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Im Sinne des Refinements von Tierversuchen sollen alle Bedingungen während der Zucht, der Haltung und des Transports von zu Versuchszwecken gehaltenen Tieren und alle Methoden während des Versuchs so verbessert werden, dass die verwendeten Tiere ein minimales Maß an potentiellem Distress, Schmerzen oder Leiden erfahren. Zudem soll ihr Wohlbefinden durch die Möglichkeit des Auslebens speziesspezifischer Verhaltensweisen und die Anwendung tierschonender Verfahren maximal gefördert werden. Zur Etablierung von Grundsätzen des Refinements sind grundlegende Kenntnisse über die physiologischen Bedürfnisse und Verhaltensansprüche der jeweiligen Spezies unabdingbar. Die Experimentatoren sollten das Normalverhalten der Tiere kennen, um potentielle Verhaltensabweichungen, wie Stereotypien, zu verstehen und interpretieren zu können. Standardisierte Haltungsbedingungen von zu Versuchszwecken gehaltenen Mäusen weichen in diversen Aspekten von der natürlichen Umgebung ab und erfordern eine gewisse Adaptation. Ist ein Tier über einen längeren Zeitraum unfähig, sich an die gegebenen Umstände anzupassen, können abnormale Verhaltensweisen, wie Stereotypien auftreten. Stereotypien werden definiert als Abweichungen vom Normalverhalten, die repetitiv und ohne Abweichungen im Ablauf ausgeführt werden, scheinbar keiner Funktion dienen und der konkreten Umweltsituation nicht immer entsprechen.
Bisher war unklar, in welchem Ausmaß stereotypes Verhalten den metabolischen Phänotyp eines Individuums beeinflusst. Ziel dieser Arbeit war es daher, das stereotype Verhalten der FVB/NJ-Maus erstmals detailliert zu charakterisieren, systematisch zusammenzutragen, welche metabolischen Konsequenzen dieses Verhalten bedingt und wie sich diese auf das Wohlbefinden der Tiere und die Verwendung stereotyper Tiere in Studien mit tierexperimentellem Schwerpunkt auswirken.
Der Versuch begann mit der Charakterisierung der mütterlichen Fürsorge in der Parentalgeneration. Insgesamt wurden 35 Jungtiere der F1-Generation vom Absatz an, über einen Zeitraum von 11 Wochen einzeln gehalten, kontinuierlich beobachtet, bis zum Versuchsende wöchentlich Kotproben gesammelt und das Körpergewicht bestimmt. Zusätzlich erfolgten begleitende Untersuchungen wie Verhaltenstests und die Erfassung der physischen Aktivität und metabolischer Parameter. Anschließend wurden u.a. die zerebralen Serotonin- und Dopamingehalte, fäkale Glucocorticoidlevels, hepatisches Glykogen und muskuläre Glykogen- und Triglyceridlevels bestimmt.
Nahezu unabhängig von der mütterlichen Herkunft entwickelte sich bei mehr als der Hälfte der 35 Jungtiere in der F1-Generation stereotypes Verhalten. Diese Daten deuten darauf hin, dass es keine Anzeichen für das Erlernen oder eine direkte genetische Transmission stereotypen Verhaltens bei der FVB/NJ-Maus gibt. Über den gesamten Beobachtungszeitraum zeichneten sich die stereotypen FVB/NJ-Mäuse durch ein eingeschränktes Verhaltensrepertoire aus. Zu Gunsten der erhöhten Aktivität und des Ausübens stereotypen Verhaltens lebten sie insgesamt weniger andere Verhaltensweisen (Klettern, Graben, Nagen) aus. Darüber hinaus waren Stereotypien sowohl im 24-Stunden Open Field Test als auch in der Messeinrichtung der indirekten Tierkalorimetrie mit einer erhöhten Aktivität und Motilität assoziiert, während die circadiane Rhythmik nicht divergierte. Diese erhöhte körperliche Betätigung spiegelte sich in den niedrigeren Körpergewichtsentwicklungen der stereotypen Tiere wieder. Außerdem unterschieden sich die Körperfett- und Körpermuskelanteile.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Ausüben stereotypen Verhaltens zu Differenzen im metabolischen Phänotyp nicht-stereotyper und stereotyper FVB/NJ-Mäuse führt. Im Sinne der „Guten Wissenschaftlichen Praxis“ sollte das zentrale Ziel jedes Wissenschaftlers sein, aussagekräftige und reproduzierbare Daten hervorzubringen. Jedoch können keine validen Resultate von Tieren erzeugt werden, die in Aspekten variieren, die für den vorgesehenen Zweck der Studie nicht berücksichtigt wurden. Deshalb sollten nicht-stereotype und stereotype Individuen nicht innerhalb einer Versuchsgruppe randomisiert werden. Stereotype Tiere demzufolge von geplanten Studien auszuschließen, würde allerdings dem Gebot des zweiten R’s – der Reduction – widersprechen. Um Refinement zu garantieren, sollte der Fokus auf der maximal erreichbaren Prävention stereotypen Verhaltens liegen. Diverse Studien haben bereits gezeigt, dass die Anreicherung der Haltungsumwelt (environmental enrichment) zu einer Senkung der Prävalenz von Stereotypien bei Mäusen führt, dennoch kommen sie weiterhin vor. Daher sollte environmental enrichment zukünftig weniger ein „Kann“, sondern ein „Muss“ sein – oder vielmehr: der Goldstandard. Zudem würde eine profunde phänotypische Charakterisierung dazu beitragen, Mausstämme zu erkennen, die zu Stereotypien neigen und den für den spezifischen Zweck am besten geeigneten Mausstamm zu identifizieren, bevor ein Experiment geplant wird.
Adipositas wird mit einer Vielzahl schwerwiegender Folgeerkrankungen in Verbindung gebracht. Eine Gewichtsreduktion führt zu einer Verbesserung der metabolischen Folgen der Adipositas. Es ist bekannt, dass die Mehrzahl der adipösen Personen in den Monaten nach der Gewichtsreduktion einen Großteil des abgenommenen Gewichts wieder zunimmt. Nichtsdestotrotz existiert eine hohe Variabilität hinsichtlich des Langzeiterfolges einer Gewichtsreduktion. Der erfolgreiche Erhalt des reduzierten Körpergewichts einiger Personen führt zu der Frage nach den Faktoren, die einen Gewichtserhalt beeinflussen, mit dem Ziel einen Ansatzpunkt für mögliche Therapiestrategien zu identifizieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde im Rahmen einer kontrollierten, randomisierten Studie mit 143 übergewichtigen Probanden untersucht, ob nach einer dreimonatigen Gewichtsreduktion eine zwölfmonatige gewichtsstabilisierende Lebensstilintervention einen Einfluss auf die Veränderungen der neuroendokrinen Regelkreisläufe und damit auf den langfristigen Gewichtserhalt über einen Zeitraum von achtzehn Monaten hat.
Hierbei wurde im Vergleich der beiden Behandlungsgruppen primär festgestellt, dass die multimodale Lebensstilintervention zu einer Gewichtstabilisierung über die Dauer dieser zwölfmonatigen Behandlungsphase führte. In der Kontrollgruppe kam es zu einer moderaten Gewichtszunahme . Dadurch war nach Beendigung der Interventionsphase der BMI der Teilnehmer in der Kontrollgruppe höher als der in der Interventionsgruppe (34,1±6,0 kg*m-2 vs. 32,4±5,7 kg*m-2; p<0,01).
Während der Nachbeobachtungszeit war die Interventionsgruppe durch eine signifikant stärkere Gewichtswiederzunahme im Vergleich zur Kontrollgruppe gekennzeichnet, so dass der BMI zwischen beiden Behandlungsgruppen bereits sechs Monate nach der Intervention keinen Unterschied mehr aufwies.
Bezüglich der hormonellen Veränderung durch die Gewichtsreduktion wurde, wie erwartet, eine Auslenkung des endokrinen Systems beobachtet. Jedoch konnte kein Unterschied der untersuchten Hormone im Vergleich der beiden Behandlungsgruppen ausfindig gemacht werden.
Im Verlauf der Gewichtsabnahme und der anschließenden Studienphasen zeigten sich tendenziell drei verschiedene Verlaufsmuster in den hormonellen Veränderungen. Nach einer zusätzlichen Adjustierung auf den jeweiligen BMI des Untersuchungszeitpunktes konnte für die TSH-Spiegel (p<0,05), die Schilddrüsenhormone (p<0,001) und für die IGF 1-Spiegel (p<0,001) eine über die Studienzeit anhaltende Veränderung festgestellt werden.
Abschließend wurde behandlungsgruppenunabhängig untersucht, ob die Hormonspiegel nach Gewichtsreduktion oder ob die relative hormonelle Veränderung während der Gewichtsreduktion prädiktiv für den Erfolg der Gewichterhaltungsphase ist. Hier fand sich für die Mehrzahl der hormonellen Parameter kein Effekt auf die Langzeitentwicklung der Gewichtszunahme. Jedoch konnte gezeigt werden, dass eine geringere Abnahme der 24h Urin-Metanephrin-Ausscheidung während der Gewichtsabnahmephase mit einem besseren Erfolg bezüglich des Gewichtserhalts über die achtzehnmonatige Studienzeit assoziiert war (standardisiertes Beta= -0,365; r2=0,133 p<0,01). Die anderen hormonellen Achsen zeigten keinen nachweislichen Effekt.
Der Bittergeschmack warnt den Organismus vor potentiell verdorbener oder giftiger Nahrung und ist somit ein wichtiger Kontrollmechanismus. Die initiale Detektion der zahlreich vorkommenden Bitterstoffe erfolgt bei der Maus durch 35 Bitterrezeptoren (Tas2rs), die sich im Zungengewebe befinden. Die Geschmacksinformation wird anschließend von der Zunge über das periphere (PNS) ins zentrale Nervensystem (ZNS) geleitet, wo deren Verarbeitung stattfindet. Die Verarbeitung der Geschmacksinformation konnte bislang nicht gänzlich aufgeklärt werden. Neue Studien deuten auf eine Expression von Tas2rs auch im PNS und ZNS entlang der Geschmacksbahn hin. Über Vorkommen und Aufgaben dieser Rezeptoren bzw. Rezeptorzellen im Nervensystem ist bislang wenig bekannt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Tas2r-Expression in verschiedenen Mausmodellen untersucht, Tas2r-exprimierende Zellen identifiziert und deren Funktionen bei der Übertragung der Geschmacksinformationen analysiert. Im Zuge der Expressionsanalysen mittels qRT-PCR konnte die Expression von 25 der 35 bekannten Bittergeschmacksrezeptoren im zentralen Nervensystem der Maus nachgewiesen werden. Die Expressionsmuster im PNS sowie im ZNS lassen darüber hinaus Vermutungen zu Funktionen in verschiedenen Bereichen des Nervensystems zu. Basierend auf den Ergebnissen der Expressionsanalysen war es möglich, stark exprimierte Tas2rs mittels In-situ-Hybridisierung in verschiedenen Zelltypen zu visualisieren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen unter Verwendung eines genetisch modifizierten Mausmodells die Ergebnisse der Expressionsanalysen bestätigen. Sie zeigten eine Expression von Tas2rs, am Beispiel des Tas2r131-Rezeptors, in cholinergen, dopaminergen, GABAergen, noradrenergen und glycinerg-angesteuerten Projektionsneuronen sowie in Interneuronen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen daher erstmals das Vorkommen von Tas2rs in verschiedenen neuronalen Zelltypen in weiten Teilen des ZNS. Dies lässt den Schluss zu, dass Tas2r-exprimierende Zellen potentiell multiple Funktionen innehaben. Anhand von Verhaltensexperimenten in genetisch modifizierten Mäusen wurde die mögliche Funktion von Tas2r131-exprimierenden Neuronen (Tas2r131-Neurone) bei der Geschmackswahrnehmung untersucht. Die Ergebnisse weisen auf eine Beteiligung von Tas2r131-Neuronen an der Signalweiterleitung bzw. -verarbeitung der Geschmacksinformation für eine Auswahl von Bittersubstanzen hin. Die Analysen zeigen darüber hinaus, dass Tas2r131-Neuronen nicht an der Geschmackswahrnehmung anderer Bitterstoffe sowie Geschmacksstimuli anderer Qualitäten (süß, umami, sauer, salzig), beteiligt sind. Eine spezifische „Tas2r131-Bittergeschmacksbahn“, die mit anderen potentiellen „Bitterbahnen“ teils unabhängige, teils überlappende Signalwege bzw. Verarbeitungsbereiche besitzt, bildet eine mögliche zelluläre Grundlage zur Unterscheidung von Bitterstoffen. Die im Rahmen dieser Arbeit entstandene Hypothese einer potentiellen Diskriminierung von Bitterstoffen soll daher in weiterführenden Studien durch die Etablierung eines Verhaltenstest mit Mäusen geprüft werden.
Die hohe Energieaufnahme durch Fette ist ein Hauptfaktor für die Entstehung von Adipositas, was zu weltweiten Bestrebungen führte, die Fettaufnahme zu verringern. Fettreduzierte Lebensmittel erreichen jedoch, trotz ihrer Weiterentwicklung, nicht die Schmackhaftigkeit ihrer Originale. Die traditionelle Sichtweise, dass die Attraktivität von Fetten allein durch Textur, Geruch, Aussehen und postingestive Effekte bestimmt wird, wird nun durch das Konzept einer gustatorischen Wahrnehmung ergänzt. Bei Nagetieren zeigte sich, dass Lipide unabhängig von den vorgenannten Eigenschaften erkannt werden, sowie, dass Fettsäuren, freigesetzt durch linguale Lipasen, als gustatorische Stimuli fungieren und Fettsäuresensoren in Geschmackszellen exprimiert sind. Die Datenlage für den Menschen erwies sich jedoch als sehr begrenzt, daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit molekulare und histologische Voraussetzungen für eine gustatorische Fettwahrnehmung beim Menschen zu untersuchen.
Zunächst wurde humanes Geschmacksgewebe mittels RT-PCR und immunhistochemischen Methoden auf die Expression von Fettsäuresensoren untersucht, sowie exprimierende Zellen in Kofärbeexperimenten charakterisiert und quantifiziert. Es wurde die Expression fettsäuresensitiver Rezeptoren nachgewiesen, deren Agonisten das gesamte Spektrum an kurz- bis langkettigen Fettsäuren abdecken (GPR43, GPR84, GPR120, CD36, KCNA5). Ein zweifelsfreier Nachweis des Proteins konnte für den auf langkettige Fettsäuren spezialisierten Rezeptor GPR120 in Typ-I- und Typ-III-Geschmackszellen der Wallpapillen erbracht werden. Etwa 85 % dieser GPR120-exprimierenden Zellen enthielten keine der ausgewählten Rezeptoren der Geschmacksqualitäten süß (TAS1R2/3), umami (TAS1R1/3) oder bitter (TAS2R38). Somit findet sich in humanen Geschmackspapillen nicht nur mindestens ein Sensor, sondern möglicherweise auch eine spezifische, fettsäuresensitive Zellpopulation. Weitere RT-PCR-Experimente und Untersuchungen mittels In-situ-Hybridisierung wurden zur Klärung der Frage durchgeführt, ob Lipasen in den Von-Ebner-Speicheldrüsen (VED) existieren, die freie Fettsäuren aus Triglyceriden als gustatorischen Stimulus freisetzen können. Es zeigte sich zwar keine Expression der bei Nagetieren gefundenen Lipase F (LIPF), jedoch der eng verwandten Lipasen K, M und N in den serösen Zellen der VED. In-silico-Untersuchungen der Sekundär- und Tertiärstrukturen zeigten die hohe Ähnlichkeit zu LIPF, erwiesen aber auch Unterschiede in den Bindungstaschen der Enzyme, welche auf ein differenziertes Substratspektrum hinweisen. Die Anwesenheit eines spezifischen Signalpeptids macht eine Sekretion der Lipasen in den die Geschmacksporen umspülenden Speichel wahrscheinlich und damit auch eine Bereitstellung von Fettsäuren als Stimuli für Fettsäuresensoren. Die Übertragung des durch diese Stimuli hervorgerufenen Signals von Geschmackszellen auf gustatorische Nervenfasern über P2X-Rezeptormultimere wurde mit Hilfe einer vorherigen Intervention mit einem P2X3 /P2X2/3-spezifischen Antagonisten an der Maus als Modellorganismus im Kurzzeit-Präferenztest untersucht. Es zeigte sich weder eine Beeinträchtigung der Wahrnehmung einer Fettsäurelösung, noch einer zuckerhaltigen Kontrolllösung, wohingegen die Wahrnehmung einer Bitterstofflösung reduziert wurde. Somit ist anhand der Ergebnisse dieser Arbeit eine Beteiligung des P2X3-Homomers bzw. des P2X2/3-Heteromers unwahrscheinlich, jedoch die des P2X2-Homomers und damit der gustatorischen Nervenfasern nicht ausgeschlossen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf die Erfüllung grundlegender Voraussetzungen für die gustatorische Fett(säure)wahrnehmung hin und tragen zum Verständnis der sensorischen Fettwahrnehmung und der Regulation der Fettaufnahme bei. Das Wissen um die Regulation dieser Mechanismen stellt eine Grundlage zur Aufklärung der Ursachen und damit der Bekämpfung von Adipositas und assoziierten Krankheiten dar.