarer Aggregate.
Der zweite Typ basierte auf ein Terblock-Polyelektrolyt-System mit Polyacrylaten bzw. Polystyrolen als Polymerrückgrat. Polymere ionische Flüssigkeiten wurden als Vorlage der Entwicklung zweier Modell-Systeme genommen. Eines der beiden Systeme bestand aus dem permanent hydrophilen Block Poly(Oligo(ethylenglykol)monomethyletheracrylat, dem permanent hydrophoben Block Poly(2-Ethylhexylacrylat) sowie dem Polyanion-Block Poly(3-Sulfopropylacrylat). Die Hydrophobie des Polyanion-Blocks variierte durch Verwendung großer organischer Gegenionen, nämlich Tetrabutylammonium, Tetraphenylphosphonium und Tetraphenylstibonium.
Analog wurde in einem weiteren System aus dem permanent hydrophilen Block Poly(4-Vinylbenzyltetrakis(ethylenoxy)methylether), dem permanent hydrophoben Block Poly(para-Methylstyrol) und Poly(4-Styrolsulfonat) mit den entsprechenden Gegenionen gebildet. Aufgrund unterschiedlicher Kettensteifigkeit in beiden Modell-Systemen sollte es bei der Selbstorganisation der mizellarer Aggregate zu unterschiedlichen Überstrukturen kommen.
Mittels DSC-Messungen konnte nachgewiesen werden, dass für alle Modell-Systeme die Blöcke in Volumen-Phase miteinander inkompatibel waren, was eine Voraussetzung für Multikompartimentierung von mizellaren Aggregaten ist. Die Größe mizellarer Aggregate sowie der Einfluss externer Einflüsse wie der Veränderung der Temperatur bzw. der Hydrophobie und Größe von Gegenionen auf den hydrodynamischen Durchmesser mittels DLS-Untersuchungen wurden für alle Modell-Systeme untersucht. Die Ergebnisse zu den thermoresponsiven ternären Blockcopolymeren belegten , dass sich oberhalb der Phasenübergangstemperatur des thermoresponsiven Blocks die Struktur der mizellaren Aggregate änderte, indem der p(DEAm)-Block scheinbar kollabierte und so zusammen mit den permanent hydrophoben Block den jeweiligen Mizellkern bildete. Nach gewisser Equilibrierungszeit konnten bei Raumtemperatur dir ursprünglichen mizellaren Strukturen regeneriert werden. Hingegen konnte für die Terblock-Polyelektrolyt-Systeme bei Verwendung der unterschiedlich hydrophoben Gegenionen kein signifikanter Unterschied in der Größe der mizellaren Aggregate beobachtet werden.
Zur Abbildung der mizellaren Aggregate mittels kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (cryo-TEM) der mizellaren Aggregate war mit Poly(1,3-Bis(butylthio)-prop-2-yl-acrylat) ein Modell-System so konzipiert, dass ein erhöhter Elektronendichtekontrast durch Schwefel-Atome die Visualisierung ultrastrukturierter hydrophober Mizellkerne ermöglichte. Dieser Effekt sollte in den Terblock-Polyelektrolyt-Systemen auch durch die Gegenionen Tetraphenylphosphonium und Tetraphenylstibonium nachgestellt werden. Während bei den thermoresponsiven Systemen auch oberhalb des Phasenübergangs kein Hinweis auf Ultrastrukturierung beobachtet wurde, waren für die Polyelektrolyt-Systeme, insbesondere im Fall von Tetraphenylstibonium als Gegenion Überstrukturen zu erkennen. Der Nachweis der Bildung von Multikompartiment-Mizellen war für beide Polymertypen mit dieser abbildenden Methode nicht möglich. Die Unterschiede in der Elektronendichte einzelner Blöcke müsste möglicherweise weiter erhöht werden um Aussagen diesbezüglich zu treffen.
Die Untersuchung von ortsspezifischen Solubilisierungsexperimenten mit solvatochromen Fluoreszenzfarbstoffen mittels „steady-state“-Fluoreszenzspektroskopie durch Vergleich der Solubilisierungsorte der Terblockcopolymere bzw. –Polyelektrolyte mit den jeweiligen Solubilisierungsorten von Homopolymer- und Diblock-Vorstufen sollten den qualitativen Nachweis der Multikompartimentierung erbringen. Aufgrund der geringen Mengen an Farbstoff, die für die Solubilisierungsexperimente eingesetzt wurden zeigten DLS-Untersuchungen keine störenden Effekte der Sonden auf die Größe der mizellaren Aggregate. Jedoch erschwerten Quench-Effekte im Falle der Polyelektrolyt Modell-Systeme eine klare Interpretation der Daten. Im Falle der Modell-Systeme der thermoresponsiven Blockcopolymere waren dagegen deutliche solvatochrome Effekte zwischen der Solubilisierung in den mizellaren Aggregaten unterhalb und oberhalb des Phasenübergangs zu erkennen. Dies könnte ein Hinweis auf Multikompartimentierung oberhalb des LCST-Übergangs sein. Ohne die Informationen einer Strukturanalyse wie z.B. der Röntgen- oder Neutronenkleinwinkelstreuung (SAXS oder SANS), kann nicht abschließend geklärt werden, ob die Solubilisierung in mizellaren hydrophoben Domänen des kollabierten Poly(N,N‘-Diethylacrylamid) erfolgt oder in einer Mischform von mizellaren Aggregaten mit gemittelter Polarität.