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Initiation and perpetuation of inflammatory bowel diseases (IBD) may result from an exaggerated mucosal immune response to the luminal microbiota in a susceptible host. We proposed that this may be caused either 1) by an abnormal microbial composition or 2) by weakening of the protective mucus layer due to excessive mucus degradation, which may lead to an easy access of luminal antigens to the host mucosa triggering inflammation. We tested whether the probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 (NCIMB) is capable of reducing chronic gut inflammation by changing the existing gut microbiota composition and aimed to identify mechanisms that are involved in possible beneficial effects of the probiotic. To identify health-promoting mechanisms of the strain, we used interleukin (IL)-10 deficient mice that spontaneously develop gut inflammation and fed these mice a diet containing NCIMB (106 cells g-1) for 3, 8 and 24 weeks, respectively. Control mice were fed an identically composed diet but without the probiotic strain. No clear-cut differences between the animals were observed in pro-inflammatory cytokine gene expression and in intestinal microbiota composition after probiotic supplementation. However, we observed a low abundance of the mucin-degrading bacterium Akkermansia muciniphila in the mice that were fed NCIMB for 8 weeks. These low cell numbers were associated with significantly lower interferon gamma (IFN-γ) and IFN-γ-inducible protein (IP-10) mRNA levels as compared to the NCIMB-treated mice that were killed after 3 and 24 weeks of intervention. In conclusion, NCIMB was not capable of reducing gut inflammation in the IL-10-/- mouse model. To further identify the exact role of A. muciniphila and uncover a possible interaction between this bacterium, NCIMB and the host in relation to inflammation, we performed in vitro studies using HT-29 colon cancer cells. The HT-29 cells were treated with bacterial conditioned media obtained by growing either A. muciniphila (AM-CM) or NCIMB (NCIMB-CM) or both together (COMB-CM) in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) for 2 h at 37 °C followed by bacterial cell removal. HT-29 cells treated with COMB-CM displayed reduced cell viability after 18 h (p<0.01) and no viable cells were detected after 24 h of treatment, in contrast to the other groups or heated COMB-CM. Detection of activated caspase-3 in COMB-CM treated groups indicated that death of the HT-29 cells was brought about by apoptosis. It was concluded that either NCIMB or A. muciniphila produce a soluble and heat-sensitive factor during their concomitant presence that influences cell viability in an in vitro system. We currently hypothesize that this factor is a protein, which has not yet been identified. Based on the potential effect of A. muciniphila on inflammation (in vivo) and cell-viability (in vitro) in the presence of NCIMB, we investigated how the presence of A. muciniphila affects the severity of an intestinal Salmonella enterica Typhimurium (STm)-induced gut inflammation using gnotobiotic C3H mice with a background microbiota of eight bacterial species (SIHUMI, referred to as simplified human intestinal microbiota). Presence of A. muciniphila in STm-infected SIHUMI (SIHUMI-AS) mice caused significantly increased histopathology scores and elevated mRNA levels of IFN-γ, IP-10, tumor necrosis factor alpha (TNF-α), IL-12, IL-17 and IL-6 in cecal and colonic tissue. The number of mucin filled goblet cells was 2- to 3- fold lower in cecal tissue of SIHUMI-AS mice compared to SIHUMI mice associated with STm (SIHUMI-S) or A. muciniphila (SIHUMI-A) or SIHUMI mice. Reduced goblet cell numbers significantly correlated with increased IFN-γ (r2 = -0.86, ***P<0.001) in all infected mice. In addition, loss of cecal mucin sulphation was observed in SIHUMI-AS mice. Concomitant presence of A. muciniphila and STm resulted in a drastic change in microbiota composition of the SIHUMI consortium. The proportion of Bacteroides thetaiotaomicron in SIHUMI, SIHUMI-A and SIHUMI-S mice made up to 80-90% but was completely taken over by STm in SIHUMI-AS mice contributing 94% to total bacteria. These results suggest that A. muciniphila exacerbates STm-induced intestinal inflammation by its ability to disturb host mucus homeostasis. In conclusion, abnormal microbiota composition together with excessive mucus degradation contributes to severe intestinal inflammation in a susceptible host.
Bei der Entdeckung der Glutathionperoxidase-2 (GPx2) wurde zunächst davon ausgegangen, dass die Funktion dieses Enzyms im Kryptengrund des Colons einzig in der Reduktion von H2O2 besteht. Im Laufe der weiteren Erforschung zeigte sich, dass GPx2 auch in verschiedenen Tumorgeweben vermehrt exprimiert wird. Dabei wird diskutiert, ob die Wirkung von GPx2 im Tumor eher als pro- oder als antikarzinogen einzustufen ist. Mehrere Experimente in vitro und in vivo zeigten antiinflammatorische Eigenschaften der GPx2. Aufgrund dieser Befunde wird derzeit über weitere Funktionen der GPx2 spekuliert. In dieser Arbeit wurde die physiologische Funktion von GPx2 näher erforscht, dazu wurden Wildtyp- und GPx2-Knockout-Mäuse in Hinblick auf Veränderungen der Enzymexpression und der Colonmorphologie untersucht. Es wurden drei verschiedene Selendiäten verfüttert: selenarmes, selenadäquates und selensupplementiertes Futter. Unter physiologischen Bedingungen ist am Kryptengrund des Colons, innerhalb der proliferierenden Zone, die Mitoserate am höchsten. Der Großteil der apoptotischen Zellen ist hingegen an der Kryptenspitze vorzufinden. Durch den Knockout von GPx2 kam es zu einer signifikanten Erhöhung der Apoptoserate am Kryptengrund. Dabei war der größte Effekt auf selenarmem Futter zu verzeichnen. Hierbei wurde sogar eine Veränderung der Colonmorphologie dokumentiert, da die Verschiebung der Proliferationszone in Richtung Kryptenspitze eine Verlängerung der Krypten nach sich zog. Im Wildtyp wurden keine Apoptosen im Kryptengrund detektiert. GPx1 wird unter physiologischen Bedingungen im Gegensatz zur GPx2 in der Kryptenspitze exprimiert und ist im Selenmangel nicht mehr detektierbar. Der Knockout von GPx2 erhöhte die GPx1-Expression im Kryptengrund auf allen drei Selendiäten. Diese Überexpression von GPx1 am Kryptengrund soll vermutlich den Verlust von GPx2 an dieser Stelle kompensieren. Da jedoch dort die massive Apoptoserate detektiert wurde, kann die GPx1 nicht die komplette Funktion von GPx2 kompensieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Funktion von GPx2 nicht nur in der Reduktion von H2O2 liegt. Vielmehr kann eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase von Zellen postuliert werden. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Klärung der Frage, welchen Einfluss GPx2 auf die entzündungsassoziierte Colonkarzinogenese ausübt. In dem hierfür verwendeten AOM/DSS-Model wird der karzinogene Prozess durch Entzündung vorangetrieben. Es erfolgte sowohl im Wildtyp als auch im GPx2-Knockout zum einen die Bewertung des Entzündungsstatus des Colons und zum anderen wurde die Anzahl von ACF und Tumoren verglichen. Das Colon im GPx2-Knockout war wesentlich stärker entzündet als im Wildtyp. Diese Ergebnisse bestätigen die für die GPx2 postulierte antiinflammatorische Funktion. Normalerweise führt eine Erhöhung der Mitoseanzahl zur Regeneration des entzündeten Gewebes. Jedoch beeinflusst der Verlust von GPx2 vermutlich den Ablauf der Entzündung, indem beispielsweise die Regeneration des Gewebes durch die enorm hohe Apoptoserate am Kryptengrund verlangsamt wird. Des Weiteren hatten sich im GPx2-Knockout tendenziell mehr Tumore entwickelt. Somit korrelierte die Entzündung des Colons mit der Entwicklung von Tumoren. Der Verlust von GPx2 begünstigte vermutlich sowohl die Tumorinitiation als auch die Tumorprogression. Allerdings stimulierte die Expression von GPx2 ebenfalls das Tumorwachstum. Es kann geschlussfolgert werden, dass eine adäquate GPx2-Expression vor Entzündung schützt und somit das Risiko für Colonkrebs senkt. Ob GPx2 aber insgesamt pro- oder antikarzinogen wirkt, hängt vermutlich vom Stadium des Colonkarzinogenese ab.