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Die Ausstattung der gastrointestinalen Mukosa des Menschen und der Ratte mit Sulfotransferasen wurde mit Hilfe von Immunodetektion und Enzymaktivitätsmessungen untersucht. In Proben aus Colon und Rektum von 39 Personen wurden die Formen h1A1, h1A3 und h1B1 identifiziert, wobei in einer weiteren Probe, die als einzige von einem an Colitis Ulcerosa erkrankten Patienten stammte, keine Sulfotransferasen nachgewiesen werden konnten. Bei der Immunblot-Analyse war das Expressionsmuster der einzelnen Formen in allen Proben ähnlich. In wenigen Proben waren die relativen Signalintensitäten der h1A1 und der h1B1 um die Hälfte erniedrigt. Der Gehalt von SULT an zytosolischem Protein zeigte einen bis zu 8 - 10fachen Unterschied, er betrug jedoch bei zwei Dritteln der Proben zwischen 0,15 und 0,3 (h1A1 und h1A3) bzw. 0,6 und 0,8 Promille (h1B1). Die Variation konnte nicht auf Alter, Geschlecht oder Krankheitsbild der Patienten zurückgeführt werden. Auch der für die allelischen Varianten der h1A1 beschriebene Effekt auf die Enzymaktiviät bzw. Stabilität konnte in der Menge an immunreaktivem Protein nicht in diesem Ausmaß detektiert werden. Die Allelhäufigkeit von h1A1*R und h1A1*H war gegenüber der gesunden Bevölkerung nicht verändert. In den sieben Proben aus dem Dünndarm (Coecum, viermal Ileum, Jejunum) konnten zusätzlich die Formen h1E1 und h2A1 identifiziert werden. Ein möglicherweise der Form h1C1 entsprechendes Protein wurde im Magen detektiert. Im Vergleich zum Menschen war die Expression in der Ratte stärker auf die Leber konzentriert. Während beim Menschen in allen untersuchten Abschnitten Sulfotransferasen in Mengen detektiert wurden, die in zwei Fällen (h1B1 und h1A3) sogar den Gehalt in der Leber überstiegen, beschränkte sich die Expression in der Ratte auf im Vergleich zur Leber geringe Mengen im Magen und Dickdarm. Nachgewiesen wurden die r1B1, r1A1 sowie eine nicht identifizierte Form von 35kD, bei der es sich vermutlich um die r1C2 handelt. Im Vergleich zur Leber enthielt der Dickdarm der Ratte 20 - 30 % an r1B1 und 3 % an r1A1, während im Dickdarm des Menschen die 3 - 5fache Menge an h1B1 und 25 - 50 % an h1A1 gefunden wurden. Die nicht identifizierte Form verhielt sich wie die r1B1. Die für die Leber der Ratte bekannte geschlechtsabhängige Expression wurde im Gastrointestinaltrakt nicht beobachtet. Die Verteilung der Sulfotransferasen im Colon und Ileum des Menschen wurde immunhistochemisch untersucht; für die Gewebe der Ratte war die Spezifität der zur Verfügung stehenden Antiseren nicht ausreichend. Im Colon traten h1B1-spezifische Färbungen in den differenzierten Enterozyten am oberen Ende der Krypten auf, im Dünndarm wurden die Epithelzellen der Zotten gefärbt. Die Färbung konzentrierte sich auf das Zytoplasma. Eine ähnliche Verteilung zeigte sich für h1A1 und h1A3, außer daß zusätzlich eine intensive Färbung der Endothelzellen der Kapillaren in der Submukosa des Ileums auftrat. Im Dickdarm war dies nur bei den Kapillaren in den Lymphfollikeln zu erkennen. Die h2A1 war lediglich im Zytoplasma der Epithelzellen der Zotten des Ileums nachzuweisen, während im Colon keine Farbreaktion auftrat. Durch die Verwendung der rekombinanten Indikatorstämme TA1538-h1A1, -h1A3 und -h1B1 und des Ausgangsstammes Salmonella typhimurium TA1538 im Ames-Test wurde gezeigt, daß verschiedene benzylische und allylische Alkohole durch im humanen Colon exprimierte Sulfotransferasen zu Mutagenen aktiviert werden. In den meisten Fällen erwies sich eine der drei Sulfotransferasen als besonders effizient in der Bioaktivierung, während durch die anderen Formen kein oder nur ein schwacher Effekt verursacht wurde. Die Bioaktivierung von Promutagenen durch Sulfotransferasen im Colon muß im Zusammenhang mit der Lokalisation diskutiert werden. Die Zellen im Darm, in denen immunhistochemisch Sulfotransferasen detektiert wurden, haben mit Ausnahme des Endothels je nach Abschnitt eine Lebensdauer von maximal fünf Tagen und machen keine weiteren Zellteilungen mehr durch. Daher sind DNA-Schäden in diesen Zellen ein sehr geringes Risiko für den Organismus. Soweit die reaktiven Metabolite in diesen Zellen gefangen bleiben, kann die Bioaktivierung in diesen Zellen und die Bildung von Addukten als protektiv betrachten werden, da letztere nach wenigen Tagen mit den toten Zellen in das Darmlumen abgegeben werden. Für den Vergleich der Bioaktiverung von Promutagenen durch die Form 1B1 des Menschen und der Ratte wurden aus V79 Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters abgeleitete Zellinien hergestellt, die je eine der beiden Formen stabil exprimieren. Damit standen 1B1-profiziente Indikatorzellen für den HPRT-Genmutationstest zur Verfügung, und die 1B1-abhängige Bioaktivierung konnte in einem System untersucht werden, die dem eukaryontischen Organismus näher steht als die für die Ames-Tests verwendeten Bakterien. So war z.B. die Sulfotransferase wie im Gewebe im Zytoplasma lokalisiert. Als Modellsubstanzen wurden hierbei die bereits in TA1538-h1B1 mutagen wirkenden benzylischen Alkohole 6-Hydroxymethylbenzo[a]pyren und 4-Hydroxycyclopenta-[def]chrysen getestet. Da die Sensitivität einer Sulfotransferase-exprimierenden V79-Zellinie sowohl durch die Menge an Sulfotransferase als auch durch die Verfügbarkeit des Sulfodonors limitiert sein könnte, wurden die Mutagenitätsexperimente mit V79-r1B1-Zellinien durchgeführt, die sich in ihrer Enzymaktivität um das Zwanzigfache unterschieden: V79-r1B1/A und -/B. Eine starke Erhöhung der Mutantenfrequenz wurde nur in der hoch exprimierenden Zellinie V79-r1B1/A (1019 ± 224 pmol/mg/min) beobachtet, so daß eine gravierende Beeinträchtigung der Sensitivität durch einen Mangel an Kosubstrat ausgeschlossen wurde. In der niedriger exprimierenden Zellinie V79-r1B1/B (57 ± 9 pmol/mg/min) war nur mit 6-Hydroxymethylbenzo[a]pyren ein schwacher Anstieg der Mutantenfrequenz zu erkennen, der mit 0,3 µM bei einer in etwa 100fach höheren Konzentration begann als bei V79-r1B1/A. Die zytosolische Fraktion aus V79-r1B1/B-Zellen enthielt in etwa die dreifache Menge an r1B1-Protein wie die aus Colonmucosa der Ratte. Da zumindest für die humane Mukosa gezeigt wurde, daß die 1B1 nur im einschichtigen Epithel, nicht aber in allen Zellen der Mukosa exprimiert wird, repräsentiert die zytosolische Fraktion aus der Mukosa nur bedingt die Expression in den Epithelzellen und der Vergleich mit den V79-1B1-Zellen ist grob. Im Gegensatz zu V79-r1B1/B war die Zellinie V79-h1B1, die ebenfalls nur mit Darm und Leber vergleichbare Mengen an h1B1 exprimierte, in der Lage, beide benzylischen Alkohole zu aktivieren. Der Erhöhung der Mutantenfrequenz im Vergleich zur KontrollZellinie war ähnlich wie bei der stark exprimierenden Zellinie V79-r1B1/A, erforderte aber 10fach höhere Konzentrationen. Somit unterscheiden sich Mensch und Ratte nicht nur insgesamt in ihrer Ausstattung des Gastrointestinaltrakts mit Sulfotransferasen, auch bei Betrachtung einer einzelnen Form zeigten sich deutliche Unterschiede in der Aktivierung von zwei Promutagenen. Die Ratte ist daher ein ungeeignetes Modell, um die Rolle von Sulfotransferasen bei tumorinitiierenden Prozessen im Darm zu untersuchen. Dies unterstreicht die Bedeutung von rekombinanten in-vitro-Systemen für die Erfassung des humanen Metabolismus von Fremdstoffen. Insgesamt kennt man nur eine geringe Anzahl von Substanzen, die im Tierexperiment Colontumore erzeugen, und mit Ausnahme der heterozyklischen aromatischen Amine sind diese lediglich von experimenteller Bedeutung. Dies spricht für effiziente Schutzmechanismen der Darmmukosa gegenüber Mutagenen und läßt die Frage nach der hohen Inzidenz des Kolorektalkarzinoms offen.
Bildung, Verteilung und DNA-Bindung des reaktiven Sulfatesters 1-Sulfooxymethylpyren in der Ratte
(2001)
In der randomisierten, multizentrischen DASH-Studie (Dietary Approaches to Stop Hy-pertension), die unter kontrollierten Bedingungen stattfand, führte eine fettreduzierte Mischkost, reich an Obst, Gemüse und Milchprodukten, bei Borderline-Hypertonikern zu einer signifikanten Blutdrucksenkung. Während der Studienphase wurden Körpermasse, Natrium-Aufnahme sowie Alkoholzufuhr aufgrund der bekannten Einflussnahme auf den Blutdruck konstant gehalten. In der eigenen Pilot-Studie sollte untersucht werden, ob das Ergebnis der DASH-Studie (i) mit deutschen Hypertonikern und (ii) unter habituellen Ernährungs- und Lebensbedingungen mit regelmäßig durchgeführter Ernährungsberatung und ad libitum Verzehr anstelle des streng kontrollierten Studienansatzes bestätigt werden kann. Eine Konstanz der Körpermasse, der Natrium-Urinausscheidung (unter diesem Studienansatz valider als die Aufnahme) und des Alkoholkonsums wurde vorausgesetzt. Die Studienpopulation setzte sich aus 53 übergewichtigen Probanden mit einer nicht medikamentös therapierten Borderline-Hypertonie und ohne Stoffwechselerkrankungen zusammen. Die Studienteilnehmer wurden randomisiert entweder der Idealgruppe mit einer fettarmen Kost reich an Milchprodukten, Obst und Gemüse (ähnlich der DASH-Idealgruppe) oder der Kontrollgruppe mit habitueller Ernährungsweise zugeteilt. Über einen Zeitraum von fünf Wochen wurde den Probanden etwa 50% ihres täglichen Lebensmittelbedarfes entsprechend ihrer Gruppenzugehörigkeit kostenfrei zur Verfügung gestellt. Gelegenheitsblutdruckmessungen und 24h-Blutdruckmessungen, Ernährungs- und Aktivitätsprotokolle, Blut- und Urinproben sowie anthropometrische Messungen wurden vor, während und fünf Wochen nach der Interventionsphase durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass in der Idealgruppe keine signifikante Blutdrucksenkung beobachtet werden konnte. Dies lässt sich durch die Tatsache erklären, dass die Lebens-mittel- und Nährstoffaufnahme der deutschen Kontrollgruppe eher der amerikanischen Idealgruppe entsprach. In der Pilot-Studie waren die Unterschiede in der Nährstoffzufuhr zwischen den beiden Gruppen viel geringer als in der DASH-Studie; für eine blutdrucksenkende Ernährungsumstellung bestand somit nur ein geringer Spielraum. Eine weitere Erklärung besteht in der unterschiedlichen Zusammensetzung der Studienpopulation. Bei DASH wurden vorwiegend farbige Probanden (40% höhere Hypertonieprävalenz) untersucht. Die Studienergebnisse lassen also den Schluss zu, dass Ernährungs- und Lebensstilgewohnheiten sowie der genetische Hintergrund der entsprechenden Bevölkerungsgruppe bei der Formulierung von nährstoff- oder lebensmittelbezogenen Empfehlungen zur Senkung des Bluthochdruckes Berücksichtigung finden müssen.
Mercaptursäure und Nukleosidaddukt im Harn als Biomarker in 1-Hydroxymethylpyren-exponierten Ratten
(2002)
1-Methylpyren (MP) ist hepatokanzerogen in neugeborenen männlichen Mäusen. Durch Hydroxylierung an der benzylischen Stelle und anschließende Sulfonierung wird MP zu DNA-reaktivem 1-Sulfooxymethylpyren (SMP) aktiviert. In der Ratte führt die Exposition des benzylischen Alkohols, 1-Hydroxymethylpyren (HMP), zur DNA-Adduktbildung in verschiedenen Geweben. Eventuelle Konsequenz der Toxifizierung ist die Ausscheidung entsprechender Mercaptursäure und Nukleosidaddukt im Harn, welche aufgrund ihrer Herkunft als Biomarker eignen könnten. In dieser Arbeit wird die Ausscheidung der Mercaptursäure und des N2-Desoxyguanosinadduktes in HMP-exponierten Ratten untersucht. Nach der Applikation von HMP bzw. MP wurden weniger als 1 % der Dosis als MPMA über Urin und Faeces ausgeschieden (0 - 48 h). Die Ausscheidung erfolgt hauptsächlich in den ersten 24 h nach der Applikation. MPdG konnte weder in Urin noch in Faeces der HMP-behandelten Tieren identifiziert werden. Nach direkter SMP-Applikation wurde MPdG nur in sehr geringe Menge (weniger als 0,9 ppm in 12 h) im Urin gefunden. Aufgrund der geringen Menge eignet sich MPdG nicht als Biomarker. MPMA dagegen, lässt sich analytisch gut erfassen. Es sollte daher untersucht werden, ob MPMA die Toxifizierung des HMP wiederspiegelt. Die Voraussetzung dafür ist die Kenntnisse über das Metabolismusmuster von HMP. Es wurde daher umfassende Untersuchungen zum Metabolismus des HMP durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass mehr als 80 % der Metaboiten in ihrer oxidierten Form (PCS, deren Glucuronsäure-Konjugate sowie phenolische Sulfatester der PCS) ausgeschieden wurden. Demnach spielt die Oxidation des HMP zu PCS eine sehr wichtige Rolle bei der Detoxifizierung und Ausscheidung von HMP. Ferne konnte nachgewiesen werden, dass die Enzyme Alkohol- und Aldehyd-Dehydrogenase an der Oxidation von HMP beteiligt waren. Die Inhibitoren Disulfiram und Ethanol der o. g. Enzyme wurde daher zur Modulation der Detoxifizierung in vivo eingesetzt. Die Veränderungen in der Toxifizierung von HMP zu SMP wurden durch die SMP-Konzentration im Plasma, die DNA-Addukthäufigkeit und die MPMA-Ausscheidung erfasst. Die Vorbehandlung von Disulfiram und Ethanol führte zu tendentielle Erhöhung der SMP-Konzentration im Plasma, DNA-Addukthäufigkeit in der Leber und die MPMA-Ausscheidung. Bemerkenswert ist jedoch, dass bereits eine Dosis von 0,2 g Ethanol/kg Körpermasse bereits zu statistisch signifikanten Erhöhungen der MPMA-Ausscheidung bei weiblichen Ratten.
Am Beispiel der Wiederkäuer wurde unter Zuhilfenahme von biochemischen und molekularbiologischen Methoden die Adaptation von Pflanzenfressern (Herbivoren) an pflanzliche Sekundärmetabolite wie z.B. Tannine untersucht. Tannine können in nicht an ihren Verzehr adaptierten Spezies durch ihr Proteinbindungsvermögen die Nahrungsverwertung und damit Wachstum und Gesundheit des Pflanzenfressers beeinträchtigen (antinutritive Wirkung). Einige Wiederkäuerarten wie z.B. das Reh (Capreolus capreolus) haben in ihrem Nahrungsspektrum viele stark tanninhaltige Pflanzen, leiden aber nicht unter den erwähnten postdigestiven Konsequenzen. Eine Möglichkeit, die antinutritive Wirkung von Tanninen zu neutralisieren, besteht in der Produktion tanninbindender Speichelproteine. Der Speichel verschiedener Wiederkäuerarten wurde auf das Vorhandensein tanninbindender Proteine untersucht. Diese Arten wurden so ausgewählt, dass alle drei Ernährungstypen (Konzentratselektierer, Intermediärtyp, Gras- und Rauhfutterfresser) in den Vergleich eingeschlossen werden konnten. Als Referenzspezies wurde der Konzentratselektierer Reh herangezogen. Die Speichelproteine des Rehs und die der Intermediärtypen (Rentier, Rangifer tarandus; Damhirsch, Cervus dama; Moschusochse, Ovibos moschatus) banden ungefähr doppelt so effektiv an hydrolysierbare Tannine (Tanninsäure), wie die der untersuchten Gras- und Rauhfutterfresser (Rind, Bos taurus; und Mufflon, Ovis orientalis musimon). Diese Abstufung zeigte sich auch bei der Untersuchung der Bindung an kondensierte Tannine (Quebracho). Eine Ausnahme stellte Mufflonspeichel dar, dieser band ebenso gut an Quebracho wie die Speichelproteine der anderen Ernährungstypen. Über eine Aminosäuretotalanalyse konnte festgestellt werden, dass der Speichel einiger untersuchter Wiederkäuerarten prolinreiche Proteine (PRPs) enthielt. Unter Ausnutzung ihrer Trichloressigsäure (TCA)-Löslichkeit wurden diese angereichert und genauer untersucht. Die Analyse der TCA-löslichen Speichelproteine der Konzentratselektierer (Reh, Elch) ergab einen relativen Prolingehalt von über 35 %, während beim Moschusochsen noch 29 % gemessen wurden. In Damhirsch- und Rinderspeichel wurden keine prolinreichen Proteine gefunden. Für die TCA-löslichen Speichelproteine des Rehs konnte eine hohe Tanninbindungskapazität nachgewiesen werden. Diese banden 24 - 30 x effektiver an Tannine als die TCA-löslichen Speichelproteine des Rindes. Die Tanninbindungskapazitäten der TCA-löslichen Speichelproteine von Moschusochse und Damhirsch waren ebenfalls höher als die des Rindes, aber niedriger als die des Rehs. Die Kohlenhydrat-Analyse der TCA-löslichen Speichelproteine des Rehs erbrachte, dass es sich bei ihnen um Glykoproteine handelt. Mittels Gelfiltration und zweidimensionaler Polyacrylamidgelektrophorese konnten fünf Proteingruppen mit Molekulargewichten zwischen 15 und 50 kd sowie isoelektrischen Punkten zwischen 4,0 und 8,2 detektiert werden. Von 15 dieser Proteine konnten die N-terminalen Aminosäuresequenzen ermittelt werden. Ausgehend von diesen Informationen wurden Reh-PRP spezifische mRNAs isoliert und partiell sequenziert. Die meisten dieser Fragmente hatten eine gemeinsame 18 Aminosäuren lange C-terminale Sequenz PPPEEQPEE/QSPDEE/DSPSE. Die Suche nach Übereinstimmungen der analysierten Sequenzen mit anderen Säugetier-PRPs in der Genbank ergab keine sinnvollen Ähnlichkeiten. Die Ergebnisse können zu Informationen über tanninbindende Proteine anderer Wiederkäuer führen. Die Sequenzinformationen stellen einen Ausgangspunkt bei der Analyse der evolutiven Zusammenhänge der Cerviden dar.
Aromatische Amine und Amide (aAA) sind aufgrund ihrer starken Verbreitung in der menschlichen Umwelt und ihres kanzerogenen Potenzials von großer toxikologischer Bedeutung. Die Kanzerogenität der aAA wird durch die Mutagenität hochreaktiver Stoffwechselprodukte vermittelt, die in zwei sequenziellen katalytischen Reaktionen entstehen. Die erste ist meistens eine N-Hydroxylierung, die oft durch Cytochrom P450 1A2 (CYP1A2) katalysiert wird. Daran schließt sich eine O-Konjugation durch Sulfotransferasen (SULT) oder N-Acetyltransferasen (NAT) an. Die Bioaktivierung ist ein kritischer Parameter für die Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tiermodellen auf den Menschen. Rekombinante in vitro Systeme, die fremdstoffmetabolisierende Enzyme verschiedener Spezies exprimieren, ermöglichen die vergleichende Untersuchung der Bioaktivierung im Menschen und in Versuchstieren. Ziel des Projektes war die Aufklärung der Bioaktivierung der aAA durch humane Enzyme. Im Vordergrund stand die Untersuchung der Rolle humaner SULT in diesem Prozess. Es wurden rekombinante in vitro Systeme, konstruiert, die CYP1A2 und SULT des Menschen koexprimieren. SULT-cDNAs wurden in den Säugerzell Expressionsvektor pMPSV kloniert und in Standardindikatorzellen für Mutagenitätsuntersuchungen (V79 Zellen aus dem Chinesischen Hamster) transfiziert. Das Expressionsniveau von CYP1A2 und SULT wurde mittels Immunblotanalyse und radiometrischen Aktivitätsmessungen charakterisiert. In den rekombinanten Zellen wurden vier aAA als Modellsubstanzen (2-Acetylaminofluoren, 2-Aminoanthracen, 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol, 2,4-Diaminotoluol) auf ihre Mutagenität am hprt-Locus hin untersucht.Die aAA waren in Zellen, die keine rekombinanten Enzyme oder lediglich CYP1A2 exprimierten, nicht mutagen. In Zellen, die CYP1A2 und SULT der Subfamilie 1A koexprimierten, erzeugten sie bereits in geringen Konzentrationen klare mutagene Effekte (0,3 µM für 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol; 0,1 µM für 2-Aminoanthracen; 10 µM für 2,4-Diaminotoluol). Die stärkste Aktivierung von 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A2 koexprimierte; die stärkste Aktivierung von 2,4-Diaminotoluol und 2-Aminoanthracen erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A1 koexprimierte. Sowohl SULT1A1 als auch SULT1A2 sind im Menschen genetisch polymorph. Ein unterschiedlich starkes Aktivierungspotenzial der Alloenzyme könnte eine individuell unterschiedliche Suszeptibilität für die durch aAA ausgelöste Kanzerogenese bedingen. In HPRT-Mutationsuntersuchungen mit rekombinanten Zellen zeigten die allelischen Varianten der SULT1A2 starke Unterschiede in ihrem Aktivierungpotenzial. Nur in der Zelllinie, die das Alloenzym SULT1A2*1 mit CYP1A2 koexprimierte, wurde 2-Acetylaminofluoren zum Mutagen aktiviert. Zur Aktivierung von 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol waren jedoch sowohl das Alloenzym SULT1A2*1 als auch das Alloenzym SULT1A2*2 in der Lage. Die Alloenzyme der SULT1A1 zeigten ein ähnlich gutes Aktivierungspotenzial für aAA. In früheren Studien wurde gezeigt, dass die SULT1C1 der Ratte eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der aAA in dieser Spezies spielt. Dahingegen war die humane SULT1C1 nicht in der Lage die untersuchten aAA zu aktivieren. Die Kenntnis solcher Spezieunterschiede könnte wichtig sein um unterschiedliche Organotropismen aAA in Menschen und Tiermodellen zu erklären, da SULT mit starker Gewebespezifität exprimiert werden und das Expressionsmuster für die einzelnen SULT-Formen in Menschen und Ratten sich stark unterscheidet.
Menschen nehmen Tausende von Stoffen als bitter wahr. Die chemische Struktur der verschiedenen Bitterstoffe ist sehr vielfältig: Sie reicht von kleinen Molekülen wie Kaliumchlorid oder Harnstoff, bis zu sehr komplexen organischen Verbindungen. Die Größe der einzigen bekannten menschlichen Familie von Bitterrezeptoren (TAS2Rs) wurde auf nur ca. 80-120 Mitglieder geschätzt. In Anbetracht der hohen Zahl und Komplexität der Bitterstoffe erscheint die Zahl von Rezeptoren als sehr gering. Dies führt natürlich zu einer Reihe von Fragen: Wie viele Mitglieder hat die menschliche TAS2R-Genfamilie? Wie viele verschiedene Substanzen können denselben Rezeptor aktivieren? Scheint die Zahl der TAS2R-Rezeptoren ausreichend, alle Bitterstoffe wahrnehmen zu können oder muss es noch andere Bitterrezeptorfamilien geben? Diese Fragen zu beantworten, ist das Ziel der vorliegenden Arbeit. Hier durchgeführte Analysen des menschlichen Genomprojektes zeigen, dass Menschen ca. 25 TAS2R-Rezeptoren besitzt, die eine sehr divergente Aminosäurestruktur aufweisen. Diese Rezeptoren wurden in eine neu entwickelte Expressionskassette kloniert, die den Transport des Rezeptors an die Zelloberfläche ermöglicht. Um Liganden für die menschliche TAS2R-Rezeptoren zu identifizieren, wurden die Rezeptoren in HEK293 Zellen exprimiert und mit verschiedenen Bitterstoffen stimuliert. Der Nachweis der Rezeptoraktivierung erfolgte durch Calcium-Imaging. Es konnte gezeigt werden, dass hTAS2R16 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Salicin und verwandten bitteren Pyranosiden ist. So wird hTAS2R16 in HEK293 Zellen durch Salicin und chemisch verwandte Substanzen aktiviert. Ein Vergleich der in diesem Messsystem erhaltenen Daten mit psychophysikalisch ermittelten Geschmackswahrnehmungen beim Menschen, ergab eine hohe Übereinstimmung. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Desensitiverung einzelner Rezeptoren die Ursache für die Adaption des Bittergeschmacks ist. Der Nachweis der Expression des Rezeptors in menschlichen Geschmackspapillen, sowie die festgestellte Assoziation des G/A Polymorpphismus an Position 665 des hTAS2R16 Gens mit einer reduzierten Salicinwahrnehmung, sind weitere unabhängige Beweise für diese These. Ein anderer menschlicher Rezeptor, hTAS2R10, wird durch die Bitterstoffe Strychnin, Brucin und Denatonium aktiviert. Dies sowie die Tatsache, dass die zur Aktivierung benutzten Konzentrationen eine sinnvolle Korrelation zu dem menschlichen Geschmacksschwellwert von Strychnin zeigen, sind starke Hinweise, dass hTAS2R10 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Strychnin und verwandten Substanzen ist. Die vorliegenden Daten zeigen eindeutig, dass die TAS2R-Rezeptoren auch beim Menschen Bitterrezeptoren darstellen. Sowohl hTAS2R16, als auch hTAS2R10 werden durch ein Spektrum strukturell sehr unterschiedlicher Bitterstoffe aktiviert. Falls die anderen Mitglieder der TAS2R-Familie ebenfalls dieses Verhalten zeigen, wäre es möglich, dass die nur ca. 25 Mitglieder umfassende TAS2R-Rezeptorfamilie des Menschen tatsächlich zur Wahrnehmung aller Bitterstoffe ausreicht.
Zur Ermittlung der Akzeptanz und ihres prädiktiven Wertes für den Verzehr von Lebensmitteln bzw. Getränken, sind Beliebtheitsprüfungen mit Konsumenten unter standardisierten Bedingungen im Sensoriklabor üblich. Die prädiktive Aussagekraft dieser Laboruntersuchungen wird jedoch durch folgende Aspekte eingeschränkt: (1) Der situative Kontext wird ausgeschaltet, d.h. die Verzehrssituation, in der ein Produkt üblicherweise konsumiert wird, ist im Labor bewusst eliminiert und das zu bewertende Produkt wird nicht in einer kompletten Mahlzeit dargeboten (2) Der Produktkontakt im Labor ist im Gegensatz zu der anhaltenden Konfrontation unter alltäglichen Bedingungen nur kurzfristig, was Langzeitaussagen bzw. Dauerpräferenzen nicht zuläßt; (3) Im Labortest ist die freie Auswahl auf eine geringe Anzahl angebotener Produkte beschränkt. In dieser Arbeit soll daher die Frage beantwortet werden, welchen prädiktiven Wert sensorische Beliebtheitsuntersuchungen im Labor für Lebensmittelakzeptanz und -verzehr unter Alltagssituationen haben. Dies wird für verschiedene Altersgruppen gezeigt, die frei in ihrer Entscheidungsfindung sind. Dazu gaben 56 Studenten (23,1±3,7 Jahre) und zwei Seniorengruppen, zum einen aus einer Begegnungsstätte (20 Probanden; 75,6±8,1 Jahre) und zum anderen aus dem betreuten Wohnen (14 Probanden; 76,1±12,5 Jahre), in einer ersten Laboruntersuchung Beliebtheitsbewertungen (Akzeptanz und Rangordnungsprüfung) zu 6 Erfrischungsgetränken ab. Anschließend folgte ein mindestens vierwöchiger Zeitraum, in denen die Probanden aus einem speziell für die Studie konzipierten Automaten Getränke in Einrichtungen der Gemeinschaftsverpflegung entnehmen konnten. Die Entnahme war via Chipkarte ad libitum möglich. Computergestützt wurden dabei individuelle Getränkewahl, Menge und Entnahmezeit aufgezeichnet. Unmittelbar nach der Automatenphase wurde eine erneute Laboruntersuchung durchgeführt. In allen Untersuchungsphasen wurden dieselben Erfrischungsgetränke aus Konzentrat, variiert in Apfel- oder Orangensaftgeschmack, ohne oder mit Zusatz von Zucker (20g/l) und Kohlensäure (4 g/l CO2), angeboten. Eine Quntitativ Deskriptive Analyse bestätigte unterschiedliche Profile bei den Produkten, so dass von sensorisch wahrnehmbaren Unterschieden zwischen den Produkten ausgegangen werden konnte. Die Probanden bekamen zu keiner Zeit Informationen über die exakte Zusammensetzung der Getränke. Sowohl in der Laborbewertung als auch nach Getränkekonsum via Automat, fanden sich unterschiede zwischen den Altersgruppen. In der Akzeptanzprüfung bewerteten Studenten die Apfelvarianten besser als die Orangenvarianten. Senioren, die insgesamt höhere Akzeptanzwerte vergaben, bewerteten alle Getränke in fast allen Attributen gleichermaßen gut. Nach der 4-wöchigen Automatenphase hatte sich die Akzeptanz der sechs Getränke nicht wesentlich geändert. Auch in beiden Rangordnungsprüfungen waren bei den Studenten „Apfel“ und „Apfel mit Kohlensäure“ auf den ersten Plätzen, „Orange mit Zuckerzusatz“ auf dem letzten Platz. Nach Adjustierung auf die individuelle Trinkmenge (in Wenig-, Mittel- Vieltrinker) und wurde „Apfel mit Kohlensäure“ in der Automatenphase von den Studenten am meisten getrunken. In der Vieltrinkergruppe wurde „Orange mit Zuckerzusatz“ deutlich vernachlässigt. Der Automatenkonsum der Studenten bestätigte damit im Wesentlichen die Ergebnisse der Beliebtheitsprüfung im Labor. Bei den Senioren waren in der Rangordnungsprüfung, die eine Lieblingsreihenfolge erzwang, alle süßeren Getränke (mit Zuckerzusatz) auf den ersten Plätzen. In der Automatenphase wurden jedoch viele Getränke ohne Zuckerzusatz bevorzugt. Dies zeigte sich sowohl in der individuellen Präferenz, als auch im Gesamtkonsum. Aufgrund der Ergebnisse kann der prädiktive Wert von Laboruntersuchungen mit Senioren in Bezug auf die Auswahl und den Konsum unter alltäglichen Bedingungen als gering beurteilt werden. Die Getränke mit der individuell höchsten Laborpräferenz wurden unter Alltagsumgebung in der Gemeinschaftsverpflegung in deutlich geringeren Umfang als erwartet verzehrt. In der Vergleichsgruppe der Studenten ist die Übereinstimmung größer(p<0,05). In Häufigkeitsfragebögen vor und nach der Automatenphase wurde das Trinkverhalten speziell von kohlensäurehaltigen Getränken erfragt. Der Anteil von kohlensäurehaltigen Getränken ist sehr variabel, und kann tagesabhängig von einem geringen bis zum Hauptanteil ausmachen. Senioren tranken von den Automatengetränken weniger kohlensäurehaltige Getränke als Studenten(p<0,001). Trotzdem zeigte nur eine Minderheit einen völligen Verzicht, wie sich durch Fragebogen und auch Automatenkonsum ermitteln ließ. Die Verwendung eines computergestützten Getränkeautomaten bietet eine neue Möglichkeit, die Langzeitpräferenz und den tatsächlichen Konsum unter gewohnten Alltagsbedingungen und bei freier Produktauswahl zu ermitteln. Selbst bei Altersgruppen, die mit Laboruntersuchungen überfordert sind, können Vorlieben untersucht werden.
Substanzen der pharmazeutischen und chemischen Industrie müssen nach internationalen Richtlinien auf deren Toxizität gegenüber Mensch und Umwelt geprüft werden. Dazu gehören u. a. Prüfungen zur Vorhersage des embryotoxischen Potentials, die am lebenden Organismus durchgeführt werden. Mit dem Ziel die Anzahl der Tierversuche zu verringern, die notwendig sind um das toxikologische Profil einer Prüfsubstanz zu bestimmen, wurde der Embryonale Stammzelltest (EST) entwickelt. Als Grundlage des EST dienen embryonale Stammzellen (ES-Zellen) einer Zelllinie. ES-Zellen sind Zellen, die sich in der frühen embryonalen Entwicklung in die Zellen der Keimblätter entwickeln können. Daraus wiederum differenzieren die vielen verschiedenen, unterschiedlich spezialisierten Zelltypen des komplexen Organismus. Im EST wird die Konzentration einer Prüfsubstanz bestimmt, bei der die Differenzierung von ES-Zellen zu Herzmuskelzellen zu 50 % inhibiert wird. Zusätzlich wird die Konzentration der Prüfsubstanz bestimm°t, bei der 50 % der ES-Zellen (IC50D3) bzw. Fibroblastenzellen (IC503T3) absterben. Die allgemeine Toxizität ist damit von der spezifischen Toxizität der Prüfsubstanz auf die ES-Zellen und deren Differenzierung unterscheidbar. Die Parameter fliessen in ein biostatistisches Modell zur Prädiktion des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanzen ein. Es wurde ein Versuchsprotokoll entwickelt, wonach die ES-Zellen sich verstärkt zu Endothelzellen differenzieren. Die Endothelzellen, die im lebenden Organismus die Wand der späteren Blutgefässe, wie Venen und Arterien bilden, wurden mittels molekularbiologischer Methoden auf der RNA- und der Protein-Ebene nachgewiesen und quantifiziert. Verschiedene Zellkulturmethoden, Wachstumsfaktoren, als auch Wachstumsfaktorkonzentrationen wurden auf deren Vermögen die Differenzierung der ES-Zellen zu Endothelzellen zu induzieren, untersucht. Nach der Etablierung des Differenzierungsprotokolls wurden sieben Substanzen auf deren Vermögen geprüft, die Differenzierung von ES-Zellen zu Endothelzellen zu inhibieren. Die Endothelzellen wurden dabei über die Expression der RNA von zwei endothelzellspezifischen Genen quantifiziert. Im Vergleich dazu wurden die IC50D3 und die IC503T3 der Prüfsubstanz bestimmt, um eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanz zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der sieben Prüfsubstanzen in nicht-, schwach- oder stark embryotoxisch vorgenommen werden konnte. Es ist zu schlussfolgern, dass der weiterentwickelte in vitro Embryotoxizitätsassay sensitiv und reproduzierbar ist. Mit der Verwendung von verschiedenen Differenzierungsendpunkten kann die Prädiktionskraft des Assays deutlich verbessert, und die Anzahl von Tierversuchen verringert werden. Durch die Verwendung von molekularbiologischen Markern kann der Assay einem Hochdurchsatzscreening zugängig gemacht werden und damit die Anzahl von Prüfsubstanzen deutlich erhöht werden.
Identifikation des mitochondrialen Proteins Frataxin als stoffwechselmodulierenden Tumorsuppressor
(2004)
Die Krebsentstehung wurde vor rund 80 Jahren auf veränderten zellulären Energiestoffwechsel zurückgeführt. Diese Hypothese konnte bisher weder experimentell bewiesen noch widerlegt werden. Durch den Einsatz zweier Modellsysteme mit unterschiedlicher Expression des mitochondrialen Proteins Frataxin konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass der mitochondriale Energiestoffwechsel einen Einfluss auf die Tumorentstehung zu besitzen scheint. Eine Reduktion des mitochondrialen Energiestoffwechsels wurde durch die hepatozytenspezifische Ausschaltung des mitochondrialen Proteins Frataxin in Mäusen erreicht. Der durch das Cre-/loxP-Rekombinasesystem erreichte organspezifische Knock-out wurde auf Transkriptions- und Translationsebene nachgewiesen. Anhand verminderter Aconitaseaktivität, geringeren Sauerstoffverbrauches und reduzierten ATP-Gehaltes im Lebergewebe wurde ein signifikant verminderter Energiestoffwechsel dargestellt. Zwar entsprach die Genotypenverteilung in den Versuchsgruppen der erwarteten Mendelschen Verteilung, dennoch war die mittlere Lebenserwartung der Knock-out-Tiere mit ca. 30 Wochen stark reduziert. Bereits in jungem Alter war bei diesen Tieren die Ausbildung von präneoplastischen Herden zu beobachten. Mit proteinbiochemischen Nachweistechniken konnte in Lebergewebe 4-8 Wochen alter Tiere eine verstärkte Aktivierung des Apoptosesignalweges (Cytochrom C im Zytosol, verstärkte Expression von Bax) sowie eine Modulation stressassoziierter Proteine (geringere Phosphorylierungsrate p38-MAPK, vermehrte Expression HSP-25, verminderte Expression HSP-70) aufgezeigt werden. Im inversen Ansatz wurde eine Steigerung des mitochondrialen Energiestoffwechsels durch stabile transgene Frataxinüberexpression in zwei Kolonkarzinomzelllinien erreicht. Diese Steigerung zeigte sich durch erhöhte Aconitaseaktivität, erhöhten Sauerstoffverbrauch, gesteigertes mitochondriales Membranpotenzial und erhöhten ATP-Gehalt in den Zellen. Die frataxinüberexprimierenden Zellen wuchsen signifikant langsamer als Kontrollzellen und zeigten im Soft-Agar-Assay und im Nacktmausmodell ein deutlich geringeres Potenzial zur Ausbildung von Kolonien bzw. Tumoren. Mittels Immunoblot war hier eine vermehrte Phosphorylierung der p38-MAPK festzustellen. Die zusammenfassende Betrachtung beider Modelle zeigt, dass ein reduzierter mitochondrialer Energiestoffwechsel durch Regulation der p38-MAPK und apoptotischer Signalwege ein erhöhtes Krebsrisiko zu verursachen vermag.
Entsprechend der sogenannten Set-point-Theorie besitzt jeder Mensch eine individuell festgelegte Körpermasse, die über große Zeiträume konstant gehalten und gegen Abweichungen verteidigt wird. Es wird angenommen, dass der Körper auf noch unbekannte Weise Änderungen in der Körpermasse per se wahrnimmt und daraufhin Mechanismen aktiviert, die zur Regenerierung der ursprünglichen Masse führen. In dieser Arbeit wurde die Hypothese getestet, dass eine künstliche Erhöhung der Körpermasse zu einer kompensatorischen Reduktion in der Körpermasse führt, um das Ausgangsgewicht wieder zu regenerieren. Die Körpermasse von männlichen und weiblichen Mäusen wurde akut durch die Implantation von Gewichten mit einer Masse von 10% der aktuellen Körpermasse in die Bauchhöhle erhöht. Bei Gültigkeit der Set-point-Theorie sollte die Körpermassereduktion der Masse des zusätzlichen Gewichtsimplantats entsprechen. Die Mäuse reagierten auf die künstlich erhöhte Körpermasse geschlechtsspezifisch. Männchen zeigten eine partielle Reduktion in der Körpermasse. Weibchen zeigten langfristig jedoch keine Änderungen in der Körpermasse. Die Reduktion der Körpermasse erfolgte bei den Männchen durch eine Abnahme in der Fettmasse. Die fettfreie Masse war in beiden Geschlechtern nicht verändert. Änderungen in der Körpermasse wurden vor allem durch Änderungen in der Energieaufnahme hervorgerufen. Ein Einfluss des Energieumsatzes auf Änderungen in der Körpermasse konnte nicht nachgewiesen werden. Die Regulation der Körpermasse entsprechend eines massespezifischen Set-points konnte partiell für die Männchen gezeigt werden. Bei den Männchen könnte daher die Wahrnehmung der Körpermasse in die Regulation der Körpermasse teilweise integriert sein. Weibchen verminderten ihre Körpermasse dagegen trotz der künstlichen Körpermasseerhöhung nicht. Das führte zur Bewahrung der Energiereserven und spricht eher für die Regulation der Körpermasse entsprechend des notwendigen Energiebedarfs im Vergleich zu Änderungen in der Körpermasse per se. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Regulation der Körpermasse geschlechtsspezifischen Mechanismen unterliegt. Dementsprechend sind auch geschlechtsspezifische Ansätze zur Therapie von Übergewicht und Adipositas notwendig.
Die Entwicklung von Dickdarmkrebs wird durch eine Reihe von Lebens- und Essgewohnheiten sowie Umweltfaktoren begünstigt. Den letzteren beiden sind Substanzen zuzurechnen, die bei der Zubereitung der Nahrung entstehen und mit ihr aufgenommen werden. Zu diesen Verbindungen gehört das 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin (PhIP) aus der Substanzklasse der heterozyklischen aromatischen Amine. Es entsteht bei der Erhitzung zahlreicher proteinhaltiger Nahrungsmittel und die Zielorgane in Nagerstudien stimmen mit der Häufung von Krebsinzidenzen in westlichen Industrienationen überein. Dieser Zusammenhang konnte jedoch bis heute nicht endgültig bewiesen werden. Fütterungsversuche mit Ratten wurden mit Konzentrationen der Substanz durchgeführt, die weit über der menschlichen Exposition liegen. Durch das Verfüttern einer humanrelevanten Dosis PhIP sollte geklärt werden, ob auch geringe Konzentrationen dickdarmkrebstypische Mutationen, präneoplastische Läsionen oder Tumore induzierten. Die mit humanrelevanten Dosen gefütterten Tiere wiesen weniger Läsionen als die Hoch-Dosis-PhIP-Gruppe auf, in der allerdings keinerlei maligne Tumoren des Dickdarms auftraten. Hinweise auf dickdarmkrebstypische Mutationen fanden sich ebenfalls in beiden Gruppen, wobei hier keine Dosisabhängigkeit beobachtet werden konnte. Die Sequenzierung ergab ein deutlich von Literaturdaten abweichendes Spektrum. In Bezug auf das verwendete Tiermodell wurden erhebliche Abweichungen in der Empfindlichkeit der Tiere gegenüber der Substanz im Vergleich zu ähnlichen Studien festgestellt. Beide Fütterungsgruppen zeigten deutlich weniger Läsionen; als mögliche Gründe wurden Unterschiede in der Futterzusammensetzung und –zubereitung sowie in der Tierhaltung und –herkunft ausgemacht. Es konnte erstmalig ein Zusammenhang zwischen PhIP in niedrigen Dosen in der Nahrung und der Induktion von Entzündungen gezeigt werden. Diese waren sowohl makroskopisch als auch histologisch sichtbar, der genaue Mechanismus ihrer Entstehung ist jedoch unbekannt. Die zusammenfassende Betrachtung aller Ergebnisse lässt vermuten, dass PhIP allein über lange Zeiträume aber in geringen Dosen verabreicht nicht für die hohe Zahl an Krebserkrankungen in westlichen Industrienationen ursächlich ist.
Das 1817 erstmals schriftlich erwähnte Selen galt lange Zeit nur als toxisch und sogar als procancerogen, bis es 1957 von Schwarz und Foltz als essentielles Spurenelement erkannt wurde, dessen biologische Funktionen in Säugern durch Selenoproteine vermittelt werden. Die Familie der Glutathionperoxidasen nimmt hierbei eine wichtige Stellung ein. Für diese sind konkrete Funktionen und die dazugehörigen molekularen Mechanismen, welche über die von ihnen katalysierte Hydroperoxidreduktion und damit verbundene antioxidative Kapazität hinausgehen, bislang nur unzureichend beschrieben worden. Die Funktion der gastrointestinalen Glutathionperoxidase (GI-GPx) wird als Barriere gegen eine Hydroperoxidabsorption im Gastrointestinaltrakt definiert. Neuen Erkenntnissen zufolge wird die GI-GPx aber auch in verschiedenen Tumoren verstärkt exprimiert, was weitere, bis dato unbekannte, Funktionen dieses Enzymes wahrscheinlich macht. Um mögliche neue Funktionen der GI-GPx, vor allem während der Cancerogenese, abzuleiten, wurde hier die transkriptionale Regulation der GI-GPx detaillierter untersucht. Die Sequenzanalyse des humanen GI-GPx-Promotors ergab das Vorhandensein von zwei möglichen "antioxidant response elements" (ARE), bei welchen es sich um Erkennungssequenzen des Transkriptionsfaktors Nrf2 handelt. Die meisten der bekannten Nrf2-Zielgene gehören in die Gruppe der Phase-II-Enzyme und verfügen über antioxidative und/oder detoxifizierende Eigenschaften. Sowohl auf Promotorebene als auch auf mRNA- und Proteinebene konnte die Expression der GI-GPx durch typische, in der Nahrung enthaltene, Nrf2-Aktivatoren wie z.B. Sulforaphan oder Curcumin induziert werden. Eine direkte Beteiligung von Nrf2 wurde durch Cotransfektion von Nrf2 selbst bzw. von Keap1, das Nrf2 im Cytoplasma festhält, demonstriert. Somit konnte die GI-GPx eindeutig als Nrf2-Zielgen identifiziert werden. Ob sich die GI-GPx in die Gruppe der antiinflammatorischen und anticancerogenen Phase-II-Enzyme einordnen lässt, bleibt noch zu untersuchen. Die Phospholipidhydroperoxid Glutathionperoxidase (PHGPx) nimmt aufgrund ihres breiten Substratspektrums, ihrer hohen Lipophilie und ihrer Fähigkeit, Thiole zu modifizieren, eine Sonderstellung innerhalb der Familie der Glutathionperoxidasen ein. Mit Hilfe eines PHGPx-überexprimierenden Zellmodells wurden deshalb Beeinflussungen des zellulären Redoxstatus und daraus resultierende Veränderungen in der Aktivität redoxsensitiver Transkriptionsfaktorsysteme und in der Expression atheroskleroserelevanter Adhäsionsmoleküle untersucht. Als Transkriptionsfaktoren wurden NF-kB und Nrf2 ausgewählt. Die Bindung von NF-kB an sein entsprechendes responsives Element in der DNA erfordert das Vorhandensein freier Thiole, wohingegen Nrf2 durch Thiolmodifikation von Keap1 freigesetzt wird und in den Kern transloziert. Eine erhöhte Aktivität der PHGPx resultierte in einer Erhöhung des Verhältnisses von GSH zu GSSG, andererseits aber in einer verminderten Markierbarkeit freier Proteinthiole. PHGPx-Überexpression reduzierte die IL-1-induzierte NF-kB-Aktivität, die sich in einer verminderten NF-kB-DNA-Bindefähigkeit und Transaktivierungsaktivität ausdrückte. Auch war die Proliferationsrate der Zellen vermindert. Die Expression des NF-kB-regulierten vaskulären Zelladhäsionsmoleküls, VCAM-1, war ebenfalls deutlich verringert. Umgekehrt war in PHGPx-überexprimierenden Zellen eine erhöhte Nrf2-Aktivität und Expression der Nrf2-abhängigen Hämoxygenase-1 zu verzeichnen. Letzte kann für die meisten der beobachteten Effekte verantwortlich gemacht werden. Die hier dargestellten Ergebnisse verdeutlichen, dass eine Modifizierung von Proteinthiolen als wichtige Determinante für die Regulation der Expression und Funktion von Glutathionperoxidasen angesehen werden kann. Entgegen früheren Vermutungen, welche oxidative Vorgänge generell mit pathologischen Veränderungen assoziierten, scheint ein moderater oxidativer Stress, bedingt durch eine transiente Thiolmodifikation, durchaus günstige Auswirkungen zu haben, da, wie hier dargelegt, verschiedene, miteinander interagierende, cytoprotektive Mechanismen ausgelöst werden. Hieran wird deutlich, dass sich "antioxidative Wirkung" oder "oxidativer Stress" keineswegs nur auf "gute" oder "schlechte" Vorgänge beschränken lassen, sondern im Zusammenhang mit den beeinflussten (patho)physiologischen Prozessen und dem Ausmaß der "Störung" des physiologischen Redoxgleichgewichtes betrachtet werden müssen.
In einer Zeit, in der eine Zunahme von ernährungsbedingten Erkrankungen in steigendem Maße zu beobachten ist, wird dem Getreide als Grundlage der menschlichen Ernährung erhöhte Aufmerksamkeit gewidmet. Ein hoher Verzehr von Ballaststoffen ist ein wesentlicher Aspekt in der präventiv-medizinischen Ernährung. Die von der Deutschen Gesellschaft für Ernährung vorgeschlagene tägliche Ballaststoffzufuhr liegt bei 30 g. Die Aufnahme von Ballaststoffen ist jedoch in Deutschland deutlich unterhalb dieser empfohlenen Menge. Getreideprodukte, besonders vom Vollkorntyp, sind die wichtigste Quelle für Ballaststoffe. Deshalb sollten im Rahmen dieser Arbeit direkt verzehrsfähige, Ballaststoff-angereicherte Haferprodukte (vorwiegend Extrudate) mit hohen Gehalten an b-Glucanen und resistenter Stärke hergestellt, analysiert und nachfolgend auf relevante ernährungsphysiologische Wirkungen geprüft werden. Als Basis für die Produkte wurden Hafermehl und Haferkleie eingesetzt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Analyse der Haferprodukte. Diese wiesen eine hohe Wasserbindungskapazität auf. Bei den Untersuchungen am Tiermodell wurde gezeigt, dass im Dünndarm eine größere Menge an Wasser durch die Haferprodukte gebunden wurde, was zu einem höheren Feuchtigkeitsanteil der gastrointestinalen Inhalte der Tiere führte, die ballaststoffreiches Futter erhielten. Trotz der hydrothermischen Behandlung während der Extrusion wurden Produkte gewonnen, deren β-Glucane im hochmolekularen Zustand erhalten blieben und somit eine hohe Viskosität in wässrigen Lösungen beibehielten. In rheologischen Untersuchungen wurde bestätigt, dass die aus Haferprodukten isolierten β-Glucane ein pseudoplastisches Fließverhalten besitzen. Demgegenüber führte ein Autoklavieren der Produkte zu einer starken Depolymerisation der b-Glucane, was sich in einer Änderung der funktionellen Eigenschaften der b-Glucane widerspiegelte. Im Mittelpunkt der Untersuchungen standen ernährungsphysiologische In-vitro- und In-vivo-Experimente mit Extrudaten und Proben auf der Basis von Hafer, die einen erhöhten Anteil an Ballaststoffen, speziell an b-Glucan und an resistenter Stärke, besaßen und die direkt verzehrbar sind. Diese Haferprodukte zeigten eine Reihe von ernährungsphysiologisch vorteilhaften und protektiven Wirkungen in In-vitro-Experimenten. So traten sie mit Gallensäuren unter den Bedingungen des Dünndarms in Wechselwirkung und waren gut mit Faecesflora vom Menschen fermentierbar. Die In-vitro-Verdauung von Maisstärke durch Pankreatin, wurde durch die ballaststoffreichen Haferprodukte partiell gehemmt. Dieser Befund lässt eine Abschwächung des postprandialen Glukoseanstieges erwarten. In einem sechswöchigen Fütterungsversuch erhielten Ratten Diäten, die zu 50 % aus ballaststoffreichen Haferprodukten bestanden. Diese Haferprodukte bewirkten einen erhöhten Transport von Gallensäuren und neutralen Sterolen in den unteren Intestinaltrakt sowie deren verstärkte Ausscheidung. Durch den Verzehr der ballaststoffreichen Haferprodukte kam es zu Veränderungen in der Mikroflora, wobei sich besonders die coliformen Keime verminderten und die Keimzahlen der Lactobacillen sowie die Bifidobakterien erhöhten. Die Fermentation der Ballaststoffe führte zur erhöhten Bildung von kurzkettigen Fettsäuren einschließlich von Butyrat. Die Bildung der kurzkettigen Fettsäuren geht mit einer pH-Wert-Absenkung im Caecum und Colon einher, die wiederum für eine geringere Bildung von sekundären Gallensäuren verantwortlich ist. Die Ergebnisse des Fütterungsversuchs an Ratten wurden prinzipiell durch eine vierwöchige Pilotstudie am Menschen, in der Probanden täglich 100 g Haferextrudat erhielten, bestätigt. Das Extrudat wurde von den Probanden gut akzeptiert. In der 4. Woche wurden eine geringe Abnahme der Cholesterolfraktionen im Serum, höhere Keimzahlen für Lactobacillen, Bifidobacterien und Bacteroides, geringere pH-Werte und Trockenmassegehalte in den Faeces, eine Zunahme der individuellen und Gesamt-SCFA sowie des Butyratanteils in den Faeces, eine erhöhte Ausscheidung an Steroiden, eine Zunahme der primären Gallensäuren und eine Abnahme des prozentualen Anteils an sekundären Gallensäuren sowie der Cholesterol-Metaboliten gefunden. Diese Parameter gingen 2 Wochen nach Beendigung der Intervention mit dem Haferextrudat wieder in Richtung der Ausgangswerte (0. Woche) zurück. Die untersuchten Haferprodukte erwiesen sich als gut fermentierbare Substrate für die intestinale Mikroflora und können deshalb als ein Präbiotikum mit Ballaststoffcharakter eingeschätzt werden. Diese Produkte, die mit einem erhöhten Anteil an resistenter Stärke und wertvollen Haferballaststoffen hergestellt wurden, können dazu beitragen, die Ballaststofflücke in unserer Ernährung zu schließen und positive ernährungsphysiologische Effekte zu bewirken.
Als Resultat überhöhter Energieaufnahme und zu geringen Energieverbrauchs beobachten wir eine über das normale Maß hinausgehende Akkumulation von Fettgewebe, die sich als Adipositas manifestiert. Sie gilt als einer der Hauptrisikofaktoren für Krankheiten des metabolischen Syndroms. Im Rahmen von Prävention, Diagnose und Therapie der Adipositas, muss ihr wesentliches Charakteristikum; der individuelle Körperfettanteil; einer Messung zugänglich gemacht werden. Eine direkte Bestimmung der Körperzusammensetzung erlauben die Neutronenaktivierungsanalyse und die chemische Analyse. Beide Verfahren sind sehr genau, aber aufwendig und kostenintensiv und darüber hinaus die chemische Analyse nur am menschlichen Cadaver praktizierbar. Um dennoch die Körperzusammensetzung hinreichend genau bestimmen zu können, wurden zahlreiche indirekte Messverfahren entwickelt. Man kann sie in Labor- und Feldmethoden untergliedern. Die Labormethoden bestechen durch hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, sind aber zumeist aufwendig und teuer. Feldmethoden sind im Gegensatz dazu leicht anwendbar, transportabel und preiswert, weisen aber eine weniger hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit auf. In der vorgestellten Arbeit wird über eine jüngere Entwicklung, die das Prinzip der unterschiedlichen Leitfähigkeit für den elektrischen Strom durch die verschiedenen Gewebe des Körpers nutzt, berichtet. Der Prototyp eines Gerätes wurde innerhalb eines von der EU geförderten multizentrischen Projekts entwickelt und auf seine Einsatzfähigkeit und Qualität hin geprüft. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt auf der Einschätzung der Körperzusammensetzung normal- und übergewichtiger Probanden mit der neu entwickelten Technik. Das vorliegende Studiendesign diente nicht nur der Beurteilung der neuen Technik die Körperzusammensetzung und Veränderungen dieser zu erfassen, sondern darüber hinaus, etablierte Methoden hinsichtlich ihrer Genauigkeit zu bewerten. Bezüglich ihrer Anwendbarkeit und Reproduzierbarkeit hat die neue Methode Hoffnung geweckt, sich als eine Feldmethode zu etablieren. Auf der anderen Seite zeigte sich in Abhängigkeit der Gesamtkörperfettmasse eine Überschätzung der Zielgröße im Vergleich zur Referenzmethode (dual energy x ray absorptiometry (DXA)). Die Abweichungen waren dabei gerade für das einzelne Individuum sehr groß. Technische Verbesserungen und die Entwicklung spezifischer Regressionsgleichungen könnten in Zukunft zu einer wesentlichen Verbesserung der neuen Methode beitragen. Die Labormethode "Air Displacement Plethysmography" konnte durch die guten Übereinstimmungen der Ergebnisse mit denen der Referenzmethode DXA und die einfache Anwendung überzeugen. Sie stellt eine durchaus konkurrenzfähige Alternative zur Hydrodensitometrie dar, die noch heute als "goldener Standard" zur Erfassung der Körperzusammensetzung akzeptiert wird. Im Verlauf der durchgeführten Studie stellte sich heraus, dass die Hydrodensitometrie sehr hohe Anforderungen an den Probanden stellt. Das Untertauchen des gesamten Körpers unter Wasser in Kombination mit einer maximalen Ausatmung erwies sich als sehr problematisch. Die dabei auftretenden Fehler schlugen sich in der Berechnung der Gesamtkörperfettmasse des einzelnen Individuums wieder und führten zu zum Teil erheblichen Abweichungen der Ergebnisse von denen der Referenzmethode. Die Feldmethoden bioelektrische Impedanzanalyse und Hautfaltendickenmessung erwiesen sich als kostengünstige und leicht anwendbare Methoden. Die Ergebnisse beider Methoden stimmten im Mittel gut mit den Ergebnissen der Referenzmethoden überein. Dennoch zeigte die BIA größere Abstriche in der Beurteilung der Gesamtkörperfettmasse des einzelnen Individuums und bei der Dokumentation von Veränderungen der Gesamtkörperfettmasse. Die Hautfaltendickenmessung stellt – wendet man sie korrekt an – eine Methode dar, die sowohl die Gesamtkörperfettmasse als auch Veränderungen dieser gut erfassen kann. In Abhängigkeit der geforderten Genauigkeit kann diese Methode für die Erfassung der Körperzusammensetzung empfohlen werden. Demnach bleibt die Frage unbeantwortet, inwieweit die indirekten Methoden in der Lage sind, die "wahre" Körperzusammensetzung adäquat zu erfassen. Jede neu entwickelte Methode – die möglichst viele Vorteile in sich vereint – wird wieder vor dem Problem stehen: eine geeignete und dabei praktikable Referenzmethode zu finden, die die wahre Körperzusammensetzung zu bestimmen in der Lage ist. Daher sollte neben dem Streben nach der Entwicklung einer Methode, die genau und leicht anwendbar ist, das Hauptaugenmerk auf die Überarbeitung der zugrunde liegenden Modellvorstellungen und die Verbesserung von Regressionsgleichungen gelegt werden.
Homocystein (tHcy) gilt als unabhängiger kardiovaskulärer Risikofaktor und korreliert eng mit einer endothelialen Dysfunktion, welche nichtinvasiv mittels der flussinduzierten Vasodilatation (FMD) messbar ist. Experimentelle Hyperhomocysteinämie ist mit einer reduzierten Bioverfügbarkeit von endothelialen Stickstoffmonoxid (NO) bei gleichzeitig erhöhten Spiegeln des kompetetiven Inhibitors der NO-Biosynthese asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) assoziiert. In-vivo senkt eine Östrogenbehandlung neben tHcy auch die ADMA-Spiegel und verbessert signifikant die Endothelfunktion. Hinsichtlich ihrer Wirkung als selektive Östrogenrezeptormodulatoren wird angenommen, dass Phytoöstrogene, speziell Sojaisoflavone, ähnliche Effekte hervorrufen. Innerhalb einer europäischen, multizentrischen, doppelblinden Interventionsstudie an 89 gesunden, postmenopausalen Frauen wurde der Einfluss von Sojaisoflavonen auf den Homocysteinmetabolismus, den Blutdruck und die in-vivo Endothelfunktion untersucht. Die cross-over Studie umfasste zwei achtwöchige Interventionsperioden, die von einer gleichlangen Wash-out-Phase unterbrochen waren. Die Zuteilung zum Isoflavon- (50 mg/d) oder Plazeboregime für die erste Interventionsphase erfolgte randomisiert. Endpunkterhebungen fanden jeweils in den Wochen 0 und 8 der Interventionsperioden statt. Die renale Ausscheidung von Genistein, Daidzein und Equol war während der Isoflavonintervention signifikant erhöht (P>0,001). Die Phyoöstrogene hatten weder einen Effekt auf die tHcy-Konzentration (P=0,286), noch auf ADMA, Erythrozytenfolat und Vitamin B-12 (P>0,05) im Plasma. Während die Summe aus Nitrat und Nitrit (NOx), welche die NO-Bioverfügbarkeit reflektiert, im Verlaufe der Plazebobehandlung abfiel, wurde ein leichter Anstieg bei der Isoflavonsupplementation beobachtet (Delta Wo8-Wo0: -2,60 [-8,75; 2,25] vs. 1,00 [-6,65; 7,85] µmol/L P<0,001), was zu einem signifikanten Behandlungseffekt führte. Weiterhin wurde eine positive Korrelation zwischen ADMA und Vitamin B-12 gefunden (R=0,252; P=0,018). Die flussinduzierte Vasodilatation (P=0,716), ein Maß für die Endothelfunktion, blieb durch die Isoflavonbehandlung unbeeinflusst, obwohl sich diese über die Zeit insgesamt verbesserte (P>0,001). Bis auf einen marginalen Anstieg des systolischen Wertes (P=0,032) im Vergleich zur Plazebobehandlung blieb der Blutdruck während der Isoflavonintervention unverändert. Im Gegensatz zu Östrogen übten Sojaisoflavone weder einen Einfluss auf die in-vivo Endothelfunktion noch auf die traditionellen und neuen kardiovaskulären Risikofaktoren den Blutdruck, tHcy und ADMA aus. Demzufolge ist der gesundheitliche Nutzen isolierter Isoflavone hinsichtlich einer Prävention hormonmangelbedingter Erkrankungen in gesunden postmenopausalen Frauen fraglich.
Das proinflammatorische Zytokin Interleukin-1 (IL-1) spielt eine zentrale Rolle bei Entzündungen und Infektionen. Die zellulären Antworten von IL-1 werden über den IL-1-Rezeptor Typ I (IL-1RI) vermittelt. Adapterproteine und die IL-1RI-assoziierte Kinase IRAK werden nach Ligandenbindung an den Rezeptor rekrutiert. Nach ihrer Phosphorylierung dissoziiert die IRAK vom IL-1RI-Komplex und aktiviert weitere Kinasen, was letztendlich zur Aktivierung von NF-κB und zur Induktion der Transkription von Genen führt. Für eine adäquate Immunantwort ist ein intrazellulärer reduzierter Status von Proteinthiolen essentiell. Vorausgegangene Untersuchungen an der murinen Thymomzelllinie EL-4 zeigten, dass die IL-1-Signalkaskade durch thiolmodifizierende Substanzen wie Menadion (MD) oder Phenylarsinoxid (PAO) gehemmt wird. Eine IL-1-abhängige Aktivierung von IL-1RI-assoziierte Kinasen oder NF-κB fand nicht mehr statt. Ziele dieser Arbeit waren: (i) mögliche Proteine, die für den Angriff von thiolmodifizierenden Agenzien ein Ziel sein könnten, zu identifizieren und (ii) den Einfluss nahrungsrelevanter und redoxaktiver Substanzen auf frühe Ereignisse der IL-1-Signaltransduktion wie der Bildung des IL-1RI-Komplexes zu untersuchen. Als Zellmodell wurden EL-4-Zellen mit stabil überexprimierter IRAK (EL-4<sup>IRAK) verwendet. Um die Bildung des IL-1RI-Komplexes, anschließende Phosphorylierungsereignisse und somit Kinase-Aktivitäten nachzuweisen, wurden Co-Präzipitations-Experimente und in vitro Kinase Tests durchgeführt. Die Markierung von Proteinthiolen erfolgte mit dem thiolspezifischen Reagenz Iodoacetyl-[<sup>125I]-Iodotyrosin ([<sup>125I]-IAIT). Die Vorbehandlung von EL-4<sup>IRAK-Zellen mit MD oder PAO führte zu einer Hemmung der Rekrutierung der IRAK an den IL-1RI und der anschließenden Phosphorylierungen. Zur Identifikation weiterer IL-1RI-assoziierter Proteine wurden IL-1RI-Immunpräzipitate zweidimensional aufgetrennt, Colloidal-Coomassie gefärbte Proteinspots ausgeschnitten und anschließend massenspektrometrisch mittels ESI-Q-TOF analysiert. Bei der Analyse wurden Proteine des Cytoskeletts wie z. B. Actin identifiziert. In Analogie zu den synthetischen Substanzen MD und PAO wurden nahrungsrelevante und redoxaktive Substanzen wie Curcumin (Gelbwurz) und Sulforaphan (Broccoli) eingesetzt, um zu untersuchen, ob sie bereits früh die IL-1-Signaltransduktion beeinflussen. Bislang sind antiinflammatorische Effekte dieser beiden Nahrungsinhaltsstoffe nur auf der Ebene der Zytokin-vermittelten Aktivierung von NF-κB beschrieben. Sowohl Curcumin als auch Sulforaphan blockierten konzentrationsabhängig die Assoziation der IRAK an den IL-1RI in EL-4<sup>IRAK-Zellen, wobei beide Substanzen unterschiedlich wirkten. Curcumin beeinflusste die IRAK-Aktivierung durch direkte Modifikation von Thiolen der IRAK ohne die Bindung von IL-1 mit dem IL-1RI zu beeinträchtigen. Sulforaphan hingegen induzierte auf mRNA- und Proteinebene die Expression von Tollip, welches durch PCR bzw. Western Blot nachgewiesen wurde. Tollip, ein negativer Regulator in TLR/IL-1RI-Signalkaskaden, könnte somit nach Induktion die IRAK-Aktivierung unterdrücken. Die Sulforaphan-abhängige Induktion der Tollip-Expression erfolgte jedoch nicht über Nrf2 und "antioxidant response element" (ARE)-regulierte Transkription, obwohl Sulforaphan ein bekannter Nrf2-Aktivator ist. Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass die IRAK ein redoxsensitives Protein ist und für die Bildung des IL-1RI-Komplexes reduzierte Proteinthiole eine Voraussetzung sind. Der Angriffspunkt für die antiinflammatorische Wirkung der beiden Nahrungsbestandteile Curcumin und Sulforaphan ist die Bildung des IL-1RI-Komplexes als ein frühes Ereignis in der IL-1-Signalkaskade. Die Hemmung dieses Prozesses würde die in der Literatur beobachteten Inhibitionen der abwärts liegenden Signale wie die Aktivierung von NF-κB und die Induktion proinflammatorischer Proteine erklären.
Die Zahl der Kolonkarzinome in den westlichen Industrieländern steigt in den letzten Jahren stetig an. Zu den Verbindungen, die mit der Zubereitung der Nahrung entstehen, mit ihr aufgenommen werden und die Kolonkanzerogenese möglicherweise begünstigen, gehört das heterozyklische aromatische PhIP, das bei der Erhitzung proteinreicher Nahrungsmittel entsteht. Neben zahlreichen Fütterungsversuchen an Nagern existieren auch Zellkulturmodelle zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der PhIP-induzierten Kolonkanzerogenese. Die chemische Transformation von Zellen sollte durch wiederholte Exposition gegenüber dem hydroxylierten Metaboliten des Kanzerogens (N2-OH-PhIP) erzielt werden. Es wurden IEC-18-Zellen der Ratte und HCEC-Zellen des Menschen zur Untersuchung verwendet. Die Behandlung der IEC-18-Zellen führt nach 25 Behandlungszyklen mit Konzentrationen von 5 bis 20 µM nicht zur Transformation der Zellen. Die Anwesenheit von N2-OH-PhIP führt zu einer zehnfach erhöhten Induktion der GST-Aktivität, insbesondere der Untereinheiten GST-A1, -A3, -Pi und -T2, die für die effiziente Detoxifizierung des N-Acetoxy-Metaboliten vom N2-OH-PhIP verantwortlich sind. Bereits nach drei Behandlungen mit 1,5 µM N2-OH-PhIP konnte eine maligne Transformation der HCEC-Zellen erzielt werden. Die Zellen zeigten die charakteristischen Zeichen der Transformation: veränderte Wachstumseigenschaften wie klonales dreidimensionales Zellwachstum („pilling up“), Hemmung der Zell-Zell-Kontaktinhibierung, verkürzte Populationsverdopplungszeiten und tumorigene und metastasierende Eigenschaften. Außerdem exprimierten die N2-OH-PhIP-exponierten humanen Kolonzellen mit steigender Anzahl der Behandlungen größere Mengen des trunkierten APC-Proteins. Die bekannten PhIP-spezifischen Mutationen im APC-Gen resultieren in der Expression eines trunkierten Proteinproduktes und werden als frühe Ereignisse in der Kolonkanzerogenese betrachtet. Die zusammenfassende Betrachtung aller Ergebnisse zeigt, dass die IEC-18-Zelllinie zur chemischen Transformation durch N2-OH-PhIP ungeeignet ist. Dagegen wurde erstmalig eine vollständige chemische Transformation von Humandickdarmepithelzellen in vitro durch Exposition der humanen Kolonepithelzelllinie HCEC gegenüber dem Kolonkarzinogen N2-OH-PhIP erzielt.
"Untersuchung kardioprotektiver Wirkungen des Olivenöles und seiner phenolischen Komponenten in einer Gruppe gesunder deutscher Männer" EINLEITUNG: Epidemiologische Daten belegen, dass die mediterrane Ernährung mit einer niedrigen Inzidenz an mit oxidativen Stress assoziierten kardiovaskulären Erkrankungen einhergeht. Dabei wird vor allem dem Olivenöl, als Hauptfettlieferant in der mediterranen Ernährung, eine kardioprotektive Wirkung zugesprochen. Olivenöl zeichnet sich neben dem hohen Gehalt an einfach ungesättigten Fettsäuren (MUFA) durch ein reichhaltiges Spektrum an phenolischen Verbindungen aus, deren antioxidative Wirkung bereits zahlreichen in in vitro Studien beschrieben wurde. Demnach könnte der Verzehr von phenolreichem Olivenöl auch in vivo vor oxidativen Schädigungen schützen und somit das Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen senken. ZIELSTELLUNG: Untersuchung der kardioprotektiven Wirkung von Olivenöl und seiner phenolischen Komponenten in einer Gruppe gesunder deutscher Männer. METHODE: Dazu wurde eine randomisierte cross-over doppelt-verblindete Interventionsstudie an 70 gesunden Männern zwischen 20 - 60 Jahren im Raum Berlin-Brandenburg durchgeführt. In jeweils drei dreiwöchigen Interventionsphasen konsumierten die Probanden täglich 25 ml natives (phenolreich), gemischtes (mittlerer Phenolgehalt) und raffiniertes (annähernd phenolfrei) Olivenöl, was sich ausschließlich im Gehalt an phenolischen Verbindungen unterschied. Das Olivenöl sollte dabei die gewöhnlich verzehrten Fette ersetzen. Die Interventionsphasen waren durch zweiwöchige Wash out-Phasen unterbrochen. Die Erhebung der Blutlipide, Biomarker der Lipidperoxidation und endogene Antioxidantien erfolgte zu Studienbeginn sowie zu Beginn und Ende jeder Verzehrsperiode.ERGEBNISSE: Bei den Blutlipiden sowie den Biomarkern der Lipidperoxidation und den endogenen Antioxidantien konnte keine signifikante Veränderung in Abhängigkeit vom Phenolgehalt der applizierten Olivenöle nachgewiesen werden. Einzig die Glutathion-Reduktase-Aktivität stieg mit zunehmendem Gehalt an phenolischen Verbindungen (pTrend = 0,041). Unabhängig von der Konzentration der Phenole im Olivenöl wurde bei den Probanden durch den Olivenölverzehr eine Senkung von Gesamtcholesterol (p = 0,007) und Triglyzeride (p = 0,013) im Serum erzielt. Diese Wirkung geht einher mit einem gestiegenen MUFA-Anteil in der Ernährung aufgrund des Olivenölkonsums (p < 0,001). SCHLUSSFOLGERUNG: Die Hypothese, dass die Phenole im Olivenöl aufgrund ihrer in in vitro und Tierstudien beschriebenen antioxidativen Wirkung dem Olivenöl neben dem einzigartigen Fettsäureprofil eine zusätzliche kardioprotektive Wirkung bescheren, konnte in der vorliegenden Studie nicht gezeigt werden. Dennoch konnte durch den Olivenölverzehr und der damit einhergehenden Erhöhung des MUFA-Anteils in der Ernährung eine vorteilhafte Beeinflussung der Blutlipide erzielt werden. Obgleich Olivenöl nicht das vorwiegend verzehrte Fett in Deutschland darstellt, zeigten die befragten Probanden eine hohe Akzeptanz. Folglich könnte die Integration von Olivenöl in die habituelle Ernährung einen Beitrag zur Senkung des kardiovaskulären Erkrankungsrisikos leisten.
Nahrungsinhaltsstoffe sind im Organismus an Steuerungsprozessen und Stoffwechselvorgängen beteiligt, wobei die Mechanismen ihrer Wirkung noch nicht völlig aufgeklärt sind. Wie Vitamin E zeigen auch sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe in Zellsystemen sowie in vivo eine Reihe biologischer Wirkungen, deren Erklärung jedoch häufig auf ihre antioxidative Eigenschaft reduziert wird. Ziel der Dissertation war es, den Einfluss von Vitamin E und anderen Pflanzeninhaltsstoffen (in Form von Pflanzenextrakten oder isolierten sekundären Pflanzeninhaltsstoffen, z.B. Polyphenole), die bisher alle hauptsächlich als Antioxidanz klassifiziert wurden, auf die transkriptionelle Regulation von Phase I- und Phase II-Enzymen zu untersuchen. Dazu wurde die Aktivierung des PXR (pregnane X receptor) und des Nrf2 (NF-E2-related factor-2) als zentrale Transkriptionsfaktoren der Phase I- bzw. Phase II-Enzyme getestet. Der Einfluss von verschiedenen Vitamin E-Formen und antioxidativen Pflanzeninhaltsstoffen in Form von Reinsubstanzen (Curcumin, EGCG, Medox, Quercetin, Resveratrol und Sulforaphan) oder Pflanzenextrakten (aus Blaubeeren, Gewürznelken, Himbeeren, Nelkenpfeffer, Thymian oder Walnüssen) auf die Aktivierung von PXR und Nrf2 sowie des Promotors eines jeweiligen Zielgens (CYP3A4 bzw. GI-GPx) wurde in vitro mit Reportergenplasmiden untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl Vitamin E-Formen als auch verschiedene sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe PXR und/oder Nrf2 sowie die Promotoren der jeweiligen Zielgene CYP3A4 bzw. GI-GPx aktivieren. In einem Tierexperiment konnte diese genregulatorische Wirkung von Vitamin E auf die in vivo-Situation übertragen werden. In Lebern von Mäusen, deren Futter unterschiedliche Mengen von Vitamin E enthielt (Mangel-, Normal- und Überflussdiät), wurde eine direkte Korrelation zwischen der alpha-Tocopherol-Konzentration und der Cyp3a11 mRNA-Expression nachgewiesen (Cyp3a11 ist das murine Homolog zum humanen CYP3A4). Entgegen der in vitro-Situation hatte gamma-Tocotrienol in vivo einen nur kaum nachweisbaren Effekt auf die Expression der Cyp3a11 mRNA, induzierte aber die Expression der alpha-TTP mRNA. Es konnte gezeigt werden, dass Vitamin E und sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe Phase I- und Phase II-Enzyme transkriptionell regulieren können. Die Wirkungen des Vitamin E können sich allerdings nur entfalten, wenn die Vitamin E-Formen ausreichend vom Körper aufgenommen werden. Gegenstand der Dissertation waren daher auch Untersuchungen zur Bioverfügbarkeit (zelluläre Akkumulation und Metabolismus) verschiedener Vitamin E-Formen. Es konnte gezeigt werden, dass Unterschiede in der chemischen Struktur der Vitamin E-Formen deren zelluläre Akkumulation und Metabolisierung beeinflussen. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der Dissertation lassen sich protektive Wirkungen von antioxidativen Nahrungsinhaltsstoffen auch unabhängig von ihren antioxidativen Eigenschaften über die Induktion zelleigener Schutzsysteme, einschließlich der Phase I- und Phase II-Enzyme, erklären. Die Induktion der zelleigenen Abwehr lässt sich auch als adaptive Antwort (sog. "adaptive response") des Organismus gegenüber zellschädigenden Ereignissen betrachten.