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Herein, we report the synthesis of two phenylaza-[18]crown-6 lariat ethers with a coumarin fluorophore (1 and 2) and we reveal that compound 1 is an excellent probe for K+ ions under simulated physiological conditions. The presence of a 2-methoxyethoxy lariat group at the ortho position of the anilino moiety is crucial to the substantially increased stability of compounds 1 and 2 over their lariat-free phenylaza-[18] crown-6 ether analogues. Probe 1 shows a high K+/Na+ selectivity and a 2.5-fold fluorescence enhancement was observed in the presence of 100 mm K+ ions. A fluorescent membrane sensor, which was prepared by incorporating probe 1 into a hydrogel, showed a fully reversible response, a response time of 150 s, and a signal change of 7.8% per 1 mm K+ within the range 1-10 mm K+. The membrane was easily fabricated (only a single sensing layer on a solid polyester support), yet no leaching was observed. Moreover, compound 1 rapidly permeated into cells, was cytocompatible, and was suitable for the fluorescent imaging of K+ ions on both the extracellular and intracellular levels.
Growing attention to phytoplankton mixotrophy as a trophic strategy has led to significant revisions of traditional pelagic food web models and ecosystem functioning. Although some empirical estimates of mixotrophy do exist, a much broader set of in situ measurements are required to (i) identify which organisms are acting as mixotrophs in real time and to (ii) assess the contribution of their heterotrophy to biogeochemical cycling. Estimates are needed through time and across space to evaluate which environmental conditions or habitats favour mixotrophy: conditions still largely unknown. We review methodologies currently available to plankton ecologists to undertake estimates of plankton mixotrophy, in particular nanophytoplankton phago-mixotrophy. Methods are based largely on fluorescent or isotopic tracers, but also take advantage of genomics to identify phylotypes and function. We also suggest novel methods on the cusp of use for phago-mixotrophy assessment, including single-cell measurements improving our capacity to estimate mixotrophic activity and rates in wild plankton communities down to the single-cell level. Future methods will benefit from advances in nanotechnology, micromanipulation and microscopy combined with stable isotope and genomic methodologies. Improved estimates of mixotrophy will enable more reliable models to predict changes in food web structure and biogeochemical flows in a rapidly changing world.
Myoviruses, bacteriophages with T4-like architecture, must contract their tails prior to DNA release. However, quantitative kinetic data on myovirus particle opening are lacking, although they are promising tools in bacteriophage-based antimicrobial strategies directed against Gram-negative hosts. For the first time, we show time-resolved DNA ejection from a bacteriophage with a contractile tail, the multi-O-antigen-specific Salmonella myovirus Det7. DNA release from Det7 was triggered by lipopolysaccharide (LPS) O-antigen receptors and notably slower than in noncontractile-tailed siphoviruses. Det7 showed two individual kinetic steps for tail contraction and particle opening. Our in vitro studies showed that highly specialized tailspike proteins (TSPs) are necessary to attach the particle to LPS. A P22-like TSP confers specificity for the Salmonella Typhimurium O-antigen. Moreover, crystal structure analysis at 1.63 angstrom resolution confirmed that Det7 recognized the Salmonella Anatum O-antigen via an E15-like TSP, DettilonTSP. DNA ejection triggered by LPS from either host showed similar velocities, so particle opening is thus a process independent of O-antigen composition and the recognizing TSP. In Det7, at permissive temperatures TSPs mediate O-antigen cleavage and couple cell surface binding with DNA ejection, but no irreversible adsorption occurred at low temperatures. This finding was in contrast to short-tailed Salmonella podoviruses, illustrating that tailed phages use common particle-opening mechanisms but have specialized into different infection niches.
Signaling pathways in biological systems rely on specific interactions between multiple biomolecules. Fluorescence fluctuation spectroscopy provides a powerful toolbox to quantify such interactions directly in living cells. Cross-correlation analysis of spectrally separated fluctuations provides information about intermolecular interactions but is usually limited to two fluorophore species. Here, we present scanning fluorescence spectral correlation spectroscopy (SFSCS), a versatile approach that can be implemented on commercial confocal microscopes, allowing the investigation of interactions between multiple protein species at the plasma membrane. We demonstrate that SFSCS enables cross-talk-free cross-correlation, diffusion, and oligomerization analysis of up to four protein species labeled with strongly overlapping fluorophores. As an example, we investigate the interactions of influenza A virus (IAV) matrix protein 2 with two cellular host factors simultaneously. We furthermore apply raster spectral image correlation spectroscopy for the simultaneous analysis of up to four species and determine the stoichiometry of ternary IAV polymerase complexes in the cell nucleus.
We report a comparison of two photonic techniques for single-molecule sensing: fluorescence nanoscopy and optoplasmonic sensing. As the test system, oligonucleotides with and without fluorescent labels are transiently hybridized to complementary "docking" strands attached to gold nanorods. Comparing the measured single-molecule kinetics helps to examine the influence of the fluorescent labels as well as factors arising from different sensing geometries. Our results demonstrate that DNA dissociation is not significantly altered by the fluorescent labels and that DNA association is affected by geometric factors in the two techniques. These findings open the door to exploiting plasmonic sensing and fluorescence nanoscopy in a complementary fashion, which will aid in building more powerful sensors and uncovering the intricate effects that influence the behavior of single molecules.
Point-of-care and in-vivo bio-diagnostic tools are the current need for the present critical scenarios in the healthcare industry. The past few decades have seen a surge in research activities related to solving the challenges associated with precise on-site bio-sensing. Cutting-edge fiber optic technology enables the interaction of light with functionalized fiber surfaces at remote locations to develop a novel, miniaturized and cost-effective lab on fiber technology for bio-sensing applications. The recent remarkable developments in the field of nanotechnology provide innumerable functionalization methodologies to develop selective bio-recognition elements for label free biosensors. These exceptional methods may be easily integrated with fiber surfaces to provide highly selective light-matter interaction depending on various transduction mechanisms. In the present review, an overview of optical fiber-based biosensors has been provided with focus on physical principles used, along with the functionalization protocols for the detection of various biological analytes to diagnose the disease. The design and performance of these biosensors in terms of operating range, selectivity, response time and limit of detection have been discussed. In the concluding remarks, the challenges associated with these biosensors and the improvement required to develop handheld devices to enable direct target detection have been highlighted.
LCST-type synthetic thermoresponsive polymers can reversibly respond to certain stimuli in aqueous media with a massive change of their physical state. When fluorophores, that are sensitive to such changes, are incorporated into the polymeric structure, the response can be translated into a fluorescence signal. Based on this idea, this thesis presents sensing schemes which transduce the stimuli-induced variations in the solubility of polymer chains with covalently-bound fluorophores into a well-detectable fluorescence output. Benefiting from the principles of different photophysical phenomena, i.e. of fluorescence resonance energy transfer and solvatochromism, such fluorescent copolymers enabled monitoring of stimuli such as the solution temperature and ionic strength, but also of association/disassociation mechanisms with other macromolecules or of biochemical binding events through remarkable changes in their fluorescence properties. For instance, an aqueous ratiometric dual sensor for temperature and salts was developed, relying on the delicate supramolecular assembly of a thermoresponsive copolymer with a thiophene-based conjugated polyelectrolyte. Alternatively, by taking advantage of the sensitivity of solvatochromic fluorophores, an increase in solution temperature or the presence of analytes was signaled as an enhancement of the fluorescence intensity. A simultaneous use of the sensitivity of chains towards the temperature and a specific antibody allowed monitoring of more complex phenomena such as competitive binding of analytes. The use of different thermoresponsive polymers, namely poly(N-isopropylacrylamide) and poly(meth)acrylates bearing oligo(ethylene glycol) side chains, revealed that the responsive polymers differed widely in their ability to perform a particular sensing function. In order to address questions regarding the impact of the chemical structure of the host polymer on the sensing performance, the macromolecular assembly behavior below and above the phase transition temperature was evaluated by a combination of fluorescence and light scattering methods. It was found that although the temperature-triggered changes in the macroscopic absorption characteristics were similar for these polymers, properties such as the degree of hydration or the extent of interchain aggregations differed substantially. Therefore, in addition to the demonstration of strategies for fluorescence-based sensing with thermoresponsive polymers, this work highlights the role of the chemical structure of the two popular thermoresponsive polymers on the fluorescence response. The results are fundamentally important for the rational choice of polymeric materials for a specific sensing strategy.
Eine Nutzung der optischen Anisotropie dünner Schichten ist vor allem für die Displaytechnologie, die optische Datenspeicherung und für optische Sicherheitselemente von hoher Bedeutung. Diese Doktorarbeit befasst sich mit theoretischen und experimentellen Untersuchung von dreidimensionaler Anisotropie und dabei insbesondere mit der Untersuchung von lichtinduzierter dreidimensionaler Anisotropie in organischen dünnen Polymer-Schichten. Die gewonnenen Erkentnisse und entwickelten Methoden können wertvolle Beiträge für Optimierungsprozesse, wie bei der Kompensation der Blickwinkelabhängigkeit von Flüssigkristall-Displays, liefern. Die neue Methode der Immersions-Transmissions-Ellipsometrie (ITE) zur Untersuchung von dünneren Schichten wurde im Rahmen dieser Dissertation entwickelt. Diese Methode gestattet es, in Kombination mit konventioneller Reflexions- und Transmissionsellipsometrie, die absoluten dreidimensionalen Brechungsindices einer biaxialen Schicht zu bestimmen. Erstmals gelang es damit, das dreidimensionale Brechungsindexellipsoid von transparenten, dünneren (150 nm) Filmen hochgenau (drei Stellen hinter dem Komma) zu bestimmen. Die ITE-Methode hat demzufolge das Potential, auch bei noch dünneren Schichten mit Gewinn eingesetzt werden zu können. Die lichtinduzierte Generierung von dreidimensionaler Anisotropie wurde in dünnen Schichten von azobenzenhaltigen und zimtsäurehaltigen, amorphen und flüssig-kristallinen Homo- und Copolymeren untersucht. Erstmals wurden quantitative Untersuchungen zur Änderung von lichtinduzierten, dreidimensionalen Anisotropien in dünnen Schichten von azobenzenhaltigen und zimtsäurehaltigen Polymeren bei Tempern oberhalb der Glastemperatur durchgeführt. Bei vielen der untersuchten Polymere war die dreidimensionale Ordnung nach dem Bestrahlen mit polarisiertem Licht und anschließendem Tempern oberhalb der Glastemperatur scheinbar von der Schichtdicke abhängig. Die Ursache liegt wohl in der, mit der neuentwickelten ITE-Methode detektierten, planaren Ausgangsorientierung der aufgeschleuderten dünneren Schichten. Um Verkippungs-Gradienten in dickeren Polymerschichten in ihrem Verlauf zu bestimmen, wurde eine spezielle Methode unter Benutzung der Wellenleitermoden-Spektroskopie entwickelt. Quantenchemisch bestimmte, maximal induzierbare Doppelbrechungen in flüssig-kristallinen Polymeren wurden mit den experimentell gefundenen Ordnungen verglichen.
Eine Nutzung der optischen Anisotropie dünner Schichten ist vor allem für die Displaytechnologie, die optische Datenspeicherung und für optische Sicherheitselemente von hoher Bedeutung. Diese Doktorarbeit befasst sich mit theoretischen und experimentellen Untersuchung von dreidimensionaler Anisotropie und dabei insbesondere mit der Untersuchung von lichtinduzierter dreidimensionaler Anisotropie in organischen dünnen Polymer-Schichten. Die gewonnenen Erkentnisse und entwickelten Methoden können wertvolle Beiträge für Optimierungsprozesse, wie bei der Kompensation der Blickwinkelabhängigkeit von Flüssigkristall-Displays, liefern. Die neue Methode der Immersions-Transmissions-Ellipsometrie (ITE) zur Untersuchung von dünneren Schichten wurde im Rahmen dieser Dissertation entwickelt. Diese Methode gestattet es, in Kombination mit konventioneller Reflexions- und Transmissionsellipsometrie, die absoluten dreidimensionalen Brechungsindices einer biaxialen Schicht zu bestimmen. Erstmals gelang es damit, das dreidimensionale Brechungsindexellipsoid von transparenten, dünneren (150 nm) Filmen hochgenau (drei Stellen hinter dem Komma) zu bestimmen. Die ITE-Methode hat demzufolge das Potential, auch bei noch dünneren Schichten mit Gewinn eingesetzt werden zu können. Die lichtinduzierte Generierung von dreidimensionaler Anisotropie wurde in dünnen Schichten von azobenzenhaltigen und zimtsäurehaltigen, amorphen und flüssig-kristallinen Homo- und Copolymeren untersucht. Erstmals wurden quantitative Untersuchungen zur Änderung von lichtinduzierten, dreidimensionalen Anisotropien in dünnen Schichten von azobenzenhaltigen und zimtsäurehaltigen Polymeren bei Tempern oberhalb der Glastemperatur durchgeführt. Bei vielen der untersuchten Polymere war die dreidimensionale Ordnung nach dem Bestrahlen mit polarisiertem Licht und anschließendem Tempern oberhalb der Glastemperatur scheinbar von der Schichtdicke abhängig. Die Ursache liegt wohl in der, mit der neuentwickelten ITE-Methode detektierten, planaren Ausgangsorientierung der aufgeschleuderten dünneren Schichten. Um Verkippungs-Gradienten in dickeren Polymerschichten in ihrem Verlauf zu bestimmen, wurde eine spezielle Methode unter Benutzung der Wellenleitermoden-Spektroskopie entwickelt. Quantenchemisch bestimmte, maximal induzierbare Doppelbrechungen in flüssig-kristallinen Polymeren wurden mit den experimentell gefundenen Ordnungen verglichen.
Ziel der Arbeit war die Entwicklung von farbstoffmarkierten Polymeren, die einen temperaturgetriebenen Knäuel-Kollaps-Phasenübergang in wässriger Lösung ("thermo-responsive Polymere") zeigen und diesen in ein optisches Signal übersetzen können. Solche Polymere unterliegen innerhalb eines kleinen Temperaturintervalls einer massiven Änderung ihres Verhaltens, z B. ihrer Konformation und ihres Quellungsgrads. Diese Änderungen sind mit einem Wechsel der Löseeigenschaften von hydrophil zu hydrophob verbunden. Als Matrixpolymere wurden Poly-N-isopropylacrylamid (polyNIPAm), Poly(oligoethylen-glykolacrylat) (polyOEGA) und Poly(oligoethylenglykolmethacrylat) (polyOEGMA) ein-gesetzt, in die geeignete Farbstoffen durch Copolymerisation eingebaut wurden. Als besonders geeignet, um den Phasenübergang in ein optisches Signal zu übersetzen, erwiesen sich hierfür kompakte, solvatochrome Cumarin- und Naphthalimidderivate. Diese beeinträchtigten weder das Polymerisationsverhalten noch den Phasenübergang, reagierten aber sowohl bezüglich Farbe als auch Fluoreszenz stark auf die Polarität des Lösemittels. Weiterhin wurden Systeme entwickelt, die mittels Energietransfer (FRET) ein an den Phasenübergang gekoppeltes optisches Signal erzeugen. Hierbei wurde ein Cumarin als Donor- und ein Polythiophen als Akzeptorfarbstoff eingesetzt. Es zeigte sich, dass trotz scheinbarer Ähnlichkeit bestimmte Polymere ausgeprägt auf einen Temperaturstimulus mit Änderung ihrer spektralen Eigenschaften reagieren, andere aber nicht. Hierfür wurden die molekularen Ursachen untersucht. Als wahrscheinliche Gründe für das Ausbleiben einer spektralen Änderung in Oligo(ethylenglykol)-basierten Polymeren sind zum einen die fehlende Dehydratationseffektivität infolge des Fehlens eines selbstgenügenden Wasserstoffbrückenbindungsmotivs zu nennen und zum anderen die sterische Abschirmung der Farbstoffe durch die Oligo(ethylenglykol)-Seitenketten. Als Prinzipbeweis für die Nützlichkeit solcher Systeme für die Bioanalytik wurde ein System entwickelt, dass die Löslichkeitseigenschaft eines thermoresponsiven Polymers durch Antikörper-Antigen-Reaktion änderte. Die Bindung selbst kleiner Mengen eines Antikörpers ließ sich so direkt optisch auslesen und war bereits mit dem bloßen Auge zu erkennen.