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Isothermal amplification technologies are emerging on the horizon that could have the potential to pose as alternatives to PCR in terms of sensitivity and ease of use. One of the most recent isothermal technologies is helicase- dependent amplification (HDA). This technology uses the helicase's capability to disrupt the hydrogen bonds of a Watson-Crick base pair in order to separate dsDNA. A denaturation step, as is used in PCR, is no longer required. This gives rise to new, less expensive and less complicated designs for point-of-care devices and 'Lab on Chip' systems. Helicase-dependent OnChip-amplification (OnChip-HDA) is a further step into this direction as it integrates the HDA technology with microarray technology and its power of multiplexing. This special report will give an overview on the HDA and OnChip-HDA technology, and its potential for point-of-care diagnostics.
Background: The need for fast, specific and sensitive multiparametric detection methods is an ever growing demand in molecular diagnostics. Here we report on a newly developed method, the helicase dependent Onchip amplification (OnChip-HDA). This approach integrates the analysis and detection in one single reaction thus leading to time and cost savings in multiparametric analysis. Methods: HDA is an isothermal amplification method that is not depending on thermocycling as known from PCR due to the helicases' ability to unwind DNA double-strands. We have combined the HDA with microarray based detection, making it suitable for multiplex detection. As an example we used the Onchip HDA in single and multiplex amplifications for the detection of the two pathogens N. gonorrhoeae and S. aureus directly on surface bound primers. Results: We have successfully shown the OnChip-HDA and applied it for single- and duplex- detection of the pathogens N. gonorrhoeae and S. aureus. Conclusion: We have developed a new method, the OnChip-HDA for the multiplex detection of pathogens. Its simplicity in reaction setup and potential for miniaturization and multiparametric analysis is advantageous for the integration in miniaturized Lab on Chip systems, e.g. needed in point of care diagnostics.
In der molekularen Diagnostik besteht ein Bedarf an schnellen und spezifischen Testsystemen, die entweder für die Labordiagnostik oder in Point of Care-Umgebungen eingesetzt werden können. Um dieses Ziel zu erreichen, stehen die Miniaturisierung und Parallelisierung im Mittelpunkt des Forschungsinteresses. Die führende Methode im Bereich der DNA-Analytik ist derzeit die Realtime-PCR. Dieser Technologie sind hinsichtlich der Multiplexfähigkeit technologischen Hürden gesetzt, da derzeit nur eine Analyse von maximal vier Parametern parallel in einem Versuchsansatz erfolgen kann. Microarrays stellen hingegen die benötigten Voraussetzungen zur Verfügung, um als Werkzeuge für die Multiparameteranalyse in verschiedensten Anwendungsbereichen zu dienen. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war es, Multiplex-PCRs und diagnostische Microarrays zu entwickeln, die für analytische Fragestellungen eine schnelle und zuverlässige Multiparameteranalytik ermöglichen, um die bisherigen Einschränkungen aktueller Nachweisverfahren zu vermeiden. Als Anwendungen wurden zum einen ein Nachweissystem für acht relevante Geflügelpathogene zur Überwachung in der Geflügelzucht, zum anderen ein Nachweissystem zur Identifikation potentiell allergener Lebensmittelinhaltstoffe entwickelt. Neben der Entwicklung geeigneter PCR und Multiplex-PCR-Verfahren sowie spezifischer Microarrays für die Detektion der gesuchten Zielsequenzen stand auch die weiterführende Integration von DNA-Amplifikation und Microarray-Technologie im Fokus dieser Arbeit. Die OnChip-Amplifikation stellt eine Möglichkeit dar, um DNA-Analytik und Detektion in einem Reaktionsschritt zu integrieren. Entsprechend wurden die in der Arbeit entwickelten PCR- und Multiplex-PCR-Verfahren zum Nachweis potentieller allergener Lebensmittelinhaltsstoffe für die OnChip-Amplifikation adaptiert und Reaktionsbedingungen getestet, die eine Multiparameteranalyse auf dem Chip ermöglichen. Die entwickelten OnChip-PCR-Verfahren zeigten eine hohe Spezifität sowohl in Single- als auch in der Multiplex-OnChip-PCR. Eine Sensitivität von 10 Kopien bzw. <10ppm konnte in Single-OnChip-PCRs für den Nachweis allergener Lebensmittelinhaltsstoffe gezeigt werden. In Multiplex-OnChip-PCRs konnten 10-100ppm allergene Verunreinigungen spezifisch in unterschiedlichen Lebensmitteln nachgewiesen werden. Ein weiterer Schritt in Richtung einer möglichen Verwendung im Point of Care-Bereich stellt der Einsatz eines isothermalen Amplifikationsverfahrens dar. Vorteil eines solchen Verfahrens ist die Möglichkeit, auf das ansonsten benötigte Thermocycling zu verzichten. Dies vereinfacht eine Integration der OnChip-Amplifikation in mobile Analysegeräte oder Lab on Chip-Systeme und qualifiziert das Verfahren für den Einsatz in Point of Care-Umgebungen. In dieser Arbeit wurde eine noch junge isothermale Amplifikationsmethode, die helikase-abhängige Amplifikation (HDA), hinsichtlich ihrer Eignung für die Integration auf einem Microarray getestet. Hierfür konnte die bislang erste OnChip-HDA für Einzel- und Duplex-Nachweise von Pathogenen entwickelt werden.