Refine
Document Type
- Doctoral Thesis (3)
Is part of the Bibliography
- yes (3)
Keywords
- proteasomal degradation (2)
- F-box (1)
- F. oxysporum (1)
- MADS (1)
- Proteasomaler Abbau (1)
- SAP (1)
- SCF complex (1)
- STERILE APETALA (1)
- Stomatäre Immunität (1)
- V. dahliae (1)
Institute
STERILE APETALA (SAP) is known to be an essential regulator of flower development for over 20 years. Loss of SAP function in the model plant Arabidopsis thaliana is associated with a reduction of floral organ number, size and fertility. In accordance with the function of SAP during early flower development, its spatial expression in flowers is confined to meristematic stages and to developing ovules. However, to date, despite extensive research, the molecular function of SAP and the regulation of its spatio-temporal expression still remain elusive.
In this work, amino acid sequence analysis and homology modeling revealed that SAP belongs to the rare class of plant F-box proteins with C-terminal WD40 repeats. In opisthokonts, this type of F-box proteins constitutes the substrate binding subunit of SCF complexes, which catalyze the ubiquitination of proteins to initiate their proteasomal degradation. With LC-MS/MS-based protein complex isolation, the interaction of SAP with major SCF complex subunits was confirmed. Additionally, candidate substrate proteins, such as the growth repressor PEAPOD 1 and 2 (PPD1/2), could be revealed during early stages of flower development. Also INDOLE-3-BUTYRIC ACID RESPONSE 5 (IBR5) was identified among putative interactors. Genetic analyses indicated that, different from substrate proteins, IBR5 is required for SAP function. Protein complex isolation together with transcriptome profiling emphasized that the SCFSAP complex integrates multiple biological processes, such as proliferative growth, vascular development, hormonal signaling and reproduction. Phenotypic analysis of sap mutant and SAP overexpressing plants positively correlated SAP function with plant growth during reproductive and vegetative development.
Furthermore, to elaborate on the transcriptional regulation of SAP, publicly available ChIP-seq data of key floral homeotic proteins were reanalyzed. Here, it was shown that the MADS-domain transcription factors APETALA 1 (AP1), APETALA 3 (AP3), PISTILLATA (PI), AGAMOUS (AG) and SEPALLATA 3 (SEP3) bind to the SAP locus, which indicates that SAP is expressed in a floral organ-specific manner. Reporter gene analyses in combination with CRISPR/Cas9-mediated deletion of putative regulatory regions further demonstrated that the intron contains major regulatory elements of SAP in Arabidopsis thaliana.
In conclusion, these data indicate that SAP is a pleiotropic developmental regulator that acts through tissue-specific destabilization of proteins. The presumed transcriptional regulation of SAP by the floral MADS-domain transcription factors could provide a missing link between the specification of floral organ identity and floral organ growth pathways.
Recently crops encounter an increased number of individual and combined abiotic and biotic stress, which severely affect their growth and yield. Plants are associated with a large number of microorganisms including beneficial as well as pathogenic microorganisms. The interaction of plants with beneficial microorganisms can exert a substantial impact on plant growth and health and their potential can be utilized in sustainable plant production systems. Currently, climate change will increase the impact of stress on crops which will more likely be exposed to combined abiotic and biotic stress. At present, knowledge on how abiotic and biotic stress and the combination of both stresses affect the plant performance and the microbiome is limited. Soil-borne pathogens are responsible for relevant economic losses and are difficult to control. The root bacterial endophytes have shown potential in alleviating stress on plants and improving crop yield and quality. This raises the question how individual abiotic stress like salinity (ionic) and drought (osmotic) and the combination with biotic stress (Verticillium dahliae or Fusarium oxysporum) affects the root microbiota and thus the performance of the plant. Therefore, the goal of this thesis was to improve the understanding of the impact of individual and combined biotic and abiotic stress especially the endophytic root microbiota and thus plant performance. The work is focused on the economically important horticultural crop tomato. The bacterial rootendophytes of tomato plants exposed to individual and combined abiotic and biotic stress was studied with culture-independent and culture-dependent methods. Bacterial root endophytes obtained from tomato roots exposed to individual and combined stress were characterized for their traits that are beneficial to plant growth and health in in vitro and in vivo assays. Finally, the efficacy of selected endophytes in alleviating individual and combined abiotic and biotic stress in tomato plants was assessed. Furthermore, stress conditions can alter the composition of root exudates and volatiles, which may in turn affect the root microbiota assembly. Therefore, the volatile profiles of healthy and pathogen (F. oxysporum) infected tomato roots grown in soil was investigated. A soil olfactometer was established to study the impact of root volatiles of healthy and infected tomato on migration of applied beneficial bacteria. The results of tomato characteristics (plant growth, photosynthesis rate) confirmed the negative effect of individual abiotic and biotic stress reported in other studies. However, the response of combined abiotic stress with biotic stress on plant growth varied depending on the type of combined stress.. For instance, a significant higher negative impact on plant growth was observed when tomato plants were cultivated under ionic stress and infected with F. oxysporum. No additional negative effect on plant growth was observed when tomato was infected with V. dahliae. Both culture-dependent and cultureindependent analyses of the root microbiota revealed that individual and combined abiotic and biotic stress alter the root microbiota structure and diversity of tomato. A significantly lower number of cultivable root endophytes was obtained from roots exposed to ionic stress. 16S rRNA amplicon analysis revealed a stronger impact on the diversity of root-associated bacteria in comparison to biotic stress. The endophytes were characterized as member of the phyla Proteobacteria, Actinobacteria and Firmicutes, and members of Bacteriodetes were only detected by culture-independent approach. A total of 683 cultivable bacterial endophytes were characterized using various in vitro and in vivo plant growth-promoting (PGP) assays. As expected, the highest number of root endophytes with tolerance to ionic stress were obtained from tomato roots exposed to ionic stress. Comparably, a high percentage of root endophytes isolated from roots exposed to osmotic were tolerant to osmotic stress showing that the environment affects the selection of microorganisms by the plant. Interestingly, endopyhtes obtained from roots exposed to abiotic stress showed no traits related to plant growth promotion. Based on in vivo and in vitro traits, five selected endophytes were able to alleviate abiotic and biotic stress on plants. These endophytes were obtained from tomato roots infected with V. dahliae. The blend of root emitted volatiles also differed between healthy and F. oxysporum infected tomato plants. The olfactometer setup results highlighted that root volatiles were involved in attraction of bacteria to the plant roots and beneficial bacteria were observed to migrate towards both, diseased and healthy plants in comparable density. It is proposed that root volatiles from healthy and pathogen infected plants not only work as signals but are also used as an energy source for the rhizosphere bacteria. Concluding, the results of this study indicate that abiotic and biotic stress altered the bacterial rootendophytes and thus affects plant performance. The treatment of plants with beneficial microorganisms reduced the negative impact of stress conditions on plant performance. However, more studies using the selected isolates must be performed in the field for drawing inferences on the efficacy of the selected bacterial isolates in ameliorating the effect of abiotic and biotic stress in plants. The extensive isolate collection will serve as a basis for conducting investigations of root-associated bacteria on plant performance. This is important for the development of new plant protection strategies.
Angepasste Pathogene besitzen eine Reihe von Virulenzmechanismen, um pflanzliche Immunantworten unterhalb eines Schwellenwerts der effektiven Resistenz zu unterdrücken. Dadurch sind sie in der Lage sich zu vermehren und Krankheiten auf einem bestimmten Wirt zu verursachen. Eine essentielle Virulenzstrategie Gram-negativer Bakterien ist die Translokation von sogenannten Typ-III Effektorproteinen (T3Es) direkt in die Wirtszelle. Dort stören diese die Immunantwort des Wirts oder fördern die Etablierung einer für das Pathogen günstigen Umgebung. Eine kritische Komponente der Pflanzenimmunität gegen eindringende Pathogene ist die schnelle transkriptionelle Umprogrammierung der angegriffenen Zelle. Viele adaptierte bakterielle Pflanzenpathogene verwenden T3Es, um die Induktion Abwehr-assoziierter Gene zu stören. Die Aufklärung von Effektor-Funktionen, sowie die Identifikation ihrer pflanzlichen Zielproteine sind für das Verständnis der bakteriellen Pathogenese essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Typ-III Effektorprotein XopS aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) funktionell charakterisiert werden. Zudem lag hier ein besonderer Fokus auf der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen XopS und seinem in Vorarbeiten identifizierten pflanzlichen Interaktionspartner WRKY40, einem transkriptionellen Regulator der Abwehr-assoziierten Genexpression. Es konnte gezeigt werden, dass XopS ein essentieller Virulenzfaktor des Phytopathogens Xcv während der präinvasiven Immunantwort ist. So zeigten xopS-defiziente Xcv Bakterien bei einer Inokulation der Blattoberfläche suszeptibler Paprika Pflanzen eine deutlich reduzierte Virulenz im Vergleich zum Xcv Wildtyp. Die Translokation von XopS durch Xcv, sowie die ektopische Expression von XopS in Arabidopsis oder N. benthamiana verhinderte das Schließen von Stomata als Reaktion auf Bakterien bzw. einem Pathogen-assoziierten Stimulus, wobei zudem gezeigt werden konnte, dass dies in einer WRKY40-abhängigen Weise geschieht. Weiter konnte gezeigt werden, dass XopS in der Lage ist, die Expression Abwehr-assoziierter Gene zu manipulieren. Dies deutet darauf hin, dass XopS sowohl in die prä-als auch in die postinvasive, apoplastische Abwehr eingreift. Phytohormon-Signalnetzwerke spielen während des Aufbaus einer effizienten pflanzlichen Immunantwort eine wichtige Rolle. Hier konnte gezeigt werden, dass XopS mit genau diesen Signalnetzwerken zu interferieren scheint. Eine ektopische Expression des Effektors in Arabidopsis führte beispielsweise zu einer signifikanten Induktion des Phytohormons Jasmonsäure (JA), während eine Infektion von suszeptiblen Paprika Pflanzen mit einem xopS-defizienten Xcv Stamm zu einer ebenfalls signifikanten Akkumulation des Salicylsäure (SA)-Gehalts führte.
So kann zu diesem Zeitpunkt vermutet werden, dass XopS die Virulenz von Xcv fördert, indem JA-abhängige Signalwege induziert werden und es gleichzeitig zur Unterdrückung SA-abhängiger Signalwege kommt. Die Virus-induzierte Genstilllegung des XopS Interaktionspartners WRKY40a in Paprika erhöhte die Toleranz der Pflanze gegenüber einer Xcv Infektion, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesem Protein um einen transkriptionellen Repressor pflanzlicher Immunantworten handelt. Die Hypothese, dass WRKY40 die Abwehr-assoziierte Genexpression reprimiert, konnte hier über verschiedene experimentelle Ansätze bekräftigt werden. So wurde beispielsweise gezeigt, dass die Expression von verschiedenen Abwehrgenen einschließlich des SA-abhängigen Gens PR1 und die des Negativregulators des JA-Signalwegs JAZ8 von WRKY40 gehemmt wird. Um bei einem Pathogenangriff die Abwehr-assoziierte Genexpression zu gewährleisten, muss WRKY40 als Negativregulator abgebaut werden. Vorarbeiten zeigten, dass WRKY40 über das 26S Proteasom abgebaut wird. In der hier vorliegenden Studie konnte weiter bestätigt, dass der T3E XopS zu einer Stabilisierung des WRKY40 Proteins führt, indem er auf bislang ungeklärte Weise dessen Abbau über das 26S Proteasom verhindert. Die Ergebnisse aus der hier vorliegenden Arbeit lassen die Vermutung zu, dass die Stabilisierung des Negativregulators der Immunantwort WRKY40 seitens XopS dazu führt, dass eine darüber vermittelte Manipulation der Abwehr-assoziierten Genexpression, sowie eine Umsteuerung phytohormoneller Wechselwirkungen die Ausbreitung von Xcv auf suszeptiblen Paprikapflanzen fördert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, weitere potentielle in planta Interaktionspartner von XopS zu identifizieren die für seine Interaktion mit WRKY40 bzw. für die Aufschlüsselung seines Wirkmechanismus relevant sein könnten. So konnte die Deubiquitinase UBP12 als weiterer pflanzlicher Interaktionspartner sowohl von XopS als auch von WRKY40 gefunden werden. Dieses Enzym ist in der Lage, die Ubiquitinierung von Substratproteinen zu modifizieren und seine Funktion könnte somit ein Bindeglied zwischen XopS und dessen Interferenz mit dem proteasomalen Abbau von WRKY40 sein. Während einer kompatiblen Xcv-Wirtsinteraktion führte die Virus-induzierte Genstilllegung von UBP12 zu einer reduzierten Resistenz der Pflanze gegenüber des Pathogens Xcv, was auf dessen positiv-regulatorische Wirkung während der Immunantwort hindeutet. Zudem zeigten Western Blot Analysen, dass das Protein WRKY40 bei einer Herunterregulierung von UBP12 akkumuliert und dass diese Akkumulation von der Anwesenheit des T3Es XopS zusätzlich verstärkt wird. Weiterführende Analysen zur biochemischen Charakterisierung der XopS/WRKY40/UBP12 Interaktion sollten in Zukunft durchgeführt werden, um den genauen Wirkmechanismus des XopS T3Es weiter aufzuschlüsseln.