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Sf6 belongs to the Podoviridae family of temperate bacteriophages that infect gram-negative bacteria by insertion of their double-stranded DNA. They attach to their hosts specifically via their tailspike proteins. The 1.25 Å crystal structure of Shigella phage Sf6 tailspike protein (Sf6 TSP) reveals a conserved architecture with a central, right-handed ; helix. In the trimer of Sf6 TSP, the parallel ; helices form a left-handed, coiled;; coil with a pitch of 340 Å. The C-terminal domain consists of a ; sandwich reminiscent of viral capsid proteins. Further crystallographic and biochemical analyses show a Shigella cell wall O-antigen fragment to bind to an endorhamnosidase active site located between two ;-helix subunits each anchoring one catalytic carboxylate. The functionally and structurally related bacteriophage, P22 TSP, lacks sequence identity with Sf6 TSP and has its active sites on single subunits. Sf6 TSP may serve as an example for the evolution of different host specificities on a similar general architecture.
Phage tailspike proteins with beta-solenoid fold as thermostable carbohydrate binding materials
(2009)
We have investigated the stability of three tailspike proteins (TSPs) from bacteriophages Sf6, P22, and HK620. Tailspikes are rod-like homotrimers with comparable beta-solenoid folds and similarly high kinetic stability in spite of different amino acid sequences. As tailspikes bind polysaccharides to recognize the bacterial host cell, their stability is required for maintenance of bacteriophage infectivity under harsh extracellular conditions. They resist denaturation by SDS at ambient temperature and their unfolding is slow even in 6 m guanidinium hydrochloride (GdmHCl). This makes them interesting candidates for very stable carbohydrate binding protein materials.
Bacteriophage Sf6 tailspike protein is functionally equivalent to the well characterized tailspike ofSalmonella phage P22, mediating attachment of the viral particle to host cell-surface polysaccharide. However, there is significant sequence similarity between the two 70-kDa polypeptides only in the N-terminal putative capsid-binding domains. The major, central part of P22 tailspike protein, which forms a parallel ;-helix and is responsible for saccharide binding and hydrolysis, lacks detectable sequence homology to the Sf6 protein. After recombinant expression in Escherichia coli as a soluble protein, the Sf6 protein was purified to homogeneity. As shown by circular dichroism and Fourier transform infrared spectroscopy, the secondary structure contents of Sf6 and P22 tailspike proteins are very similar. Both tailspikes are thermostable homotrimers and resist denaturation by SDS at room temperature. The specific endorhamnosidase activities of Sf6 tailspike protein toward fluorescence-labeled dodeca-, deca-, and octasaccharide fragments of Shigella O-antigen suggest a similar active site topology of both proteins. Upon deletion of the N-terminal putative capsid-binding domain, the protein still forms a thermostable, SDS-resistant trimer that has been crystallized. The observations strongly suggest that the tailspike of phage Sf6 is a trimeric parallel ;-helix protein with high structural similarity to its functional homolog from phage P22.
Folding and stability of the leucine-rich repeat domain of internalin B from Listeria monocytogenes
(2004)
Internalin B (InlB), a surface protein of the human pathogen Listeria monocytogenes, promotes invasion into various host cell types by inducing phagocytosis of the entire bacterium. The N-terminal half of InlB (residues 36-321, InlB(321)), which is sufficient for this process, contains a central leucine-rich repeat (LRR) domain that is flanked by a small a-helical cap 2 and an immunoglobulin (Ig)-like domain. Here we investigated the variant lacking the Ig-like domain (lnlB(248)). The circular dichroism spectra of both protein variants in the far ultraviolet region are very similar, with a characteristic minimum found at similar to200 nm, possibly resulting from the high 3(10)-helical content in the LRR domain. Upon addition of chemical denaturants, both variants unfold in single transitions with unusually high cooperativity that are fully reversible and best described by two-state equilibria. The free energies of GdmCl-induced unfolding determined from transitions at 20degreesC are 9.9(+/- 0.8)kcal/mol for InlB(321) and 5.4(+/- 0.4) kcal/mol for InlB(248). InlB(321) is also more stable against thermal denaturation, as observed by scanning calorimetry. This suggests, that the Ig-like domain, which presumably does not directly interact with the host cell receptor during bacterial invasion, plays a critical role for the in vivo stability of InlB. (C) 2004 Elsevier Ltd. All rights reserved
Für das Verständnis der Strukturbildung bei Proteinen ist es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilität und Faltung zu verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Erörterung von Gesetzmäßigkeiten zu den Faltungseigenschaften von globulären Proteinen investiert. Die große Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat- (LRR-) oder Ankyrin-Proteine gehören, wurde dahingegen noch wenig untersucht. Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelförmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Tertiärstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Stabilität und Faltung eines LRR-Proteins mittels verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als Untersuchungsobjekt diente die für die Infektion ausreichende zentrale LRR-Domäne des Invasionsproteins Internalin B (InlB241) des Bakteriums Listeria monocytogenes. Des weiteren sollten die Integrität und die Stabilitäts- und Faltungseigenschaften der sogenannten Internalin-Domäne (InlB321) untersucht werden. Hierbei handelt es sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Domäne, welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Domäne mit einer Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domäne besteht. Von beiden Konstrukten konnte eine vollständige thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw. thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungsübergängen durchgeführt werden. Sowohl InlB241 als auch InlB321 zeigen einen reversiblen und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichtsübergänge, was die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte. Die zusätzliche Ig-ähnliche Domäne im InlB321 resultierte im Vergleich zum InlB241 in einer Erhöhung der freien Enthalpie der Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese Stabilitätszunahme äußerte sich sowohl in einer Verschiebung des Übergangsmittelpunktes zu höheren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch in einer Erhöhung der Kooperativität des Gleichgewichtsübergangs (9.7 kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Domäne nicht unabhängig voneinander falten und dass die Ig-ähnliche Domäne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor während der Invasion interagiert, eine kritische Rolle für die <i style='mso-bidi-font-style:normal'>in vivo Stabilität des Internalin B spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativität des Übergangs die Integrität der Internalin-Domäne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen keine Intermediate vorliegen. Kinetische Messungen über Tryptophanfluoreszenz und Fern-UV<span style='color:red'> </span>Circulardichroismus deuteten auf die Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der LRR-Domäne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH 2 denaturierten Zustand zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen über ein Intermediat. Eine Erhöhung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins führte zu einer Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im Übergang zu einem alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Domäne deuteten kinetische Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals während der Entfaltung möglicherweise auf die Präsenz von zwei Prozessen hin. Der erste langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem Übergangsmittelpunkt zeigte eine starke Abhängigkeit von der Temperatur, während der zweite schnellere Prozess der Entfaltung stärker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing. Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten für die Erklärung der langsamen Faltungsphase zunächst keinen Hinweis auf dass Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollständige Amplitude während der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann. Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die InlB-Konstrukte als Modelle für die Untersuchung der Faltung von Solenoidproteinen verwendet werden können.<span lang=EN-GB style='mso-ansi-language: EN-GB'><o:p></o:p></span>