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Nutrigenetik der metabolischen Adaptation an eine isokalorische Hochfettdiät bei gesunden Zwillingen
(2013)
Intensive Forschung hat in den vergangenen Jahrzehnten zu einer sehr detaillierten Charakterisierung des Geschmackssystems der Säugetiere geführt. Dennoch sind mit den bislang eingesetzten Methoden wichtige Fragestellungen unbeantwortet geblieben. Eine dieser Fragen gilt der Unterscheidung von Bitterstoffen. Die Zahl der Substanzen, die für den Menschen bitter schmecken und in Tieren angeborenes Aversionsverhalten auslösen, geht in die Tausende. Diese Substanzen sind sowohl von der chemischen Struktur als auch von ihrer Wirkung auf den Organismus sehr verschieden. Während viele Bitterstoffe potente Gifte darstellen, sind andere in den Mengen, die mit der Nahrung aufgenommen werden, harmlos oder haben sogar positive Effekte auf den Körper. Zwischen diesen Gruppen unterscheiden zu können, wäre für ein Tier von Vorteil. Ein solcher Mechanismus ist jedoch bei Säugetieren nicht bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Verarbeitung von Geschmacksinformation in der ersten Station der Geschmacksbahn im Mausgehirn, dem Nucleus tractus solitarii (NTS), mit besonderem Augenmerk auf der Frage nach der Diskriminierung verschiedener Bitterstoffe. Zu diesem Zweck wurde eine neue Untersuchungsmethode für das Geschmackssystem etabliert, die die Nachteile bereits verfügbarer Methoden umgeht und ihre Vorteile kombiniert. Die Arc-catFISH-Methode (cellular compartment analysis of temporal activity by fluorescent in situ hybridization), die die Charakterisierung der Antwort großer Neuronengruppen auf zwei Stimuli erlaubt, wurde zur Untersuchung geschmacksverarbeitender Zellen im NTS angewandt. Im Zuge dieses Projekts wurde erstmals eine stimulusinduzierte Arc-Expression im NTS gezeigt. Die ersten Ergebnisse offenbarten, dass die Arc-Expression im NTS spezifisch nach Stimulation mit Bitterstoffen auftritt und sich die Arc exprimierenden Neurone vornehmlich im gustatorischen Teil des NTS befinden. Dies weist darauf hin, dass Arc-Expression ein Marker für bitterverarbeitende gustatorische Neurone im NTS ist. Nach zweimaliger Stimulation mit Bittersubstanzen konnten überlappende, aber verschiedene Populationen von Neuronen beobachtet werden, die unterschiedlich auf die drei verwendeten Bittersubstanzen Cycloheximid, Chininhydrochlorid und Cucurbitacin I reagierten. Diese Neurone sind vermutlich an der Steuerung von Abwehrreflexen beteiligt und könnten so die Grundlage für divergentes Verhalten gegenüber verschiedenen Bitterstoffen bilden.
Die Expansion des renalen Tubulointerstitiums aufgrund einer Akkumulation zellulärer Bestandteile und extrazellulärer Matrix ist eine charakteristische Eigenschaft der chronischen Nierenerkrankung (CKD) und führt zu einer Progression der Erkrankung in Richtung eines terminalen Nierenversagens. Die Fibroblasten Proliferation und ihre Transformation hin zum sekretorischen Myofibroblasten-Phänotyp stellen hierbei Schlüsselereignisse dar. Signalprozesse, die zur Induktion der Myofibroblasten führen, werden aktiv beforscht um anti-fibrotische Therapieansätze zu identifizieren. Das anti-inflammatorische Protein Annexin A1 und sein Rezeptor Formyl-Peptid Rezeptor 2 (FPR2) wurden in verschiedenen Organsystemen mit der Regulation von Fibroblastenaktivität in Verbindung gebracht, jedoch wurden ihre Expression und Funktion bei renalen fibrotischen Erkrankungen bisher nicht untersucht. Ziel der aktuellen Studie war daher die Untersuchung der renalen Annexin A1- und FPR2-Expression in einem Tiermodell des chronischen Nierenversagens, sowie die Charakterisierung der funktionellen Rolle von Annexin A1 in der Regulation des Fibroblasten Phänotyps und ihrer Syntheseleistung. Dazu wurden neugeborene Sprague-Dawley Ratten in den ersten zwei Wochen ihres Lebens entweder mit Vehikel oder mit einem Angiotensin II Typ I Rezeptor Antagonisten behandelt und ohne weitere Intervention bis zu einem Alter von 11 Monaten (CKD Ratten) gehalten. Die Regulation und Lokalisation von Annexin A1 und FPR2 wurden mit Hilfe von Real-Time PCR und Immunhistochemie erfasst. Annexin A1- und FPR2-exprimierende Zellen wurden weiter durch Doppelimmunfluoreszenzfärbungen charakterisiert. Gefärbt wurde mit Antikörpern gegen endotheliale Zellen (rat endothelial cell antigen), Makrophagen (CD 68), Fibroblasten (CD73) und Myofibroblasten (alpha-smooth muscle actin (α-sma)). Zellkulturstudien wurden an immortalisierten renalen kortikalen Fibroblasten aus Wildtyp- und Annexin A1-defizienten Mäusen, sowie an etablierten humanen und murinen renalen Fibrolasten durchgeführt. Eine Überexpression von Annexin A1 wurde durch eine stabile Transfektion erreicht. Die Expression von Annexin A1, α-sma und Kollagen 1α1 wurde durch Real-Time PCR, Western Blot und Immuhistochemie erfasst. Die Sekretion des Annexin A1 Proteins wurde nach TCA-Fällung des Zellkulturüberstandes im Western Blot untersucht. Wie zu erwarten zeigten die CKD Ratten eine geringere Anzahl an Nephronen mit deutlicher glomerulären Hypertrophie. Der tubulointerstitielle Raum war durch fibrilläres Kollagen, aktivierte Fibroblasten und inflammatorische Zellen expandiert. Parallel dazu war die mRNA Expression von Annexin A1 und Transforming growth factor beta (TGF-β) signifikant erhöht. Die Annexin A1-Lokalisation mittels Doppelimmunfluorsezenz identifizierte eine große Anzahl von CD73-positiven kortikalen Fibroblasten und eine Subpopulation von Makrophagen als Annexin A1-positiv. Die Annexin A1-Menge in Myofibroblasten und renalen Endothelien war gering. FPR2 konnte in der Mehrzahl der renalen Fibroblasten, in Myofibroblasten, in einer Subpopulation von Makrophagen und in renalen Epithelzellen nachgewiesen werden. Eine Behandlung der murinen Fibroblasten mit dem pro-fibrotischen Zytokin TGF-β führte zu einem parallelen Anstieg der α-sma-, Kollagen 1α1- und Annexin A1-Biosynthese und zu einer gesteigerten Sekretion von Annexin A1. Eine Überexpression von Annexin A1 in murinen Fibroblasten reduzierte das Ausmaß der TGF-β induzierten α-sma- und Kollagen 1α1-Biosynthese. Fibroblasten aus Annexin A1-defizienten Mäusen zeigten einen starken Myofibroblasten-Phänotyp mit einer gesteigerten Expression an α-sma und Kollagen 1α1. Der Einsatz eines Peptidantagonisten des FPR2 (WRW4) resultierte in einer Stimulation der α-sma-Biosynthese, was die Vermutung nahe legte, dass Annexin A1 FPR2-vermittelt anti-fibrotische Effekte hat. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass renale kortikale Fibroblasten eine Hauptquelle des Annexin A1 im renalen Interstitium und einen Ansatzpunkt für Annexin A1-Signalwege in der Niere darstellen. Das Annexin A1/FPR2-System könnte daher eine wichtige Rolle in der Kontrolle des Fibroblasten Phänotyp und der Fibroblasten Aktivität spielen und daher einen neuen Ansatz für die anti-fibrotischen pharmakologischen Strategien in der Behandlung des CKD darstellen.
Hintergrund: Gestillte Kinder haben im Vergleich zu nicht gestillten Kindern eine geringere Inzidenz von gastrointestinalen Infektionen und atopischen Erkrankungen. Man geht davon aus, dass der gesundheitsfördernde Effekt der Muttermilch teilweise über die intestinale Mikrobiota vermittelt wird. Diese ist in Stillkindern durch eine geringe Diversität und einen hohen Anteil an Bifidobakterien charakterisiert. Neueste Ansätze in der Weiterentwicklung industriell hergestellter Säuglingsnahrung zielen darauf ab, eine intestinale Mikrobiota zu fördern, die der von gestillten Kindern ähnelt. Die Supplementation von Säuglingsnahrung mit Probiotika (lebende Mikroorganismen) oder Präbiotika (unverdauliche Kohlenhydrate, die als Energiesubstrat für probiotische Bakterien dienen) könnte die bifidogene und antipathogene, aber auch immunmodulierende Wirkung der Muttermilch nachahmen. Aufgrund unterschiedlicher Interaktionen mit der Darmmikrobiota und dem Immunsystem fokussiert man mit der gleichzeitigen Gabe von Pro- und Präbiotika (Synbiotika) eine synergistische Wirkung an. Zielstellung und Studiendesign: In einer randomisiert-kontrollierten, klinischen Studie wurde untersucht, ob sich in den ersten drei Lebensmonaten von gesunden und termingerecht geborenen Kindern mit einer Synbiotikum-haltigen Säuglingsnahrung eine intestinale Mikrobiota etabliert, die der von gestillten Kindern gleicht. Das Synbiotikum setzte sich aus Bifidobacterium animalis ssp. lactis CNCM I 3446 (ältere Bezeichnung B. lactis BB-12) und Kuhmilcholigosacchariden zusammen. Die Studie umfasste zwei Gruppen von Kindern, die eine Säuglingsnahrung mit (SYN-Gruppe, n=21) oder ohne Supplement (KON-Gruppe, n=18) erhielten. Gestillte Kinder dienten als Referenz (REF-Gruppe, n=23). Um die Diversität der Bifidobakterien auf Speziesebene umfassend zu charakterisieren, wurden quantitative Real-Time PCR (qPCR)-Verfahren, basierend auf dem single-copy groEL als phylogenetisches Zielgen, zur spezifischen Quantifizierung von zwölf Bifidobakterienspezies in humanen Fäzes entwickelt und validiert. Ergebnisse: Die supplementierte Säuglingsnahrung war gut verträglich und unterstützte eine gesunde Entwicklung; vergleichbare anthropometrische Daten von SYN- und REF-Gruppe. Das Synbiotikum stimulierte selektiv das Wachstum von Laktobazillen und Bifidobakterien. Die Zellzahl für Laktobazillen der SYN-Gruppe war zur REF-Gruppe äquivalent (9,07±0,32 versus 9,90±0,27 log10 Zellen/g Fäzes TM [MW±SEM]; p<0,0019; Äquivalenzdifferenz von 1 log10 Zellen/g Fäzes TM) und höher als in der KON-Gruppe (8,27±0,31 log10 Zellen/g Fäzes TM [MW±SEM]). Die Zellzahl für Bifidobakterien war in der SYN-Gruppe am höchsten (11,54±0,05 versus 11,00±0,17 [REF-Gruppe] und 10,54±0,24 [KON-Gruppe] log10 Zellen/g Fäzes TM [MW±SEM]). In der SYN-Gruppe wurde die höchste Anzahl an Bifidobakterienspezies erfasst (167 mit [128 ohne] B. animalis in 56 Fäzesproben versus 98 und 93 in jeweils 51 Fäzesproben der REF- und KON-Gruppe). Neben Kinder-typischen Spezies wie B. bifidum und B. breve wurden auch Spezies, die für Erwachsene charakteristisch sind (B. adolescentis), häufiger in der SYN-Gruppe als in den Vergleichsgruppen nachgewiesen. Der pH-Wert in Fäzes von Kindern aus der SYN-Gruppe war niedriger als der aus der KON-Gruppe (6,07±0,20 versus 6,45±0,17 [MW±SEM]) und näher an dem von gestillten Kindern mit 5,29±0,12 (MW±SEM). Schlussfolgerung: Die Supplementation einer Säuglingsnahrung mit dem Synbiotikum aus CNCM I-3446 und Kuhmilcholigosacchariden führte zu einer Angleichung in der Zusammensetzung der intestinalen Mikrobiota und des fäkalen pH-Wertes an gestillte Kinder. Die in dieser Arbeit entwickelten groEL-basierten qPCR-Verfahren erlaubten eine spezifische und genaue Analyse der Bifidobakterienpopulation unter dem Einfluss eines Synbiotikums.