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Die Qualität von Nutzpflanzen ist von zahlreichen Einflussfaktoren wie beispielsweise Lagerbedingungen und Sorteneigenschaften abhängig. Um Qualitätsmängel zu minimieren und Absatzchancen von Nutzpflanzen zu steigern sind umfangreiche Analysen hinsichtlich ihrer stofflichen Zusammensetzung notwendig. Chromatographische Techniken gekoppelt an ein Massenspektrometer und die Kernspinresonanzspektroskopie wurden dafür bislang verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Gaschromatograph an ein Flugzeitmassenspektrometer (GC-TOF-MS) gekoppelt, um physiologische Prozesse bzw. Eigenschaften (die Schwarzfleckigkeit, die Chipsbräunung, das Physiologische Alter und die Keimhemmung) von Nutzpflanzen aufzuklären. Als Pflanzenmodell wurde dafür die Kartoffelknolle verwendet. Dazu wurden neue analytische Lösungsansätze entwickelt, die eine zielgerichtete Auswertung einer Vielzahl von Proben, die Etablierung einer umfangreichen Referenzspektrenbibliothek und die sichere Archivierung aller experimentellen Daten umfassen. Das Verfahren der Probenvorbereitung wurde soweit modifiziert, dass gering konzentrierte Substanzen mittels GC-TOF-MS analysiert werden können. Dadurch wurde das durch die Probenvorbereitung limitierte Substanzspektrum erweitert. Anhand dieser Lösungsansätze wurden physiologisch relevante Stoffwechselprodukte identifiziert, welche indikativ (klassifizierend) bzw. prädiktiv (vorhersagend) für die physiologischen Prozesse sind. Für die Schwarzfleckigkeitsneigung und die Chipseignung wurde jeweils ein biochemisches Modell zur Vorhersage dieser Prozesse aufgestellt und auf eine Züchtungspopulation übertragen. Ferner wurden für die Schwarzfleckigkeit Stoffwechselprodukte des Respirationsstoffwechsels identifiziert sowie Aminosäuren, Glycerollipide und Phenylpropanoide für das Physiologische Alter als relevant erachtet. Das physiologische Altern konnte durch die Anwendung höherer Temperaturen beschleunigt werden. Durch Anwendung von Keimhemmern (Kümmelöl, Chlorpropham) wurde eine Verzögerung des physiologischen Alterns beobachtet. Die Applikation von Kümmelöl erwies sich dabei als besonders vorteilhaft. Kümmelöl behandelte Knollen wiesen im Vergleich zu unbehandelten Knollen nur Veränderungen im Aminosäure-, Zucker- und Sekundärstoffwechsel auf. Chlorpropham behandelte Knollen wiesen einen ähnlichen Stoffwechsel wie die unbehandelten Knollen auf. Für die bislang noch nicht identifizierten Stoffwechselprodukte wurden im Rahmen dieser Arbeit das Verfahren der „gezielten An-/Abreicherung“, der „gepaarten NMR/GC-TOF-MS Analyse“ und das „Entscheidungsbaumverfahren“ entwickelt. Diese ermöglichen eine Klassifizierung von GC-MS Signalen im Hinblick auf ihre chemische Funktionalität. Das Verfahren der gekoppelten NMR/GC-TOF-MS Analyse erwies sich dabei als besonders erfolgversprechend, da es eine Aufklärung bislang unbekannter gaschromatographischer Signale ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurden neue Stoffwechselprodukte in der Kartoffelknolle identifiziert, wodurch ein wertvoller Beitrag zur Analytik der Metabolomik geleistet wurde.
The past decades are characterized by various efforts to provide complete sequence information of genomes regarding various organisms. The availability of full genome data triggered the development of multiplex high-throughput assays allowing simultaneous measurement of transcripts, proteins and metabolites. With genome information and profiling technologies now in hand a highly parallel experimental biology is offering opportunities to explore and discover novel principles governing biological systems. Understanding biological complexity through modelling cellular systems represents the driving force which today allows shifting from a component-centric focus to integrative and systems level investigations. The emerging field of systems biology integrates discovery and hypothesis-driven science to provide comprehensive knowledge via computational models of biological systems. Within the context of evolving systems biology, investigations were made in large-scale computational analyses on transcript co-response data through selected prokaryotic and plant model organisms. CSB.DB - a comprehensive systems-biology database - (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/) was initiated to provide public and open access to the results of biostatistical analyses in conjunction with additional biological knowledge. The database tool CSB.DB enables potential users to infer hypothesis about functional interrelation of genes of interest and may serve as future basis for more sophisticated means of elucidating gene function. The co-response concept and the CSB.DB database tool were successfully applied to predict operons in Escherichia coli by using the chromosomal distance and transcriptional co-responses. Moreover, examples were shown which indicate that transcriptional co-response analysis allows identification of differential promoter activities under different experimental conditions. The co-response concept was successfully transferred to complex organisms with the focus on the eukaryotic plant model organism Arabidopsis thaliana. The investigations made enabled the discovery of novel genes regarding particular physiological processes and beyond, allowed annotation of gene functions which cannot be accessed by sequence homology. GMD - the Golm Metabolome Database - was initiated and implemented in CSB.DB to integrated metabolite information and metabolite profiles. This novel module will allow addressing complex biological questions towards transcriptional interrelation and extent the recent systems level quest towards phenotyping.
Cells are built from a variety of macromolecules and metabolites. Both, the proteome and the metabolome are highly dynamic and responsive to environmental cues and developmental processes. But it is not their bare numbers, but their interactions that enable life. The protein-protein (PPI) and protein-metabolite interactions (PMI) facilitate and regulate all aspects of cell biology, from metabolism to mitosis. Therefore, the study of PPIs and PMIs and their dynamics in a cell-wide context is of great scientific interest. In this dissertation, I aim to chart a map of the dynamic PPIs and PMIs across metabolic and cellular transitions. As a model system, I study the shift from the fermentative to the respiratory growth, known as the diauxic shift, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. To do so, I am applying a co-fractionation mass spectrometry (CF-MS) based method, dubbed protein metabolite interactions using size separation (PROMIS). PROMIS, as well as comparable methods, will be discussed in detail in chapter 1.
Since PROMIS was developed originally for Arabidopsis thaliana, in chapter 2, I will describe the adaptation of PROMIS to S. cerevisiae. Here, the obtained results demonstrated a wealth of protein-metabolite interactions, and experimentally validated 225 previously predicted PMIs. Applying orthogonal, targeted approaches to validate the interactions of a proteogenic dipeptide, Ser-Leu, five novel protein-interactors were found. One of those proteins, phosphoglycerate kinase, is inhibited by Ser-Leu, placing the dipeptide at the regulation of glycolysis.
In chapter 3, I am presenting PROMISed, a novel web-tool designed for the analysis of PROMIS- and other CF-MS-datasets. Starting with raw fractionation profiles, PROMISed enables data pre-processing, profile deconvolution, scores differences in fractionation profiles between experimental conditions, and ultimately charts interaction networks. PROMISed comes with a user-friendly graphic interface, and thus enables the routine analysis of CF-MS data by non-computational biologists.
Finally, in chapter 4, I applied PROMIS in combination with the isothermal shift assay to the diauxic shift in S. cerevisiae to study changes in the PPI and PMI landscape across this metabolic transition. I found a major rewiring of protein-protein-metabolite complexes, exemplified by the disassembly of the proteasome in the respiratory phase, the loss of interaction of an enzyme involved in amino acid biosynthesis and its cofactor, as well as phase and structure specific interactions between dipeptides and enzymes of central carbon metabolism.
In chapter 5, I am summarizing the presented results, and discuss a strategy to unravel the potential patterns of dipeptide accumulation and binding specificities. Lastly, I recapitulate recently postulated guidelines for CF-MS experiments, and give an outlook of protein interaction studies in the near future.