Messenger RNA acts as an informational molecule between DNA and translating ribosomes. Emerging evidence places mRNA in central cellular processes beyond its major function as informational entity. Although individual examples show that specific structural features of mRNA regulate translation and transcript stability, their role and function throughout the bacterial transcriptome remains unknown. Combining three sequencing approaches to provide a high resolution view of global mRNA secondary structure, translation efficiency and mRNA abundance, we unraveled structural features in E. coli mRNA with implications in translation and mRNA degradation. A poorly structured site upstream of the coding sequence serves as an additional unspecific binding site of the ribosomes and the degree of its secondary structure propensity negatively correlates with gene expression. Secondary structures within coding sequences are highly dynamic and influence translation only within a very small subset of positions. A secondary structure upstream of the stop codon is enriched in genes terminated by UAA codon with likely implications in translation termination. The global analysis further substantiates a common recognition signature of RNase E to initiate endonucleolytic cleavage. This work determines for the first time the E. coli RNA structurome, highlighting the contribution of mRNA secondary structure as a direct effector of a variety of processes, including translation and mRNA degradation.

mRNA is translated with a non-uniform speed that actively coordinates co-translational folding of protein domains. Using structure-based homology we identified the structural domains in epoxide hydrolases (EHs) and introduced slow-translating codons to delineate the translation of single domains. These changes in translation speed dramatically improved the solubility of two EHs of metagenomic origin in Escherichia coli. Conversely, the importance of transient attenuation for the folding, and consequently solubility, of EH was evidenced with a member of the EH family from Agrobacterium radiobacter, which partitions in the soluble fraction when expressed in E. coli. Synonymous substitutions of codons shaping the slow-transiting regions to fast-translating codons render this protein insoluble. Furthermore, we show that low protein yield can be enhanced by decreasing the free folding energy of the initial 5'-coding region, which can disrupt mRNA secondary structure and enhance ribosomal loading. This study provides direct experimental evidence that mRNA is not a mere messenger for translation of codons into amino acids but bears an additional layer of information for folding, solubility and expression level of the encoded protein. Furthermore, it provides a general frame on how to modulate and fine-tune gene expression of a target protein.

Pathogens such as viruses and bacteria use their envelope proteins and their adhesin lectins to recognize the glycan residues presented on the cell surface of the target tissues. This principle of recognition is used in a new electrochemical displacement sensor for the protein concanavalin A (ConA). A gold electrode was first modified with a self-assembled monolayer of a thiolated mannose/OEG conjugate and a ferrocene boroxol derivative was pre-assembled as reporter molecule onto the mannose surface. The novel tracer molecule based on a 2-hydroxymethyl phenyl boronic acid derivative binds even at neutral pH to the saccharides which could expand the application towards biological samples (i.e., urine and feces). Upon the binding of ConA, the tracer was displaced and washed away from the sensor surface leading to a decrease in the electrochemical signal. Using square wave voltammetry (SWV), the concentration of ConA in the sample solution could be determined in the dynamic concentration range established from 38 nmol L-1 to 5.76 mu mol L-1 with a reproducible detection limit of 1 mu g mL(-1) (38 nmol L-1) based on the signal-to-noise ratio (S/N=3) with fast response of 15 min. The new reporter molecule showed a reduced non-specific displacement by BSA and ribonuclease A. The sensor was also successfully transferred to the first proof of principle for the detection of Escherichia coli exhibiting a detection limit of approximately 6 x 102 cells/mL Specificity of the displacement by target protein ConA and E. coli was demonstrated since the control proteins (i.e., BSA and RNaseA) and the control E. coli strain, which lack of type 1 fimbriae, were ineffective. (C) 2014 Elsevier B.V. All rights reserved.

Escherichia (E.) coli ist als kommensales Bakterium ein wichtiger Bestandteil des Mikrobioms von Säugern, jedoch zudem der häufigste Infektionserreger des Menschen. Entsprechend des Infektionsortes werden intestinal (InPEC) und extraintestinal pathogene E. coli (ExPEC) unterschieden. Die Pathogenese von E. coli-Infektionen ist durch Virulenzfaktoren determiniert, welche von jeweils spezifischen virulenzassoziierten Genen (inVAGs und exVAGs) kodiert werden. Häufig werden exVAGs auch in E. coli-Isolaten aus dem Darm gesunder Wirte nachgewiesen. Dies führte zu der Vermutung, dass exVAGs die intestinale Kolonisierung des Wirtes durch E. coli unterstützen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, das Wissen über den Einfluss von exVAGs auf die Besiedlung und damit die Adhäsion von E. coli an Epithelzellen des Darmtraktes zu erweitern. Die Durchführung einer solch umfassenden E. coli-Populationsstudie erforderte die Etablierung neuer Screeningmethoden. Für die genotypische Charakterisierung wurden mikropartikelbasierte Multiplex-PCR-Assays zum Nachweis von 44 VAGs und der Phylogenie etabliert. Für die phänotypische Charakterisierung wurden Adhäsions- und Zytotoxizitätsassays etabliert. Die Screeningmethoden basieren auf der VideoScan-Technologie, einem automatisierten bildbasierten Multifluoreszenzdetektionssystem. Es wurden 398 E. coli-Isolate aus 13 Wildsäugerarten und 5 Wildvogelarten sowie aus gesunden und harnwegserkrankten Menschen und Hausschweinen charakterisiert. Die Adhäsionsassays hatten zum Ziel, sowohl die Adhäsionsraten als auch die Adhäsionsmuster der 317 nicht hämolytischen Isolate auf 5 Epithelzelllinien zu bestimmen. Die Zytotoxizität der 81 hämolytischen Isolate wurde in Abhängigkeit der Inkubationszeit auf 4 Epithelzelllinien geprüft. In den E. coli-Isolaten wurde eine Reihe von VAGs nachgewiesen. Potentielle InPEC, insbesondere shigatoxinproduzierende und enteropathogene E. coli wurden aus Menschen, Hausschweinen und Wildtieren, vor allem aus Rehen und Feldhasen isoliert. exVAGs wurden mit stark variierender Prävalenz in Isolaten aus allen Arten detektiert. Die größte Anzahl und das breiteste Spektrum an exVAGs wurde in Isolaten aus Urin harnwegserkrankter Menschen, gefolgt von Isolaten aus Dachsen und Rehen nachgewiesen. In Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 wurden mehr exVAGs detektiert als in den Isolaten der phylogenetischen Gruppen A, B1 und D. Die Ergebnisse der Adhäsionsassays zeigten, dass die meisten Isolate zelllinien-, gewebe- oder wirtsspezifisch adhärierten. Ein Drittel der Isolate adhärierte an keiner Zelllinie und nur zwei Isolate adhärierten stark an allen Zelllinien. Grundsätzlich adhärierten mehr Isolate an humanen sowie an intestinalen Zelllinien. Besonders Isolate aus Eichhörnchen und Amseln sowie aus Urin harnwegserkrankter Menschen und Hausschweine waren in der Lage, stark zu adhärieren. Hierbei bildeten die Isolate als Adhäsionsmuster diffuse Adhäsion, Mikrokolonien, Ketten und Agglomerationen. Mittels statistischer Analysen wurden Assoziationen zwischen exVAGs und einer hohen Adhäsionsrate ersichtlich. So war beispielsweise das Vorkommen von afa/dra mit einer höheren Adhäsionsrate auf Caco-2- und 5637-Zellen und von sfa/foc auf IPEC-J2-Zellen assoziiert. Die Ergebnisse der Zytotoxizitätsassays zeigten eine sehr starke und zeitabhängige Zerstörung der Monolayer aller Epithelzelllinien durch die α-Hämolysin-positiven Isolate. Auffallend war die hohe Toxizität hämolytischer Isolate aus Wildtieren gegenüber den humanen Zelllinien. Mit den innerhalb dieser Arbeit entwickelten Screeningmethoden war es möglich, große Mengen an Bakterien zu charakterisieren. Es konnte ein Überblick über die Verbreitung von VAGs in E. coli aus unterschiedlichen Wirten gewonnen werden. Besonders Wildtiere wurden sowohl durch den Nachweis von VAGs in den entsprechenden Isolaten, verbunden mit deren Adhäsionsfähigkeit und ausgeprägter Zytotoxizität als Reservoire pathogener E. coli identifiziert. Ebenso wurde eine zelllinienspezifische Adhäsion von Isolaten mit bestimmten exVAGs deutlich. Damit konnte der mögliche Einfluss von exVAGs auf die intestinale Kolonisierung bestätigt werden. In weiterführenden Arbeiten sind jedoch Expressions- und Funktionsanalysen der entsprechenden Proteine unerlässlich. Es wird anhand der Mikrokoloniebildung durch kommensale E. coli vermutet, dass Adhäsionsmuster und demzufolge Kolonisierungsstrategien, die bisher pathogenen E. coli zugeschrieben wurden, eher als generelle Kolonisierungsstrategien zu betrachten sind. Das E. coli-α-Hämolysin wirkt im Allgemeinen zytotoxisch auf Epithelzellen. Ein in der Fachliteratur diskutierter adhäsionsunterstützender Mechanismus dieses Toxins ist demnach fragwürdig. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Screeningmethoden umfassende Analysen einer großen Anzahl an E. coli-Isolaten ermöglichen.

Die ubiquitär verbreitete Molybdänkofaktorbiosynthese ist in Escherichia coli (E. coli) bisher am umfassendsten untersucht. Bislang war jedoch nicht bekannt, welche physiologische Schwefelquelle im zweiten Schritt dieses Syntheseweges zur Bildung der charakteristischen Dithiolengruppe genutzt wird. Erste Untersuchungen deuteten auf eine der Cysteindesulfurasen E. colis hin, welche in Verbindung mit einem rhodaneseähnlichen Protein den Schwefel in Form eines Persulfids übertragen. Ähnliche Mechanismen wurden bereits in der humanen Moco-Biosynthese und der Thiaminbiosynthese identifiziert. In dieser Arbeit wurde das E. coli Protein YnjE näher charakterisiert. Es handelt sich bei YnjE um ein rhodaneseähnliches Protein aus drei Rhodanesedomänen. Durch Proteinkristallisation und anschliessender Röntgenstrukturanalyse wurde die Tertiärstruktur des YnjE-Proteins analysiert. Die hergestellten Kristalle konnten zur Gewinnung von Strukturdaten vermessen und eine Proteinkristallstruktur für YnjE berechnet werden. Desweiteren besitzt YnjE ein N-terminales Typ I Sekretionssystem abhängiges Sipnalpeptid. Durch Lokalisieungsexperimente wurde die Bedeutung des Signalpeptids für das YnjE-Protein untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass endogenes YnjE sowohl im peri- als auch im cytoplasmatischen Raum lokalisiert ist. Auf Grund von vorhergehenden Studien, wurde eine Funktion des YnjE-Proteins innerhalb der Molybdänkofaktorbiosynthese in der Schwefelübertragung auf das Protein MoaD in E. coli vermutet und deshalb in dieser Arbeit näher untersucht. Es wurde eine Interaktion des YnjE-Proteins mit dem MoeB-Protein, welches für die Thiocarboxylierung des MoaD-Proteins essentiell ist, durch Tandem-Affinitätsreinigung und Antikörper-basierte Affinitätsreinigung nachgewiesen und ein signifikanter positiver Einfluss YnjEs auf die Bildung von Molybdopterin, einer Vorstufe des Molybdänkofaktors, bestätigt. Dabei wurde sowohl der Sulfurierungsgrad des MoaD-Proteins in YnjE und Cysteindesulfurase-knock-out Mutanten untersucht, als auch die Bildung von Molybdopterin in einem in vitro Ansatz in Abhängigkeit von steigenden YnjE-Konzentrationen analysiert. Im Ergebnis kann man daraus schließen, dass der Mechanismus der Schwefelübertragung ähnlich der Thiaminbiosynthese, über eine der drei Cysteindesulfurasen CsdA, SufS oder IscS geschieht, welche Schwefel in Form eines Persulfids auf YnjE übertragen können. Thiosulfat und Mercaptopyruvat, die Substrate für die beiden Familien der rhodaneseähnlichen Proteine, Thiosulfat-Sulfurtransferasen und Mercaptopyruvat-Sulfurtransferasen, dienen nicht als Substrate für eine Persulfurierung YnjEs. Durch eine Austauschmutante des Cysteinrestes der aktiven Schleife von YnjE konnte nicht bestätigt werden, dass dieser Aminosäurerest und damit die Bildung eines YnjE-gebundenen Persulfids für die positive Beeinflussung der MPT-Synthese essentiell ist. Vielmehr kann durch diese Arbeit von einer Vermittlung der Interaktionen zwischen MoeB, IscS und der MPT-Synthase durch YnjE ausgegangen werden wobei die Cysteindesulfurase IscS den Schwefel für die Thiocarboxylierung des MoaD-Proteins liefert.