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Die sensorisch einwandfreie, konstant gute Qualität von Backprodukten, die beim Verbraucher einen hohen Stellenwert hat, wird maßgeblich durch den Gehalt endogener Getreideenzyme beeinflusst. Seit dem Auftreten züchtungsbedingter Enzymdefizite ist der Einsatz technischer Enzyme zur Gewährleistung dieser geforderten Qualität eine feste Größe in der Backwarenindustrie. Lebensmittelrechtlich werden technische Enzyme nicht als Zutat betrachtet, da sie theoretisch während des Backprozesses umgesetzt werden und im Endprodukt keine technologische Wirkung mehr zeigen. Vor allem in gebackenen Produkten bedarf es der Prüfung, dass die eingesetzten technischen Enzyme nicht mehr als Zutat vorliegen und sich somit einer potentiellen Deklarationspflicht entziehen. Zur Gewährleistung der Wirtschaftlichkeit muss der quantitative Einsatz technischer Enzyme in der Backwarenindustrie gesteuert werden, um optimale Effekte zu erzielen und Kosten zu sparen. Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung eines Analysenverfahrens, das den simultanen Nachweis verschiedener technischer Enzyme und deren Quantifizierung im Spurenbereich auch in gebackenen Produkten ermöglicht.
Für die Einschätzung der Wirkung der technischen Enzyme Fungamyl (Novozymes), Amylase TXL (ASA Spezialenzyme GmbH) sowie Lipase FE-01 (ASA Spezialenzyme GmbH) wurden Backversuche durchgeführt, die zeigten, dass Fungamyl und Amylase TXL zu einer verbesserten Brotqualität (Volumenausbeute, Feuchtegehalt, Sensorik) beitrugen. Die Zugabe der Lipase FE-01 führte zu einer vermehrten Bildung freier Fettsäuren und wirkte sich negativ auf die sensorische Brotqualität aus. Dieser bisher nicht beschriebene Effekt konnte auf die Nutzung eines Spezialöls als Backzutat zurückgeführt werden, welches ausschließlich aus gesättigten Fettsäuren besteht. Dies bestätigt die Bedeutung der Auswahl eines geeigneten Fettes beim Zusatz technischer Lipase zum Backprozess.
Um die in Fungamyl und Lipase FE-01 enthaltenen Enzyme zu identifizieren, wurden SDS-PAGE und anschließender In-Gel-Verdau angewendet um die Analyse proteolytisch gespaltener Proteine mit MALDI-TOF-MS zu ermöglichen. Es konnte gezeigt werden, dass Fungamyl ein Gemisch aus 9,8 % alpha-Amylase (Aspergillus oryzae) und 5,2 % Endo-1,4-Xylanase (Thermomyces lanuginosus) enthält. Lipase FE-01 besteht aus der Lipase (Thermomyces lanuginosus), Amylase TXL wurde als alpha-Amylase (Aspergillus oryzae) identifiziert.
Zur Analyse der technischen Enzyme in Backwaren wurde aufgrund seiner Robustheit und Sensitivität das Verfahren der LC-MS/MS gewählt. Die Entwicklung einer solchen Methode zur Detektion spezifischer Peptide ermöglichte den qualitativen Nachweis der 3 Enzyme alpha-Amylase (Aspergillus oryzae), Endo-1,4-Xylanase (Thermomyces lanuginosus) und Lipase (Thermomyces lanuginosus). Durch eine lineare Kalibrierung aus synthetisch hergestellten Peptiden unter Einbeziehung eines Protein-Internen-Standards sowie isotopenmarkierter Peptidstandards erfolgte darüber hinaus die quantitative Bestimmung in selbst hergestellten Referenzmaterialien (Weizenmehl, Toastbrot und Biskuitkeks). In weniger als 20 Minuten Messzeit kann das Enzym alpha-Amylase ab einer Konzentration von 2,58 mg/kg (Mehl, Keks), bzw. 7,61 mg/kg (Brot) quantitativ nachgewiesen werden. Zeitgleich können die Enzyme Endo-1,4-Xylanase ab einer Konzentration von 7,75 mg/kg (Brot), 3,64 mg/kg (Keks) bzw. 15,60 mg/kg (Mehl) sowie Lipase ab einer Konzentration von 1,26 mg/kg (Mehl, Keks), bzw. 2,68 mg/kg (Brot) quantifiziert werden. Die Methode wurde nach allgemein verwendeten Richtlinien im Zuge einer Validierung statistisch geprüft und lieferte sehr robuste und reproduzierbare quantitative Werte mit Wiederfindungsraten zwischen 50 % und 122 %. Das primäre Ziel dieser Arbeit, die Entwicklung eines quantitativen Multiparameterverfahrens zum Nachweis technischer Enzyme in Backwaren, wurde somit erfolgreich umgesetzt.
Die hohe Energieaufnahme durch Fette ist ein Hauptfaktor für die Entstehung von Adipositas, was zu weltweiten Bestrebungen führte, die Fettaufnahme zu verringern. Fettreduzierte Lebensmittel erreichen jedoch, trotz ihrer Weiterentwicklung, nicht die Schmackhaftigkeit ihrer Originale. Die traditionelle Sichtweise, dass die Attraktivität von Fetten allein durch Textur, Geruch, Aussehen und postingestive Effekte bestimmt wird, wird nun durch das Konzept einer gustatorischen Wahrnehmung ergänzt. Bei Nagetieren zeigte sich, dass Lipide unabhängig von den vorgenannten Eigenschaften erkannt werden, sowie, dass Fettsäuren, freigesetzt durch linguale Lipasen, als gustatorische Stimuli fungieren und Fettsäuresensoren in Geschmackszellen exprimiert sind. Die Datenlage für den Menschen erwies sich jedoch als sehr begrenzt, daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit molekulare und histologische Voraussetzungen für eine gustatorische Fettwahrnehmung beim Menschen zu untersuchen.
Zunächst wurde humanes Geschmacksgewebe mittels RT-PCR und immunhistochemischen Methoden auf die Expression von Fettsäuresensoren untersucht, sowie exprimierende Zellen in Kofärbeexperimenten charakterisiert und quantifiziert. Es wurde die Expression fettsäuresensitiver Rezeptoren nachgewiesen, deren Agonisten das gesamte Spektrum an kurz- bis langkettigen Fettsäuren abdecken (GPR43, GPR84, GPR120, CD36, KCNA5). Ein zweifelsfreier Nachweis des Proteins konnte für den auf langkettige Fettsäuren spezialisierten Rezeptor GPR120 in Typ-I- und Typ-III-Geschmackszellen der Wallpapillen erbracht werden. Etwa 85 % dieser GPR120-exprimierenden Zellen enthielten keine der ausgewählten Rezeptoren der Geschmacksqualitäten süß (TAS1R2/3), umami (TAS1R1/3) oder bitter (TAS2R38). Somit findet sich in humanen Geschmackspapillen nicht nur mindestens ein Sensor, sondern möglicherweise auch eine spezifische, fettsäuresensitive Zellpopulation. Weitere RT-PCR-Experimente und Untersuchungen mittels In-situ-Hybridisierung wurden zur Klärung der Frage durchgeführt, ob Lipasen in den Von-Ebner-Speicheldrüsen (VED) existieren, die freie Fettsäuren aus Triglyceriden als gustatorischen Stimulus freisetzen können. Es zeigte sich zwar keine Expression der bei Nagetieren gefundenen Lipase F (LIPF), jedoch der eng verwandten Lipasen K, M und N in den serösen Zellen der VED. In-silico-Untersuchungen der Sekundär- und Tertiärstrukturen zeigten die hohe Ähnlichkeit zu LIPF, erwiesen aber auch Unterschiede in den Bindungstaschen der Enzyme, welche auf ein differenziertes Substratspektrum hinweisen. Die Anwesenheit eines spezifischen Signalpeptids macht eine Sekretion der Lipasen in den die Geschmacksporen umspülenden Speichel wahrscheinlich und damit auch eine Bereitstellung von Fettsäuren als Stimuli für Fettsäuresensoren. Die Übertragung des durch diese Stimuli hervorgerufenen Signals von Geschmackszellen auf gustatorische Nervenfasern über P2X-Rezeptormultimere wurde mit Hilfe einer vorherigen Intervention mit einem P2X3 /P2X2/3-spezifischen Antagonisten an der Maus als Modellorganismus im Kurzzeit-Präferenztest untersucht. Es zeigte sich weder eine Beeinträchtigung der Wahrnehmung einer Fettsäurelösung, noch einer zuckerhaltigen Kontrolllösung, wohingegen die Wahrnehmung einer Bitterstofflösung reduziert wurde. Somit ist anhand der Ergebnisse dieser Arbeit eine Beteiligung des P2X3-Homomers bzw. des P2X2/3-Heteromers unwahrscheinlich, jedoch die des P2X2-Homomers und damit der gustatorischen Nervenfasern nicht ausgeschlossen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf die Erfüllung grundlegender Voraussetzungen für die gustatorische Fett(säure)wahrnehmung hin und tragen zum Verständnis der sensorischen Fettwahrnehmung und der Regulation der Fettaufnahme bei. Das Wissen um die Regulation dieser Mechanismen stellt eine Grundlage zur Aufklärung der Ursachen und damit der Bekämpfung von Adipositas und assoziierten Krankheiten dar.
Der Bittergeschmack warnt den Organismus vor potentiell verdorbener oder giftiger Nahrung und ist somit ein wichtiger Kontrollmechanismus. Die initiale Detektion der zahlreich vorkommenden Bitterstoffe erfolgt bei der Maus durch 35 Bitterrezeptoren (Tas2rs), die sich im Zungengewebe befinden. Die Geschmacksinformation wird anschließend von der Zunge über das periphere (PNS) ins zentrale Nervensystem (ZNS) geleitet, wo deren Verarbeitung stattfindet. Die Verarbeitung der Geschmacksinformation konnte bislang nicht gänzlich aufgeklärt werden. Neue Studien deuten auf eine Expression von Tas2rs auch im PNS und ZNS entlang der Geschmacksbahn hin. Über Vorkommen und Aufgaben dieser Rezeptoren bzw. Rezeptorzellen im Nervensystem ist bislang wenig bekannt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Tas2r-Expression in verschiedenen Mausmodellen untersucht, Tas2r-exprimierende Zellen identifiziert und deren Funktionen bei der Übertragung der Geschmacksinformationen analysiert. Im Zuge der Expressionsanalysen mittels qRT-PCR konnte die Expression von 25 der 35 bekannten Bittergeschmacksrezeptoren im zentralen Nervensystem der Maus nachgewiesen werden. Die Expressionsmuster im PNS sowie im ZNS lassen darüber hinaus Vermutungen zu Funktionen in verschiedenen Bereichen des Nervensystems zu. Basierend auf den Ergebnissen der Expressionsanalysen war es möglich, stark exprimierte Tas2rs mittels In-situ-Hybridisierung in verschiedenen Zelltypen zu visualisieren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen unter Verwendung eines genetisch modifizierten Mausmodells die Ergebnisse der Expressionsanalysen bestätigen. Sie zeigten eine Expression von Tas2rs, am Beispiel des Tas2r131-Rezeptors, in cholinergen, dopaminergen, GABAergen, noradrenergen und glycinerg-angesteuerten Projektionsneuronen sowie in Interneuronen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen daher erstmals das Vorkommen von Tas2rs in verschiedenen neuronalen Zelltypen in weiten Teilen des ZNS. Dies lässt den Schluss zu, dass Tas2r-exprimierende Zellen potentiell multiple Funktionen innehaben. Anhand von Verhaltensexperimenten in genetisch modifizierten Mäusen wurde die mögliche Funktion von Tas2r131-exprimierenden Neuronen (Tas2r131-Neurone) bei der Geschmackswahrnehmung untersucht. Die Ergebnisse weisen auf eine Beteiligung von Tas2r131-Neuronen an der Signalweiterleitung bzw. -verarbeitung der Geschmacksinformation für eine Auswahl von Bittersubstanzen hin. Die Analysen zeigen darüber hinaus, dass Tas2r131-Neuronen nicht an der Geschmackswahrnehmung anderer Bitterstoffe sowie Geschmacksstimuli anderer Qualitäten (süß, umami, sauer, salzig), beteiligt sind. Eine spezifische „Tas2r131-Bittergeschmacksbahn“, die mit anderen potentiellen „Bitterbahnen“ teils unabhängige, teils überlappende Signalwege bzw. Verarbeitungsbereiche besitzt, bildet eine mögliche zelluläre Grundlage zur Unterscheidung von Bitterstoffen. Die im Rahmen dieser Arbeit entstandene Hypothese einer potentiellen Diskriminierung von Bitterstoffen soll daher in weiterführenden Studien durch die Etablierung eines Verhaltenstest mit Mäusen geprüft werden.
The impact of collagen modifications by methylglyoxal on fibroblast function and the role in aging
(2016)
Dietary approaches contribute to the prevention and treatment of type 2 diabetes. High protein diets were shown to exert beneficial as well as adverse effects on metabolism. However, it is unclear whether the protein origin plays a role in these effects. The LeguAN study investigated in detail the effects of two high protein diets, either from plant or animal origin, in type 2 diabetic patients. Both diets contained 30 EN% protein, 40 EN% carbohydrates, and 30 EN% fat. Fiber content, glycemic index, and composition of dietary fats were similar in both diets. In comparison to previous dietary habits, the fat content was exchanged for protein, while the carbohydrate intake was not modified. Overall, both high protein diets led to improvements of glycemic control, insulin sensitivity, liver fat, and cardiovascular risk markers without remarkable differences between the protein types.
Fasting glucose together with indices of insulin resistance were ameliorated by both interventions to varying extents but without significant differences between protein types. The decline of HbA1c was more pronounced in the plant protein group, whereby the improvement of insulin sensitivity in the animal protein group. The high protein intake had only slight influence on postprandial metabolism seen for free fatty acids and indices of insulin secretion, sensitivity and degradation. Except for GIP release, ingestion of animal and plant meals did not provoke differential metabolic and hormonal responses despite diverse circulating amino acid levels.
The animal protein diets led to a selective increase of fat-free mass and decrease of total fat mass, which was not significantly different from the plant protein diet. Moreover, the high protein diets potently decreased liver fat content by 42% on average which was linked to significantly diminished lipogenesis, free fatty acids flux and lipolysis in adipose tissue. Moderate decline of circulating liver enzymes was induced by both interventions. The liver fat reduction was associated with improved glucose homeostasis and insulin sensitivity which underlines the protective effect of the diets.
Blood lipid profile improved in all subjects and was probably related to the lower fat intake. Reductions in uric acid and markers of inflammation further argued for metabolic benefits of both high protein diets. Systolic and diastolic blood pressure declined only in the PP group pointing a possible role of arginine.
Kidney function was not altered by high protein consumption over 6 weeks. The rapid decrease of serum creatinine in the PP group was noteworthy and should be further investigated. Protein type did not seem to play a role but long-term studies are warranted to fully elucidate safety of high protein regimen.
Varying the source of dietary proteins did not affect the mTOR pathway in adipose tissue and blood cells under neither acute nor chronic settings. Enhancement of whole-body insulin sensitivity suggested also no alteration of mTOR and no impairment of insulin sensitivity in skeletal muscle.
A remarkable outcome was the extensive reduction of FGF21, critical regulator of metabolic processes, by approximately 50% independently of protein type. Whether hepatic ER-stress, ammonia flux or rather macronutrient preferences is behind this paradoxical finding remains to be investigated in detail.
Unlike initial expectations and previous reports plant protein based diet had no clear advantage over animal proteins. The pronounced beneficial effect of animal protein on insulin homeostasis despite high BCAA and methionine intake was certainly unexpected assuming more complex metabolic adaptations occurring upon prolonged consumption. In addition, the reduced fat intake may have also contributed to the overall improvements in both groups.
Taking into account the above observed study results, a short-term diet containing 30 EN% protein (either from plant or animal origin), 40 EN% carbohydrates, and 30 EN% fat with lower SFA amount leads to metabolic improvements in diabetic patients, regardless of protein source.
Protektiver Effekt von 6-Shogaol, Ellagsäure und Myrrhe auf die intestinale epitheliale Barriere
(2016)
Viele bioaktive Pflanzeninhaltsstoffe bzw. Pflanzenmetabolite besitzen antiinflammatorische Eigenschaften. Diese versprechen ein hohes Potential für den Einsatz in der Phytotherapie bzw. Prävention von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED). Eine intestinale Barrieredysfunktion ist ein typisches Charakteristikum von CED Patienten, die dadurch an akuter Diarrhoe leiden.
In dieser Arbeit werden die Pflanzenkomponenten 6-Shogaol, Ellagsäure und Myrrhe an den intestinalen Kolonepithelzellmodellen HT-29/B6 und Caco-2 auf ihr Potential hin, die intestinale Barriere zu stärken bzw. eine Barrieredysfunktion zu verhindern, untersucht. Hauptschwerpunkt der Analysen ist die parazelluläre Barrierefunktion und die Regulation der dafür entscheidenden Proteinfamilie der Tight Junctions (TJs), der Claudine.
Die Barrierefunktion wird durch Messung des transepithelialen Widerstands (TER) und der Fluxmessung in der Ussing-Kammer bestimmt. Dazu werden die HT-29/B6- und Caco-2-Monolayer mit den Pflanzenkomponenten (6-Shogaol, Ellagsäure, Myrrhe), dem proinflammatorischen Zytokin TNF-α oder der Kombination von beiden Subsztanzen für 24 oder 48 h behandelt. Außerdem wurden zur weiteren Charakterisierung die Expression sowie die Lokalisation der für die parazelluläre Barriere relevanten Claudine, die TJ-Ultrastruktur und verschiedene Signalwege analysiert.
In Caco-2-Monolayern führten Ellagsäure und Myrrhe, nicht aber 6-Shogaol, allein zu einem TER-Anstieg bedingt durch eine verringerte Permeabilität für Natriumionen. Myrrhe verminderte die Expression des Kationenkanal-bildenden TJ-Proteins Claudin-2 über die Inhibierung des PI3K/Akt-Signalweges, während Ellagsäure die Expression der TJ-Proteine Claudin-4 und -7 reduzierte. Alle Pflanzenkomponenten schützten in den Caco-2-Zellen vor einer TNF-α-induzierten Barrieredysfunktion.
An den HT-29/B6-Monolayern änderte keine der Pflanzenkomponenten allein die Barrierefunktion. Die HT-29/B6-Zellen reagierten auf TNF-α mit einer deutlichen Verminderung des TER und einer erhöhten Fluoreszein-Permeabilität. Die TER-Abnahme war durch eine PI3K/Akt-vermittelte gesteigerte Claudin-2-Expression sowie eine NFκB-vermittelte Umverteilung des abdichtenden TJ-Proteins Claudin-1 gekennzeichnet. 6-Shogaol konnte den TER-Abfall partiell hemmen sowie die PI3K/Akt-induzierte Claudin-2-Expression und die NFκB-bedingte Claudin-1-Umverteilung verhindern. Ebenso inhibierte Myrrhe, nicht aber Ellagsäure, den TNF-α-induzierten TER-Abfall. Dabei konnte Myrrhe zwar den Claudin-2-Expressionsanstieg und die Claudin-1-Umverteilung unterbinden, jedoch weder die NFκB- noch die PI3K/Akt-Aktivierung hemmen. Diese Arbeit zeigt, dass auch STAT6 an dem Claudin-2-Expressionsanstieg durch
TNF-α in HT-29/B6-Zellen beteiligt ist. So wurde durch Myrrhe die TNF-α-induzierte Phosphorylierung von STAT6 und die erhöhte Claudin-2-Expression inhibiert.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Pflanzenkomponenten 6-Shogaol, Ellagsäure und Myrrhe mit unterschiedlichen Mechanismen stärkend auf die Barriere einwirken. Zur Behandlung von intestinalen Erkrankungen mit Barrieredysfunktion könnten daher Kombinationspräparate aus verschiedenen Pflanzen effektiver sein als Monopräparate.