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Nutrigenetik der metabolischen Adaptation an eine isokalorische Hochfettdiät bei gesunden Zwillingen
(2013)
Intensive Forschung hat in den vergangenen Jahrzehnten zu einer sehr detaillierten Charakterisierung des Geschmackssystems der Säugetiere geführt. Dennoch sind mit den bislang eingesetzten Methoden wichtige Fragestellungen unbeantwortet geblieben. Eine dieser Fragen gilt der Unterscheidung von Bitterstoffen. Die Zahl der Substanzen, die für den Menschen bitter schmecken und in Tieren angeborenes Aversionsverhalten auslösen, geht in die Tausende. Diese Substanzen sind sowohl von der chemischen Struktur als auch von ihrer Wirkung auf den Organismus sehr verschieden. Während viele Bitterstoffe potente Gifte darstellen, sind andere in den Mengen, die mit der Nahrung aufgenommen werden, harmlos oder haben sogar positive Effekte auf den Körper. Zwischen diesen Gruppen unterscheiden zu können, wäre für ein Tier von Vorteil. Ein solcher Mechanismus ist jedoch bei Säugetieren nicht bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Verarbeitung von Geschmacksinformation in der ersten Station der Geschmacksbahn im Mausgehirn, dem Nucleus tractus solitarii (NTS), mit besonderem Augenmerk auf der Frage nach der Diskriminierung verschiedener Bitterstoffe. Zu diesem Zweck wurde eine neue Untersuchungsmethode für das Geschmackssystem etabliert, die die Nachteile bereits verfügbarer Methoden umgeht und ihre Vorteile kombiniert. Die Arc-catFISH-Methode (cellular compartment analysis of temporal activity by fluorescent in situ hybridization), die die Charakterisierung der Antwort großer Neuronengruppen auf zwei Stimuli erlaubt, wurde zur Untersuchung geschmacksverarbeitender Zellen im NTS angewandt. Im Zuge dieses Projekts wurde erstmals eine stimulusinduzierte Arc-Expression im NTS gezeigt. Die ersten Ergebnisse offenbarten, dass die Arc-Expression im NTS spezifisch nach Stimulation mit Bitterstoffen auftritt und sich die Arc exprimierenden Neurone vornehmlich im gustatorischen Teil des NTS befinden. Dies weist darauf hin, dass Arc-Expression ein Marker für bitterverarbeitende gustatorische Neurone im NTS ist. Nach zweimaliger Stimulation mit Bittersubstanzen konnten überlappende, aber verschiedene Populationen von Neuronen beobachtet werden, die unterschiedlich auf die drei verwendeten Bittersubstanzen Cycloheximid, Chininhydrochlorid und Cucurbitacin I reagierten. Diese Neurone sind vermutlich an der Steuerung von Abwehrreflexen beteiligt und könnten so die Grundlage für divergentes Verhalten gegenüber verschiedenen Bitterstoffen bilden.
Hintergrund: Gestillte Kinder haben im Vergleich zu nicht gestillten Kindern eine geringere Inzidenz von gastrointestinalen Infektionen und atopischen Erkrankungen. Man geht davon aus, dass der gesundheitsfördernde Effekt der Muttermilch teilweise über die intestinale Mikrobiota vermittelt wird. Diese ist in Stillkindern durch eine geringe Diversität und einen hohen Anteil an Bifidobakterien charakterisiert. Neueste Ansätze in der Weiterentwicklung industriell hergestellter Säuglingsnahrung zielen darauf ab, eine intestinale Mikrobiota zu fördern, die der von gestillten Kindern ähnelt. Die Supplementation von Säuglingsnahrung mit Probiotika (lebende Mikroorganismen) oder Präbiotika (unverdauliche Kohlenhydrate, die als Energiesubstrat für probiotische Bakterien dienen) könnte die bifidogene und antipathogene, aber auch immunmodulierende Wirkung der Muttermilch nachahmen. Aufgrund unterschiedlicher Interaktionen mit der Darmmikrobiota und dem Immunsystem fokussiert man mit der gleichzeitigen Gabe von Pro- und Präbiotika (Synbiotika) eine synergistische Wirkung an. Zielstellung und Studiendesign: In einer randomisiert-kontrollierten, klinischen Studie wurde untersucht, ob sich in den ersten drei Lebensmonaten von gesunden und termingerecht geborenen Kindern mit einer Synbiotikum-haltigen Säuglingsnahrung eine intestinale Mikrobiota etabliert, die der von gestillten Kindern gleicht. Das Synbiotikum setzte sich aus Bifidobacterium animalis ssp. lactis CNCM I 3446 (ältere Bezeichnung B. lactis BB-12) und Kuhmilcholigosacchariden zusammen. Die Studie umfasste zwei Gruppen von Kindern, die eine Säuglingsnahrung mit (SYN-Gruppe, n=21) oder ohne Supplement (KON-Gruppe, n=18) erhielten. Gestillte Kinder dienten als Referenz (REF-Gruppe, n=23). Um die Diversität der Bifidobakterien auf Speziesebene umfassend zu charakterisieren, wurden quantitative Real-Time PCR (qPCR)-Verfahren, basierend auf dem single-copy groEL als phylogenetisches Zielgen, zur spezifischen Quantifizierung von zwölf Bifidobakterienspezies in humanen Fäzes entwickelt und validiert. Ergebnisse: Die supplementierte Säuglingsnahrung war gut verträglich und unterstützte eine gesunde Entwicklung; vergleichbare anthropometrische Daten von SYN- und REF-Gruppe. Das Synbiotikum stimulierte selektiv das Wachstum von Laktobazillen und Bifidobakterien. Die Zellzahl für Laktobazillen der SYN-Gruppe war zur REF-Gruppe äquivalent (9,07±0,32 versus 9,90±0,27 log10 Zellen/g Fäzes TM [MW±SEM]; p<0,0019; Äquivalenzdifferenz von 1 log10 Zellen/g Fäzes TM) und höher als in der KON-Gruppe (8,27±0,31 log10 Zellen/g Fäzes TM [MW±SEM]). Die Zellzahl für Bifidobakterien war in der SYN-Gruppe am höchsten (11,54±0,05 versus 11,00±0,17 [REF-Gruppe] und 10,54±0,24 [KON-Gruppe] log10 Zellen/g Fäzes TM [MW±SEM]). In der SYN-Gruppe wurde die höchste Anzahl an Bifidobakterienspezies erfasst (167 mit [128 ohne] B. animalis in 56 Fäzesproben versus 98 und 93 in jeweils 51 Fäzesproben der REF- und KON-Gruppe). Neben Kinder-typischen Spezies wie B. bifidum und B. breve wurden auch Spezies, die für Erwachsene charakteristisch sind (B. adolescentis), häufiger in der SYN-Gruppe als in den Vergleichsgruppen nachgewiesen. Der pH-Wert in Fäzes von Kindern aus der SYN-Gruppe war niedriger als der aus der KON-Gruppe (6,07±0,20 versus 6,45±0,17 [MW±SEM]) und näher an dem von gestillten Kindern mit 5,29±0,12 (MW±SEM). Schlussfolgerung: Die Supplementation einer Säuglingsnahrung mit dem Synbiotikum aus CNCM I-3446 und Kuhmilcholigosacchariden führte zu einer Angleichung in der Zusammensetzung der intestinalen Mikrobiota und des fäkalen pH-Wertes an gestillte Kinder. Die in dieser Arbeit entwickelten groEL-basierten qPCR-Verfahren erlaubten eine spezifische und genaue Analyse der Bifidobakterienpopulation unter dem Einfluss eines Synbiotikums.
Das Selenoprotein Glutathionperoxidase 2 (GPx2) ist ein epithelzellspezifisches, Hydroperoxide-reduzierendes Enzym, welches im Darmepithel, vor allem in den proliferierenden Zellen des Kryptengrundes, exprimiert wird. Die Aufrechterhaltung der GPx2-Expression im Kryptengrund auch bei subadäquatem Selenstatus könnte darauf hinweisen, dass sie hier besonders wichtige Funktionen wahrnimmt. Tatsächlich weisen GPx2 knockout (KO)-Mäuse eine erhöhte Apoptoserate im Kryptengrund auf. Ein Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die physiologische Funktion der GPx2 näher zu untersuchen. In Kryptengrundepithelzellen aus dem Colon selenarmer GPx2 KO-Mäuse wurde eine erhöhte Caspase 3/7-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp (WT) festgestellt. Zudem wiesen diese Zellen eine erhöhte Suszeptibilität für oxidativen Stress auf. Die GPx2 gewährleistet also den Schutz der proliferierenden Zellen des Kryptengrundes auch bei subadäquater Selenversorgung. Des Weiteren wurde im Colon selenarmer (-Se) und -adäquater (+Se) GPx2 KO-Mäuse im Vergleich zum WT eine erhöhte Tumornekrosefaktor α-Expression und eine erhöhte Infiltration von Makrophagen festgestellt. Durch Fütterung einer selensupplementierten Diät (++Se) konnte dies verhindert werden. In GPx2 KO-Mäusen liegt demnach bereits basal eine niedriggradige Entzündung vor. Dies unterstreicht, dass GPx2 vor allem eine wichtige antiinflammatorische Funktion im Darmepithel besitzt. Dem Mikronährstoff Selen werden protektive Funktionen in der Colonkanzerogenese zugeschrieben. In einem Mausmodell der Colitis-assoziierten Colonkanzerogenese wirkte GPx2 antiinflammatorisch und hemmte so die Tumorentstehung. Auf der anderen Seite wurden jedoch auch prokanzerogene Eigenschaften der GPx2 aufgedeckt. Deshalb sollte in dieser Arbeit untersucht werden, welchen Effekt ein GPx2 knockout in einem Modell der sporadischen, durch Azoxymethan (AOM) induzierten, Colonkanzerogenese hat. Im WT kam es in präneoplastischen Läsionen häufig zu einer erhöhten GPx2-Expression im Vergleich zur normalen Darmmucosa. Eine derartige Steigerung der GPx2-Expression wurde auch in der humanen Colonkanzerogenese beschrieben. Das Fehlen der GPx2 resultierte in einer verminderten Entstehung von Tumoren (-Se und ++Se) und präneoplastischen Läsionen (-Se und +Se). Somit förderte GPx2 die Tumorentstehung im AOM-Modell. Acht Stunden nach AOM-Gabe war im GPx2 KO-Colon im Vergleich zum WT eine erhöhte Apoptoserate in der Kryptenmitte (-Se, +Se), nicht jedoch im Kryptengrund oder in der ++Se-Gruppe zu beobachten. Möglicherweise wirkte GPx2 prokanzerogen, indem sie die effiziente Elimination geschädigter Zellen in der Tumorinitiationsphase verhinderte. Eine ähnliche Wirkung wäre auch durch die erhöhte GPx2-Expression in der Promotionsphase denkbar. So könnte GPx2 proliferierende präneoplastische Zellen vor oxidativem Stress, Apoptosen, oder auch der Antitumorimmunität schützen. Dies könnte durch ein Zusammenwirken mit anderen Selenoproteinen wie GPx1 und Thioredoxinreduktasen, für die ebenfalls auch prokanzerogene Funktionen beschrieben wurden, verstärkt werden. Eine wichtige Rolle könnte hier die Modulation des Redoxstatus in Tumorzellen spielen. Die Variation des Selengehalts der Diät hatte im WT einen eher U-förmigen Effekt. So traten in der –Se und ++Se-Gruppe tendenziell mehr und größere Tumore auf, als in der +Se Gruppe. Zusammenfassend schützt GPx2 also die proliferierenden Zellen des Kryptengrundes. Sie könnte jedoch auch proliferierende transformierte Zellen schützen und so die sporadische, AOM-induzierte Colonkanzerogenese fördern. In einem Modell der Colitis-assoziierten Colonkanzerogenese hatte GPx2 auf Grund ihrer antiinflammatorischen Wirkung einen gegenteiligen Effekt und hemmte die Tumorentstehung. Die Rolle der GPx2 in der Colonkanzerogenese ist also abhängig vom zugrunde liegenden Mechanismus und wird maßgeblich von der Beteiligung einer Entzündung bestimmt.
Korrelation zwischen der genetischen und der funktionellen Diversität humaner Bitterrezeptoren
(2013)
Der Mensch besitzt ~25 funktionelle Bitterrezeptoren (TAS2R), die für die Wahrnehmung potenziell toxischer Substanzen in der Nahrung verantwortlich sind. Aufgrund der großen genetischen Variabilität der TAS2R-Gene könnte es eine Vielzahl funktionell unterschiedlicher TAS2R-Haplotypen geben, die zu Unterschieden der Bitterwahrnehmung führen. Dies konnte bereits in funktionellen Analysen und sensorischen Studien für einzelne Bitterrezeptoren gezeigt werden. In dieser Arbeit wurden die häufigsten Haplotypen aller 25 Bitterrezeptoren verschiedener Ethnien funktionell charakterisiert. Das Ziel war eine umfassende Aussage über die funktionelle Diversität der TAS2Rs, die die molekulare Grundlage für individuelle Bitterwahrnehmung bildet, treffen zu können. Fehlende Varianten wurden aus genomischer DNA kloniert oder durch gezielte Mutagenese bereits vorhandener TAS2R-Konstrukte generiert. Die funktionelle Analyse erfolgte mittels Expression der TAS2R-Haplotypen in HEK293TG16gust44 Zellen und anschließenden Calcium-Imaging-Experimenten mit zwei bekannten Agonisten. Die Haplotypen der fünf orphanen TAS2Rs wurden mit über hundert Bitterstoffen stimuliert. Durch die gelungene Deorphanisierung des TAS2R41 in dieser Arbeit, wurden für die 21 aktivierbaren TAS2Rs 36 funktionell-unterschiedliche Haplotypen identifiziert. Die tatsächliche funktionelle Vielfalt blieb jedoch deutlich hinter der genetischen Variabilität der TAS2Rs zurück. Neun Bitterrezeptoren wiesen funktionell homogene Haplotypen auf oder besaßen nur eine weltweit vorherrschende Variante. Funktionell heterogene Haplotypen wurden für zwölf TAS2Rs identifiziert. Inaktive Varianten der Rezeptoren TAS2R9, TAS2R38 und TAS2R46 sollten die Wahrnehmung von Bitterstoffen wie Ofloxacin, Cnicin, Hydrocortison, Limonin, Parthenolid oder Strychnin beeinflussen. Unterschiedlich sensitive Varianten, besonders der Rezeptoren TAS2R47 und TAS2R49, sollten für Agonisten wie Absinthin, Amarogentin oder Cromolyn ebenfalls zu phänotypischen Unterschieden führen. Wie für den TAS2R16 bereits gezeigt, traten Haplotypen des funktionell heterogenen TAS2R7 und TAS2R41 ethnien-spezifisch auf, was auf lokale Anpassung und verschiedene Phänotypen hinweisen könnte. Weiterführend muss nun eine Analyse der funktionell-variablen TAS2Rs in sensorischen Tests erfolgen, um ihre phänotypische Relevanz zu prüfen. Die Analyse der funktionsmodulierenden Aminosäurepositionen, z.Bsp. des TAS2R44, TAS2R47 oder TAS2R49, könnte weiterführend zum besseren Verständnis der Rezeptor-Ligand- und Rezeptor-G-Protein-Interaktion beitragen.