Refine
Year of publication
- 2014 (8) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (8) (remove)
Language
- German (8) (remove)
Is part of the Bibliography
- yes (8)
Keywords
- Biosensor (1)
- Bittergeschmack (1)
- Bittergeschmacksrezeptor (1)
- Doping (1)
- Geschmackswahrnehmung (1)
- Influenza (1)
- Interaktionsstudie (1)
- Mehrkomponentenanalyse (1)
- Multiplex (1)
- Peptid (1)
Institute
- Institut für Biochemie und Biologie (8) (remove)
Epitop-Kartierung von PBP2A und Identifizierung MRSA-spezifischer immunodominanter Peptidsequenzen
(2014)
Der Bittergeschmack dient Säugern vermutlich zur Wahrnehmung und Vermeidung toxischer Substanzen. Bitterstoffe können jedoch auch gesund sein oder werden oft bereitwillig mit der Nahrung aufgenommen. Ob sie geschmacklich unterschieden werden können, ist allerdings umstritten. Detektiert werden Bitterstoffe von oralen Bittergeschmacksrezeptoren, den TAS2R (human) bzw. Tas2r (murin). In der Literatur gibt es aber immer mehr Hinweise darauf, dass überdies Tas2r nicht nur in extragustatorischen Organen exprimiert werden, sondern dort auch wichtige Aufgaben erfüllen könnten, was wiederum die Aufklärung ihrer noch nicht vollständig entschlüsselten Funktionsweisen erfordert. So ist noch unbekannt, ob alle bisher als funktionell identifizierten Tas2r wirklich gustatorische Funktionen erfüllen.
Im Rahmen der Charakterisierung neu generierter, im Locus des Bittergeschmacksrezeptors Tas2r131 genetisch modifizierter Mauslinien, wurde in vorliegender Arbeit die gustatorische sowie extragustatorische Expression von Tas2r131 untersucht. Dass Tas2r131 nicht nur in Pilzpapillen, Wall- und Blätterpapillen (VP+FoP), Gaumen, Ductus nasopalatinus, Vomeronasalorgan und Kehldeckel, sondern auch in Thymus, Testes und Nebenhodenkopf, in Gehirnarealen sowie im Ganglion geniculatum nachgewiesen wurde, bildete die Grundlage für weiterführende Studien. Die vorliegende Arbeit zeigt außerdem, dass Tas2r108, Tas2r126, Tas2r135, Tas2r137 und Tas2r143 in Blut exprimiert werden, was auf eine heterogene Funktion der Tas2r hindeutet. Dass zusätzlich erstmals die Expression aller 35 als funktionell beschriebenen Tas2r im gustatorischen VP+FoP-Epithel von C57BL/6-Mäusen nachgewiesen wurde, verweist auf deren Relevanz als funktionelle Geschmacksrezeptoren.
Weiter zeigten Untersuchungen zur Aufklärung eines möglichen Bitter-Unterscheidungsvermögens in Geschmackspapillen von Mäusen mit fluoreszenzmarkierten oder ablatierten Tas2r131-Zellen, dass Tas2r131 exprimierende Zellen eine Tas2r-Zellsubpopulation bilden. Darüber hinaus existieren innerhalb der Bitterzellen geordnete Tas2r-Expressionsmuster, die sich nach der chromosomalen Lage ihrer Gene richten. Isolierte Bitterzellen reagieren heterogen auf bekannte Bitterstoffe. Und Mäuse mit ablatierter Tas2r131-Zellpopulation besitzen noch andere Tas2r-Zellen und schmecken damit einige Bitterstoffe kaum noch, andere aber noch sehr gut. Diese Befunde belegen die Existenz verschiedener gustatorischer Tas2r-Zellpopulationen, welche die Voraussetzung bilden, Bitterstoffe heterogen zu detektieren. Ob dies die Grundlage für ein divergierendes Verhalten gegenüber unverträglichen und harmlosen oder gar nützlichen Bitterstoffen darstellt, kann mit Hilfe der dargelegten Tas2r-Expressionsmuster künftig in Verhaltensexperimenten geprüft werden.
Die Bittergeschmackswahrnehmung in Säugetieren stellt sich als ein hochkomplexer Mechanismus dar, dessen Vielschichtigkeit durch die hier neu aufgezeigten heterogenen Tas2r-Expressions- und Funktionsmuster erneut verdeutlicht wird.
Das Influenzavirus infiziert Säugetiere und Vögel. Der erste Schritt im Infektionszyklus ist die Anbindung des Viruses über sein Oberflächenprotein Hämagglutinin (HA) an Zuckerstrukturen auf Epithelzellen des respiratorischen Traktes im Wirtsorganismus. Aus den drei komplementaritätsbestimmenden Regionen (complementarity determining regions, CDRs) der schweren Kette eines monoklonalen Hämagglutinin-bindenden Antikörpers wurden drei lineare Peptide abgeleitet. Die Bindungseigenschaften der drei Peptide wurden experimentell mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie untersucht. Es zeigte sich, dass in Übereinstimmung mit begleitenden Molekulardynamik-Simulationen zwei der drei Peptide (PeB und PeC) analog zur Bindefähigkeit des Antikörpers in der Lage sind, Influenzaviren vom Stamm X31 (H3N2 A/Aichi/2/1968) zu binden. Die Interaktion des Peptids PeB, welches potentiell mit der konservierten Rezeptorbindestelle im HA interagiert, wurde anschließend näher charakterisiert. Die Detektion der Influenzaviren war unter geeigneten Immobilisationsbedingungen im diagnostisch relevanten Bereich möglich. Die Spezifität der PeB-Virus-Bindung wurde mittels geeigneter Kontrollen auf der Seite des Analyten und des Liganden nachgewiesen. Des Weiteren war das Peptid PeB in der Lage die Bindung von X31-Viren an Mimetika seines natürlichen Rezeptors zu inhibieren, was die spezifische Interaktion mit der Rezeptorbindungsstelle im Hämagglutinin belegt. Anschließend wurde die Primärsequenz von PeB durch eine vollständige Substitutionsanalyse im Microarray-Format hinsichtlich der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen charakterisiert. Dies führte außerdem zu verbesserten Peptidvarianten mit erhöhter Affinität und breiterer Spezifität gegen aktuelle Influenzastämme verschiedener Serotypen (z.B. H1N1/2009, H5N1/2004, H7N1/2013). Schließlich konnte durch Verwendung einer in der Primärsequenz angepassten höher affinen Peptidvariante die Influenzainfektion in vitro inhibiert werden. Damit stellen die vom ursprünglichen Peptid PeB abgeleiteten Varianten Rezeptormoleküle in biosensorischen Testsystemen sowie potentielle Wirkstoffe dar.
Untersuchungen zur pro-inflammatorischen Wirkung von Serum-Amyloid A in glatten Gefäßmuskelzellen
(2014)
Tierische und menschliche Fäkalien aus Landwirtschaft und Haushalten enthalten zahlreiche obligat und opportunistisch pathogene Mikroorganismen, deren Konzentration u. a. je nach Gesundheitszustand der betrachteten Gruppe schwankt. Neben den Krankheitserregern enthalten Fäkalien aber auch essentielle Pflanzennährstoffe (276) und dienen seit Jahrtausenden (63) als Dünger für Feldfrüchte. Mit der unbedarften Verwendung von pathogenbelastetem Fäkaldünger steigt jedoch auch das Risiko einer Infektion von Mensch und Tier. Diese Gefahr erhöht sich mit der globalen Vernetzung der Landwirtschaft, z. B. durch den Import von kontaminierten Futter- bzw. Lebensmitteln (29).
Die vorliegende Arbeit stellt die milchsaure Fermentation von Rindergülle und Klärschlamm als alternative Hygienisierungsmethode gegenüber der Pasteurisation in Biogasanlagen bzw. gebräuchlichen Kompostierung vor.
Dabei wird ein Abfall der Gram-negativen Bakterienflora sowie der Enterokokken, Schimmel- und Hefepilze unter die Nachweisgrenze von 3 log10KbE/g beobachtet, gleichzeitig steigt die Konzentration der Lactobacillaceae um das Tausendfache. Darüber hinaus wird gezeigt, dass pathogene Bakterien wie Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, EHEC O:157 und vegetative Clostridum perfringens-Zellen innerhalb von 3 Tagen inaktiviert werden. Die Inaktivierung von ECBO-Viren und Spulwurmeiern erfolgt innerhalb von 7 bzw. 56 Tagen. Zur Aufklärung der Ursache der beobachteten Hygienisierung wurde das fermentierte Material auf flüchtige Fettsäuren sowie pH-Wertänderungen untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die gemessenen Werte nicht die alleinige Ursache für das Absterben der Erreger sind, vielmehr wird eine zusätzliche bakterizide Wirkung durch eine mutmaßliche Bildung von Bakteriozinen in Betracht gezogen. Die parasitizide Wirkung wird auf die physikalischen Bedingungen der Fermentation zurückgeführt.
Die methodischen Grundlagen basieren auf Analysen mittels zahlreicher klassisch-kultureller Verfahren, wie z. B. der Lebendkeimzahlbestimmung. Darüber hinaus findet die MALDI-TOF-Massenspektrometrie und die klassische PCR in Kombination mit der Gradienten-Gelelektrophorese Anwendung, um kultivierbare Bakterienfloren zu beschreiben bzw. nicht kultivierbare Bakterienfloren stichprobenartig zu erfassen.
Neben den Aspekten der Hygienisierung wird zudem die Eignung der Methode für die landwirtschaftliche Nutzung berücksichtigt. Dies findet sich insbesondere in der Komposition des zu fermentierenden Materials wieder, welches für die verstärkte Humusakkumulation im Ackerboden optimiert wurde. Darüber hinaus wird die Masseverlustbilanz während der milchsauren Fermentation mit denen der Kompostierung sowie der Verarbeitung in der Biogasanlage verglichen und als positiv bewertet, da sie mit insgesamt 2,45 % sehr deutlich unter den bisherigen Alternativen liegt (73, 138, 458). Weniger Verluste an organischem Material während der Hygienisierung führen zu einer größeren verwendbaren Düngermenge, die auf Grund ihres organischen Ursprungs zu einer Verstärkung des Humusanteiles im Ackerboden beitragen kann (56, 132).
Weltweit streben Anti-Doping Institute danach jene Sportler zu überführen, welche sich unerlaubter Mittel oder Methoden bedienen. Die hierfür notwendigen Testsysteme werden kontinuierlich weiterentwickelt und neue Methoden aufgrund neuer Wirkstoffe der Pharmaindustrie etabliert. Gegenstand dieser Arbeit war es, eine parallele Mehrkomponentenanalyse auf Basis von Antigen-Antikörper Reaktionen zu entwickeln, bei dem es primär um Verringerung des benötigten Probevolumens und der Versuchszeit im Vergleich zu einem Standard Nachweis-Verfahren ging. Neben der Verwendung eines Multiplex Ansatzes und der Mikroarraytechnologie stellten ebenfalls die Genauigkeit aller Messparameter, die Stabilität des Versuchsaufbaus sowie die Performance über einen Einfach-Blind-Ansatz Herausforderungen dar. Die Anforderung an den Multiplex Ansatz, keine falschen Signale trotz ähnlicher Strukturen zu messen, konnte durch die gezielte Kombination von spezifischen Antikörpern realisiert werden. Hierfür wurden neben Kreuzreaktivitätstests auf dem Mikroarray parallel erfolgreich Western Blot Versuche durchgeführt. Jene Antikörper, welche in diesen Versuchen die gesetzten Anforderungen erfüllten, wurden für das Ermitteln der kleinsten nachweisbaren Konzentration verwendet. Über das Optimieren der Versuchsbedingungen konnte unter Verwendung von Tween in der Waschlösung sowohl auf Glas als auch auf Kunststoff die Hintergrundfluoreszenz reduziert und somit eine Steigerung des Signal/Hintergrundverhältnisses erreicht werden. In den Versuchen zu Ermittlung der Bestimmungsgrenze wurde für das humane Choriongonadotropin (hCG-i) eine Konzentration von 10 mU/ml, für dessen beta-Untereinheit (hCG-beta) eine Konzentration von 3,6 mU/ml und für das luteinisierende Hormon (LH) eine Konzentration von 10 mU/ml bestimmt. Den ermittelten Wert im Serum für das hCG-i entspricht dem von der Welt-Anti-Dopin-Agentur (WADA) geforderten Wert in Urin von 5 mU/ml. Neben der Ermittlung von Bestimmungsgrenzen wurden diese hinsichtlich auftretender Matrixeffekte in Serum und Blut gemessen. Wie aus den Versuchen zur Ermittlung von Kreuzreaktivitäten auf dem Mikroarray zu entnehmen ist, lassen sich das LH, das hCG-i und hCG-β ebenfalls in Serum und Blut messen. Die Durchführung einer Performance-Analyse über einem Einfach-Blind-Ansatz mit 130 Serum Proben, wurde ebenfalls über dieses System realisiert. Die ausgewerteten Proben wurden anschließend über eine Grenzwertoptimierungskurve analysiert und die diagnostische Spezifität ermittelt. Für die Messungen des LH konnte eine Sensitivität und Spezifität von 100% erreicht werden. Demnach wurden alle negativen und positiven Proben eindeutig interpretiert. Für das hCG-β konnte ebenfalls eine Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 97% erreicht werden. Die hCG-i Proben wurden mit einer Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 97,5% gemessen. Um den Nachweis zu erbringen, dass dieser Versuchsaufbau über mehrere Wochen stabile Signale bei Vermessen von identischen Proben liefert, wurde ein über zwölf Wochen angesetzter Stabilitätstest für alle Parameter erfolgreich in Serum und Blut durchgeführt. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erfolgreich eine Mehrkomponentenanalyse als Multiplex Ansatz auf einem Mikroarray entwickelt werden. Die Durchführung der Performance-Analyse und des Stabilitätstests zeigen bereits die mögliche Einsatzfähigkeit dieses Tests im Kontext einer Dopinganalyse.